Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Glikoz Alımı Ölçümü ve İnsülin Uyarıcısına Yanıt doi: 10.3791/55743 Published: June 25, 2017

Summary

Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklı miyotüpler elde edilir ve glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2-deoksi-D-Glikoz kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.

Abstract

İskelet kası, memelilerdeki en büyük glikoz mevduat ve büyük ölçüde glikoz homeostazına katkıda bulunur. Kas glikoz metabolizmasını araştırmaya ve metabolik değişiklikleri karakterize etme amaçlı tüm çalışmalar için kas hücrelerinin insülin duyarlılığının değerlendirilmesi büyük önem taşımaktadır. Kas hücrelerinde, glukoz taşıyıcı tip 4 (GLUT4) proteinleri, insüline tepki olarak plazma membranına translokasyon yapar, böylece hücrenin içine glükoz girmesini sağlar. Kas hücrelerinin glikoz alım oranını arttırarak insüline cevap verme yeteneği, insüline karşı kas hücrelerinin duyarlılığını ölçmek için standart okumalardan biridir. İnsan primer miyotları, in vitro model olarak uygundur, çünkü hücreler insülin duyarlılığı da dahil olmak üzere verici fenotipin birçok özelliğini korurlar. Bu in vitro model de insülin yanıt vermeyi etkileyebilecek herhangi bir bileşiğin testi için uygundur. Farklı miyotlarda glikoz alım hızı ölçümleriInsülin duyarlılığı.

Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklılaşmış miyotlar elde edilir ve insülin stimülasyonu olan ve olmayan glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [3H] 2-deoksi-D-Glukoz ([3H] 2dG) kullanılarak pasif ve aktif glikoz taşınım oranlarını belirlemek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Hesaplama yöntemleri, aktif bazal ve insülin tarafından uyarılan hızların yanı sıra stimülasyon katının miktarını belirlemek için sağlanır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İskelet kası, memelilerdeki en büyük glikoz mevduat ve büyük ölçüde glikoz homeostazına katkıda bulunur. Bu insülin yanıt veren doku, insülin stimülasyonu 1 tarafından tetiklenen glikoz alımının birincil bölgesidir.

Tip 2 diyabette, iskelet kası da dahil olmak üzere çeşitli dokularda insülin direnci gözlenir ve normal kan şekeri konsantrasyonunun üstünde seyreder. Bu nedenle, bir öznedeki bir kusurun karakterize edilmesine mi yoksa iyileştirmek isteyen bir tedavinin verimliliğini değerlendirmeye mi götürmesi gerektiği gibi, bu dokunun ve hücrelerinin insülin duyarlılığının seviyesinin belirlenmesi büyük önem taşır. Insan ya da hayvan konularda, insülin duyarlılığını değerlendirmek için altın standart tekniği, hiperinsülinemik-öglisemik klipstir. DeFronzo tarafından 1979 2'de tanıtıldı ve 3 , 4'den sonra değiştirildi, yöntem tüm vücudu a veDokular insülin tepkisi, normal kan şekeri konsantrasyonunu korumak için insülin uyarımı altında perfüze edilecek glikoz oranı olarak ölçülmüştür.

İnsülin duyarlılığı araştırması, in vitro kas modelleri kullanılarak hücre seviyesinde de yapılabilir ve glikoz alım oranlarının ölçümü, hücrenin insülin stimülasyonuna biyolojik tepkisini ölçmek için etkin ve güvenilir bir araç olarak kalır 5 , 6 , 7 . Aslında, glikoz alım ölçümleri, insülin reseptörüne bağlanmasından, GLUT4 zenginleştirilmiş vezikülleri translokasyonuna kadar ve hücre içi sinyalizasyon ve fosforilasyon kaskadları dahil olmak üzere, insülin stimülasyonuna verilen hücre biyolojik tepkisini niceleştirir.

