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Biology

Misurazione e risposta alla somministrazione di glucosio alla stimolazione dell'insulina in doi: 10.3791/55743 Published: June 25, 2017

Summary

In questo metodo, le cellule muscolari primarie umane vengono coltivate in vitro per ottenere miotubi differenziati e misurati i tassi di assorbimento del glucosio. Forniamo un protocollo dettagliato per quantificare i tassi negli stati basali e stimolati da insulina utilizzando il [ 3 H] 2-deoxy-D-Glucose radiomarcato.

Abstract

Il muscolo scheletrico è il più grande deposito di glucosio nei mammiferi e contribuisce in gran parte all'omeostasi del glucosio. La valutazione della sensibilità all'insulina delle cellule muscolari è di grande rilevanza per tutti gli studi dedicati all'esplorazione del metabolismo muscolare del glucosio e alla caratterizzazione delle alterazioni metaboliche. Nelle cellule muscolari, le proteine ​​di glucosio trasportatore di tipo 4 (GLUT4) si traslocano alla membrana plasmatica in risposta all'insulina, consentendo così l'immissione massiccia di glucosio nella cellula. La capacità delle cellule muscolari di rispondere all'insulina aumentando il tasso di assorbimento di glucosio è una delle letture standard per quantificare la sensibilità delle cellule muscolari all'insulina. I miotubi primari umani sono un modello in vitro adatto, in quanto le cellule mantengono molte caratteristiche del fenotipo del donatore, compresa la sensibilità all'insulina. Questo modello in vitro è anche adatto per la prova di tutti i composti che potrebbero influenzare la reattività dell'insulina. Riflettere le misurazioni della portata di glucosio in miotubi differenziatiSensibilità all'insulina.

In questo metodo, le cellule muscolari primarie umane vengono coltivate in vitro per ottenere miotubi differenziati e misurati i tassi di assorbimento di glucosio con e senza stimolazione dell'insulina. Forniamo un protocollo dettagliato per quantificare i tassi di trasporto passivi e attivi di glucosio usando [ 3 H] 2-deoxy-D-Glucose ([ 3 H] 2dG radiolabeled). I metodi di calcolo sono forniti per quantificare i tassi attivi basali e insulino-stimolati, nonché la piega di stimolazione.

Introduction

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Il muscolo scheletrico è il più grande deposito di glucosio nei mammiferi e contribuisce in gran parte all'omeostasi del glucosio. Questo tessuto sensibile all'insulina è il sito primario dell'assorbimento di glucosio che è innescato dalla stimolazione insulinica 1 .

Nel diabete di tipo 2, la resistenza all'insulina è osservata in diversi tessuti, inclusi i muscoli scheletrici, e conduce alla normale concentrazione di glucosio nel sangue. Pertanto, è di grande importanza determinare il livello di sensibilità all'insulina di questo tessuto e delle sue cellule, se si vuole caratterizzare un difetto di un soggetto o per valutare l'efficacia di un trattamento che intende migliorare. Nei soggetti umani o animali, la tecnica del gold standard per valutare la sensibilità all'insulina è il morsetto iperinsulinemico euglicemico. Introdotto da DeFronzo nel 1979 2 e modificato dal 3 , 4 poi, il metodo permette di quantificare il corpo intero aNd la reattività dell'insulina misurata come il tasso di glucosio da perfezionare sotto la stimolazione dell'insulina per mantenere la concentrazione normale di glucosio nel sangue.

L'esplorazione di sensibilità all'insulina può essere eseguita anche a livello cellulare utilizzando modelli muscolari in vitro e la misurazione dei tassi di assorbimento di glucosio rimane uno strumento efficace e affidabile per quantificare la risposta biologica della cellula alla stimolazione insulinica 5 , 6 , 7 . Infatti, la misurazione dell'assorbimento di glucosio quantifica la risposta biologica cellulare alla stimolazione dell'insulina, dal legame dell'insulina al suo recettore alla traslocazione delle vescicole arricchite GLUT4, e che comprende le cascate intracellulari di segnalazione e di fosforilazione 8 .

Questo è di grande interesse per i campioni umani, in quanto i miotubi differenziati mantengono molte caratteristiche del fenotipo del donatore, incluso il metabolismoI disturbi osservati nel paziente 9 , 10 , 11 , 12 . I myotubes mostrano somiglianze strutturali, metaboliche e fenotipiche al muscolo scheletrico 13 , 14 , compresa l'espressione dei trasportatori di glucosio 15 e delle macchine di segnalazione di insulina cellulare 16 . Pertanto, la misurazione dell'assorbimento di glucosio nei miotubi primari è rilevante per caratterizzare il fenotipo muscolare di un donatore, o per indagare l'effetto di un intervento (farmaco, nutrizione o attività fisica) sulla sensibilità dell'insulina nella cellula muscolare.

La misurazione dell'assorbimento di glucosio sui miotubi coltivati ​​è anche uno strumento affidabile quando si eseguono esperimenti che modificano la sensibilità all'insulina 17 , 18 . L' in vitro 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per coltivare e differenziare i miotubi umani e per misurare i tassi di assorbimento di glucosio cellulare. Il metodo è applicabile a qualsiasi sorgente di cellule umane di precursori muscolari, siano essi provenienti da preparazioni in laboratorio, collaborazioni o fornitori disponibili in commercio. Le linee di cellule muscolari immortalizzate, come C2C12 e L6, rispettivamente dall'origine del topo e del ratto, possono anche essere utilizzate per la misurazione dell'assorbimento di glucosio con questo protocollo 7 .

Forniamo un protocollo dettagliato per quantificare i tassi in stati basali e stimolati da insulina usando radiodiffatti [ 3 H] 2dG. TL'uso di un analogo glucosio etichettato consente una accurata determinazione dell'ingresso di glucosio con un materiale di partenza ridotto, una condizione comune quando si lavora con le cellule primarie. La molecola di glucosio modificata non è in grado di entrare nei percorsi metabolici e quindi si accumula all'interno della cellula, consentendo una quantificazione affidabile tramite la radioattività totale della cellula. Le condizioni sperimentali includono l'uso di un inibitore del trasporto di glucosio (citocalasin B) e le misurazioni vengono eseguite con e senza insulina. Questa combinazione permette di determinare le percentuali di ingresso attive del glucosio, nonché il calcolo del cambiamento di piega per l'indice di risposta dell'insulina. Il metodo viene presentato con una dose di insulina durante un solo periodo di incubazione, ma il protocollo può essere facilmente modificato per la risposta alla dose o per gli esperimenti del corso di tempo 12 .

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Protocol

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1. Preparazione dei mezzi di coltura cellulare e delle soluzioni

  1. Preparazione di supporti di coltura
    1. Preparare il medium di proliferazione (PM) completando il mezzo F-10 di Ham con glutamina (2 mM), penicillina / streptomicina (5 μg / mL finale), 2% fetale calf serum (FCS) e 2% siero sostituto.
    2. Preparare il mezzo di differenziazione (DM) integrando Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con glutamina (2 mM), penicillina / streptomicina (5 μg / mL finale) e 2% FCS.
  2. Preparazione di soluzioni di assorbimento di glucosio
    Attenzione: La manipolazione del materiale radioattivo è consentita solo da un personale autorizzato in una zona limitata e controllata. Il materiale e gli sprechi devono essere trattati secondo procedure, linee guida e legislazioni locali appropriate.
    1. Per preparare la soluzione salina fosforata (X-DPBS) di X-Dulbecco, preparare una soluzione di DPBS contenente 0,2% (w / v) (concentrazione finale)Umina (BSA). Filtrare la soluzione con un filtro da 0,2 μm. Conservare a 4 ° C.
    2. Per preparare una soluzione fredda di 2-deossi-D-glucosio (2dG), pesare 16,4 mg di 2dG e solubilizzare in 10 mL di acqua distillata per ottenere una soluzione di 10 mM. Conservare a 4 ° C.
    3. Aggiungere 600 μl di freddo 2dG e 6 μL di radiolabeled [3H] 2dG a 5400 μL di X-DPBS per ottenere la soluzione radiomarcata 2dG (2dG *).
      NOTA: La concentrazione finale è di 1 mM 2dG e l'etichettatura è 1 μCi / mL.
      1. Impostare una aliquota di 20 μl (TC20) di soluzione 2dG * radiomarcato.
  3. Preparazione delle miscele di incubazione
    1. Per la miscela di citocalasin B aggiungere 2 μL di 20 mM di citocalasin B a 2 ml di soluzione 2dG * radiolabeled.
      NOTA: La soluzione di base del citocalasin B è a 10 mg / mL in dimetilsolfossido (DMSO).
    2. Per la miscela DMSO aggiungere 4 μL di DMSO alle restanti 4 mL di soluzione 2dG * radiolabeled.

    2. Cultura di cellule muscolari primarie umane

    1. Seminazione di piatti a 6 pozzetti con cellule umane del muscolo cellulare
      NOTA: utilizzare in-house (vedere il riferimento 24 per i dettagli) o le cellule umane del muscolo umano commercialmente disponibili da una fiala congelata (contenente 250.000 celle). La seguente procedura è fornita per 250.000 celle per ottenere una piastra a 6 pozzetti necessaria per la misurazione dell'assorbimento di glucosio in una sola condizione.
      1. Rapidamente scongelare flaconi congelati di preparazioni in-house 24 o preparazioni commerciali di cellule umane del muscolo cellulare in acqua pre-riscaldata (37 ° C) fino a quando rimane solo un piccolo blocco di ghiaccio nella fiala.
      2. Versare direttamente in un tubo di plastica da 50 ml contenente 10 ml di PM pre-riscaldato (37 ° C).
      3. Centrifugare per 5 minuti a 500 xg e scartare il surnatante.
      4. Riposare delicatamente il pellet cellulare con 18 ml di PM pre-riscaldato (per ottenere 42.000 cellule per3 ml di media). Distribuire 3 mL in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (9,6 cm2).
        NOTA: i sei singoli pozzetti di una piastra sono necessari per eseguire una misura duplicata di assorbimento di glucosio per le seguenti condizioni: inibizione del trasporto passivo (pozzetti 1 e 2), tasso basale (pozzetti 3 e 4) e tasso stimolato da insulina (pozzetti 5 e 6). Ripetere quanti piatti a sei pozzetti, come sono necessari trattamenti distinti.
      5. Incubare in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO 2 ) fino a quando le cellule raggiungono la confluenza del 90%.
        NOTA: Questo passaggio richiede tra 48 e 72 h a seconda del batch della cella. Non cambia mezzo durante questo passaggio.
    2. Differenziazione delle cellule muscolari
      1. Rimuovere PM (dopo 48-72 h) e sostituire con DM pre-riscaldato (3 mL per pozzetto). Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 .
        NOTA: La differenziazione richiede cinque giorni per raggiungere uno stato stabile dove le celle sono allineate e polinucleate. Tipicamente, il primarioI miotubi vengono coltivati ​​in un mezzo di glucosio da 1 g / l. Pertanto, per evitare l'esaurimento del glucosio durante la coltura, riempire la piastra con mezzo di 3 ml per assicurare che in qualsiasi momento sia disponibile il substrato di glucosio sufficiente per le cellule.
      2. Sostituire il mezzo DM ogni due giorni.
        NOTA: Da questo punto, i myotubes sono stabili per un massimo di 7 giorni senza alcuna modifica significativa e la misurazione dell'assorbimento di glucosio può essere eseguita in qualsiasi momento.
    3. Trattamento delle cellule muscolari (opzionale)
      NOTA: i miotubi primari possono essere trattati per diversi giorni per indurre la modifica (test di farmaco, inibitori / attivatori del percorso di segnalazione, ecc. ) Prima della stimolazione dell'insulina e delle misure di assorbimento del glucosio. Le cellule muscolari possono essere sottoposte a qualsiasi trattamento che possa avere un impatto sulla sensibilità all'insulina e la misurazione dell'assorbimento di glucosio quantificerà tale impatto. Ad esempio, l'incubazione delle cellule muscolari con il palmitato acido grasso saturo promuove la resistenza all'insulina e le cellule presentano ridottiNsulin stimolava l'assorbimento di glucosio.
      1. Preparare 12 ml di DM completato con 10% BSA (senza acidi grassi) e 0,5 ml di palmitato (PALM). Preparare solo 12 ml di DM completato con 10% BSA (solo acido grasso).
      2. Preparare due piastre a 6 pozzetti con miotubi primari umani e coltivarli come descritto nelle sezioni 2.1 e 2.2 (con 5 giorni di differenziazione).
      3. Il giorno 5, lavare ogni pozzetto con 2 ml di PBS. Ad una piastra aggiungere 2 mL di DM contenente PALM. All'altra piastra aggiungere 2 mL di BSA contenente solo DM.
      4. Incubare per 48 h a 37 ° C, 5% CO 2 .

    3. Stimolazione dell'insulina

    1. Lavare le cellule muscolari differenziate due volte con 2 mL di PBS.
    2. Rimuovere attentamente PBS e incubare con 3 ml di DM senza FCS per 3 h (37 ° C, 5% CO 2 ) per l'esaurimento del siero.
    3. Sostituire i supporti in tutti i pozzetti con 3 mL di DM senza FCS. Aggiungere 100 nM insulina ai pozzetti 5 e 6.
    4. Incubare la cultura umana di myotubes per1 h (37 ° C, 5% CO 2 ).

    4. Assorbimento di glucosio

    1. Dopo 1 ora di stimolazione dell'insulina, lavare i pozzetti due volte con X-DPBS (1 mL per lavaggio).
    2. Aggiungere 1 mL di miscela di citocalasin B ai pozzi 1 e 2 e 1 mL di miscela DMSO ai pozzetti 3 - 6. Incubare per 15 minuti (37 ° C, 5% CO 2 ). Al termine dell'incubazione, posizionare immediatamente la lastra sul ghiaccio.

    5. Lysis cellulare

    1. Lavare le cellule due volte con 1 ml di PBS a ghiaccio freddo.
    2. Lyse le cellule in ciascun pozzetto con 600 μL di 50 mM NaOH. Incubare su ghiaccio per 5 minuti e mescolare delicatamente con rotazione orbitale lenta.
      NOTA: Se il lisato è troppo viscoso, diluire fino a 1,5 mL di NaOH.
    3. Usando una pipetta, risospendere e raccogliere il lisato cellulare.

    6. Determinazione del glucosio radioattivato

    1. Mettere 400 μl di ciascuna cellula lisata in una fiala di conteggio liquido di scintillazione. Preparare una fiala di controllo negativa con 400ΜL di 50 mM NaOH e un flaconcino di controllo positivo con 20 μL di TC20 (dal punto 1.2.3.1).
    2. Aggiungere 4 ml di soluzione di scintillazione liquida a ciascuna fiala. Chiudere il tappo e mescolare bene ogni fiala (1-2 s).
    3. Inserire ciascuna fiala in un contatore di scintillazione liquida e misurare la radioattività secondo le istruzioni del produttore. Conteggio record per min (CPM) per ogni fiala di scintillazione per 10 min.
      NOTA: CPM = "disintegrazioni al minuto" x "efficienza di conteggio".

    7. Tasso di assorbimento di glucosio

    1. Utilizzare il restante lisato (200 μL dalla fase 5.2) per misurare la concentrazione proteica. Determinare la concentrazione proteica di ogni lisi cellulare utilizzando Bradford 25 o un metodo equivalente. Calcolare la quantità totale di proteine ​​(Q) in mg per ogni pozzetto.
    2. Per ottenere TC1 (il valore per 1 μL di radiodiffusione 2dG *), dividere il valore CPM di TC20 per 20.
    3. Per ogni fiala, calcolare tTasso di assorbimento di glucosio come segue:
      Equazione
      NOTA: R è misurato in pmol / mg / min. Il mezzo di R per i pozzi 1 - 2 fornisce un tasso di trasporto passivo, R p . Il mezzo di R per i pozzi 3-4 fornisce il tasso di trasporto totale basale, R bt . Il mezzo di R per i pozzi 5-6 fornisce il tasso di trasporto totale stimolato dall'insulina, R it .
      1. Calcolare il tasso di trasporto attivo basale (R ba ) come segue:
        Equazione
      2. Calcolare il tasso di trasporto attivo stimolato dall'insulina (R ia ) come segue:
        Equazione
        NOTA: nelle cellule reattive dell'insulina come i myotubes, i tassi di assorbimento del glucosio sono di solito rappresentati da tre valori: R ba , R ia , e la stimolazione di insulina piega come R ia / R ba .

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Representative Results

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Il giorno 3, i mioblasti arrivano a confluenza ( Figura 1A ). I myoblasti in questa fase sono tipicamente mononucleati. La media è stata modificata e il giorno 8, la differenziazione è stata completata ( figura 1B ) (protocollo sezione 2). Dopo 5 giorni di differenziazione, i myotubi sono allineati e tipicamente polinucleati. I miotubi primari umani sono stati sottoposti a un trattamento con palmitato o un solo BSA prima della misurazione del tasso di assorbimento del glucosio. Le cellule sono state incubate per 48 h con palmitato 0,5 mM in BSA (PALM) o solo BSA (BSA). La stimolazione dell'insulina è stata eseguita (protocollo sezione 3) e l'assorbimento di glucosio è stato misurato (protocollo sezione 4). La Figura 2 mostra la frequenza di assorbimento del glucosio in una condizione di controllo (BSA) e una condizione di trattamento (PALM). L'assorbimento non specifico è quantificato nei miotubi incubati con il citocalasin B. I tassi di assorbimento basale e di glucosio stimolato da insulina possono essere confrontati in BSA e PAL M condizioni. L'insulina aumenta notevolmente il trasporto di glucosio nella condizione BSA (p <0.01). Il tasso di assorbimento del glucosio stimolato da insulina è significativamente più basso nei miotubi trattati con PALM (p <0,05). Inoltre, la risposta cellulare delle miopelle umane all'insulina può anche essere espressa come cambiamento pieghevole. La Figura 3 mostra che la risposta all'insulina è diminuita nei miotubi trattati con PALM rispetto al controllo (p <0,05).

Nonostante la limitata espressione della proteina GLUT4 nei miotubi coltivati, le cellule muscolari primarie sono in grado di rispondere all'insulina con un aumento dell'assorbimento di glucosio ( Figura 2 ). Il cambiamento medio ripiegato è ~ 1,3, simile a quello che è stato descritto da altri gruppi con cellule muscolari umane 6 , 7 , 10 , 26 ,> 27. L'induzione della resistenza all'insulina nelle cellule muscolari con acido grasso saturo è comunemente descritta nelle cellule del muscolo di topo, ratto e umano ed è stato dimostrato di ridurre l'assorbimento di glucosio delle cellule muscolari trattate 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Abbiamo eseguito l'incubazione di palmitato (0,5 mM) per 48 h e abbiamo osservato una diminuzione del tasso di assorbimento basale e insulinico stimolato glucosio e una diminuzione del cambiamento della piega dell'insulina, riflettendo lo stato insulino-resistente. Il tempo di incubazione utilizzato in questo manoscritto è stato scelto per dimostrare pienamente l'effetto inibitorio sull'assorbimento di glucosio. I tempi di incubazione più brevi possono anche produrre resistenza all'insulina e riduzione della quantità di glucosio 31 , 32 , 33 , 34 . Minime e quindi più concentrazioni fisiologiche possono essere utilizzate in vitro , come anche la risposta della dose e / o gli esperimenti del corso di tempo e il confronto con l'effetto di acidi grassi insaturi come l'oleato 29 , 35 .

Figura 1
Figura 1: Myotubi umani primari in vitro . Sono mostrate immagini di miotubi umani a 2 stadi di coltura ottenuti utilizzando un microscopio ottico. ( A ) Giorno 3 della cultura myoblast alla confluenza. ( B ) Al giorno 8 (5 giorni di differenziazione) i myotubes sono allineati. Barra di scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.


Figura 2: Effetto della stimolazione dell'insulina sulla frequenza di assorbimento del glucosio nei miotubi umani in condizioni BSA e PALM. I miotubi sono stati trattati da solo da BSA o da 0,5 mM di PALM per 48 ore. Dopo un cambiamento medio e una depletione del siero di 3 ore, la misura di glucosio specifico (in pmol / mg / min) è stata misurata in assenza (-) o in presenza (+) dell'insulina (1 h, 100 nM). I dati sono la media ± sem di quattro esperimenti indipendenti che utilizzano myotubes da quattro diversi donatori. #P <0,05 rispetto al valore basale; * P <0,05 rispetto al valore di stimolazione insulinica BSA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Piegatura IRisposta nsulin in condizioni di cultura BSA e PALM. Rapporto dell'insulina stimolato sul tasso di trasporto del glucosio basale nelle condizioni di BSA e PALM. Questo rapporto fornisce il tasso di assorbimento del glucosio piegato sulla stimolazione insulinica (100 nM). * P <0,05 rispetto alla condizione BSA (n = 4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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L'assorbimento di glucosio è una misura biologica chiave per l'attivazione di attivatori o inibitori sulla coltura cellulare e su come influenzano l'uso del glucosio e la capacità della cellula di rispondere all'insulina. Il metodo descritto qui è stato dimostrato rapido e affidabile ed è stato ampiamente utilizzato in molti studi utilizzando miotubi primari da soggetti sani e / o pazienti affetti da metabolismo 6 , 7 , 10 , 12 , 21 , 26 , 27 , 36 , 37 . Con un solo piatto a 6 pozzetti, i tassi possono essere ottenuti in duplicati per il trasporto totale basale, il trasporto attivo basale e il trasporto attivo stimolato da insulina. Questi tre valori descrivono completamente la sensibilità dell'insulina delle cellule muscolari colte in vitro .

La miscela di 2dG può essere aggiunta a tutti i pozzetti esaminati. Per la lisi cellulare, il volume di NaOH può essere modificato in base alle caratteristiche delle cellule. Quando si lavora con cellule che contengono alti livelli di acidi grassi, cioè per lisati molto viscosi, il volume di NaOH può essere aumentato fino a 1,5 ml.

Il metodo utilizza materiale radiologico che aumenta la sensibilità della misura, ma richiede che il protocollo venga eseguito in aree controllate. I materiali ei rifiuti devono essere trattati secondo le norme locali di sicurezza. Per i laboratori non attrezzati sono disponibili altri metodi di quantificazione colorimetrica e fluorescenza 38 . In analisi non radioattive, l'intensità di fluorescenza può essere misurata dopo l'incubazione delle cellule con un fluoro D-glucosio analogico 2- [ N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il) ammino] 2-deossi-D-glucosio (2-NBDG). Con questo analogo, alcuni gruppi riportano che l'insulina ha perso i suoi effetti fisiologici nelle cellule L6Ass = "xref"> 39, mentre altri gruppi hanno dimostrato che l'insulina continua ad aumentare l'assorbimento di glucosio (nelle cellule muscolari primarie umane) 38 . A causa della bassa espressione GLUT4, la quantificazione dell'assorbimento di glucosio stimolata da insulina nelle cellule muscolari colte è ridotta rispetto alle condizioni in vivo 6 , 16 . È quindi importante caratterizzare ulteriormente la reattività di insulina delle cellule muscolari colte attraverso altri approcci. Le misurazioni dello stato di fosforilazione delle proteine ​​chiave del percorso di segnalazione di insulina (come Akt / PKB e / o GSK3) utilizzando l'immuno-rilevazione possono essere utilizzati 14 , 21 , 31 . A livello enzimatico, la sintesi del glicogeno, l'ossidazione del glucosio e / o lipidi può essere valutata anche in condizioni con e senza insulina 14 , 26 , 31 . Qualsiasi altro cel Il tipo L (se risponde all'insulina o meno) potrebbe essere teoricamente analizzato in quanto tutte le cellule possono assumere attivamente o passivamente il glucosio. I pozzetti stimolati da insulina possono quindi essere sostituiti da qualsiasi altro trattamento appropriato.

L'uso di myotube primario umano implica che le cellule muscolari hanno raggiunto uno stato di differenziazione coerente con sufficiente espressione della proteina GLUT4. Se il preparato contiene cellule non muscoli o essenzialmente myoblasti, i valori di assorbimento di glucosio nella condizione di stimolazione insulinica non saranno diversi da quelli basali (R ia versus R ba ), principalmente a causa della predominanza del trasportatore GLUT1.

L'insulina può essere aggiunta al mezzo di coltura della cellula muscolare primaria per promuovere e migliorare la proliferazione e la differenziazione delle cellule muscolari. Tuttavia, anche l'insulina ha dimostrato di indurre una resistenza all'insulina nella stimolazione cronica 40 , 41 ,Class = "xref"> 42. Nei nostri esperimenti, le cellule muscolari primarie umane differenziano correttamente solo dopo un cambiamento medio con il siero ridotto. Noi preferiamo quindi non aggiungere insulina esterna durante la coltura per preservare le cellule dalla stimolazione cronica prima della valutazione della reattività all'insulina. Infine, il metodo richiede diversi passaggi di lavaggio. Pertanto, è necessario prestare attenzione a non staccare le celle dalla piastra, come può accadere con le cellule primarie.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono Anne Charrié presso il servizio Radiobiology (ospedale Lyon-Sud) e il Fond National Suisse (FNS) per il loro sostegno finanziario.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human primary muscle cell In house preparation from human skeletal muscle biopsies In house preparation from human skeletal muscle biopsies If not available, use commercial source
Human primary muscle cell Promocell C-12530 Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plate Corning 356400 BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10 Dutscher L0145-500 1 g/L glucose
Glutamine Dutscher X0551-100
penicilin/streptomycin 100x Thermo fisher scientific 15140122
Serum substitute UltroserG Pall France 15950.017 serum substitute in text
DMEM low glucose Dutscher L0064-500 1 g/L glucose
Fetal Calf Serum Eurobio CVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Dutscher L0625-500 Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278
2-deoxy-D-glucose  Sigma-Aldrich D6134
Albumin bovine euromedex 04-100-812-E
fatty acid-free BSA Roche 10,775,835,001
palmitate Sigma-Aldrich P0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] PerkinElmer NET328A001MC Specific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq
Cytochalasin B Sigma-Aldrich c2743
PICO PRIAS VIAL 6 mL PerkinElmer 6000192
ultima gold MW CA  PerkinElmer 6013159 scintillation liquid
bêta counter  PerkinElmer 2900TR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Misurazione e risposta alla somministrazione di glucosio alla stimolazione dell&#39;insulina in<em&gt; In vitro</em&gt; Myotubes primario umano coltivato
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Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).More

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).

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