Summary
בשיטה זו, תאי השריר העיקריים של האדם מתורבתים במבחנה כדי לקבל מיוטובים מובחנים ושיעורי ספיגה של גלוקוז נמדדים. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לכמת את שיעורי במדינות בסיס ומעוררת אינסולין באמצעות [ 3 H] 2-deoxy-D גלוקוז.
Abstract
שריר השלד הוא הפיקדון הגדול ביותר גלוקוז ביונקים תורמת במידה רבה גלוקוז הומיאוסטזיס. הערכה של רגישות לאינסולין של תאי שריר היא רלוונטית משמעותית עבור כל המחקרים המוקדש לחקר מטבוליזם גלוקוז בשרירים ואפיון שינויים מטבוליים. בתאי שריר, חלבונים מסוג 4 גלוקוז מסוג 4 (GLUT4) מתורגמים לממברנת הפלסמה בתגובה לאינסולין, ובכך מאפשרים כניסה מסיבית של גלוקוז לתא. היכולת של תאי שריר להגיב לאינסולין על ידי הגדלת שיעור ספיגת הגלוקוז הוא אחד readouts תקן לכמת רגישות תאי שריר לאינסולין. מיוטובין ראשוני האדם הם מתאימים במודל חוץ גופית , כמו התאים לשמור על תכונות רבות של פנוטיפ התורם, כולל רגישות לאינסולין. מודל זה במבחנה מתאים גם למבחן של כל תרכובות שעלולות להשפיע על היענות האינסולין. מדידות של שיעור ספיגת הגלוקוז במיטובים מובחנים משקפיםרגישות לאינסולין.
בשיטה זו, תאי שריר ראשוניים אנושיים מתורבתים במבחנה כדי לקבל מיוטובים מובחנים, ושיעורי ספיגה של גלוקוז עם גירוי אינסולין ובלי נמדדים. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לכמת שיעורי העברה גלוקטיבית פסיבית פעילה באמצעות [ 3 H] 2-deoxy-D-Glucose [ 3 H] 2dG). שיטות חישוב ניתנים לכמת פעיל basal ו אינסולין מגורה שיעורי, כמו גם גירוי לקפל.
Introduction
שריר השלד הוא הפיקדון הגדול ביותר גלוקוז ביונקים תורמת במידה רבה גלוקוז הומיאוסטזיס. זו רקמת תגובה אינסולין הוא האתר העיקרי של ספיגה הגלוקוז כי מופעלת על ידי גירוי אינסולין 1 .
בסוכרת מסוג 2, עמידות לאינסולין נצפתה במספר רקמות, כולל שריר השלד, ומובילה לריכוז גבוה יותר של גלוקוז בדם. לכן, יש חשיבות רבה לקביעת רמת הרגישות לאינסולין של רקמה זו ותאייה, בין אם המטרה היא לאפיין פגם בנושא או להעריך את היעילות של טיפול המיועד לשפר אותו. בבעלי חיים אנושיים או בבעלי חיים, טכניקת הזהב סטנדרטית להעריך רגישות לאינסולין הוא מהדק hyperinsulinemic-euglycemic. הוצג על ידי DeFronzo בשנת 1979 2 ו שונה מאז 3 , 4 אז, השיטה מאפשרת לכמת את כל הגוףNd רקמות התגובה האינסולין נמדד כמו שיעור גלוקוז להיות perfused תחת גירוי אינסולין לשמור על ריכוז גלוקוז בדם רגיל.
בדיקת רגישות לאינסולין יכולה להתבצע גם ברמת התא באמצעות מודלים של שריר במבחנה , ומדידת שיעורי ספיגת הגלוקוז נותרת כלי יעיל ואמין לכמת התגובה הביולוגית של התא לגירוי אינסולין 5 , 6 , 7 . ואכן, מדידת ספיגת הגלוקוז מכמתת את התגובה הביולוגית של התא לגירוי אינסולין, מהכריכה של אינסולין לקולטן שלה לטרנסלוקציה של שלפוחית GLUT4 מועשר, כולל איתות תאיים ומפלצי זרחון 8 .
זה עניין מרכזי עם דגימות אנושיות, כמו myotubes מובחן לשמור על תכונות רבות של פנוטיפ התורם, כולל trueat מטבוליתIes והפרעות שנצפו בחולה 9 , 10 , 11 , 12 . המיאוטובס מציג קווי דמיון מבניים, מטבוליים ופנוטיפיים לשרירי השלד 13 , 14 , כולל הביטוי של מובילי גלוקוז 15 ומנגנון האינסולין הסלולרי 16 . לפיכך, מדידה של ספיגה הגלוקוז ב myotubes העיקרי הוא רלוונטי לאפיון פנוטיפ השריר של התורם, או לחקור את ההשפעה של התערבות (סמים, תזונה, או פעילות גופנית) על רגישות האינסולין בתא השריר.
המדידה של ספיגה גלוקוז על המיאוביים תרבותיים גם הוא כלי אמין בעת ביצוע ניסויים לשנות רגישות לאינסולין 17 , 18 . במבחנה , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לתרבות להבדיל מיוטוב האדם למדוד את שיעורי ספיגת גלוקוז התא. השיטה מתאימה לכל מקור של תאים מבשר שרירים אנושיים, בין אם הם באים מתוך ההכנות במעבדה, שיתוף פעולה או ספקים זמינים מסחרית. שורות תאים שרירים מונצחים, כמו C2C12 ו- L6, בהתאמה ממקור עכבר ומ חולדה, יכולים לשמש גם למדידת ספיגה של גלוקוז עם פרוטוקול זה.
אנו מספקים פרוטוקול מפורט לכמת את שיעורי במדינות בסיס ומעוררת אינסולין באמצעות radiolabeled [ 3 H] 2dG. Tהוא משתמש אנלוגי גלוקוז שכותרתו מאפשר קביעת מדויקת של כניסת גלוקוז עם חומר מופחת החל, מצב שכיח בעת עבודה עם תאים ראשוניים. מולקולה גלוקוז שונה אינו מסוגל להיכנס נתיבים מטבוליים, ולכן, מצטבר בתוך התא, המאפשר כימות אמין באמצעות רדיואקטיביות התא הכולל. תנאי הניסוי כוללים את השימוש של מעכב גלוקוז תחבורה (cytochalasin B), ומדידות מבוצעות עם וללא אינסולין. שילוב זה מאפשר לקבוע את ערכי הכניסה הפעילים לגלוקוז, כמו גם את חישוב השינוי לקפל עבור אינדקס התגובה לאינסולין. השיטה מוצגת עם מנה אחת של אינסולין במהלך זמן הדגירה יחיד, אבל הפרוטוקול יכול בקלות להיות שונה עבור התגובה מינון או קורס זמן ניסויים 12 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תרבות תאים מדיה ופתרונות
- הכנת מדיה תרבותית
- הכן בינוני שגשוג על ידי תוספת של F-10 בינוני עם גלוטמין (2 מ"מ), פניצילין / סטרפטומיצין (5 מיקרוגרם / מ"ל סופי), 2% עגל סרום בסרום (FCS) ו 2% תחליף בסרום.
- הכן בינוני בידול (DM) על ידי הוספת Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) עם גלוטמין (2 מ"מ), פניצילין / סטרפטומיצין (5 מיקרוגרם / מ"ל סופי), ו FCS 2%.
- הכנת פתרונות ספיגת גלוקוז
זהירות: טיפול בחומרים רדיואקטיביים מותר רק באזור מוגבל ומבוקר על-ידי כוח מורשה. יש לטפל בחומר ובפסולת בהתאם לנהלים, להנחיות ולחקיקה המקומית.- כדי להכין X-DPBS של X-DBSBCo שנאגרו מלוחים (X-DPBS), לעשות פתרון של DPBS המכיל 0.2% (w / v) (ריכוז סופי)(BSA). סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר. חנות ב 4 ° C.
- כדי להכין קר 2-deoxy-D- גלוקוז (2dG) פתרון, לשקול 16.4 מ"ג של 2dG ו solubilize ב 10 מ"ל מים מזוקקים כדי לקבל פתרון 10 מ"מ. חנות ב 4 ° C.
- הוסף 600 μL של 2dG קר 6 μL של radiolabeled [ 3 H] 2dG ל 5400 μL של X-DPBS כדי להשיג את הפתרון 2dG radiolabeled (2dG *).
הערה: הריכוז הסופי הוא 1 מ"מ 2 מ"מ ו תיוג הוא 1 μCi / מ"ל.- להפריש 20 aliquot μL (TC20) של פתרון 2dG radiolabeled *.
- הכנת תערובות הדגירה
- עבור תערובת cytochalasin B, להוסיף 2 μL של 20 מ"מ cytochalasin B ל 2 מ"ל של פתרון 2dG radiolabeled *.
הערה: פתרון מלאי של cytochalasin B הוא ב 10 מ"ג / מ"ל ב dimethyl sulfoxide (DMSO). - עבור תערובת DMSO, להוסיף 4 μL של DMSO ל 4 מ"ל הנותרים של הפתרון 2dG radiolabeled *.
2. התרבות של תאי שריר ראשוניים של האדם
- זריעה של 6-צלחות היטב עם תאי שריר אנושיים
הערה: השתמש ב-בית (ראה התייחסות 24 לפרטים) או בתאים מסחריים שרירים זמינים מסחרית מ בקבוקון קפוא (המכיל 250,000 תאים). ההליך הבא ניתנת עבור 250,000 תאים על מנת להשיג אחד 6-היטב צלחת הכרחי למדידת ספיגת גלוקוז במצב אחד.- להפשיר במהירות בקבוקונים קפואים של הבית 24 או הכנות מסחריות של תאי שריר האדם בתאים מראש חימם (37 מעלות צלזיוס) עד רק גוש קרח קטן נשאר הבקבוקון.
- יוצקים ישירות לתוך צינור פלסטיק 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של חימם מראש (37 מעלות צלזיוס) PM.
- צנטריפוגה 5 דקות ב 500 xg וזורקים supernatant.
- בעדינות resuspend גלולה התא עם 18 מ"ל של מראש חימם PM (להשיג 42,000 תאים לכל3 מ"ל של המדיום). מפיצים 3 מ"ל בכל היטב של צלחת 6-היטב (9.6 ס"מ 2 ).
הערה: שש הבארות הבודדות של צלחת נדרשות לבצע מדידה כפולה של ספיגה של גלוקוז לתנאים הבאים: מעכבי תחבורה פסיבית (בארות 1 ו -2), קצב בסיסי (בארות 3 ו -4) ושיעור מגורה לאינסולין (בארות 5 ו -5) 6). חזור כמו צלחות 6-היטב כמו טיפולים נפרדים נדרשים. - דגירה בתנאי תרבות רגילה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ) עד תאים להגיע מפגש 90%.
הערה: שלב זה לוקח בין 48 - 72 שעות בהתאם אצווה התא. אל תשנה מדיום במהלך שלב זה.
- דיפרנציאציה של תאי שריר
- הסר PM (לאחר 48-72 שעות) ולהחליף עם מראש חימם DM (3 מ"ל לכל טוב). לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 .
הערה: Differentiation לוקח חמישה ימים כדי להגיע למצב יציב שבו תאים מיושרים polynucleated. בדרך כלל, הראשיMyotubes הם מתורבת בינוני 1 גרם / גלוקוז L. לכן, כדי למנוע דלדול הגלוקוז במהלך התרבות, למלא את הצלחת עם בינוני 3 מ"ל על מנת להבטיח כי מספיק גלוקוז המצע זמין עבור התאים בכל עת. - החלף מדיום DM מדי יומיים.
הערה: מנקודה זו, המוטובוסים יציבים עד 7 ימים ללא כל שינוי משמעותי מדידת ספיגת גלוקוז יכול להתבצע בכל עת.
- הסר PM (לאחר 48-72 שעות) ולהחליף עם מראש חימם DM (3 מ"ל לכל טוב). לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 .