Farklılaşmış miyotlar, verici fenotipin metabolik özellikleri de dahil olmak üzere pek çok özelliğini muhafaza ettiği için insan numuneleri ile büyük ilgi görüyor.Hastalarda görülen bozukluklar ve bozukluklar 9 , 10 , 11 , 12 . Miyotüpler, glikoz taşıyıcıları 15 ve hücresel insülin sinyalleme makineleri 16'nın ekspresyonu dahil olmak üzere iskelet kasına 13 , 14 yapısal, metabolik ve fenotipik benzerlikler gösterir. Bu nedenle, primer miyotlarda glikoz alımı ölçümü, bir donörün kas fenotipinin karakterize edilmesi veya bir müdahalenin (ilaç, beslenme veya fiziksel aktivite) kas hücresindeki insülin duyarlılığı üzerindeki etkisinin araştırılması ile ilgilidir.

Kültürlenmiş miyotlarda glikoz alımı ölçümü, insülin duyarlılığını değiştiren deneyler yaparken güvenilir bir araçtır17,18. In vitro 19 , 20 , 21 , 22 , 23 engelleyebilen veya tersine döndürebilen herhangi bir bileşiğin testi için uygundur.

Burada insan miyotlarını kültürlemek ve ayırmak ve hücre glikoz alım hızlarını ölçmek için ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Bu yöntem, laboratuvar ortamındaki preparatlardan, işbirliğinden ya da piyasada bulunan tedarikçilerden gelmiş olmasına rağmen, insan kas öncül hücrelerinin herhangi bir kaynağına uygulanabilir. Fare ve sıçan kökenli sırasıyla C2C12 ve L6 gibi ölümsüzleştirilmiş kas hücre çizgileri, bu protokolle glikoz alım ölçümleri için de kullanılabilir 7 .

Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2dG'yi kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. TEtiketli bir glikoz analoğunun kullanılması, birincil hücrelerle çalışıldığında ortak bir koşul olan indirgenmiş başlangıç ​​materyali ile glikoz girişinin doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Modifiye glikoz molekülü, metabolik yollara giremiyor ve böylece hücre içinde birikiyor ve toplam hücre radyoaktivitesi aracılığıyla güvenilir bir şekilde ölçülebiliyor. Deneysel koşullar arasında bir glikoz transport inhibitörü (sitokalasin B) kullanımı yer alır ve ölçümler insülin ile veya insülinsiz yapılır. Bu kombinasyon, glukoz aktif giriş hızlarının belirlenmesine ve insülin tepki indeksi için kat değişikliğinin hesaplanmasına izin verir. Yöntem tek bir kuluçka süresi boyunca bir doz insülin ile sunulur, ancak protokol doz yanıtı ya da zaman dersi deneyleri için kolayca modifiye edilebilir 12 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Hücre Kültürü Ortamlarının ve Çözümlerinin Hazırlanması

  1. Kültür ortamının hazırlanması
    1. Ham'in F-10 ortamını glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (5 μg / mL final),% 2 Fetal Buzağı Serumu (FCS) ve% 2 serum replasmanı ile takviye ederek çoğalma ortamı hazırlayın.
    2. Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (5 μg / mL son) ve% 2 FCS ile takviye ederek farklılaşma ortamı (DM) hazırlayın.
  2. Glikoz alım çözümlerinin hazırlanması
    Dikkat: Radyoaktif maddenin taşınmasına yalnızca sınırlı ve kontrollü bir alanda yetkili personel tarafından izin verilmektedir. Malzeme ve atıklar, uygun prosedürlere, kılavuzlara ve yerel mevzuata uygun olarak ele alınmalıdır.
    1. X-Dulbecco fosfat tamponlu salin (X-DPBS) hazırlamak için,% 0.2 (w / v) (son konsantrasyon) sığır serumu alb içeren bir DPBS solüsyonu hazırlayınUmin (BSA). Çözeltiyi 0.2 um'lik bir filtreden geçirin. 4 ° C'de saklayın.
    2. Soğuk 2-deoksi-D-glikoz (2dG) solüsyonu hazırlamak için 16.4 mg 2dG'yi tartın ve 10 mM'lik bir çözelti elde etmek için 10 mL damıtılmış suda çözünürleştirin. 4 ° C'de saklayın.
    3. Radyoaktif olarak işaretlenmiş 2dG (2dG *) çözeltiyi elde etmek için 600 μL soğuk 2dG ve 6 μL radyoaktif işaretlenmiş [3H] 2dG'yi 5400 μL X-DPBS'ye ekleyin.
      NOT: Nihai konsantrasyon 1 mM 2dG'dir ve etiketleme 1 mcC / mL'dir.
      1. Radyoaktif olarak işaretlenmiş 2dG * solüsyonundan 20 μL'lik bir alikot (TC20) ayırın.
  3. Kuluçka karışımlarının hazırlanması
    1. Sitokalasin B karışımı için, 2 mL radiolabeled 2dG * solüsyonuna 2 mcL 20 mM sitokalazin B ilave edin.
      NOT: Sitokalasin B stok solüsyonu dimetil sülfoksid (DMSO) içinde 10 mg / mL'dir.
    2. DMSO karışımı için kalan 4 mL radyoaktif işaretlenmiş 2dG * çözeltisine 4 uL DMSO ekleyin.

