Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Uppmätt mätning av glukos och reaktion på insulinstimulering i doi: 10.3791/55743 Published: June 25, 2017

Summary

I denna metod odlas humana primära muskelceller in vitro för erhållande av differentierade myotubes och upptagningshastigheter för glukos mäts. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att kvantifiera frekvenserna i basala och insulinstimulerade tillstånd med radiomärkt [3H] 2-deoxi-D-glukos.

Abstract

Skelettmuskel är den största glukosdepositionen hos däggdjur och bidrar till stor del till glukoshomeostas. Bedömning av insulinkänsligheten hos muskelceller är av stor betydelse för alla studier som är dedikerade till att undersöka glukosmetabolism och karakteriserande metaboliska förändringar. I muskelceller translaterar glukostransportör typ 4 (GLUT4) proteiner till plasmamembranet som svar på insulin, vilket möjliggör massiv inträde av glukos i cellen. Muskelcellernas förmåga att reagera på insulin genom att öka graden av glukosupptagning är en av standardavläsningarna för att kvantifiera muskelcellens känslighet för insulin. Mänskliga primära myotubes är en lämplig in vitro- modell, eftersom cellerna bibehåller många egenskaper hos donorfenotypen, inklusive insulinkänslighet. Denna in vitro- modell är också lämplig för testet av några föreningar som kan påverka insulinresponsen. Mätningar av glukosupptagningshastigheten i differentierade myotubes reflekterarInsulinkänslighet.

I denna metod odlas humana primära muskelceller in vitro för erhållande av differentierade myotubes, och upptagningshastigheter för glukos med och utan insulinstimulering mäts. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att kvantifiera passiva och aktiva glukostransporthastigheter med radiomärkt [3H] 2-deoxi-D-glukos ([ 3 H] 2dG). Beräkningsmetoder tillhandahålls för att kvantifiera aktiva basala och insulinstimulerade hastigheter, såväl som stimuleringsvikt.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Skelettmuskel är den största glukosdepositionen hos däggdjur och bidrar till stor del till glukoshomeostas. Denna insulinreaktiva vävnad är den primära platsen för glukosupptaget som utlöses av insulinstimulering 1 .

I typ 2-diabetes observeras insulinresistens i flera vävnader, inklusive skelettmuskler, och leder till över normal blodglukoskoncentration. Det är således av stor betydelse att bestämma nivån på insulinkänsligheten hos denna vävnad och dess celler, oavsett om syftet är att karakterisera en defekt hos ett individ eller att utvärdera effektiviteten av en behandling som avser att förbättra den. Hos människor eller djur är standardmetoden för guld för att bedöma insulinkänslighet hyperinsulinemisk-euglykemisk klämma. Infördes av DeFronzo i 1979 2 och modifierad sedan 3 , 4 då tillåter metoden att kvantifiera hela kroppen aNd vävnad insulinresponsivitet mätt som graden av glukos som ska perfusioneras under insulinstimulering för att upprätthålla normal blodglukoskoncentration.

Insulinkänslighetsutforskning kan även utföras på cellnivå med in vitro- muskelmodeller, och mätning av glukosupptagningshastigheter är fortfarande ett effektivt och pålitligt verktyg för att kvantifiera cellets biologiska respons till insulinstimulering 5 , 6 , 7 . I själva verket kvantifierar mätningen av glukosupptagning det cellbiologiska svaret på insulinstimulering, från bindning av insulin till dess receptor för translokation av GLUT4-berikade vesiklar och innefattande intracellulära signalerings- och fosforyleringskaskader 8 .

Detta är av stort intresse med humana prover, eftersom differentierade myotubes upprätthåller många egenskaper hos donatorfenotypen, inklusive metaboliska egenskaperSjukdomar och störningar observerade i patienten 9 , 10 , 11 , 12 . Myotubesna visar strukturella, metaboliska och fenotypiska likheter med skelettmuskeln 13 , 14 , innefattande uttrycket av glukostransportörer 15 och cellinsulin-signaleringsmaskinen 16 . Således är mätning av glukosupptagningen i primära myotubes av betydelse för att karakterisera en donors muskelfenotyp eller undersöka effekten av ett ingrepp (läkemedel, näring eller fysisk aktivitet) på insulinkänsligheten i muskelcellen.