- טיפול בתאי שריר (אופציונלי)
הערה: ניתן לטפל בטיפולי מיוטובס ראשוניים במשך מספר ימים כדי לגרום לשינוי (בדיקת סמים, מעכבים / מפעילי נתיב איתות וכו ' ) לפני גירוי אינסולין ומדידות ספיגה של גלוקוז. תאי שריר יכולים להיות מוגשים לכל טיפול שעשוי להשפיע על הרגישות לאינסולין, ומדידת ספיגת הגלוקוז תכשיר את ההשפעה הזו. לדוגמה, הדגירה של תאי שריר עם חומצה שומן רווי palmitate מקדם עמידות לאינסולין, תאים להציג מופחת אניNsulin מגורה ספיגת גלוקוז.- הכן 12 מ"ל של DM בתוספת 10% BSA (חומצת שומן חינם) ו 0.5 מ"ל palmitate (PALM). הכן 12 מ"ל של DM בתוספת 10% BSA (חומצת שומן חינם) בלבד.
- הכינו שתי צלחות 6-היטב עם myotubes העיקרי האנושי, תרבות אותם כפי שמתואר בסעיפים 2.1 ו 2.2 (עם 5 ימים של הבחנה).
- ביום 5, לשטוף היטב עם 2 מ"ל של PBS. כדי צלחת אחת, להוסיף 2 מ"ל של DM המכיל PALM. כדי צלחת אחרת להוסיף 2 מ"ל של BSA רק המכיל DM.
- לדגור על 48 שעות ב 37 ° C, 5% CO 2 .
3. גירוי אינסולין
- לשטוף תאים שריר מובחנים פעמיים עם 2 מ"ל PBS.
- הסר PBS בזהירות דגירה עם 3 מ"ל של DM ללא FCS במשך 3 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ) עבור דלדול בסרום.
- החלף את התקשורת בכל הבארות עם 3 מ"ל של DM ללא FCS. הוסף 100 ננומטר אינסולין לבארות 5 ו 6.
- דגירה התרבות מיוטוב האדם עבור1 שעות (37 ° C, 5% CO 2 ).
4. ספיגת גלוקוז
- לאחר 1 שעות של גירוי אינסולין, לשטוף בארות פעמיים עם X-DPBS (1 מ"ל לכל לשטוף).
- הוסף 1 מ"ל של תערובת cytochalasin B לארות 1 ו -2, ו 1 מ"ל של תערובת DMSO לבארות 3 - 6. דגירה במשך 15 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ). בסוף הדגירה, מיד למקם את הצלחת על הקרח.
5. תא תמוגה
- לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של קרח קר PBS.
- Lyse התאים היטב כל עם 600 μL של 50 מ"מ NaOH. דגירה על הקרח במשך 5 דקות ומערבבים בעדינות עם סיבוב אוראלי אטי.
הערה: אם lysate הוא צמיג מדי, לדלל עם עד 1.5 מ"ל NaOH. - באמצעות פיפטה, resuspend ולאסוף lysate התא.
6. קביעת גלוקוז Radiolabeled
- שים 400 μL של lysate התא בכל נוזל נצנץ ספירת בקבוקון. הכן בקבוקון שליטה שלילית עם 400ΜL של 50 מ"מ NaOH, בקבוקון שליטה חיובית עם 20 μL של TC20 (משלב 1.2.3.1).
- הוסף 4 מ"ל של תמיסת נצנץ נוזלי לכל בקבוקון. סגור את המכסה ומערבבים כל בקבוקון ביסודיות (1-2 s).
- מכניסים לכל בקבוקון נוזל נצנץ ומודדים את הרדיואקטיביות בהתאם להוראות היצרן. שיא סעיפים לדקה (CPM) עבור כל בקבוקון scintillation במשך 10 דקות.
הערה: CPM = "התפרקות לדקה" x "ספירת היעילות".
7. שיעור ספיגת גלוקוז
- השתמש lysate הנותרים (200 μL, משלב 5.2) כדי למדוד את ריכוז החלבון. לקבוע את ריכוז החלבון של lysate תא באמצעות ברדפורד 25 או שיטה המקבילה. חישוב כמות החלבון הכולל (Q) במ"ג עבור כל טוב.
- כדי לקבל TC1 (הערך עבור 1 μL של 2dG radiolabeled *), מחלקים את הערך לאלף הופעות של TC20 על ידי 20.
- עבור כל בקבוקון, לחשב tהוא שיעור ספיגת גלוקוז כדלקמן:
הערה: R נמדד ב- pmol / mg / min. ממוצע של R עבור בארות 1 - 2 נותן קצב תחבורה פסיבי, R p . ממוצע של R עבור בארות 3-4 נותן קצב התחבורה הכולל הבסיסי, R BT . ממוצע של R עבור בארות 5-6 נותן אינסולין מגורה שיעור התחבורה הכולל, R זה .- חישוב קצב התחבורה הבסיסי הפעיל (R ba ) כדלקמן:
- חישוב האינסולין מגורה המפעילים שיעור תעבורה פעיל (R ia ) כדלקמן:
הערה: בתאי התגובה האינסולין כמו myotubes, שיעורי ספיגת גלוקוז מיוצגים בדרך כלל על ידי שלושה ערכים: R Ba , R ia , ואת קיפול אינסולין גירוי כמו RIA / R Ba .
- חישוב קצב התחבורה הבסיסי הפעיל (R ba ) כדלקמן:
- עבור תערובת cytochalasin B, להוסיף 2 μL של 20 מ"מ cytochalasin B ל 2 מ"ל של פתרון 2dG radiolabeled *.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ביום 3, myoblasts להגיע מפגש ( איור 1 א ). את myoblasts בשלב זה הם בדרך כלל mononucleated. בינוני השתנה ביום 8, הבחנה הושלמה ( איור 1 ב ) (פרוטוקול סעיף 2). לאחר 5 ימים של הבחנה, מיוטובים מיושרים ו polynucleated בדרך כלל. מיוטובים ראשוניים של האדם היו נתונים לפאלמיט או לטיפול BSA בלבד לפני מדידת קצב ספיגה של גלוקוז. תאים הודגרו עבור 48 שעות עם palmitate 0.5 מ"מ ב BSA (PALM) או BSA לבד (BSA). גירוי האינסולין בוצע (פרוטוקול סעיף 3) ספיגה גלוקוז נמדדה (סעיף 4 פרוטוקול). איור 2 מציג קצב ספיגה של גלוקוז במצב בקרה (BSA) ומצב טיפול (PALM). ספיגה לא ספציפית הוא לכמת ב myotubes מודגרות עם cytochalasin B. בסל ואינסולין מגורה שיעורי ספיגת גלוקוז ניתן להשוות BSA ו PAL תנאי M. אינסולין מגדיל באופן משמעותי את רמת הסוכר בדם במצב BSA (p <0.01). שיעור ספיגת הגלוקוז הממריץ באינסולין נמוך משמעותית במיאוטובוסים שטופלו ב- PALM (p <0.05). יתר על כן, תגובת האדם myotube האינסולין יכול גם לבוא לידי ביטוי כמו שינוי לקפל. איור 3 מראה כי התגובה לאינסולין הוא ירד ב myotubes שטופלו PALM בהשוואה לשליטה (p <0.05).
למרות הביטוי המוגבל של חלבון GLUT4 ב myotubes בתרבית, תאי השריר העיקריים מסוגלים להגיב לאינסולין עם עלייה ספיגה הגלוקוז ( איור 2 ). השינוי הקפל הממוצע שנצפה הוא ~ 1.3, בדומה למה שתואר על ידי קבוצות אחרות עם תאי שריר אנושיים 6 , 7 , 10 , 26 ,> 27. אינדוקציה של עמידות לאינסולין בתאי שריר עם חומצת שומן רווי מתואר בדרך כלל בתאי שריר של עכבר, חולדה ותאי אדם, והוכח להפחתת ספיגת הגלוקוז של תאי שריר מטופלים 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . ביצענו הדגירה palmitate (0.5 מ"מ) במשך 48 שעות וצפתה ירידה בשיעור של ספיגת גלוקוז בבסיס ו אינסולין מגורה ירידה ירידה בקפל אינסולין, המשקף את מצב עמידות לאינסולין. זמן דגירה בשימוש בכתב יד זה נבחרה כדי להדגים באופן מלא את ההשפעה המעכבת על ספיגת גלוקוז. פעמים הדגירה קצר יכול גם לייצר עמידות לאינסולין מופחתת ספיגת גלוקוז 31 , 32 , 33 Sup , 34 . ריכוזים נמוכים יותר ולכן פיזיולוגיים יותר ניתן להשתמש במבחנה , כמו גם התגובה מינון ו / או ניסויים זמן, והשוואה עם ההשפעה של חומצות שומן בלתי רוויות כמו oleate 29 , 35 .
איור 1: במבחנה ראשוני האדם. תמונות של מיאוטוב האדם ב 2 שלבים של התרבות המתקבל באמצעות מיקרוסקופ אופטי מוצגים. ( א ) יום 3 של תרבות myoblast ב מפגש. ( ב ) ביום 8 (5 ימים של הבחנה), מיוטובים מיושרים. סולם בר = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
בתוך הדף = "1"> 
איור 2: השפעת גירוי האינסולין על שיעור ספיגה של גלוקוז במיאוטוביות האדם בתנאים BSA ו- PALM. Myotubes טופלו BSA לבד או 0.5 מ"מ PALM במשך 48 שעות. לאחר שינוי בינוני ו 3 שעות של דלדול בסרום, שיעור ספיגת גלוקוז ספציפי (ב pmol / mg / min) נמדד בהיעדר (-) או בנוכחות (+) של אינסולין (1 h, 100 ננומטר). הנתונים הם ממוצעים של ארבעה ניסויים עצמאיים באמצעות מיוטובים מארבעה תורמים שונים. #P <0.05 בהשוואה לערך הבסיסי; * P <0.05 בהשוואה לערך גירוי אינסולין BSA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: מקפל Iתגובת nsulin ב BSA ו PALM תנאי תרבות. יחס האינסולין מגורה על קצב העברת הגלוקוז הבסיסי בתנאים BSA ו- PALM. יחס זה נותן את הקליטה גלוקוז שיעור ספיגה על גירוי אינסולין (100 ננומטר). * P <0.05 בהשוואה למצב BSA (n = 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ספיגת גלוקוז היא מדידה ביולוגית מפתח לבדיקת actators או מעכבי על תרבות התא וכיצד הם משפיעים על השימוש בגלוקוז, ואת היכולת של התא להגיב לאינסולין. השיטה המתוארת כאן הוכחה כמהירה ואמינה ונמצאה בשימוש נרחב במחקרים רבים באמצעות מיוטובים ראשוניים של חולים בריאים ו / או מטופלים עם מטבוליזם 6 , 7 , 10 , 12 , 21 , 26 , 27 , 36 , 37 . עם רק 6 צלחת אחת, גם ניתן להשיג תעריפים בכפילויות עבור התחבורה הבסיסית הכוללת, התחבורה הבסיסית הפעילה ותחבורה פעילה הממריצה אינסולין. אלה שלושה ערכים באופן מלא לתאר את הרגישות לאינסולין של תאים במבחנה בתרבית בתרבית.
Ss = "jove_content"> תאי שריר ראשוניים מתרבים באופן שגרתי על צלחות מצופות קולגן. בעת שימוש בקווים תאים כמו C2C12 או L6, לוחות מצופה שאינם יכולים לשמש. כדי למקסם את התגובה האינסולין, חשוב לרוקן אינסולין מן התאים שריר לפני הגירוי על מנת לקבל את המצב הבסיסי הנמוך ביותר האפשרי. זמן הדגירה 3 שעות המצוין בפרוטוקול זה יכול להיות שונה בהתאם ליציבות התא על אינסולין ו / או רעב בסרום. הדגירה 3 שעות עם אינסולין הוא ואחריו הדגירה 15 דקות עם גלוקוז radiolabeled. מטרת הדגירה של שעה עם אינסולין היא לאפשר טרנסלוקציה של כל GLUT4 המכיל שלפוחית זמין לקרום על מנת להשיג מקסימום גלוקוז ספיגה הדולר. בדיקות קודמות הראו כי פעמים הדגירה קצר (15 ו 30 דקות) לא השיגו שיעורי מקסימלית. ההתמדה של גירוי אינסולין במהלך 15 דקות עם 2dG radiolabeled אינו חובה כפי שהוא לא השפיע על המדידה (נתונים אישיים). יתר על כן, אותו radiolabeled תערובת 2dG ניתן להוסיף לכל בארות נבדק. עבור תמוגה התא, את נפח NaOH ניתן לשנות על פי המאפיינים התא. כאשר עובדים עם תאים המכילים רמות גבוהות של חומצות שומן כלומר עבור lysates צמיג מאוד, את נפח NaOH ניתן להגדיל עד 1.5 מ"ל.
השיטה משתמשת חומר radiolabeled זה משפר את הרגישות של המדידה, אך דורש כי הפרוטוקול להתבצע באזורים מבוקרים. יש לטפל בחומרים ובפסולת בהתאם להנחיות הבטיחות המקומיות. עבור מעבדות לא מאובזר, כימות colorimetric אחרים פלואורסצנטי 38 שיטות זמינות. ב מבחני רדיואקטיבי, עוצמת הקרינה ניתן למדוד לאחר הדגירה של התאים עם אנלוגי D- גלוקוז פלואורסצנטי -2 [ N - (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] 2-deoxy-D-glucose (2-NBDG). עם אנלוגי זה, קבוצות מסוימות דיווחו כי האינסולין איבד את ההשפעות הפיזיולוגיות שלו בתאי L6, כאשר קבוצות אחרות הראו כי אינסולין עדיין מגביר את ספיגת הגלוקוז (בתאי שריר ראשוניים של בני אדם) 38 . בשל ביטוי נמוך GLUT4, כימות האינסולין מגורה ספיגת גלוקוז בתאי השריר בתרבית מצטמצם לעומת בתנאים vivo 6 , 16 . לכן חשוב לאפיין את היענות האינסולין של תאי השריר התרבותיים באמצעות גישות אחרות. מדידות של מצב זירחון של חלבונים מרכזיים של נתיב איתות האינסולין (כמו Akt / PKB ו / או GSK3) באמצעות immuno- איתור ניתן להשתמש 14 , 21 , 31 . ברמה האנזימטית, סינתזה גליקוגן, גלוקוז ו / או חמצון השומנים ניתן גם להעריך בתנאים עם וללא אינסולין 14 , 26 , 31 . כל cel אחרים סוג l (אם הוא מגיב לאינסולין או לא) יכול תיאורטית להיות מנותח כמו כל התאים יכולים באופן פעיל או פסיבית ספיגת גלוקוז. לפיכך ניתן להחליף את הבארות הממריצות את האינסולין על ידי טיפול מתאים אחר.
השימוש myotube העיקרי האדם מרמז כי תאי השריר הגיעו למצב בידול עולה בקנה אחד עם ביטוי מספיק חלבון GLUT4. אם ההכנה מכילה תאים שאינם שרירים או מיובלאסטים במהותם, ערכי ספיגה של גלוקוז במצב גירוי אינסולין לא יהיו שונים מהמצב הבסיסי ( Ria לעומת R Ba ), בעיקר בשל הדומיננטיות של טרנספורטר GLUT1.
אינסולין ניתן להוסיף לתרבית העיקרית שריר תרבות התא כדי לקדם ולשפר התפשטות תאים שרירים בידול. עם זאת, אינסולין הוכח גם לגרום לעמידות לאינסולין בגירוי כרוני 40 , 41 ,Class = "xref"> 42. בניסויים שלנו, תאי השריר הראשיים של האדם מבדילים בצורה נכונה רק עם שינוי בינוני עם סרום מופחת. לכן אנו מעדיפים לא להוסיף אינסולין חיצוני במהלך התרבות כדי לשמר את התאים מפני גירוי כרוני לפני הערכה של היענות לאינסולין. לבסוף, השיטה דורשת כמה צעדים כביסה. לכן, יש להקפיד לא לנתק תאים מהצלחת כפי שהוא יכול לקרות עם תאים ראשוניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
המחברים מודים אן Charrié ב Radiobiology שירות (ליון- Sud החולים) ואת הפדרציה הלאומית Suisse (FNS) על התמיכה הכספית שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human primary muscle cell | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | If not available, use commercial source |
| Human primary muscle cell | Promocell | C-12530 | Should be cultured with associated media C23060 and C23061 |
| 6-well plate | Corning | 356400 | BioCoat Collagen I Multiwell Plates |
| Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/L glucose |
| Glutamine | Dutscher | X0551-100 | |
| penicilin/streptomycin 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
| Serum substitute UltroserG | Pall France | 15950.017 | serum substitute in text |
| DMEM low glucose | Dutscher | L0064-500 | 1 g/L glucose |
| Fetal Calf Serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Dutscher | L0625-500 | Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM) |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D6134 | |
| Albumin bovine | euromedex | 04-100-812-E | |
| fatty acid-free BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
| palmitate | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Specific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
| PICO PRIAS VIAL 6 mL | PerkinElmer | 6000192 | |
| ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | scintillation liquid |
| bêta counter | PerkinElmer | 2900TR |
References
- Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38 (6), 389-402 (2006).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237 (3), E214-E223 (1979).
- Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique. Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).
- Heise, T., et al. Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it. Diabetes Obes Metab. 18 (10), 962-972 (2016).
- Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro. Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).
- Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin. J Clin Invest. 90 (4), 1386-1395 (1992).
- Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture. Biochem Cell Biol. 68 (2), 536-542 (1990).
- Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiol Rev. 93 (3), 993-1017 (2013).
- Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. Apmis. 109 (11), 735-744 (2001).
- Bouzakri, K., et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (6), 1319-1325 (2003).
- Scheele, C., et al. Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
- Jackson, S., et al. Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families. Diabetes. 49 (7), 1169-1177 (2000).
- Aas, V., et al. Are cultured human myotubes far from home? Cell Tissue Res. 354 (3), 671-682 (2013).
- Bakke, S. S., et al. Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects. PLoS One. 10 (3), e0119556 (2015).
- Stuart, C. A., et al. Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (5), E1067-E1073 (2006).
- Al-Khalili, L., et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell Mol Life Sci. 60 (5), 991-998 (2003).
- Tsuka, S., et al. Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin. Biochem Biophys Res Commun. 459 (3), 437-442 (2015).
- Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin. Bull Exp Biol Med. 159 (4), 463-465 (2015).
- Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 374 (1), 117-122 (2008).
- Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia. 49 (12), 3027-3037 (2006).
- Gastebois, C., et al. Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance. Physiol Rep. 4 (17), (2016).
- Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation. Appl Physiol Nutr Metab. 40 (4), 407-413 (2015).
- Feng, Y. Z., et al. PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference. Arch Physiol Biochem. 120 (1), 12-21 (2014).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Bouzakri, K., et al. Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle. Diabetes. 57 (6), 1508-1516 (2008).
- Shemyakin, A., et al. Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro. Diabetes. 60 (8), 2061-2067 (2011).
- Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (3), E783-E793 (2007).
- Coll, T., et al. Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells. J Biol Chem. 283 (17), 11107-11116 (2008).
- Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes. Diabetes. 54 (3), 648-656 (2005).
- Hage Hassan, R., et al. Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells. Diabetologia. 55 (1), 204-214 (2012).
- Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 460 (4), 977-982 (2015).
- Hommelberg, P. P., et al. Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation. Cell Mol Life Sci. 68 (7), 1215-1225 (2011).
- Yang, M., et al. Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes. Lipids Health Dis. 12, 104 (2013).
- Peng, G., et al. Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle. Endocrinology. 152 (6), 2206-2218 (2011).
- Lambernd, S., et al. Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways. Diabetologia. 55 (4), 1128-1139 (2012).
- Nikolic, N., et al. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise. PLoS One. 7 (3), e33203 (2012).
- Hsu, F. L., et al. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes. 62 (2), 628-638 (2013).
- Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).
- Catalano, K. J., et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS One. 9 (9), e108693 (2014).
- Liu, H. Y., et al. Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284 (40), 27090-27100 (2009).
- Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes. Metabolism. 56 (2), 190-198 (2007).