    2. İnsan Primer Kas Hücrelerinin Kültürü

    1. İnsan kaslı uydu hücreleriyle 6 oyuklu plakaların tohumlanması
      NOT: Dondurulmuş bir flakondan (250.000 hücre içeren) ticari olarak temin edilebilen insan kaslı uydu hücrelerini şirket içinde kullanın (bkz. Referans 24 ). Tek bir durumda glikoz alımının ölçümü için gerekli olan bir 6 kuyulu plaka elde etmek için aşağıdaki prosedür 250,000 hücre için verilmiştir.
      1. İçinde 24 bulunan donmuş flakonları veya önceden hazırlanmış ılık suda (37 ° C) insan kas uydu hücrelerinin ticari preparatlarını flakona sadece küçük bir buz bloğu kalana kadar hızla çözdürür.
      2. Doğrudan 10 mL önceden ısıtılmış (37 ° C) PM içeren 50 mL'lik bir plastik tüp içine dökün.
      3. 500 xg'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
      4. Hücre pelletini, önceden ısıtılmış PM'nin 18 mL'si ile hafifçe tekrar süspanse edin (her biri 42.000 hücre elde etmek için3 mL orta). 6 oyuklu bir plakanın (9.6 cm2) her oyuğuna 3 mL dağıtın.
        NOT: Bir plakanın altı ayrı oyuğu, pasif nakil inhibisyonu (kuyucuk 1 ve 2), bazal hız (kuyu 3 ve 4) ve insülinle uyarılan hız (kuyular 5 ve 6). Farklı tedavilere ihtiyaç duyulduğundan altı kuyucuklu plakaları tekrarlayın.
      5. Hücreler% 90 konfluansa erişene kadar standart kültür koşullarında (37 ° C,% 5 CO2) inkübe edin.
        NOT: Bu adım, hücre partisine bağlı olarak 48 - 72 saat arasında sürer. Bu adımda orta maddeyi değiştirmeyin.
    2. Kas hücrelerinin farklılaşması
      1. PM'yi alın (48-72 saat sonra) ve önceden ısıtılmış DM (kuyucuk başına 3 mL) ile değiştirin. 37 ° C'de,% 5 C02'de inkübe edin.
        NOT: Farklılaşma, hücrelerin hizalanması ve polinükleer hale getirildiği istikrarlı bir duruma erişmek için beş gün sürer. Tipik olarak birincilMiyotüpler, 1 g / L glikoz ortamında kültürlenir. Bu nedenle, kültür esnasında şeker tükenmesini önlemek için, yeterli glikoz substratının her zaman hücreler için mevcut olduğundan emin olmak için plakayı 3 mL ortam ile doldurun.
      2. DM ortamını iki günde bir değiştirin.
        NOT: Bu noktadan itibaren, miyotüpler önemli bir değişiklik olmaksızın 7 gün boyunca kararlıdır ve glikoz alım ölçümleri her an yapılabilir.
    3. Kas hücresi tedavisi (opsiyonel)
      NOT: Birincil miyotürler, insülin uyarımı ve glikoz alım ölçümlerinden önce modifikasyon (uyuşturucu testi, sinyal yolunun inhibitörleri / aktivatörleri vs. ) uyandırmak için birkaç gün tedavi edilebilir. Kas hücreleri insülin hassasiyetini etkileyebilecek her tedaviye tabi tutulabilir ve glikoz alım ölçümleri bu etkiyi nicelleştirir. Örneğin, kas hücrelerinin doymuş yağlı asit palmitat ile kuluçkalanması insülin direncini arttırır ve hücreler azaltılmış iNsulin, glikoz alımını uyarmıştır.
      1. % 10 BSA (yağ asidi içermeyen) ve 0.5 mL palmitat (PALM) ile desteklenmiş 12 mL DM hazırlayın. Sadece% 10 BSA (yağ asidi içermeyen) ile desteklenmiş 12 mL DM hazırlayın.
      2. İnsan primer miyotları ile iki 6 oyuklu levha hazırlayın ve bölümler 2.1 ve 2.2'de (5 günlük farklılaşma ile) açıklandığı gibi kültürleyin.
      3. 5. günde, her oyuğu 2 mL PBS ile yıkayın. Bir tabağa, PALM içeren 2 mL DM ekleyin. Diğer plakaya yalnızca DM içeren 2 mL BSA ilave edin.
      4. 48 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 C02'de inkübe edin.

    3. İnsülin Uyarımı

    1. Farklılaşmış kas hücrelerini iki kez 2 mL PBS ile yıkayın.
    2. PBS'yi dikkatlice çıkarın ve serum tükenmesi için 3 saat boyunca (37 ° C,% 5 CO 2 ) FCS içermeyen 3 mL DM ile inkübe edin.
    3. Tüm kuyularda bulunan ortamları FCS içermeyen 3 mL DM ile değiştirin. Kuyu 5 ve 6'ya 100 nM insülin ekleyin.
    4. Için insan miyotüp kültürü kuluçkalayın1 saat (37 ° C,% 5 C02).

    4. Glikoz Alımı

    1. 1 saatlik insülin stimülasyonundan sonra, oyukları X-DPBS ile yıkayın (yıkama başına 1 mL).
    2. 1 mL sitokalazin B karışımı kuyu 1 ve 2'ye ve 1 mL DMSO karışımı çukurlara 3 - 6 ekleyin. 15 dakika inkübe edin (37 ° C,% 5 CO 2 ). Kuluçka işleminin sonunda, plakayı derhal buzda bekletin.

    5. Hücre Lizizi

    1. Hücreleri 1 mL buz soğukluğundaki PBS ile iki kez yıkayın.
    2. Hücreleri, 600 uL 50 mM NaOH ile her oyukta Lyse. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve yavaş yavaş yörünge dönüşü ile karıştırın.
      NOT: Lizat çok yapışkan ise, 1.5 mL NaOH ile seyreltin.
    3. Bir pipet kullanarak, tekrar askıda bırakın ve hücre lizatını toplamayın.

    6. Radyolabellenmiş Glikoz Tayini

    1. Bir sıvı sintilasyon sayma flakonda her bir hücre lizatı 400 mcL koyun. 400 ile negatif kontrol flakonu hazırlayın50 mM NaOH'nin 50 uL'si ve 20 uL TC20 ile pozitif bir kontrol şişesi (basamak 1.2.3.1'den).
    2. Her flakona 4 mL sıvı sintilasyon solüsyonu ilave edin. Kapağı kapatın ve her şişeyi iyice karıştırın (1-2 s).
    3. Her şişeyi bir sıvı sintilasyon sayacına yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre radyoaktiviteyi ölçün. Her sintilasyon flakonu için 10 dk için dakika başına rekor (BGBM) kaydedin.
      NOT: CPM = "dakika başına parçalanma" x "sayım verimliliği".

    7. Glikoz Alım Oranı

    1. Kalan lizatı (200 uL, adım 5.2'den itibaren) protein konsantrasyonunu ölçmek için kullanın. Her hücre lizatının protein konsantrasyonunu Bradford 25 veya eşdeğer bir yöntem kullanarak belirleyin. Her kuyu için toplam protein miktarını (Q) mg cinsinden hesaplayın.
    2. TC1 (1 μL radyoaktif işaretli 2dG * değeri) elde etmek için, TC20'nin BGBM değerini 20'ye bölün.
    3. Her şişe için tGlikoz alımı oranı şu şekildedir:
      Denklem
      NOT: R, pmol / mg / dak olarak ölçülür. Kuyular 1 - 2 için R ortalaması, pasif nakliye oranını, R p'yi verir . 3-4 kuyu için R ortalaması, bazal toplam nakliye oranını, Rbt'yi verir . Kuyular 5-6 için R değeri, insülinle uyarılan toplam nakil oranını verir, R it .
      1. Bazal aktif nakil oranını (R ba ) aşağıdaki gibi hesaplayın:
        Denklem
      2. İnsülin ile uyarılan aktif aktarım hızını ( Rıa ) aşağıdaki gibi hesaplayın:
        Denklem
        NOT: Miyotüpler gibi insüline duyarlı hücrelerde, glikoz alım hızı genellikle üç değerle temsil edilir: R ba , Rıa ve kat insülin uyarımı Rıa / R ba olarak .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

3. günde miyoblastlar konfluansa ulaşır ( Şekil 1A ). Bu aşamadaki miyoblastlar tipik olarak mononükleotiddir. Ortam değiştirildi ve 8. günde farklılaşma tamamlandı ( Şekil 1B ) (protokol bölümü 2). 5 gün farklılaştıktan sonra, miyotlar hizalanır ve tipik olarak polinükleere edilir. İnsan primer miyotları, glikoz alım hızı ölçümünden önce bir palmitat veya bir BSA'ya uygulanmıştır. Hücreler, BSA (PALM) veya BSA tek başına (BSA) içinde 0.5 mM palmitat ile 48 saat inkübe edildi. İnsülin uyarıldı (protokol bölümü 3) ve glikoz alımı ölçüldü (protokol bölümü 4). Şekil 2 , bir kontrol koşulunda (BSA) ve bir tedavi koşulunda (PALM) glukoz alım hızını göstermektedir. Sitokalasin B ile inkübe edilen miyotüplerde spesifik olmayan alım miktarı ölçülmüştür. Bazal ve insülinle uyarılan glukoz alım hızı BSA ve PAL'de karşılaştırılabilir M koşulları. İnsülin, BSA durumunda glikoz taşınımını önemli ölçüde arttırır (p <0.01). PALM ile tedavi edilen miyotüplerde insülinle uyarılan glikoz alım hızı önemli ölçüde düşüktür (p <0.05). Dahası, insan miyotüp hücresi insüline tepki de kat değişikliği olarak ifade edilebilir. Şekil 3 , kontrolle karşılaştırıldığında PALM ile tedavi edilen miyotüplerde insülin yanıtının azaldığını göstermektedir (p <0.05).

Kültürlenmiş miyotlarda sınırlı miktarda GLUT4 proteininin sentezlenmesine rağmen, birincil kas hücreleri glikoz alımında bir artış ile insüline cevap verebilir ( Şekil 2 ). Gözlemlenen ortalama kat değişikliği, insan kas hücreleri 6 , 7 , 10 , 26 , ve 26 ile diğer gruplar tarafından tarif edilenle benzer şekilde ~ 1.3'tür.> 27. Kas hücrelerinde doymuş yağ asidi ile insülin direncinin indüksiyonu yaygın olarak fare, sıçan ve insan kas hücrelerinde tanımlanır ve 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 nolu muamele edilmiş kas hücrelerindeki glikoz alımını azalttığı gösterilmiştir. 48 saat süreyle palmitat (0.5 mM) kuluçkalamayı gerçekleştirdik ve insülin dirençli durumunu yansıtan, bazal ve insülinle uyarılan glikoz alım hızında bir azalma ve insülin kat değişmesinde bir düşüş gözlemledik. Bu yazıda kullanılan kuluçka süresi, glikoz alımı üzerindeki engelleyici etkiyi tam olarak gösterecek şekilde seçilmiştir. Daha kısa inkübasyon süreleri insülin direnci ve azaltılmış glikoz alımını da sağlayabilir 31 , 32 , 33 34 , 34 . Düşük ve dolayısıyla daha fazla fizyolojik konsantrasyonlar, in vitro olarak yanı sıra doz yanıtı ve / veya zaman dersi deneyleri ve oleat 29 , 35 gibi doymamış yağ asitlerinin etkisi ile karşılaştırma yapılabilir.

Şekil 1
Şekil 1: İn vitro Primer İnsan Miyotları. Optik mikroskop kullanılarak elde edilen 2 aşamalı kültürde insan miyotlarının görüntüleri gösterilmektedir. ( A ) 3. gün miyoblast kültürünün birleştiği yerde. ( B ) 8. günde (farklılaşmanın 5 günü), miyotlar hizalanır. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.


Şekil 2: İnsan Miyotlarında BSA ve PALM Koşullarında Glikoz Alım Hızı Üzerindeki İnsülin Uyarımının Etkisi. Myotublara 48 saat süreyle tek başına BSA veya 0.5 mM PALM ile muamele edildi. Orta değişim ve 3 saatlik serum tükenmesinden sonra, insülinin (1 saatlik, 100 nM) yokluğunda (-) veya varlığında (+) belirli glikoz alım hızı (pmol / mg / dakika cinsinden) ölçülmüştür. Veriler, dört farklı verenden alınan miyotüpleri kullanarak dört bağımsız deneyin ortalama ± sem'idir. #P <0.05 bazal değere kıyasla; * BSA insülin stimülasyon değeri ile karşılaştırıldığında P <0.05. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3
Şekil 3: Katlama IBSA ve PALM Kültür Koşullarında Nsulin Yanıt. BSA ve PALM koşullarında bazal glikoz taşınım hızı üzerinde uyarılan insülin oranı. Bu oran, insülin uyarımı üzerine (100 nM) kat glikoz alım oranını verir. BSA durumuna kıyasla * P <0.05 (n = 4). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glukoz alımı, hücre kültürü üzerindeki aktivatörleri veya inhibitörleri test etmek için önemli biyolojik bir ölçümdür ve glikoz kullanımını nasıl etkilediği ve hücrenin insüline cevap verme yeteneği. Burada açıklanan yöntemin hızlı ve güvenilir olduğu gösterilmiştir ve sağlıklı kişilerden ve / veya metabolik olarak etkilenen hastalardan alınan primer miyotları kullanan birçok çalışmada yaygın olarak kullanılmaktadır 6,7,10,12,21,26,27,36,37. Sadece bir 6 kuyucuklu plaka ile, toplam bazal nakil, bazal aktif nakliye ve insülin ile uyarılmış aktif nakliye için çiftler halinde oranlar elde edilebilir. Bu üç değer, in vitro kültürlenmiş kas hücrelerinin insülin duyarlılığını tam olarak tanımlar.

2dG karışım test edilmiş bütün kuyucuklara ilave edilebilir. Hücre lizisi için, NaOH hacmi hücre özelliklerine göre modifiye edilebilir. Yüksek seviyede yağ asidi içeren hücrelerle çalışırken, yani çok yapışkan lizatlar için NaOH hacmi 1,5 mL'ye kadar arttırılabilir.

Yöntem, ölçüm hassasiyetini artıran, ancak protokolün kontrollü alanlarda uygulanmasını gerektiren radyoaktif işaretli materyali kullanır. Malzemeler ve atıklar, yerel güvenlik kurallarına uygun olarak ele alınmalıdır. Donuk olmayan laboratuarlar için, diğer kolorimetrik ve flüoresans kantifikasyonu 38 yöntem mevcuttur. Radyoaktif olmayan deneylerde flüoresan yoğunluğu, hücrelerin bir fluoresan D-glikoz analoğu 2- [ N- (7-nitrobenz-2-oksa-l, 3-diazol-4-il) amino] - 2-deoksi-D-glükoz (2-NBDG). Bu analog ile bazı gruplar, insülinin L6 hücrelerindeki fizyolojik etkilerini kaybettiğini bildirmiştirDiğer gruplar insülinin hala (insan primer kas hücrelerinde) glikoz alımını arttırdığını gösterdi ( 38) . Düşük GLUT4 ekspresyonundan ötürü, kültürlenmiş kas hücrelerinde insülin ile uyarılan glikoz alımının nicelemesi, 6 , 16 nolu in vivo koşullara kıyasla azaltılır. Kültürlü kas hücrelerinin insülin tepkisini başka yaklaşımlarla daha da tanımlamak önemlidir. İnsülin sinyalleme yolağının (Akt / PKB ve / veya GSK3 gibi) anahtar proteinlerin fosforilasyon durumunun immüno-saptama kullanılarak ölçülmesi, 14 , 21 , 31 kullanılabilir . Enzimatik seviyede, glikojen sentezi, glukoz ve / veya lipid oksidasyonu, insülin 14,26,31 olan ve olmayan koşullarda da değerlendirilebilir. Başka herhangi bir cel L tipi (insüline cevap verip vermesin) teorik olarak analiz edilebilir, çünkü tüm hücreler aktif veya pasif glukoz alabilirler. Bu nedenle, insülin uyarıcı kuyular, herhangi bir başka uygun tedavi ile değiştirilebilir.

İnsan primer miyotürünün kullanılması, kas hücrelerinin GLUT4 proteininin yeterli ekspresyonu ile tutarlı bir farklılaşma durumuna geldiğini ima eder. Eğer preparat kas hücreleri ya da esasen miyoblastlar içeriyorsa, esasen GLUT1 nakil aracının baskınlığından dolayı, insülin uyarımı koşulundaki glikoz alım değerleri bazal durumdan (Rıa'ya karşı R ba ) farklı olmayacaktır.

Kas hücresi çoğalmasını ve farklılaşmasını teşvik etmek ve arttırmak için insülin, birincil kas hücre kültürü ortamına ilave edilebilir. Yine de insülinin, kronik uyarıda insülin direnci indüklediği gösterilmiştir 40 , 41 ,Class = "xref"> 42. Denemelerimizde, insan birincil kas hücreleri, yalnızca orta derecede azalmış serum ile değişime uğradıkça ayırt eder. Bu nedenle insülin yanıt verme yeteneğinin değerlendirilmesinden önce hücreleri kronik uyarıdan korumak için kültür esnasında harici insülin eklememeyi tercih ederiz. Son olarak, yöntem birkaç yıkama aşaması gerektirir. Bu nedenle, birincil hücrelerle olabileceği için hücreleri plakadan ayırmamaya özen gösterilmelidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Yazarlar, Radiobiyoloji servisindeki (Lyon-Sud hastanesi) Anne Charrié'yi ve maddi desteklerinden dolayı Fond National Suisse'yi (FNS) onaylarlar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human primary muscle cell In house preparation from human skeletal muscle biopsies In house preparation from human skeletal muscle biopsies If not available, use commercial source
Human primary muscle cell Promocell C-12530 Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plate Corning 356400 BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10 Dutscher L0145-500 1 g/L glucose
Glutamine Dutscher X0551-100
penicilin/streptomycin 100x Thermo fisher scientific 15140122
Serum substitute UltroserG Pall France 15950.017 serum substitute in text
DMEM low glucose Dutscher L0064-500 1 g/L glucose
Fetal Calf Serum Eurobio CVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Dutscher L0625-500 Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278
2-deoxy-D-glucose  Sigma-Aldrich D6134
Albumin bovine euromedex 04-100-812-E
fatty acid-free BSA Roche 10,775,835,001
palmitate Sigma-Aldrich P0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] PerkinElmer NET328A001MC Specific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq
Cytochalasin B Sigma-Aldrich c2743
PICO PRIAS VIAL 6 mL PerkinElmer 6000192
ultima gold MW CA  PerkinElmer 6013159 scintillation liquid
bêta counter  PerkinElmer 2900TR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38, (6), 389-402 (2006).
  2. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237, (3), E214-E223 (1979).
  3. Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique. Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).
  4. Heise, T., et al. Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it. Diabetes Obes Metab. 18, (10), 962-972 (2016).
  5. Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro. Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).
  6. Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin. J Clin Invest. 90, (4), 1386-1395 (1992).
  7. Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture. Biochem Cell Biol. 68, (2), 536-542 (1990).
  8. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiol Rev. 93, (3), 993-1017 (2013).
  9. Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. Apmis. 109, (11), 735-744 (2001).
  10. Bouzakri, K., et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes. Diabetes. 52, (6), 1319-1325 (2003).
  11. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7, (6), e39657 (2012).
  12. Jackson, S., et al. Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families. Diabetes. 49, (7), 1169-1177 (2000).
  13. Aas, V., et al. Are cultured human myotubes far from home? Cell Tissue Res. 354, (3), 671-682 (2013).
  14. Bakke, S. S., et al. Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects. PLoS One. 10, (3), e0119556 (2015).
  15. Stuart, C. A., et al. Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291, (5), E1067-E1073 (2006).
  16. Al-Khalili, L., et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell Mol Life Sci. 60, (5), 991-998 (2003).
  17. Tsuka, S., et al. Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin. Biochem Biophys Res Commun. 459, (3), 437-442 (2015).
  18. Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin. Bull Exp Biol Med. 159, (4), 463-465 (2015).
  19. Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 374, (1), 117-122 (2008).
  20. Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia. 49, (12), 3027-3037 (2006).
  21. Gastebois, C., et al. Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance. Physiol Rep. 4, (17), (2016).
  22. Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation. Appl Physiol Nutr Metab. 40, (4), 407-413 (2015).
  23. Feng, Y. Z., et al. PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference. Arch Physiol Biochem. 120, (1), 12-21 (2014).
  24. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4, (11), 834-845 (2015).
  25. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  26. Bouzakri, K., et al. Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle. Diabetes. 57, (6), 1508-1516 (2008).
  27. Shemyakin, A., et al. Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro. Diabetes. 60, (8), 2061-2067 (2011).
  28. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293, (3), E783-E793 (2007).
  29. Coll, T., et al. Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells. J Biol Chem. 283, (17), 11107-11116 (2008).
  30. Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes. Diabetes. 54, (3), 648-656 (2005).
  31. Hage Hassan, R., et al. Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells. Diabetologia. 55, (1), 204-214 (2012).
  32. Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 460, (4), 977-982 (2015).
  33. Hommelberg, P. P., et al. Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation. Cell Mol Life Sci. 68, (7), 1215-1225 (2011).
  34. Yang, M., et al. Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes. Lipids Health Dis. 12, 104 (2013).
  35. Peng, G., et al. Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle. Endocrinology. 152, (6), 2206-2218 (2011).
  36. Lambernd, S., et al. Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways. Diabetologia. 55, (4), 1128-1139 (2012).
  37. Nikolic, N., et al. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise. PLoS One. 7, (3), e33203 (2012).
  38. Hsu, F. L., et al. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes. 62, (2), 628-638 (2013).
  39. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64, (3), 207-215 (2005).
  40. Catalano, K. J., et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS One. 9, (9), e108693 (2014).
  41. Liu, H. Y., et al. Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284, (40), 27090-27100 (2009).
  42. Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes. Metabolism. 56, (2), 190-198 (2007).
Glikoz Alımı Ölçümü ve İnsülin Uyarıcısına Yanıt<em&gt; In vitro</em&gt; Kültürlü İnsan Primer Miyotları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).More

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter