Summary
我们报告两个细胞同步协议，提供一个上下文，用于研究与细胞周期的特定阶段相关的事件。我们表明，这种方法可用于分析未受扰动细胞周期中特定基因的调节，或暴露于影响细胞周期的试剂。
Abstract
细胞周期的基因表达程序代表了解细胞周期依赖性过程及其在疾病如癌症中的作用的关键步骤。细胞周期调节基因表达分析取决于细胞同步到特定阶段。在这里，我们描述了一种利用两种互补同步协议的方法，通常用于研究细胞周期中基因表达的周期性变化。两种方法均基于在一个限定点瞬时阻断细胞周期。羟基脲（HU）治疗的同步方案导致晚期G1 /早期S期的细胞停滞，并且从HU介导的停止释放提供通过S和G2 / M均匀进展的细胞群体。通过胸苷和诺考达唑（Thy-Noc）治疗的同步方案阻止早期有丝分裂中的细胞，并从Thy-Noc介导的停止释放提供了适合于G1期和S期的同步细胞群体尝试学习。两种方法的应用都需要监测细胞周期分布特征，这通常在细胞碘化丙啶（PI）染色后进行，流式细胞仪介导的DNA含量分析。我们表明，两个同步协议的组合使用是一种可靠的方法来清楚地确定在细胞周期中差异调节的基因（ 即 E2F1和E2F7）的转录谱，从而更好地了解它们在细胞周期中的作用流程。此外，我们显示，这种方法对于基于药物治疗（ 即丝裂霉素C，抗癌剂）的机制的研究是有用的，因为它允许区分对基因毒性因子起反应性的基因仅受细胞周期扰动影响的基因由代理人强加。
Introduction
通过细胞周期的所有阶段的过渡与紧密调节的基因表达程序相结合。认为在整个细胞周期中协调基因转录的“开”和“关”是在复杂的转录调节系统的控制之下，不仅调节时间，而且调节基因表达的水平。已知解除关键细胞周期成分的调节有助于几种疾病的发展，并且是肿瘤发生的已知标志1,2 。在酵母和哺乳动物细胞中进行的全基因组转录组学分析显示，大量基因在细胞周期中表现出周期性的基因表达模式，表明细胞周期内的转录波动反映了给定基因产物的时间需求在精确的阶段3，4 ， 5 。
研究细胞周期调节基因表达的主要任务是将细胞同步到特定的细胞周期阶段。细胞同步有助于解释基因表达模式与特定细胞周期相变的关联，并且导致更好地了解许多基因的调节和功能。细胞同步对于研究抗癌药物的作用机制也是重要的，因为已知化学治疗剂影响基因表达以及细胞周期动力学6,7 。然而，通常难以确定由这些药剂治疗引起的基因表达差异是否是对治疗的直接反应，或者仅仅是细胞周期特征变化的结果。为了区分这些可能性，基因表达应该在已经存在的细胞中进行分析在加入化疗药物之前同步化。
除了一些原代细胞例如新鲜分离的淋巴样细胞，其构成在G0-8中同步的均质细胞群体， 体外建立的细胞系在培养物中异生生长。在常规生长条件下，这些异步循环细胞发现于细胞周期的所有阶段，但优先在G1 9中 。因此，本文不提供特定细胞周期阶段功能或基因表达分析的最佳方案（ 如 G1，S等）。未转化的永生化细胞系（ 例如成纤维细胞）可以与所谓的生理方法10同步。这些方法基于未转化细胞的保留的原代细胞特征，例如细胞接触抑制和生长因子依赖性，以便继续循环。切除的血清与接触抑制组合使得非转化细胞在G0 / G1处停滞。然而，同步的细胞周期进入和进展通常需要传代培养，这也涉及细胞的人工脱离和再镀覆10 。最重要的是，该方法不适用于转化细胞系的同步，绝大多数目前使用的已建立的细胞系，其特征在于缺乏细胞接触介导的生长抑制或对生长因子撤出的应答。因此，很明显，在细胞周期的特定阶段中需要替代方法用于有效的细胞同步。一般来说，最常用的同步方法是基于细胞周期的一个定义点的瞬时化学或药理学抑制，通常是DNA合成或有丝分裂纺锤体形成。抑制DNA合成通过在晚期G1期或早期S期停滞细胞来同步细胞。这可以是achi通过添加化合物，如拟合物，核苷酸生物合成抑制剂11,12 ， aphidicolin，DNA聚合酶抑制剂13,14 ，羟基脲，核糖核苷酸还原酶15,16抑制剂或过量的胸苷17,18 等化合物。另一方面，微管聚合抑制剂如秋水仙碱或诺考达唑能够阻止有丝分裂纺锤体形成，导致早期M期19,20,21细胞同步。
在这项工作中，我们描述了一种基于瞬时化学抑制的两个互补同步协议的方法，用于研究mRNA上的细胞周期调节基因的表达水平。这种方法是定义细胞周期基因在特定细胞周期过程中的作用的基础。此外，它为研究抗癌治疗的影响提供了一个总体框架，以准确地检测药物反应性基因，并最大限度地减少由这些药物产生的细胞周期进程扰动产生的误解。
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Protocol
细胞周期进展的细胞同步，释放和监测
- 基于胸腺嘧啶和诺考达唑（Thy-Noc）的同步和释放的有丝分裂的U2OS细胞
- 准备所需的细胞培养基。 U2OS细胞通常在补充有10％（体积/体积）FBS（任选的：1％青霉素/链霉素）的DMEM-谷氨酰胺培养基中生长。在无菌条件下进行所有培养基制备和操作，并在使用前将补充培养基（从现在称为“完全培养基”）升温至37℃。
- 在10毫升完全培养基中每100毫升培养皿中种子2×10 6个 U2OS细胞。为了计算所需的培养皿数量，考虑到每个100毫米的培养皿通常提供足够的有丝分裂细胞来重新铺板6孔板的大约5个孔（0.2-0.25×10 6个细胞/孔）（参见图1B ）。每个选定时间点需要两口井在实验中（1孔用于RNA提取，1孔用于细胞周期监测）。另外，可以每个时间点收集第三个孔用于蛋白质分析。
注意：晚上（晚上7点左右）的平板细胞，以便随后的步骤可以在后几天的工作时间内进行。包括2个异步生长细胞的孔以定义FACS分析补偿设置。 - 通过在37℃下在5％CO 2的湿润气氛中孵育100毫米培养皿24小时使细胞附着。
- 对于胸苷块，通过将145.2mg胸苷粉末溶解在3mL H 2 O（或等量的量）中制备200mM胸苷储液，并通过0.2μm孔径过滤器过滤灭菌溶液。稍微加温可能有助于溶解胸苷。将100μL新鲜制备的200mM储备液加入到每个100mm培养皿（终浓度2mM）中。 37℃孵育细胞与胸苷20小时76; C在具有5％CO 2的加湿气氛中。
注意：晚上（晚上7点左右）处理细胞，第二天有时间进行胸苷释放和诺考达唑阻滞。 - 要从胸苷块中释放，请在第二天（3点）下午清除含胸苷生长培养基。用预热的1×PBS洗涤细胞两次，并向每个100mm的培养皿中加入10mL的完全培养基。在含5％CO 2的潮湿气氛中，37℃孵育细胞5小时。
- 对于有丝分裂细胞停滞，加入诺考达唑至终浓度为50 ng / mL（8 pm）。通过将诺考达唑粉末溶于DMSO（ 如 5 mg / mL）中制备储液，并在-20°C下冷冻保存。在含5％CO 2的潮湿气氛中，37℃下，使用诺考达唑孵育不超过10-11小时的细胞。
- 在早期M期（有丝分裂脱落）中释放诺考达唑介导的停滞，并在几个时间点收集样品nts（从6-7 am开始）。
- 通过摇动每个平板并轻轻吸取含有含诺科达唑的生长培养基，分离圆形（有丝分裂）细胞。将分离的细胞从每个100mm平板收集到50mL无菌管中，离心（300×g，5分钟，室温（RT）），并通过加入1x PBS洗涤细胞两次，然后离心。建议使用冷PBS或PBS加诺考达唑以避免有丝分裂滑脱（参见讨论部分）。
- 将每个100mm平板上收集的有丝分裂细胞重悬于10 mL完全培养基中。保存2 mL RNA提取，2 mL进行FACS分析，时间为0 h（每个样品约0.2-0.25 x 10 6个细胞）。
- 在6孔板（2mL /孔; 0.2-0.25×10 6个细胞/孔）中重新平板剩余的有丝分裂细胞用于随后的时间点。
注意：请记住，每个选定时间点需要2个孔（RNA为1个，FACS分析为1个）。
- 收集样品有时间点建议每1.5至3小时以获得足够的细胞周期进展曲线。
- 对于RNA提取，取出培养基，用2 mL预温的1x PBS冲洗干净，并在孔中加入1 mL合适的RNA分离试剂（ 如 TRIzol）（在化学品安全柜中执行最后一步）。上下移动以分离和裂解细胞，将细胞裂解液转移至1.5 mL微量离心管，在室温下孵育5分钟，并将试管储存在-80°C直至进一步使用。
- 对于FACS分析，用2mL预温的1x PBS冲洗，加入预先加热的胰蛋白酶-EDTA溶液（0.3mL /孔）以分离细胞，通过加入1mL完全培养基封闭胰蛋白酶-EDTA，并将每个样品分开收集15 mL管。
- 离心细胞（300×g，5分钟，RT），保存细胞沉淀并弃去上清液。为了修复细胞，通过轻轻涡旋管将1ml冷冻的70％（v / v）乙醇的1x PBS中的细胞重新悬浮，并将其放置在冰上，供应用在4℃下储存约15分钟或通过FACS进行染色进一步分析（在步骤1.4-1.5中描述）。
- 基于HU的同步和从G1 / S边界释放U2OS细胞
- 如步骤1.1所述准备完整的细胞培养基。
- 在6孔板（每孔2mL完全培养基）中每孔种0.25×10 6个 U2OS细胞。为了计算实验所需的孔数，考虑到每个选定时间点需要2个孔（RNA提取1个孔，细胞周期监测1个孔），另外2个异步生长细胞的孔是需要定义FACS分析补偿设置。
- 通过在37℃下在5％CO 2的潮湿气氛中孵育6孔板过夜（O / N）使细胞附着。
- 第二天早上从井中取出完整培养基，加入2 mL的预热的无FBS的DMEM-谷氨酰胺培养基。在37℃，5％CO 2的潮湿气氛中孵育细胞24小时。
注意：在所有孔中执行此步骤，除了2（保存定义FACS设置）。如果通过简单地将细胞与HU孵育来实现有效的同步，则可以省略血清提取步骤。 - 用HU抑制G1 / S细胞周期。
- 每次使用前准备新鲜的HU储备溶液（500 mM）。加入2mL H 2 O至76.06mg HU粉末，混匀至充分溶解。通过0.2μm孔径过滤器过滤灭菌溶液。将50 mL完全培养基与400μL过滤灭菌的HU储备液混合，最终HU浓度为4 mM。
- 除了从定义FACS设置所需的2个孔以外的所有孔中取出培养基，并用新鲜制备的4mM含HU的完全培养基（2mL /孔）替换。
- 孵育细胞24小时含HU的培养基在37℃，5％CO 2的加湿气氛中。
- 从HU介导的逮捕中释放细胞。从孔中取出含HU的培养基，并用预热的1×PBS（每次2mL）冲洗两次。每孔加入2 mL完全培养基。收集0个时间点的2个样品（1个用于RNA提取，1个用于FACS进行细胞周期停滞验证），以及2个样品保存用于FACS设置。将剩余的孔放在培养箱中。
- 每1.5至3小时收集样品，以获得足够的细胞周期进程分布。在每个时间点，进行1.1.8.1-1.1.8.2中所述的样品处理（RNA提取和FACS分析）。
- 用DNA损伤剂治疗
注意：每当目的是澄清化合物（ 例如 DNA损伤剂）对细胞周期事件的影响时，任何前述的同步方法可以是结合用基因毒素治疗细胞。为了选择同步方法，重要的是考虑我们想要分析的细胞周期的相位。通常，Thy-Noc程序可能适合于研究化合物在G1期或S期进入中的作用，而HU介导的同步可能更适合研究S至G2期或有丝分裂期的影响。- 分析基因毒素在G1期或S期进入中的作用
- 按照1.1.2所述同步单元格。至1.1.6。
- 从诺考达唑释放细胞，并按照1.1.7所述重新平板化。在37℃下，在5％CO 2的潮湿气氛中孵育3小时，以便在添加剂之前将其连接（所需的孵育期可能因细胞系而异）。
- 添加代理并收集样品，如1.1.8中所述。
- 基因毒素在SG中的作用分析2阶段或M进入
- 按1.2.2所述同步单元格。至1.2.5。
- 如1.2.6所述从HU释放细胞。并直接添加代理。
- 收集样品，如前文1.8所述。
- 分析基因毒素在G1期或S期进入中的作用
- 通过碘化丙啶（PI）染色和FACS分析监测细胞同步和通过细胞周期的进展
注意：所有时间点收集的样品以及定义FACS设置所需的样品一旦固定就可以在4°C储存（如1.1.8.2中所述）。用PI溶液进行染色，然后同时对所有实验样品进行FACS分析。当在535nm激发，宽600nm左右的发光峰时，PI插入到双链DNA的主槽中，产生高度荧光信号。由于PI还可以结合双链RNA，因此需要用RNase处理细胞以获得最佳的DNA分辨率。- 准备新鲜的PI染色溶液。可以通过将PI粉末溶解在PBS（ 例如 5mg / mL）中来制备PI储备溶液。储存溶液在4°C（黑暗）。染色溶液由PI（140μM），柠檬酸钠（38mM）和Triton X-100（0.01％v / v）组成。
- 将适当的表面（ 例如烤箱）预热至37°C。
- 离心固定细胞（450 x g，5 min，RT），倾析上清液（乙醇），并用1x PBS洗涤一次。
- 再次离心细胞，除去PBS，每样品加入300μLPI染色溶液（除了其中一个样品用于FACS设置;将PBS添加到该样品中）。
- 将细胞转移至FACS管（5mL圆底聚苯乙烯管）。
- 向每个样品加入1μLRNA酶A，混合并在37°C的黑暗条件下孵育样品30分钟。样品可以保存在4°C的光照条件下，最长不得超过2-3天。
- 通过流程分析样品中的DNA含量流式细胞仪。使用PI染色的异步样本定义FACS分析补偿设置。使用空白样品（不含PI染色溶液）检查自体荧光。以前已经描述了PI染色介导的通过流式细胞术分析DNA含量的基础。
- 通过双磷酸H3（Ser 10）/ PI染色测定有丝分裂指数
注意：通过流式细胞术可以轻易地检测到丝氨酸10（pH3）中对磷酸化组蛋白H3特异性抗体的细胞进行有丝分裂。伴随的PI染色可用于确定细胞群体基于DNA含量的分布。 FACS设置的最佳配置需要5个样品：空白，仅限PI，仅限pH3，仅次要抗体和双重染色。- 离心固定细胞（450×g，5分钟，4℃）并弃去上清液。描述以下步骤以在15mL管中进行染色。
- 通过加入1洗涤细胞mL PBS-T（PBS + 0.05％Tween-20）沉淀并离心（450×g，5分钟，4℃）。去除上清液。
- 在100-200μLPBS-T + 3％BSA中加入稀释（1:500）的抗pH3抗体，并在RT（或O / N在4℃）下摇摆培养2小时。
- 加入2mL PBS-T（PBS + 0.05％Tween-20）并离心（450×g，5分钟，4℃）。去除上清液。
- 再通过向沉淀中加入2mL PBS-T再次洗涤，离心并弃去上清液。
- 在100-200μL的PBS-T + 3％BSA中稀释（1:500）二次抗体（在选择的pH3抗体的情况下为抗兔AlexaFluor 488），并在室温下摇摆1小时（或O / N在4℃）。保护样品免受光照。
- 通过如步骤1.5.4所述的离心，用PBS-T（2mL）洗涤两次。
- 按照所述进行PI染色（步骤1.4.1至1.4.6）。
2.基因表达分析的样本收集和处理
- 采取将RNA分离试剂中的1.5 mL微量离心试样从冷冻箱中取出，并让其在室内解冻，并在化学品安全柜内解冻。
- 向每个样品中加入400μL氯仿，并剧烈振荡（但不要旋涡）直到完全混合。在室温下孵育样品5分钟。
- 在台式微量离心机中离心管15分钟（≥8,000xg，4°C）。
- 将水相（上）相转移到新的1.5 mL微量离心管中，并记录转移的体积（为了简化程序，建议在实验的所有样品中收集相等的体积）。
- 在混合的同时，向水相中逐滴加入1体积％的100％乙醇。不要离心
- 使用商业RNA mini准备工具执行下一步。将每个样品多达700μL，包括可能形成的任何沉淀物放入2 mL收集管（制造商提供）的旋转柱中。
- 关上盖子和离心机（≥8,000g，RT）15 s。丢弃流通。重复上一步与剩余的样品（如果有的话）。
- 按照制造商的说明进行RNA洗涤和洗脱（在30-40μl不含核酸酶的H 2 O中洗脱每个样品，以获得适合的下一步RNA浓度）。
- 通过吸光度测量确定样品的RNA浓度和纯度（ A 260/280比为2.0-2.1表示RNA样品的良好纯度）。将RNA样品储存于-80°C直到用于RT-qPCR分析。
- 对于RNA转化成cDNA和随后的定量PCR，每个样品取1μgRNA，并根据制造商的说明书制备逆转录酶反应。获得的cDNA样品可以在4℃（几天）或-20℃下保存（更长时间）。
注意：实时PCR的样品制备，引物设计和其他注意事项已经例如在文献22,23中有所描述。
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Representative Results
用于细胞同步的Thy-Noc和HU协议的示意图。
图1总结了U2OS细胞同步和随后的样品收集所需的步骤，以验证细胞周期的进展并进行基因表达分析。
Phospho-H3和PI染色是选择同步方法的良好评估参数。
由于培养细胞的固有异质性，必须对每个细胞系评估和优化细胞同步程序。通常使用Thy-Noc方案实现有丝分裂同步，并且可以用针对磷酸化组蛋白H3（pH3），典型的有丝分裂标记物特异性的抗体来评估用诺考达唑治疗后有丝分裂细胞的富集。井 pH3阳性细胞的鉴定允许区分有丝分裂细胞和不经历有丝分裂的4C-DNA含量的细胞（所有这些都通过PI染色被认为是“G2”群体）。在U2OS细胞中，Thy-Noc方案导致具有4CDNA含量的群体的显着富集（图2A，左上图，通过PI染色的蓝色群体），并且该群体内的有丝分裂细胞的相对分数通常是相当纯的91％，而异步电池为2％）。从诺考达唑释放导致细胞向下一个G1期的同步进展，如通过具有2CDNA含量的群体的积累所确定的（ 图2A ，右上图，PI染色的绿色群体）以及pH3阳性有丝分裂的近消失细胞（ 图2A ，右下图）。因此，pH3染色结果证实了Thy-Noc方案对U2OS细胞有丝分裂同步的适用性。
e_content“fo：keep-together.within-page =”1“>使用两种广泛使用的同步仪，用胸苷和羟基脲测试G1 / S中U2OS细胞的同步，通过PI染色测定细胞周期的不同阶段的富集， FACS分析和细胞百分比总结在表中（ 图2B ）.U2OS细胞对Thy（2mM）的24小时暴露在G1 / S边界中阻止细胞的效率低下（ 图 2B ），而用HU或双重治疗一周的胸苷（DT）导致令人满意的停止，然而，只有胡萝卜素处理的细胞完全从停止中恢复，并通过细胞周期充分进展，相反，DT阻滞在显着部分的细胞群中诱导永久性G1停滞在6 h时间点，G1为13.3％，DT 为 3.1％，HU为基础方案），这对细胞同步有负面影响，因此建议将暴露于HU作为适当的G1 / S同步化od为U2OS细胞。基于Thy-Noc和HU的协议是小区同步的补充。
如图3A所示 （0 h时间点），Thy-Noc方案治疗有效地阻止了M期进入的U2OS细胞（4CDNA含量为蓝色的群体），并通过HU方案处理G1 / S边界的细胞（具有2C DNA含量的群体，以绿色/红色显示）。在去除药物时，细胞以同步的方式进入并进行细胞周期。从Thy-Noc治疗中恢复的细胞首先在早期G1期（绿色群体）中观察到，随后以均匀的方式转变为G1期和高达S期。从HU治疗中恢复的细胞通过S（红色群体）和G2 / M同步进行。通过下一个细胞周期的进展伴随着同步性的丧失。 Consequently，这些分析中的时间点不包括在这些分析中，因为在这个时间点之后失去同步性。
细胞周期蛋白E1（G1 / S细胞周期蛋白）和细胞周期蛋白B1（G2 / M细胞周期蛋白）的蛋白质印迹分析，其水平在细胞周期中严格调控的两种蛋白质和有丝分裂标记物pH3的蛋白质印迹分析证实了每种时间点由FACS分析（ 图3B ）。如预期的那样，M期（相当于Thy-Noc同步细胞的0h时间点）和G2至M期细胞（HU同步细胞的9h至12h时间点）的细胞显示出细胞周期蛋白B1和细胞周期蛋白E1水平无法检测。此外，细胞周期蛋白B1水平在G1期（从诺考达唑释放3小时）低至不可检测，并且随着细胞进行S（Thy-Noc释放后）并进入G2（HU释放后），观察到逐渐积累。在Thy-Noc同步后0小时，细胞的pH3标记强证实了在这个时间点有丝分裂被捕的细胞的浓缩。从HU释放后12小时pH3水平略有增加，显示大多数具有4CDNA含量的细胞仍然在G2，而有丝分裂细胞的比例在15小时时间点增加。相比之下，细胞周期蛋白E1的表达模式显示从G1期到S期进入（Thy-Noc手术）逐渐积累，G2 / M期逐渐消失（HU手术）。
可以通过Thy-Noc和HU基于同步的组合来准确地分析在细胞周期中差异调节的基因的表达。
作为细胞周期调控的基因表达分析的最佳方法的两个细胞同步方法的组合的概念证明，已知在细胞周期中具有不同表达动力学的两个E2F家族成员的mRNA表达（E2F1和E2F7）通过逆转录酶定量PCR（RT-qPCR）检测。为此，使用Thy-Noc和HU同步方案， 如图1所示 ，并通过流式细胞术监测细胞周期分布， 如图3A所示 。 图4显示通过细胞周期的E2F1（上两个图）和E2F7（较低的两个图）的mRNA谱。 E2F1编码基因的转录调控特征最好用Thy-Noc方法观察，E2F1表达从早期G1期开始逐渐增加，在G1期晚期（Thy-Noc释放后9小时，绿色背景）达到峰值。此后，其水平降低，伴随着进入S期和G2期（红色和蓝色背景）。相比之下，在基于HU的同步（下图;红色背景）之后，E2F7基因表达动力学最好被检测到，在释放6小时（对应于S至G2相变）中具有峰值表达。你的-NOC另一方面，方法适用于观察E2F7的诱导，但不适用于其下调。值得注意的是，超过15小时时间点的分析的扩展再现了早期时间点的E2F1和E2F7 mRNA表达谱，尽管mRNA变异范围缩小（数据未显示）。总而言之，这些结果证实了使用适当同步的细胞群体来重要性，以评估基因表达动力学，而且还评估mRNA水平变化的准确幅度。
细胞同步可以更好地了解受抗癌治疗影响的基因表达程序。
为了分析抗肿瘤药物丝裂霉素C（MMC）在细胞周期动力学和基因表达中的作用，U2OS细胞首先与HU同步化，随后用MMC处理。暴露于该遗传毒性因子激活了检查t在G2期，在暴露15小时后显而易见（ 图5A ，下行，蓝峰）。相比之下，未处理细胞在此时间点正常进行G1（ 图5A ，上排，绿色峰）。长期MMC治疗（36小时）显示G2期细胞永久性停止，而没有MMC治疗的细胞表现出与异步细胞群体相似的细胞周期分布。
选择E2F1和p21Cip1（CDKN1A）用于在MMC处理的细胞中的基因表达分析（ 图5B ），给定它们不同的细胞周期依赖性调节。 E2F1的表达是G1相依赖的， 如图4所述，而p21 Cip1表达的诱导与细胞周期停滞/检查点激活相结合24 。 如图5B （左上图）所示，E2F1基因表达ki在MMC存在或不存在的情况下，网络是相似的，因为细胞通过G1 / S进展并进入S期。在MMC暴露15小时后观察到MMC处理和未处理细胞中E2F1基因表达的差异，由此MMC处理的细胞表达比对照细胞更低的E2F1 mRNA水平（ 图5B ，比较实线和虚线）。然而，尽管表达有明显的差异，但是由于MMC持续的G2期阻滞，MMC治疗和未处理细胞的细胞周期特征在这些后期的时间点上明显不同，因此不能断定MMC下调E2F1表达。事实上，在MMC暴露的细胞中15小时后的低E2F1 mRNA水平可能反映了药物在细胞周期动力学中的作用，而不是MMC在E2F1转录调控中的作用。
与E2F1相反，p21 Cip1是MMC反应基因。 p在HU施加的G1 / S停止时检测到21Cip1，表明HU的G1检查点激活（ 图5B ，0h时间点），其后在非MMC处理的细胞中表达降低，与释放后的未受扰动的细胞周期进程一致逮捕。相比之下，MMC治疗导致p21 Cip1 mRNA水平升高（ 图5B ，右上图，实线），而细胞积累在G2期（MMC暴露9小时）。尽管在对照和MMC处理的细胞中9小时时间段的细胞周期特征相似，但是基因表达分析显示出基本差异。 MMC暴露的细胞显示激活的G2检查点，通过诱导p21 Cip1表达证明，而未处理的细胞经历G2的不受干扰的转变，具有低p21 Cip1水平。
通过流式细胞术分析获得的数据（ Fi（ 图 5B ，下图）在RT-qPCR中产生的数据（ 图 5B ，上图）在每个所选基因的单个图中组合（ 图4B ，下图）。 mRNA表达水平，其中显示为条的相对高度，而每个样品的细胞的细胞周期分布以颜色的比例示出：G1相的绿色（2CDNA含量），G2期的蓝色（4C DNA含量）和红色用于S期（中间体DNA含量）。这种图形表示的组合方法可能有助于解释细胞周期分布和基因表达分析。
总之，与培养同步方法相结合的基因表达分析允许鉴定基因毒素反应基因（p21Cip1），并提出在用该试剂处理和未处理的细胞之间E2F1表达观察到的变化是间接的，可能与细胞的细胞周期分布的差异有关。
图1： 两个互补细胞同步方案的概述：胸苷 - 诺考达唑和羟基脲。 （ A ）哺乳动物细胞周期的图形表示，指示通过细胞同步方法实现细胞周期停滞的点。基于Thy-Noc的程序阻止早期有丝分裂（M）中的细胞，而HU阻断G1 / S边界处的细胞。 （ B ）细胞同步的Thy-Noc协议的示意图。显示了U2OS细胞中通常用于基因表达分析和细胞周期监测的步骤。 （ C ）基于HU的小区同步协议的示意图。显示了在U中通常用于基因表达分析和细胞周期监测的步骤2OS细胞。如果通过24小时暴露于HU获得最佳同步，则也可以应用省略血清饥饿的更短的同步程序。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2： 适当同步方法的评估。 （ A ）异构和Thy-Noc同步的U2OS细胞培养物进行pH3染色，以评估每种情况下有丝分裂细胞的分数。同时PI染色允许监测细胞的DNA含量。在异构群体中，只有最小部分的具有4C DNA含量（蓝色）的细胞对于有丝分裂标记是阳性的。相比之下，Thy-Noc协议高效地有丝分裂的细胞（pH3染色阳性），并且在去除诺考达唑（3小时时间点）后允许适当进展到下一个G1期（绿色）。每个阶段的细胞百分比总结在表格中，并根据PI直方图中使用的颜色进行标记：2C DNA含量细胞（G1）为绿色，具有4C DNA含量的细胞为蓝色（包括G2和M细胞，命名为直方图中的G2，以简化数字，对于具有中间DNA含量（S）的细胞，红色为（ B ）在U2OS细胞中评估胸苷和HU的细胞周期同步效率，细胞用胸苷（一或二回合），或HU为24 h，通过PI染色和FACS分析检测细胞同步，峰值用于FACS数据分析， 请点击此处查看该图的较大版本。
图3： 概述了Thy-Noc和HU介导同步后细胞均匀进展的时间框架。 （ A ）通过Thy-Noc方案（上行）或通过HU方案（下行）在G1 / S转换中，U2OS细胞在M期进行同步。化学品释放后每3小时通过PI染色和细胞DNA含量的FACS分析来监测细胞周期进程。峰会用于FACS数据分析。从Thy-Noc介导的阻滞释放的细胞在3h后的G1期早期同步进入，并在随后的时间点均匀地进行到S期。从HU介导的停止释放的细胞通过S期和G2期同步转变。在释放后15小时收集的细胞代表细胞同步的限制，因为进行到下一阶段才能实现d由人口的一小部分。 （ B ）通过蛋白质印迹分析监测细胞同步，每3小时收集蛋白质样品，释放后最多15小时。细胞周期蛋白E1（CCNE1）的表达动力学，细胞周期蛋白主要通过S期累积，细胞周期蛋白B1（CCNB1），主要存在于G2至M期和pH3，有丝分裂细胞的标志物，通过流式细胞术观察到的证实的细胞周期分布曲线。肌动蛋白B（ACTB）被用作内源性加载对照，因为其水平不是细胞周期依赖性的。 （从Mitxelena 等 8修改）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：细胞周期相关研究通过互补细胞同步方法对E2F家族成员进行转录。 U2OS细胞通过Thy-Noc方案在G2 / M中通过HU处理在G1 / S中停止，并且在释放后每3h至15h收集样品用于RNA提取和FACS分析。 RT-qPCR基因表达分析显示E2F1表达谱主要限于G1（左上图），而E2F7基因表达谱转为S期，G2期逐渐下调（右下图）。 TBP用作内源性非细胞周期调控基因，用于计算mRNA水平的相对变化，结果表示为平均值和标准偏差（SD）。通过PI染色和FACS分析细胞DNA含量测定细胞周期进展。细胞周期阶段以图表中的背景颜色表示：黑色（早期有丝分裂停滞），绿色（G1期），红色（S期）和蓝色（G2期）。.com / files / ftp_upload / 55745 / 55745fig4large.jpg“target =”_ blank“> 请点击此处查看此图的较大版本。
图5： MMC对基因表达和细胞周期进程的影响。用HU处理U2OS细胞24小时，从HU介导的G1 / S停止释放后立即加入MMC（250nM）。在指定的时间点收集FACS分析和基因表达分析的样品。 （ A ）通过Summit软件通过PI染色和DNA含量的FACS分析来确定细胞周期的进展。 MMC通过S期（红色种群）进行适度的延迟，并在G2期（蓝色群体）中持续停滞，如治疗15小时后（G1）中G1（绿色群体）中不存在细胞所示（下行））到非 -处理（上排）细胞。 （ B ）通过RT-qPCR在mRNA水平进行MMC处理或未处理细胞中E2F1和p21Cip1基因表达分析。 Oxa1L被用作内源性非MMC反应基因，结果表示为平均值和SD。上图表示从HU释放出来后选择的基因的相对mRNA水平，并加入MMC。下图合并了通过FACS分析和RT-qPCR获得的数据。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在细胞周期中涉及短暂和特异性作用的微调调节基因的分析需要均匀的细胞群体。许多研究人员通常使用长期建立的肿瘤细胞系用于这些目的，并且已经开发了多种方法以获得同步（或部分同步的）细胞群体，目的是在确定的细胞周期阶段中积累尽可能多的细胞。此外，已经作出了大量努力，以改进和优化建立良好的同步方式。然而，所有同步协议都有缺点，这可能归因于细胞培养物的异质性，同步程序的次优效率，或化学同步器在细胞功能中具有的二次效应等。应用单元同步协议时，必须考虑到这些限制。研究人员需要确定其最适合的同步方法ic细胞类型或实验。即使以完全相同的方式培养不同的细胞系，由于几个原因导致同步率可能不同。一方面，细胞周期的长度可以根据所选择的细胞系而变化;另一方面，由于每个细胞系25的特定特征，相同的抑制剂可能对不同细胞系具有对比效应。此外，选择的抑制剂浓度和暴露时间必须总是调整到每个细胞系，以避免或最小化非所需的副毒性26 。即使在优化所有这些方面之后，在给定的细胞周期阶段中100％的细胞积累从未达到，并且在去除化学物质27之后不同步逐渐增加。因此，重要的是要了解同步方法在特定时间段内获得最多的部分细胞群体富集。
在这个w ork两个同步程序（Thy-Noc和HU）已经针对其在U2OS细胞中的使用进行了优化，两者都广泛用于细胞同步测定28,29,30 。为了在M期阻滞细胞，胸苷和诺考达唑的组合在U2OS细胞中有效地起作用。鉴于诺考达唑的细胞毒性，重要的是确定该抑制剂的暴露时间和剂量，以便不仅获得高度同步的细胞群，而且获得最佳的细胞存活。先前暴露于胸苷（或理论上任何其他类似化合物如羟基脲）都会导致细胞群在G1期和S期的富集，从而降低所需的诺考达唑暴露时间。为了在G1 / S中阻止细胞，考虑了几种可能性，包括双重胸苷块，一种在几种细胞系同步时非常有效的方法“> 31,32 ，然而，由于U2OS的令人失望的结果，胸苷被丢弃，一轮胸苷治疗只能抑制一部分细胞，而两轮胸苷治疗有效地阻断了G1 / S中的大部分细胞，而G1人胸腺嘧啶核苷释放后维持细胞周期进展并不均匀，相比之下，羟基脲处理提供良好的G1 / S阻断效果，细胞通过S均匀进入G2。
在进行细胞同步实验时（ 例如碘化丙啶染色或pH3标记，然后进行FACS分析，或通过免疫印迹细胞周期相位特异性蛋白质）16,33,34，应检查细胞周期相分布，以更好地解释基因表达结果。同步效率不正确通过细胞周期的进展，ncy或轻微的实验间差异可能导致错误的结论。例如，已知诺考达唑处理在某些条件下引起有丝分裂检查点功能的失败。这引起了具有4CDNA含量的细胞群，但是对于有丝分裂标记物34是阴性的，其“滑倒”有丝分裂并且返回到与4C含量相互间隔35 。可以通过使用冷PBS用于诺考达唑洗涤步骤，可以通过用抗磷酸-H 3抗体免疫染色检测的细胞亚群的出现（参见图2A ）。与使用影响细胞同步的化学抑制剂相关的另一个影响是与暴露于这些化合物36,37相关的检查点激活，细胞通过该机制主动地阻止通过细胞周期的进展，直到它可以确保在精确点之前的过程（例如正确的DNA复制，主轴装配）被解决38 。为了使同步方法充分，逮捕必须不仅是有效的，而且是完全可逆的。因此，在细胞周期抑制剂释放后，重要的是分析抑制剂的作用是否已经被还原，例如通过分析诸如p21CIP的检查点标记的表达。 图5B显示羟基脲同步的U2OS细胞有效地解决了检查点，因为p21 CIP水平在释放后降低到基础表达。
在U2OS细胞中，细胞周期停滞后的富集百分比落在其他细胞同步研究报道的范围内29,30,39：约有85％的具有4C DNA含量的细胞（PI染色）在胸苷 - 诺考达唑治疗后，有丝分裂（pH3阳性标记）中约90％，羟基脲处理后约80-90％的G1 / S细胞。虽然同步在几个小时后不变，但细胞不能以同步的方式完成整个细胞分裂周期，但通常会以均匀的方式释放细胞周期停滞的正确进展通过下一个或两个阶段。因此，为了全面了解细胞周期的各个阶段，本工作提出的协议利用了来自细胞周期不同部分的两种同步方法。 如图3A所示 ，每个单独的协议不能确保整个细胞周期的同步性。基于Thy-Noc的同步为G1至S期发生的过程提供了适当的框架，而从HU释放的细胞适合于在S和G2 / M期间发生的事件的分析。所选择的两个程序的互补性通过分析E2F转录因子家族的两个成员（ 图4 ）来证明，支持在细胞周期的不同阶段同步的两种方法的组合是精确建立细胞周期调节基因表达的有力方法的想法模式，并更好地了解其生理作用。
细胞同步程序的引人注目的应用重点是评估潜在治疗剂的影响。药物化合物如具有抗肿瘤活性的化合物的作用在异种细胞群体中经常被研究。在这些设置下，可以确定所选择的药物在诱导几种过程如细胞死亡，细胞周期阻滞或衰老的影响7,40。然而，选择异步单元设置来识别精确的分子事件调节这种过程可能导致不完整或部分错误的结论。这一点经常被忽略，已经通过分析化疗药物MMC对E2F1和p21Cip1基因表达的影响（ 图5 ）在本工作中进行了说明。总体而言，细胞同步和基因毒素治疗的组合提供了一个合适的上下文，用于研究对基因毒性因子有反应的基因的表达，并且与受试剂施加的细胞周期扰动影响的基因区分开来。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
我们感谢Zubiaga和Altmeyer实验室的成员进行有益的讨论和技术支持。这项工作得到了西班牙部（SAF2015-67562-R，MINECO / FEDER，UE），巴斯克政府（IT634-13和KK-2015/89）和巴斯克历史大学UPV / EHU（ UFI11 / 20）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, GutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 61965-059 | |
| FBS, qualified, E.U.-approved, South America origin | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| Thymidine | SIGMA | T1895-5G | Freshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine. |
| Nocodazole | SIGMA | M-1404 | Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots |
| Hydroxyurea | SIGMA | H8627 | Freshly prepared |
| Mitomycin C from Streptomyces caespitosus | SIGMA | M4287 | 1.5 mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4 ºC |
| Dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2650 | |
| Propidium iodide | SIGMA | P4170 | Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4 º C protected from light. |
| PBS pH 7.6 | Home made | ||
| Ethanol | PANREAC | A3678,2500 | |
| Chloroform | SIGMA | C2432 | |
| Sodium Citrate | PANREAC | 131655 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| RNAse A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| TRIzol Reagent | LifeTechnologies | 15596018 | |
| RNeasy Mini kit | QIAGEN | 74106 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Anti-Cyclin E1 antibody | Cell Signaling | 4129 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-Cyclin B1 antibody | Cell Signaling | 4135 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-β-actin | SIGMA | A-5441 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Anti-pH3 (Ser 10) antiboty | Millipore | 06-570 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibody | Invitrogen | R37116 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-mouse-HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-3697 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Forward E2F1 antibody (human) TGACATCACCAACGTCCTTGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F1 antibody (human) CTGTGCGAGGTCCTGGGTC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward E2F7 antibody (human) GGAAAGGCAACAGCAAACTCT | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F7 antibody (human) TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward p21Cip1 antibody (human) AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse p21Cip1 antibody (human) TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward TBP antibody (human) reference gene | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse TBP antibody (human) | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward Oxa1L antibody (human) reference gene CACTTGCCAGAGATCCAGAAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse Oxa1L antibody (human) CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Power SYBRGreen PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4368702 | |
| FACS Tubes | Sarstedt | 551578 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | ||
| Corning Costar cell culture plates 6 well | Corning | 3506 | |
| Refrigerated Bench-Top Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12 | Jouan | 743205604 | |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A28567 |
References
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