Mätningen av glukosupptagning på odlade myotubes är också ett pålitligt verktyg vid utförande av experiment som modifierar insulinkänslighet 17 , 18 . In vitro 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för kultur och differentierar mänskliga myotubes och att mäta upptagningshastigheter för cellglukos. Metoden är tillämplig på vilken som helst källa av prekursorceller från mänskliga muskler, oavsett om de kommer från in-lab preparat, samarbete eller kommersiellt tillgängliga leverantörer. Immortaliserade muskelcellinjer, som C2C12 och L6, respektive från mus och råttor, kan också användas för mätning av glukosupptagning med detta protokoll 7 .

Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för att kvantifiera frekvenserna i basala och insulinstimulerade tillstånd med radiomärkt [ 3 H] 2dG. THan använder en märkt glukosanalog medger noggrann bestämning av glukosintaget med reducerat utgångsmaterial, ett vanligt tillstånd vid arbete med primära celler. Den modifierade glukosmolekylen kan inte komma in i metaboliska vägar, och ackumuleras således i cellen, vilket möjliggör tillförlitlig kvantifiering via total cellradioaktivitet. Experimentella förhållanden innefattar användning av en glukostransportinhibitor (cytokalasin B), och mätningar utförs med och utan insulin. Denna kombination möjliggör bestämning av glukos aktiva inträdeshastigheter, såväl som beräkningen av veckbyte för insulinresponsindex. Metoden presenteras med en dos insulin under en enda inkubationstid, men protokollet kan lätt modifieras för dosrespons eller tidskursförsök 12 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Framställning av cellkulturmedia och lösningar

  1. Framställning av odlingsmedium
    1. Preparera proliferationsmedium (PM) genom att komplettera Ham's F-10-medium med glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (5 | ig / ml slutlig), 2% fetalt kalvserum (FCS) och 2% serumutbyte.
    2. Förbered differentieringsmedium (DM) genom att komplettera Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (5 μg / mL slutlig) och 2% FCS.
  2. Framställning av glukosupptagningslösningar
    Varning: Hantering av radioaktivt material är endast tillåtet i ett begränsat och kontrollerat område av behörig personal. Material och avfall måste hanteras enligt lämpliga förfaranden, riktlinjer och lokal lagstiftning.
    1. För att framställa X-Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (X-DPBS), gör en lösning av DPBS innehållande 0,2% (vikt / volym) (slutlig koncentration) bovint serum albUmin (BSA). Filtrera lösningen genom ett 0,2 μm filter. Förvara vid 4 ° C.
    2. För att bereda kall 2-deoxi-D-glukos (2dG) lösning väger 16,4 mg 2dG och solubiliseras i 10 ml destillerat vatten för erhållande av en 10 mM lösning. Förvara vid 4 ° C.
    3. Tillsätt 600 μL kall 2dG och 6 μl radiomärkt [ 3 H] 2dG till 5400 μl X-DPBS för att erhålla den radioaktivt märkta 2dG (2dG *) lösningen.
      OBS: Slutkoncentrationen är 1 mM 2dG och märkning är 1 μCi / ml.
      1. Lägg åt en 20 μl alikvot (TC20) av radioaktivt märkt 2dG * -lösning.
  3. Framställning av inkubationsblandningar
    1. För cytokalasin B-blandningen, tillsätt 2 μL 20 mM cytokalasin B till 2 ml radiomärkt 2dG * -lösning.
      OBS: Stocklösning av cytokalasin B är vid 10 mg / ml i dimetylsulfoxid (DMSO).
    2. För DMSO-blandningen tillsätt 4 μL DMSO till resterande 4 ml radiomärkt 2dG * -lösning.

    2. Kultur av humana primära muskelceller

    1. Sädning av plattor med 6 brunnar med satellitsceller från mänskliga muskler
      OBS! Används internt (se referens 24 för detaljer) eller kommersiellt tillgängliga mänskliga muskelceller från en frusen flaska (innehållande 250 000 celler). Följande procedur ges för 250 000 celler för att erhålla en 6-brunnsplatta som är nödvändig för mätning av glukosupptagning i ett enda tillstånd.
      1. Tina snabbt frysta flaskor med internt 24 eller kommersiella beredningar av humana muskelceller i förvärmt vatten (37 ° C) tills endast ett litet isblock kvarstår i flaskan.
      2. Häll direkt i ett 50 ml plaströr innehållande 10 ml förvärmd (37 ° C) PM.
      3. Centrifugera i 5 minuter vid 500 xg och kassera supernatanten.
      4. Resuspendera cellpelleten försiktigt med 18 ml föruppvärmd PM (för att erhålla 42 000 celler per3 ml medium). Fördela 3 ml i varje brunn i en 6-brunnsplatta (9,6 cm 2 ).
        ANMÄRKNING: De sex enskilda brunnarna på en platta är nödvändiga för att utföra ett duplikatmått av glukosupptagning under följande förhållanden: passiv transporthämning (brunnar 1 och 2), bashastighet (brunnar 3 och 4) och insulinstimulerad hastighet (brunnar 5 och 6). Upprepa så många plattor med 6 brunnar som olika behandlingar behövs.
      5. Inkubera i standardkulturbetingelser (37 ° C, 5% CO2) tills celler når 90% sammanflöde.
        OBS! Detta steg tar mellan 48 och 72 timmar beroende på cellbatchen. Ändra inte mediet under detta steg.
    2. Differentiering av muskelceller
      1. Ta bort PM (efter 48-72 timmar) och byt ut med förvärmd DM (3 ml per brunn). Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2.
        OBS: Differentiering tar fem dagar för att nå ett stabilt tillstånd där cellerna är inriktade och polynukleerade. Vanligtvis är den primäraMyotubes odlas i ett 1 g / 1 glukosmedium. För att undvika glukosutarmning under odling, fyll sedan plåten med 3 ml medium för att säkerställa att tillräckligt med glukosubstrat är tillgängligt för cellerna hela tiden.
      2. Byt DM-medium varannan dag.
        OBS! Från denna punkt är myotubes stabila i upp till 7 dagar utan någon signifikant förändring och mätning av glukosupptagning kan när som helst utföras.
    3. Behandling av muskelceller (valfritt)
      OBS! Primära myotubes kan behandlas i flera dagar för att inducera modifiering (läkemedelstest, inhibitorer / aktivatorer av signalvägen etc. ) före insulinstimulering och mätningar av glukosupptagning. Muskelceller kan lämnas till någon behandling som kan påverka insulinkänsligheten, och mätningen av glukosupptagning kommer att kvantifiera denna effekt. Inkubation av muskelceller med det mättade fettsyrapalmitatet främjar till exempel insulinresistens och cellerna reduceras iNsulin stimulerad glukosupptagning.
      1. Förbered 12 ml DM kompletterat med 10% BSA (fettsyrafri) och 0,5 mL palmitat (PALM). Förbered 12 ml DM kompletterat med 10% BSA (fettsyrafri).
      2. Förbered två 6-brunnsplattor med mänskliga primära myotubes och odla dem enligt beskrivningen i avsnitt 2.1 och 2.2 (med 5 dagers differentiering).
      3. På dag 5 tvättar varje brunn med 2 ml PBS. Till en platta tillsättes 2 ml DM innehållande PALM. Till den andra plattan tillsätt 2 ml BSA som endast innehåller DM.
      4. Inkubera i 48 timmar vid 37 ° C, 5% CO2.

    3. Insulinstimulering

    1. Tvätta differentierade muskelceller två gånger med 2 ml PBS.
    2. Ta bort PBS försiktigt och inkubera med 3 ml DM utan FCS i 3 h (37 ° C, 5% CO2) för serumutarmning.
    3. Byt media i alla brunnar med 3 ml DM utan FCS. Tillsätt 100 nM insulin till brunnar 5 och 6.
    4. Inkuber mänsklig myotubes kultur för1 h (37 ° C, 5% CO2).

    4. Glukosupptagning

    1. Efter 1 h insulinstimulering, tvätta brunnar två gånger med X-DPBS (1 ml per tvätt).
    2. Tillsätt 1 ml cytokalasin B-blandning till brunnarna 1 och 2 och 1 ml DMSO-blandning till brunnar 3-6. Inkubera under 15 min (37 ° C, 5% CO2). Vid slutet av inkubationen lägg omedelbart plåten på is.

    5. Cell Lysis

    1. Tvätta cellerna två gånger med 1 ml iskall PBS.
    2. Lyse cellerna i varje brunn med 600 | il 50 mM NaOH. Inkubera på is i 5 minuter och blanda försiktigt med långsam omloppsrotation.
      OBS! Om lysatet är för visköst, späd med upp till 1,5 ml NaOH.
    3. Använd en pipett, resuspendera och samla celllysatet.

    6. Bestämning av radiomärkt glukos

    1. Sätt 400 μl av varje celllysat i en vätskescintillationsräknande flaska. Förbered en negativ kontrollflaska med 400ΜL av 50 mM NaOH och en positiv kontrollflaska med 20 | il TC20 (från steg 1.2.3.1).
    2. Tillsätt 4 ml vätskescintillationslösning till varje injektionsflaska. Stäng locket och blanda varje injektionsflaska noggrant (1-2 s).
    3. Sätt in varje injektionsflaska i en vätskescintillationsräknare och mät radioaktiviteten enligt tillverkarens instruktioner. Spela in räkningar per minut (CPM) för varje scintillationsflaska i 10 minuter.
      OBS: CPM = "sönderfall per minut" x "räkningseffektivitet".

    7. Glukosupptagningshastighet

    1. Använd det kvarvarande lysatet (200 μL, från steg 5.2) för att mäta proteinkoncentrationen. Bestäm proteinkoncentrationen för varje celllysat med användning av Bradford 25 eller en ekvivalent metod. Beräkna total proteinmängd (Q) i mg för varje brunn.
    2. För att få TC1 (värdet för 1 μl radiomärkt 2dG *) dela CPM-värdet av TC20 med 20.
    3. För varje ampull beräknar du tHan uppskattar glukosupptagningen enligt följande:
      Ekvation
      OBS: R mäts i pmol / mg / min. Medelvärdet av R för brunnar 1 - 2 ger passiv transporthastighet, R p . Medelvärdet av R för brunnar 3-4 ger basalt total transporthastighet, R bt . Medelvärdet av R för brunnar 5-6 ger insulinstimulerad total transporthastighet, R det .
      1. Beräkna den basala aktiva transporthastigheten (R ba ) enligt följande:
        Ekvation
      2. Beräkna den insulinstimulerade aktiva transporthastigheten (R ia ) enligt följande:
        Ekvation
        OBS! I insulinreaktiva celler som myotubes representeras glukosupptagningshastigheter vanligen av tre värden: R ba , R ia och vikinsulinstimuleringen som R ia / R ba .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

På dag 3 når myoblaster sammanflödet ( Figur 1A ). Myoblasterna i detta skede är typiskt mononukleerade. Medium ändrades och på dag 8 fullbordades differentiering ( Figur 1B ) (protokoll avsnitt 2). Efter 5 dagars differentiering är myotubes inriktade och typiskt polynukleerade. Humana primära myotubes utsattes för en palmitat eller en BSA-enbart behandling före mätning av glukosupptagningshastighet. Celler inkuberades under 48 timmar med palmitat 0,5 mM i BSA (PALM) eller BSA ensam (BSA). Insulinstimulering utfördes (protokoll avsnitt 3) och upptag av glukos uppmättes (protokoll avsnitt 4). Figur 2 visar upptagningshastigheten för glukos i ett kontrolltillstånd (BSA) och ett behandlingsförhållande (PALM). Nonspecifik upptag kvantifieras i myotuber inkuberade med cytokalasin B. Basala och insulinstimulerade glukosupptagningshastigheter kan jämföras i BSA och PAL M villkor. Insulin ökar väsentligt glukostransporten i BSA-tillståndet (p <0,01). Insulinstimulerad glukosupptagningshastighet är signifikant lägre i myotubes behandlade med PALM (p <0,05). Vidare kan det humana myotubecellsvaret mot insulin också uttryckas som vikväxling. Figur 3 visar att responsen på insulin minskar i myotubes behandlade med PALM när det jämförs med kontroll (p <0,05).

Trots begränsad expression av GLUT4-protein i odlade myotubes kan primära muskelceller reagera på insulin med ökad glukosupptagning ( Figur 2 ). Den observerade genomsnittliga vikförändringen är ~ 1,3, liknande vad som beskrivits av andra grupper med humana muskelceller 6 , 7 , 10 , 26 ,> 27. Induktion av insulinresistens i muskelceller med mättad fettsyra beskrivs vanligen i mus-, rått- och humana muskelceller och har visat sig minska glukosupptagningen av behandlade muskelceller 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Vi utförde inkmitation av palmitat (0,5 mM) under 48 timmar och observerade en minskning av frekvensen av basal och insulinstimulerad glukosupptagning och en minskning av insulinsviktsändringen, vilket återspeglar insulinresistent tillstånd. Inkubationstiden som användes i detta manuskript har valts för att fullt ut visa den inhiberande effekten på glukosupptagning. Kortare inkubationstider kan också producera insulinresistens och minskad glukosupptagning 31 , 32 , 33 34 . Lägre och därmed mer fysiologiska koncentrationer kan användas in vitro , såväl som dosrespons och / eller tidskursförsök, och jämförelse med effekten av omättade fettsyror som oleat 29 , 35 .

Figur 1
Figur 1: In Vitro Primär Människa Myotubes. Bilder av humana myotubes vid 2 kulturstadier erhållna med användning av ett optiskt mikroskop visas. ( A ) Dag 3 av myoblastkultur vid sammanflöde. ( B ) På dag 8 (5 dagar av differentiering) är myotubes inriktade. Skalstång = 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.


Figur 2: Effekt av insulinstimulering vid upptagning av glukosupptag i humana myotubes under BSA och PALM-betingelser. Myotubes behandlades med BSA ensam eller 0,5 mM PALM i 48 timmar. Efter mediumförändring och 3 h serumutarmning mättes specifik glukosupptagningshastighet (i pmol / mg / min) i frånvaro (-) eller i närvaro (+) insulin (1 h, 100 nM). Data är medelvärde ± som av fyra oberoende experiment med användning av myotubes från fyra olika givare. #P <0,05 jämfört med basvärdet; * P <0,05 jämfört med BSA insulinstimuleringsvärde. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3
Figur 3: Vik INsulin-svaret i BSA och PALM-kulturbetingelserna. Förhållandet mellan insulin stimulerat på basal glukos transporthastighet i BSA och PALM förhållanden. Detta förhållande ger viktsockerupptagningshastigheten vid insulinstimulering (100 nM). * P <0,05 jämfört med BSA-tillståndet (n = 4). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glukosupptagning är en nyckelbiologisk mätning för att testa aktivatorer eller hämmare på cellodling och hur de påverkar glukosanvändningen och cellens förmåga att reagera på insulin. Metoden som beskrivs här har visat sig vara snabb och pålitlig och har använts i många studier med användning av primära myotuber från friska försökspersoner och / eller metaboliskt drabbade patienter 6 , 7 , 10 , 12 , 21 , 26 , 27 , 36 , 37 . Med endast en 6-brunnsplatta kan priser erhållas i duplikat för total basal transport, basal aktiv transport och insulinstimulerad aktiv transport. Dessa tre värden beskriver fullständigt insulinkänsligheten hos de in vitro odlade muskelcellerna.

2dG-blandning kan tillsättas till alla testade brunnar. För celllys kan volymen NaOH modifieras i enlighet med cellegenskaperna. När man arbetar med celler som innehåller höga halter av fettsyror, dvs för mycket viskösa lysater, kan volymen NaOH ökas upp till 1,5 ml.

Metoden använder radioaktivt märkt material som ökar känsligheten av mätningen, men kräver att protokollet utförs i kontrollerade områden. Material och avfall måste hanteras enligt lokala säkerhetsriktlinjer. För icke-utrustade laboratorier finns andra metoder för färgimetrisk och fluorescenskvantifiering 38 tillgängliga. I icke-radioaktiva analyser kan fluorescensintensitet mätas efter inkubering av cellerna med en fluorescerande D-glukosanalog 2- [ N- (7-nitrobens-2-oxa-l, 3-diazol-4-yl) amino] - 2-deoxi-D-glukos (2-NBDG). Med denna analog rapporterar vissa grupper att insulin förlorat sina fysiologiska effekter i L6-cellerAss = "xref"> 39, medan andra grupper visade att insulin fortfarande ökar glukosupptagningen (i mänskliga primära muskelceller) 38 . På grund av lågt GLUT4-uttryck reduceras kvantifiering av insulinstimulerad glukosupptagning i odlade muskelceller jämfört med in vivo- betingelserna 6 , 16 . Det är sålunda viktigt att ytterligare karakterisera insulinreaktivitet hos de odlade muskelcellerna genom andra tillvägagångssätt. Mätningar av fosforyleringsstatus för nyckelproteiner i insulinsignalvägen (som Akt / PKB och / eller GSK3) med användning av immundetektering kan användas 14 , 21 , 31 . På enzymatisk nivå kan glykogensyntes, glukos och / eller lipidoxidering också bedömas under betingelser med och utan insulin 14 , 26 , 31 . Någon annan cell L-typ (om det svarar på insulin eller inte) kan teoretiskt analyseras eftersom alla celler aktivt eller passivt kan absorbera glukos. De insulinstimulerade brunnarna kan således ersättas med någon annan lämplig behandling.

Användningen av mänsklig primär myotube innebär att muskelceller har nått ett differentieringsläge som överensstämmer med tillräckligt uttryck av GLUT4-protein. Om preparatet innehåller icke-muskelceller eller väsentligen myoblaster, kommer glukosupptagningsvärdena i insulinstimuleringsförhållandet inte att skilja sig från basaltillståndet (R ia mot R ba ), främst beroende på övervägande av GLUT1-transportör.

Insulin kan sättas till det primära muskelcellodlingsmediet för att främja och förbättra muskelcellsproliferation och differentiering. Likväl har insulin också visat sig inducera insulinresistens vid kronisk stimulering 40 , 41 ,Class = "xref"> 42. I våra experiment, skiljer sig mänskliga primära muskelceller endast på medellång förändring med reducerat serum. Vi föredrar sålunda inte att tillsätta externt insulin under odling för att bevara cellerna från kronisk stimulering före bedömning av insulinreaktivitet. Slutligen kräver metoden flera tvättsteg. Därför måste man se till att inte lossna celler från plattan, eftersom det kan hända med primära celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Författarna bekräftar Anne Charrié vid Radiobiology-tjänsten (Lyon-Sud sjukhus) och Fond National Suisse (FNS) för deras ekonomiska stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human primary muscle cell In house preparation from human skeletal muscle biopsies In house preparation from human skeletal muscle biopsies If not available, use commercial source
Human primary muscle cell Promocell C-12530 Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plate Corning 356400 BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10 Dutscher L0145-500 1 g/L glucose
Glutamine Dutscher X0551-100
penicilin/streptomycin 100x Thermo fisher scientific 15140122
Serum substitute UltroserG Pall France 15950.017 serum substitute in text
DMEM low glucose Dutscher L0064-500 1 g/L glucose
Fetal Calf Serum Eurobio CVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Dutscher L0625-500 Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278
2-deoxy-D-glucose  Sigma-Aldrich D6134
Albumin bovine euromedex 04-100-812-E
fatty acid-free BSA Roche 10,775,835,001
palmitate Sigma-Aldrich P0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] PerkinElmer NET328A001MC Specific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq
Cytochalasin B Sigma-Aldrich c2743
PICO PRIAS VIAL 6 mL PerkinElmer 6000192
ultima gold MW CA  PerkinElmer 6013159 scintillation liquid
bêta counter  PerkinElmer 2900TR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38, (6), 389-402 (2006).
  2. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237, (3), E214-E223 (1979).
  3. Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique. Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).
  4. Heise, T., et al. Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it. Diabetes Obes Metab. 18, (10), 962-972 (2016).
  5. Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro. Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).
  6. Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin. J Clin Invest. 90, (4), 1386-1395 (1992).
  7. Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture. Biochem Cell Biol. 68, (2), 536-542 (1990).
  8. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiol Rev. 93, (3), 993-1017 (2013).
  9. Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. Apmis. 109, (11), 735-744 (2001).
  10. Bouzakri, K., et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes. Diabetes. 52, (6), 1319-1325 (2003).
  11. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7, (6), e39657 (2012).
  12. Jackson, S., et al. Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families. Diabetes. 49, (7), 1169-1177 (2000).
  13. Aas, V., et al. Are cultured human myotubes far from home? Cell Tissue Res. 354, (3), 671-682 (2013).
  14. Bakke, S. S., et al. Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects. PLoS One. 10, (3), e0119556 (2015).
  15. Stuart, C. A., et al. Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291, (5), E1067-E1073 (2006).
  16. Al-Khalili, L., et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell Mol Life Sci. 60, (5), 991-998 (2003).
  17. Tsuka, S., et al. Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin. Biochem Biophys Res Commun. 459, (3), 437-442 (2015).
  18. Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin. Bull Exp Biol Med. 159, (4), 463-465 (2015).
  19. Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 374, (1), 117-122 (2008).
  20. Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia. 49, (12), 3027-3037 (2006).
  21. Gastebois, C., et al. Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance. Physiol Rep. 4, (17), (2016).
  22. Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation. Appl Physiol Nutr Metab. 40, (4), 407-413 (2015).
  23. Feng, Y. Z., et al. PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference. Arch Physiol Biochem. 120, (1), 12-21 (2014).
  24. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4, (11), 834-845 (2015).
  25. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  26. Bouzakri, K., et al. Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle. Diabetes. 57, (6), 1508-1516 (2008).
  27. Shemyakin, A., et al. Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro. Diabetes. 60, (8), 2061-2067 (2011).
  28. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293, (3), E783-E793 (2007).
  29. Coll, T., et al. Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells. J Biol Chem. 283, (17), 11107-11116 (2008).
  30. Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes. Diabetes. 54, (3), 648-656 (2005).
  31. Hage Hassan, R., et al. Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells. Diabetologia. 55, (1), 204-214 (2012).
  32. Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 460, (4), 977-982 (2015).
  33. Hommelberg, P. P., et al. Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation. Cell Mol Life Sci. 68, (7), 1215-1225 (2011).
  34. Yang, M., et al. Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes. Lipids Health Dis. 12, 104 (2013).
  35. Peng, G., et al. Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle. Endocrinology. 152, (6), 2206-2218 (2011).
  36. Lambernd, S., et al. Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways. Diabetologia. 55, (4), 1128-1139 (2012).
  37. Nikolic, N., et al. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise. PLoS One. 7, (3), e33203 (2012).
  38. Hsu, F. L., et al. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes. 62, (2), 628-638 (2013).
  39. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64, (3), 207-215 (2005).
  40. Catalano, K. J., et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS One. 9, (9), e108693 (2014).
  41. Liu, H. Y., et al. Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284, (40), 27090-27100 (2009).
  42. Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes. Metabolism. 56, (2), 190-198 (2007).
Uppmätt mätning av glukos och reaktion på insulinstimulering i<em&gt; In Vitro</em&gt; Odlade humana primära myotubes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).More

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter