Summary
我々は、細胞周期の特定の段階に関連する事象を研究するための状況を提供する2つの細胞同期プロトコールを報告する。我々は、このアプローチが、摂動のない細胞周期または細胞周期に影響を及ぼす薬剤への暴露で特定の遺伝子の調節を分析するのに有用であることを示す。
Abstract
細胞周期の遺伝子発現プログラムは、細胞周期依存性プロセスおよび癌などの疾患におけるそれらの役割を理解するための重要なステップである。細胞周期調節遺伝子発現分析は、特定の段階への細胞の同期化に依存する。ここでは、細胞周期中の遺伝子発現の周期的変動を研究するために一般的に使用される2つの相補的な同期プロトコールを利用する方法を説明する。両方の手順は、定義された1つの点で細胞周期を一時的にブロックすることに基づいています。ヒドロキシ尿素（HU）処理による同期プロトコールは、G1 /初期S期後期に細胞停止をもたらし、HU媒介停止からの放出は、SおよびG2 / Mを介して一様に進行する細胞集団を提供する。チミジンおよびノコダゾール（Thy-Noc）処理による同期プロトコルは、初期有糸分裂において細胞をブロックし、Thy-Noc媒介停止からの放出は、G1期およびS期に適した同調細胞集団を提供する研究を試してみてください。両方の手順を適用するには、典型的には細胞のヨウ化プロピジウム（PI）染色およびフローサイトメトリーによるDNA含量分析の後に行われる細胞周期分布プロファイルのモニタリングが必要である。我々は、2つの同期プロトコルの併用は、細胞周期（ すなわち、 E2F1およびE2F7）において差次的に調節される遺伝子の転写プロファイルを明確に決定し、その結果、細胞周期におけるそれらの役割のより良い理解を有するプロセス。さらに、このアプローチは、遺伝毒性物質に応答する遺伝子を、細胞周期摂動のみによって影響を受ける遺伝子と区別することを可能にするため、薬物療法（ すなわち、抗癌剤）の基礎を成すメカニズムの研究に有用であることを示す。エージェントによって課される。
Introduction
細胞周期の全ての段階を経る移行は、厳密に調節された遺伝子発現プログラムに結合される。この細胞周期を通しての遺伝子転写の「オン・オフ」調整は複雑な転写調節系の制御下にあると考えられ、タイミングだけでなく遺伝子発現のレベルも調節する。重要な細胞周期成分の調節解除は、いくつかの疾患の発症に寄与していることが知られており、腫瘍形成の確立された特徴である1,2 。酵母および哺乳動物細胞で実施されたゲノムワイド転写物解析は、細胞周期中の周期的な遺伝子発現パターンを示し、細胞周期中の転写変動が所定の遺伝子産物の時間的要求を反映していることを示唆している正確なフェーズ3,4 、 5 。
細胞周期制御遺伝子発現の研究における主要な課題は、細胞の特定の細胞周期段階への同期化である。細胞の同期化は、特定の細胞周期相転移に対する遺伝子発現パターンの関連を解釈するのに役立ち、多数の遺伝子の調節および機能のより良い理解をもたらしている。化学療法剤は遺伝子発現だけでなく細胞周期動態にも影響することが知られているので、細胞の同期は抗癌剤の作用メカニズムを研究する上で重要である6,7 。それにもかかわらず、これらの薬剤による治療から生じる遺伝子発現の差異が治療に対する直接的な応答であるのか、または単に細胞周期プロファイルの変化の結果であるのかを決定することはしばしば困難である。これらの可能性を区別するために、遺伝子発現は、化学療法薬の添加に先立ってニンクロナイズした。
新たに単離されたリンパ球様細胞（G08に同調した均質な細胞集団を構成する）のようないくつかの初代細胞を除いて、 インビトロで確立された細胞株は培養において非同期的に増殖する。通常の増殖条件下では、これらの非同期循環細胞は、細胞周期の全ての段階において、しかしG1 9において優先的に見出される。したがって、この文脈は、特定の細胞周期段階（ 例えば、 G1、Sなど）における機能的または遺伝子発現分析のための最適なシナリオを提供しない。非形質転換不死化細胞株（ 例えば、線維芽細胞）は、いわゆる生理的方法10と同期させることができる。これらの方法は、サイクリングを続けるために、細胞接触阻害および増殖因子依存などの非形質転換細胞の保持された一次細胞の特徴に基づく。除去G0 / G1で停止した非形質転換細胞をもたらす。しかし、同期した細胞周期の進入および進行には、しばしば継代培養が必要であり、これには細胞の人工的分離および再メッキも含まれる。最も重要なことに、この方法は、形質転換細胞株（現在使用されている確立された細胞株の大部分）の同期には適しておらず、細胞接触媒介性増殖阻害または成長因子離脱に対する応答が欠如していることが特徴である。従って、細胞周期の特定の段階における効率的な細胞同期のために代替の方法が必要であることは明らかである。一般に、最も頻繁に使用される同期方法は、細胞周期の1つの定義された点、典型的にはDNA合成または有糸分裂紡錘体形成の一時的な化学的または薬理学的阻害に基づく。 DNA合成の阻害は、G1後期または初期のS期に細胞を停止させることによって細胞を同期させる。これはアーチかもしれないミオシン、ヌクレオチド生合成阻害剤11,12 、アフィジコリン、DNAポリメラーゼの阻害剤13,14 、ヒドロキシ尿素、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤15,16または過剰量のチミジン17,18 などの化合物を添加することによって得られる。他方、コルヒチンまたはノコダゾールのような微小管重合の阻害剤は、初期M期の細胞同期につながる有糸分裂紡錘体形成をブロックすることができる19,20,21。
この研究では、mRNAにおける細胞周期調節遺伝子の発現を研究するための一過性化学阻害に基づく2つの相補的同期プロトコールを含む方法を記載するレベル。この方法は、特定の細胞周期プロセスにおける細胞周期遺伝子の役割を定義するための基本である。さらに、薬物応答性遺伝子を正確に検出し、これらの薬物によって生じる細胞周期進行の摂動から生じる誤解を最小限に抑えるために、抗癌治療の影響を研究するための一般的なフレームを提供する。
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Protocol
細胞周期の進行の細胞同期化、放出およびモニタリング
- 有糸分裂からのU2OS細胞のチミジンおよびノコダゾールに基づく（Thy-Noc）同期および放出
- 必要な細胞培養液を調製する。 U2OS細胞は、10％（vol / vol）FBS（オプション：1％ペニシリン/ストレプトマイシン）で補完したDMEM-グルタミン培地で日常的に増殖させる。滅菌条件下ですべての培地の調製および操作を行い、補完培地（以後「完全培地」と呼ぶ）を使用前に37℃に暖める。
- 10mLの完全培地中、100mmディッシュあたり2×10 6個の U2OS細胞をシードする。必要な皿の数を計算するために、各100mmディッシュが、典型的には、6ウェルプレートの約5ウェル（0.2〜0.25×10 6細胞/ウェル）を再プレートするのに十分な有糸分裂細胞を提供することを考慮する1B ）。選択した時点ごとに2つのウェルが必要です（RNA抽出のための1ウェルおよび細胞周期モニタリングのための1ウェル）。さらに、タンパク質分析のために、第3のウェルを時間点ごとに収集することができる。
注：夕方（午後7時頃）に細胞を播種して、翌日の作業時間中に次のステップを行うことができます。 FACS分析補正設定を定義するために、非同期に増殖する細胞の2つのウェルを追加します。 - 細胞を、100％ディッシュを5％CO 2を含む加湿雰囲気中、37℃で24時間インキュベートすることによって付着させる。
- チミジンブロックについては、145.2mgのチミジン粉末を3mLのH 2 O（または同等の量）に溶解し、0.2μmの孔径のフィルターを通してろ過することによって溶液を滅菌することによって、200mMのチミジン原液を調製する。わずかな加温はチミジンを溶解するのに役立つかもしれない。各100mm培養皿（最終濃度2mM）に新たに調製した200mMストック100μLを加える。細胞を37℃で20時間、チミジンとインキュベートする。76℃; 5％CO 2を含む加湿雰囲気中でのC。
注：午後（午後7時頃）に細胞を処理し、チミジン放出とノコダゾールの両方を翌日にブロックする時間を有するようにする。 - チミジンブロックから遊離するには、翌日の午後3時にチミジン含有増殖培地を除去する（午後3時）。あらかじめ温めた1×PBSで細胞を2回洗浄し、各100mmディッシュに10mLの完全培地を加える。 37℃、5％CO 2の加湿雰囲気下で5時間細胞をインキュベートする。
- 有糸分裂細胞停止のために、50ng / mL（8pm）の最終濃度にノコダゾールを添加する。 DMSO（ 例えば、 5mg / mL）にノコダゾール粉末を溶解してストック溶液を調製し、-20℃で保存する。 5％CO 2を含む加湿雰囲気中で、37℃で10〜11時間以内にノコダゾールと細胞をインキュベートする。
- 早期M期（有糸分裂泡消失）におけるノコダゾール媒介性停止およびいくつかの時点での試料の回収からの放出nts（午前6時から午前7時まで）。
- 各プレートを振とうし、ノコダゾール含有増殖培地を静かにピペッティングすることにより丸い（有糸分裂）細胞を分離する。各100mmプレートから分離した細胞を含む培地を50mLの滅菌チューブに入れ、遠心分離（300xg、5分間、室温（RT））し、1xPBSを加えて遠心分離して細胞を2回洗浄する。有糸分裂のスリップを避けるために、冷PBSまたはPBSとノコダゾールの併用が推奨されます（ディスカッションセクションを参照）。
- 10mLの完全培地中の各100mmプレートから集めた有糸分裂細胞を再懸濁する。 0時間の時点（1試料あたり約0.2〜0.25×10 6細胞）について、RNA抽出のために2mLおよびFACS分析のために2mLを保存する。
- 6ウェルプレート（2mL /ウェル; 0.2-0.25×10 6細胞/ウェル）中のその後の時点について、有糸分裂細胞を再プレートする。
注記：選択した時点（RNAについては1、FACS分析については1）あたり2ウェルが必要であることに注意してください。
- セルでサンプルを収集する時間点を指定します。細胞周期の進行の適切なプロファイルを得るためには、1.5〜3時間ごとを推奨する。
- RNA抽出のために、培地を除去し、2mLの予め温めた1×PBSで十分にすすぎ、井戸中に適切なRNA単離試薬（ 例えば、 TRIzol）1mLを加える（化学物質の安全キャビネットにおけるこの最後の工程を実施する）。ピペットを上下に動かして細胞を分離・溶解し、細胞溶解液を1.5 mLのマイクロ遠心チューブに移し、RTで5分間インキュベートし、さらに使用するまで-80°Cでチューブを保存します。
- FACS分析のために、2mLの予め温めた1×PBSで十分にすすぎ、予め温めたトリプシン-EDTA溶液（0.3mL /ウェル）を加えて細胞を分離し、1mLの完全培地を添加してTrypsin-EDTAをブロックし、 15mLチューブ。
- 細胞を遠心分離（300xg、5分、RT）し、細胞ペレットを保存し、上清を捨てる。細胞を固定するために、チューブを静かにボルテックスして1×PBS中の冷やした70％（v / v）エタノール1mLに細胞を再懸濁し、氷上に置いてアプリケー4℃で保存する約15分前、またはFACSによるさらなる分析のための染色（1.4〜1.5工程に記載）。
- G1 / S境界からのHUベースの同期化およびU2OS細胞の放出
- ステップ1.1で説明したように完全な細胞培養液を調製する。
- 6ウェルプレート（1ウェルあたり2mLの完全培養培地）中に1ウェルあたり0.25×10 6個の U2OS細胞を播種する。実験に必要なウェルの数を計算するために、選択された時点（RNA抽出には1ウェル、細胞周期モニタリングには1ウェル）あたり2ウェルが必要であり、非同期的に増殖する細胞の2ウェルは、 FACS分析補償設定を定義する必要がありました。
- 5％CO 2を含む加湿雰囲気中、37℃で一晩（O / N）6ウェルプレートをインキュベートすることによって細胞を付着させる。
- 翌朝ウェルから完全培地を除去し、2mLウェル当たり予め加温したFBSを含まないDMEM-グルタミン培地。 5％CO 2を含む加湿雰囲気中、37℃でさらに24時間細胞をインキュベートする。
注記：このステップは2（FACS設定を定義するために保存されたもの）以外のすべてのウェルで実行してください。セルをHUと単にインキュベートすることによって効率的な同期が達成される場合、血清回収ステップは省略することができる。 - HUでのG1 / S細胞周期停止。
- 各使用の前に新鮮なHUストック溶液（500mM）を調製する。 76.06mgのHU粉末に2mLのH 2 Oを加え、完全に溶解するまで混合する。孔径0.2μmのフィルターで濾過して溶液を滅菌する。 50mLの完全培地を400μLのフィルター滅菌したHUストック溶液と混合し、4mMの最終HU濃度にする。
- FACS設定を定義するために必要な2つのウェル以外の全てのウェルから培地を除去し、新たに調製した4mM HU含有完全培地（2mL /ウェル）と交換する。
- 細胞を24時間インキュベートする。HU含有培地中、5％CO 2を含む加湿雰囲気中で37℃で培養した。
- HU媒介性逮捕からの細胞の放出。ウェルからHU含有培地を除去し、予め温めた1×PBS（毎回2mL）でウェルを2回リンスする。 1ウェルあたり2mLの完全培地を加える。 FACS設定のために保存された2つのサンプルと同様に、0時間の時点（RNA抽出のための1つと、FACSによる細胞周期停止確認のための1つ）について2つのサンプルを収集する。インキュベーターに残りの井戸を置きます。
- 細胞周期の進行の適切な分布を得るために1.5〜3時間毎に試料を採取する。各時点で、1.1.8.1-1.1.8.2に記載されているように、サンプル処理（RNA抽出およびFACS分析用）を行う。
- DNA損傷剤による治療
注：細胞周期事象における化合物（ 例えば、 DNA損傷因子）の効果を解明することが目的である場合は、前述のいずれかの同期方法は、遺伝毒性物質による細胞の処理と組み合わされる。同期方法を選択するためには、分析したい細胞周期の位相を考慮することが重要です。一般に、Thy-Noc手順は、G1期またはS期エントリーにおける化合物の効果を研究するのに適しているが、HU媒介性の同期化は、S期からG2期または有糸分裂への侵入における影響を研究するためにより適している。- G1期またはS期における遺伝毒性物質の影響の分析
- 1.1.2で説明したようにセルを同期させます。 1.1.6まで。
- ノコダゾールから細胞を放出し、1.1.7に記載されているようにそれらを再プレートする。 5％CO 2を含む加湿雰囲気中で37℃で3時間インキュベートし、添加前に結合させる（必要なインキュベーション時間は細胞株によって異なる）。
- エージェントを追加し、1.1.8で説明したようにサンプルを収集します。
- SGにおける遺伝毒性物質の影響の分析2段階またはM項目
- 1.2.2で説明したようにセルを同期させます。 1.2.5。
- 1.2.6で説明されているように、HUから細胞を解放する。直ちにエージェントを追加してください。
- 1.8で前に説明したようにサンプルを採取する。
- G1期またはS期における遺伝毒性物質の影響の分析
- ヨウ化プロピジウム（PI）染色およびFACS分析による細胞周期および細胞同期の進行のモニタリング
注記：FACS設定を定義するために必要なものとともに、すべての時点で収集されたサンプルは、（1.1.8.2項に記載されているように）一度固定されると4℃で保存することができます。 PI溶液で染色を行った後、実験のすべてのサンプルを同時にFACS分析する。 PIは、600nm付近のブロードな発光ピークを伴って535nmで励起されると、高度に蛍光性のシグナルを生成する二本鎖DNAの主溝にインターカレートする。 PIは二本鎖RNAにも結合することができるので、最適なDNA分解能のために細胞をRNaseで処理する必要があります。- 新鮮なPI染色溶液を調製する。 PIストック溶液は、PIパウダーをPBS（ 例えば、 5mg / mL）に溶解することによって調製することができる。原液を4°C（暗所）で保存する。染色溶液は、PI（140μM）、クエン酸ナトリウム（38mM）およびTriton X-100（0.01％v / v）からなる。
- 適切な表面（ 例えば、オーブン）を37°Cに温める。
- 固定された細胞（450×g、5分、RT）、デカント上清（エタノール）を遠心分離し、1×PBSで1回洗浄する。
- 再度細胞を遠心分離し、PBSを除去し、1検体あたり300μLのPI染色液を加える（FACSセッティングのためのサンプルの1つを除く;代わりにこのサンプルにPBSを加える）。
- 細胞をFACSチューブ（5mL丸底ポリスチレンチューブ）に移す。
- 各サンプルに1μLのRNase Aを添加し、サンプルを混合し、暗所で30分間37℃でインキュベートします。サンプルは4℃で最大2〜3日間光から保護することができます。
- フローによるサンプル中のDNA含有量の分析サイトメトリー。 PI染色された非同期サンプルを用いてFACS解析補償設定を定義する。ブランクサンプル（PI染色溶液なし）を使用して、自己蛍光をチェックします。フローサイトメトリーによるDNA含量のPI染色媒介分析の基礎は、以前に記載されている9 。
- 二重リン酸化-H3（Ser10）/ PI染色による有糸分裂指数の測定
注：有糸分裂を受ける細胞は、セリン10（pH3）中のホスホ - ヒストンH3に特異的な抗体を用いたフローサイトメトリーによって容易に検出することができる。付随するPI染色は、細胞集団のDNA含量に基づく分布を決定するために有用である。 FACS設定の最適な構成（ブランク、PIのみ、pH3のみ、二次抗体のみ、二重染色）には5つのサンプルが必要です。- 固定細胞（450 xg、5分、4℃）を遠心分離し、上清を捨てる。以下のステップは、15mLチューブ中で染色を行うために記載されている。
- 1を加えて細胞を洗浄する。ペレットおよび遠心分離（450xg、5分、4℃）にPBS-T（PBS + 0.05％Tween-20）を加えた。上清を除去する。
- 100-200μLのPBS-T + 3％BSAに希釈した抗pH3抗体（1：500）を添加し、RTで2時間振盪しながらインキュベートする（または4℃でO / N）。
- 2mLのPBS-T（PBS + 0.05％Tween-20）および遠心分離（450xg、5分、4℃）を加える。上清を除去する。
- ペレットに2mLのPBS-Tを加えてもう一度洗浄し、遠心分離して上清を捨てる。
- 100-200μLのPBS-T + 3％BSAで希釈した（1：500）二次抗体（選択したpH3抗体の場合は抗ウサギAlexaFluor488）を添加し、RTで1時間振盪しながらインキュベートする（またはO / N 4℃で）。サンプルを光から保護する。
- 1.5.4に記載されているように遠心分離によりPBS-T（2mL）で2回洗浄する。
- 前述のようにPI染色を行います（1.4.1〜1.4.6）。
遺伝子発現解析のためのサンプル収集とプロセッシング
- 取る1.5 mLのマイクロ遠心分離機を冷凍庫のRNA分離試薬に入れ、室温で化学薬品の安全キャビネット内で解凍させます。
- 各サンプルに400μLのクロロホルムを加え、完全に混合するまで激しく振とうします（しかし、ボルテックスしないでください）。サンプルを室温で5分間インキュベートする。
- ベンチトップマイクロ遠心分離機でチューブを15分間（≧8,000 xg、4℃）遠心する。
- 水性（上）相を新しい1.5mLマイクロ遠心チューブに移し、移した容積を登録する（操作の簡素化のために、実験のすべてのサンプルにおいて等しい容量を採取することが推奨される）。
- 混合しながら1容量の100％エタノールをゆっくりと水相に添加する（滴下する）。遠心分離しないでください。
- 市販のRNAミニプレップキットで次のステップを実行してください。形成した可能性のある沈殿物を含めて、各サンプル700μLを2 mLのコレクションチューブ（メーカー提供）のスピンカラムにピペットで移す。
- それを閉めて蓋および遠心分離機（≧8,000 g、RT）で15秒間洗浄する。フロースルーを捨てる。残りのサンプルがある場合は、前の手順を繰り返します。
- RNA洗浄および溶出（次のステップのために適切なRNA濃度を達成するために、各サンプルを30〜40μlのヌクレアーゼフリーH 2 Oで溶出する）についての製造業者の指示に従う。
- 吸光度測定（2.0〜2.1のA 260/280比はRNAサンプルの良好な純度を示す）によってサンプルのRNA濃度および純度を決定する。 RT-qPCR分析に使用するまで-80℃でRNAサンプルを保存する。
- cDNAへのRNA変換およびそれに続く定量的PCRのために、サンプルあたり1μgのRNAを取り、製造業者の指示に従ってレトロトランスクリプラーゼ反応を調製する。得られたcDNAサンプルは、4℃（数日間）または-20℃（長時間）で保存することができます。
注：サンプル調製、プライマー設計、およびリアルタイムPCRのためのその他の考慮事項は、文献22,23に緊密に記載されている。
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Representative Results
細胞同期のためのThy-NocおよびHUベースのプロトコルの概略図。
図1は、細胞周期の進行を確認し、遺伝子発現解析を行うために、U2OS細胞の同期化およびその後の試料採取に必要なステップをまとめたものです。
Phospho-H3およびPI染色は、同期方法を選択するための良好な評価パラメータである。
細胞同期手順は、培養細胞の固有の異質性のために、各細胞株について評価し、最適化しなければならない。有糸分裂における同期化はThy-Nocプロトコールで達成され、ノコダゾール処理後の有糸分裂細胞の濃縮は、典型的な有糸分裂マーカーであるリン酸化ヒストンH3（pH3）に特異的な抗体で評価することができる。井出 pH3陽性細胞の分化は、有糸分裂細胞と、有糸分裂を受けていない4C-DNA含量を有するもの（PI染色により全てが「G2」集団とみなされる）とを区別することを可能にする。 U2OS細胞において、Thy-Nocプロトコールは、4CのDNA含量を有する集団（図2A、左上のグラフ、PI染色による青色集団）の有意な濃縮をもたらし、この集団内の有糸分裂細胞の相対分画は、非同期細胞では2％と比較して91％）。ノコダゾールからの放出は、2CのDNA含量（ 図2A 、右上のグラフ、PI染色による緑色集団）およびpH3陽性有糸分裂の近似消滅によって決定されるように、次のG1期への細胞の同時進行をもたらす（ 図2A 、右下のグラフ）。したがって、pH3染色結果は、U2OS細胞の有糸分裂同期のためのThy-Nocプロトコールの適合性を確認した。
G1 / SにおけるU2OS細胞の同期化を、広く使用されている2つの同期化因子であるチミジンおよびヒドロキシ尿素で試験した。細胞周期の異なる相における富化を、PI染色およびFACS分析および表に要約された細胞の割合（ 図2B ）U2OS細胞のThy（2mM）への24時間の曝露は、G1 / S境界における細胞の停止において非効率的であったが（ 図 2B ）、HUまたは2倍対照的に、DTブロックは、細胞集団のかなりの部分において永久的なG1停止を誘発した（しかし、細胞周期の間に完全に回復した）細胞同期性に悪影響を及ぼしているため、6時間時点でのG1における細胞の13.3％（HUに基づくプロトコルでは、DT で 3.1％）、HUへの暴露は、適切なG1 / S同期法として推奨されるU2OS細胞についてはod。Thy-NocおよびHUベースのプロトコルは、細胞の同期を補完するものである。
図3A （0時間時点）に示すように、Thy-Nocプロトコールによる処理により、M期のエントリー（青色で示す4C DNA含量の集団）でU2OS細胞を効率的に停止させ、HUプロトコルによる処理をG1 / S境界（緑色/赤色で示す、2C DNA含量の集団）。薬物を除去すると、細胞は同期した様式で細胞周期に入り、細胞周期を経て進行した。 Thy-Noc処理から回収された細胞は、初期のG1期（緑色の集団）で最初に観察され、続いてG1を介してS期まで均一な様式で移行した。 HU処理から回収された細胞は、S（赤の集団）およびG2 / Mを介して同期して進行した。次の細胞周期を通る進行は、同時性の喪失と付随していた。 Consequentlこれらの分析には、この時点以降の同時性の喪失のために、15時間以上の時点は含まれていなかった。
サイクリンE1（G1 / Sサイクリン）およびサイクリンB1（G2 / Mサイクリン）、細胞周期で厳密に調節される2つのタンパク質、および有糸分裂マーカーpH3のウェスタンブロット分析により、それぞれの細胞周期段階が確認されたFACSによって分析された時点（ 図3B ）。予想通り、M期（Thy-Noc同期化細胞の0時間時点に対応）の細胞およびG2〜M期（HU同期化細胞の9時間〜12時間時点）の細胞は、サイクリンB1の劇的な蓄積を示したサイクリンE1の検出不可能なレベル。さらに、サイクリンB1レベルは、G1期（ノコダゾールからの放出時に3時間）では検出されにくく、細胞がS期（Thy-Noc放出後）およびG2期（HU放出後）に進行するにつれて徐々に蓄積が観察された。 Thy-Noc同期に0時間で細胞の強いpH3標識この時点で有糸分裂で停止した細胞の濃縮を確認した。 HUからの放出から12時間後のpH3レベルのわずかな増加は、4C DNA含量を有する細胞の大部分がG2に依然として存在する一方で、有糸分裂における細胞の割合が15時間時点で増加したことを明らかにした。対照的に、サイクリンE1の発現パターンは、初期G1期からS期への進入（Thy-Noc手順）およびG2 / M期（HU手順）における段階的消失を示した。
細胞周期において差次的に調節される遺伝子の発現は、Thy-NocおよびHUベースの同期の組み合わせによって正確に分析することができる。
細胞周期調節遺伝子発現分析が2つの細胞同期法の組み合わせによって最良にアッセイされるという概念の証明として、細胞周期において異なる発現動態を有することが知られている2つのE2FファミリーメンバーのmRNA発現（E2F1およびE2F7）を、逆転写酵素定量的PCR（RT-qPCR）によって試験した。この目的のために、Thy-NocおよびHU同期プロトコールを図1に要約して使用し、細胞周期分布を図3Aに示すフローサイトメトリーによってモニターした。 図4は、細胞周期を通してのE2F1（上の2つのグラフ）およびE2F7（下の2つのグラフ）mRNAプロファイルを示す。 E2F1をコードする遺伝子の転写調節プロファイルは、Thy-Noc手順で最もよく観察され、E2F1発現はG1期後期から徐々に増加してG1期後期（Thy-Noc放出9時間後;緑色のバックグラウンド）にピークに達した。その後、そのレベルは減少し、S期およびG2期（赤色および青色のバックグラウンド）への進入と併せて減少した。対照的に、E2F7遺伝子発現動態は、HUベースの同期化（下のグラフ;赤色のバックグラウンド）後に最もよく検出され、放出から6時間でピーク発現が見られた（SからG2への相転移に対応する）。 Thy-Noc他方では、E2F7の誘導を観察するのに適していたが、そのダウンレギュレーションは観察されなかった。注目すべきは、15時間を超える分析の延長は、より早い時点のE2F1およびE2F7 mRNA発現プロファイルを再現したが、mRNA変異の範囲は減少した（データは示さず）。まとめると、これらの結果は、遺伝子発現動態だけでなく、mRNAレベルの変化の正確な振幅も評価するために、適切に同期した細胞集団を扱うことの重要性を確認する。
細胞の同期化は、抗癌療法によって影響を受ける遺伝子発現プログラムのより良い理解を提供する。
細胞周期のダイナミクスならびに遺伝子発現における抗腫瘍薬マイトマイシンC（MMC）の効果を分析するために、U2OS細胞をまずHUと同調させ、続いてMMCで処理した。この遺伝毒性物質への曝露はチェックポインを活性化した15時間後に明らかになった（ 図5A 、下段、青色のピーク）。対照的に、未処理の細胞は、この時点でG1を介して正常に進行した（ 図5A 、上段、緑色のピーク）。長期間のMMC処置（36時間）は、G2期における細胞の永久的停止を示したが、MMC処置のない細胞は、非同期細胞集団によって示されるものと同様の細胞周期分布を示した。
E2F1およびp21 Cip1 （CDKN1A）は、MMC処理細胞（ 図5B ）における遺伝子発現分析のために選択され、異なる細胞周期依存性の調節が与えられた。 E2F1の発現は、 図4に記載のようにG1相依存性であるが、p21 Cip1発現の誘導は細胞周期停止/チェックポイント活性化24に結合する。 図5B （左上のグラフ）に示すように、E2F1遺伝子発現ki細胞がG1 / SおよびS期に進行するにつれて、MMCの存在下または非存在下で同様の結果が得られた。 MMC処理細胞は、対照細胞よりも低いE2F1 mRNAレベルを発現した（ 図5B 、実線と破線を比較） MMCに曝露した15時間後に、MMC処理細胞と未処理細胞との間のE2F1遺伝子発現の差異が観察された。しかし、発現の明らかな違いにもかかわらず、MMCによって抑制されたG2期停止が持続するため、MMC処理細胞および未処理細胞の細胞周期プロファイルが後の時点で明らかに異なるため、MMCがE2F1発現をダウンレギュレートするとは考えられない。実際、MMC曝露細胞における15時間後の低いE2F1 mRNAレベルは、おそらく、E2F1転写調節におけるMMCの効果ではなく、細胞周期ダイナミクスにおける薬剤の効果を反映するであろう。
E2F1とは対照的に、p21 Cip1はMMC応答遺伝子である。 pのレベル上昇21 Cip1は、HUによるG1 / S停止時に検出され、HUによるG1チェックポイント活性化を示し（ 図5B 、0時間時点）、非MMC処理細胞ではその発現が減少し、放出後の摂動していない細胞周期の進行と一致した逮捕。対照的に、MMC処理は、細胞がG2期に蓄積している間（ 図5B 、右上のグラフ、実線） 、上昇したp21 Cip1 mRNAレベルをもたらした（MMC曝露の9時間）。対照およびMMC処理細胞の9時間時点で細胞周期プロファイルが類似していたという事実にもかかわらず、遺伝子発現分析は根本的な違いを示す。 MMCに暴露された細胞は、活性化されたG2チェックポイントを示し、p21 Cip1発現の誘導によって証明されたが、未処理細胞は、低p21 Cip1レベルでG2を介する摂動を受けていなかった。
フローサイトメトリー分析（ FiRT-qPCR（ 図 5B 、上のグラフ）から得られたデータを、選択された遺伝子の各々について単一のグラフで組み合わせた（ 図4B 、下のグラフ）。 mRNA発現レベルをバーの相対的な高さとして示し、各サンプルについての細胞の細胞周期分布は、G1相については緑色（2C DNA含有量）、G2相については青色（4C DNA含有量）および赤色S期（中間体DNA含量）である。このグラフ表示の結合された方法は、細胞周期分布および遺伝子発現分析を解釈するのに有用であり得る。
要約すると、培養同期法と組み合わせた遺伝子発現分析は、遺伝子傷害性剤応答遺伝子（p21 Cip1 ）の同定を可能にし、薬剤で治療および治療していない細胞間のE2F1発現に観察される変化が間接的であることを提案した。おそらく細胞の細胞周期分布の差異に関連する。
図1： 2つの相補的な細胞同期プロトコールの概要：チミジン - ノコダゾールおよびヒドロキシ尿素。 （ A ）細胞周期の停止が細胞同期法によって達成される点を示す哺乳動物細胞周期の図式表示。 Thy-Nocベースの手順は初期の有糸分裂（M）で細胞をブロックし、HUはG1 / S境界で細胞をブロックする。 （ B ）細胞同期のThy-Nocプロトコルの模式図。示されるのは、U2OS細胞における遺伝子発現分析および細胞周期モニタリングに典型的に使用されるステップである。 （ C ）セル同期のHUベースプロトコルの概略図。示されているのは、遺伝子発現解析および細胞周期モニタリングのためにU2OS細胞。 HUへの24時間の曝露によって最適な同期が既に達成されている場合、血清飢餓を省略したより短い同期手順を適用することもできる。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2： 適切な同期方法の評価 （ A ）非同期およびThy-Noc同期化U2OS細胞培養物をそれぞれの場合の有糸分裂細胞の画分を評価するためにpH3染色に供した。同時のPI染色により、細胞のDNA含量のモニタリングが可能になった。非同期集団では、4CのDNA含量を有する細胞の最小分画（青色）のみが有糸分裂マーカーに対して陽性であった。対照的に、Thy-Nocプロトコルは効率的にaccu（pH3染色で陽性）、ノコダゾール（3時間時点）の除去時に次のG1期（緑色）への適切な進行を可能にした。各相の細胞のパーセンテージを表に要約し、PIヒストグラムに用いたものに従って色を付ける：2C DNA含量細胞（G1）の緑、4C DNA含量の細胞（G2およびM細胞を含み、 G2はヒストグラムを単純化するために、赤色は中間DNA含量（S）を示す。（ B ）チミジンおよびHUは、U2OS細胞における細胞周期の同期効率を評価し、細胞をチミジン（1または2ラウンド）、またはHUで24時間培養し、PI染色およびFACS分析によって細胞同期を調べた.FACSデータ解析にはSummitを用いた。 この図の拡大版を見るにはここをクリック。
図3： Thy-NocおよびHU媒介同期化後の細胞の均一進行のための時間フレームの概要。 （ A ）U2OS細胞はM期でThy-Nocプロトコル（上段）またはG1 / S移行でHUプロトコル（下段）により同期化した。細胞周期の進行は、PI染色および化学物質からの放出後3時間ごとの細胞のDNA含量のFACS分析によってモニターした。 SummitをFACSデータ解析に使用した。 Thy-Noc媒介停止から放出された細胞は、3時間後に初期のG1期に同期して入り、後続の時点でS期まで均一に進行した。 HU媒介性拘束から放出された細胞は、SおよびG2期を介して同調的に移行した。放出から15時間後に収集された細胞は、次の段階への進行が達成されただけであるdを人口の一部分で除算します。 （ B ）放出3時間後および15時間後までにタンパク質サンプルを回収することにより、ウェスタンブロット分析によって細胞の同期をモニターした。フローサイトメトリーによって観察された細胞周期分布プロファイルを裏付けるCyclin E1（CCNE1）、主にG期からM期および有糸分裂細胞のマーカーであるS期、サイクリンB1（CCNB1）を介して蓄積されたサイクリンの発現動態。アクチンB（ACTB）は、そのレベルが細胞周期依存性ではないため、内因性ローディングコントロールとして用いられた。 （Mitxelena ら 8から改変されたもの）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：細胞周期の位相依存性の研究 t相補的細胞同期法によるE2Fファミリーメンバーの転写。 U2OS細胞はThy-NocプロトコールによりG2 / M中で、またはHU処理によりG1 / S中に停止し、逮捕からの解放時に3時間から15時間ごとにRNA抽出およびFACS分析のために試料を収集した。 RT-qPCRによる遺伝子発現解析は、主にG1に外接するE2F1発現プロファイル（左上のグラフ）を示し、E2F7遺伝子発現プロファイルはG期（下の右のグラフ）を介して徐々にダウンレギュレーションされてS期にシフトした。 mRNAレベルの相対的変化を計算するために、TBPを内因性非細胞周期調節遺伝子として使用し、結果を平均値および標準偏差（SD）として表した。細胞周期の進行は、細胞のDNA含量のPI染色およびFACS分析によって決定した。細胞周期段階は、黒色（初期有糸分裂停止）、緑色（G1期）、赤色（S期）および青色（G2期）のグラフの背景色として表した。.com / files / ftp_upload / 55745 / 55745fig4large.jpg "target =" _ blank "> この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5： 遺伝子発現および細胞周期の進行に対するMMCの影響。 U2OS細胞をHUで24時間処理し、HU媒介G1 / S停止からの放出直後にMMC（250nM）を添加した。 FACS分析および遺伝子発現分析のための試料を、示された時点で収集した。 （ A ）細胞周期の進行は、PI染色およびSummitソフトウェアによるDNA含有量のFACS分析によって決定した。 MMCは、G1期（緑色集団）の処置が15時間後（下段）で細胞が存在しないことによって示されるように、S期（赤色集団）およびG2期（青色集団）における永続的停止を介して、非公開にする処理された（上段の）細胞。 （ B ）MMC処理細胞または未処理細胞におけるE2F1およびp21 Cip1遺伝子発現解析を、RT-qPCRによりmRNAレベルで行った。 Oxa1Lを内因性非MMC応答遺伝子として使用し、結果を平均値およびSDとして表した。上のグラフは、HUからの放出およびMMCの添加後の選択された遺伝子の相対的なmRNAレベルを表す。下のグラフは、FACS分析およびRT-qPCRによって得られたデータを結合する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
細胞周期における一過性および特異的役割に関与する微調整された遺伝子の分析は、均一な細胞集団を必要とする。多くの研究者は、これらの目的のために長年確立された腫瘍細胞株を日常的に使用しており、定義された細胞周期段階において可能な限り多くの細胞を蓄積する目的で、同期（または部分的に同期した）細胞集団を得るための様々な方法が開発されている。さらに、確立された同期アプローチを改善し、最適化するために、強力な努力が払われてきた。それにもかかわらず、全ての同期プロトコールは、細胞培養の異質性、同期手順の最適以下の効率、または化学的シンクロナイザーが細胞機能において有する副次的効果に起因し得る欠点を有する。セル同期プロトコルを適用する場合は、これらの制限を考慮する必要があります。研究者は、その仕様に最も適した同期方法を特定する必要がありますic細胞のタイプまたは実験。まったく同じ方法で異なる細胞株を栽培しても、その結果の同期率はいくつかの理由により異なる場合があります。一方で、細胞周期の長さは、選択された細胞株に依存して変化し得る。一方、同じインヒビターは、各細胞株25の特定の特性のために異なる細胞株に対して対照的な効果を有し得る。さらに、選択された阻害剤濃度および暴露時間は、望ましくない副毒性を回避または最小化するために、各細胞株に対して常に調整しなければならない。これらの全ての態様の最適化の後でさえも、所与の細胞周期段階における細胞の100％の蓄積は決して達成されず、化学物質27の除去後に徐々に非同期性が増加する。したがって、同期方法は、特定の時間枠内で部分的な細胞集団の濃縮を得ることが最良であることを理解することが重要である。
このw orkの2つの同期手順（Thy-NocおよびHU）は、U2OS細胞での使用に最適化されており、どちらも細胞同期アッセイ28,29,30に広く使用されています。 M期の細胞を停止させるために、チミジンとノコダゾールの組み合わせがU2OS細胞で効率的に働いた。ノコダゾールの細胞傷害性を考慮すると、高度に同調した細胞集団だけでなく、最適な細胞生存を得るために、この阻害剤の暴露時間および用量を決定することが重要であった。チミジン（または理論的にはヒドロキシ尿素のような他の同様の化合物）への事前の暴露は、G1期およびS期における細胞集団の濃縮をもたらし、それにより必要なノコダゾール曝露時間を減少させた。 G1 / Sの細胞を停止させるために、いくつかの可能性が考慮された。ダブルチミジンブロックは、いくつかの細胞系の同期において非常に効率的な方法であるしかし、チミジン処理の1ラウンドは細胞の一部分を捕捉するだけであったが、2ラウンドのチミジン処理はG1 / Sの細胞の大部分を効率的にブロックしたが、G1チミジンからの放出後に集団が維持され、細胞周期の進行が均一に進行しなかったのに対し、ヒドロキシ尿素処置は良好なG1 / S阻止結果およびSおよびG2への細胞の均一な進行をもたらした。
遺伝子発現をよりよく解釈するために、細胞同期実験（ 例えば 、ヨウ化プロピジウム染色またはpH3標識、その後のFACS分析、または細胞周期特異的タンパク質のイムノブロッティングによる）を行う場合はいつでも、細胞周期相分布を調べるべきである結果。不正確な同期化の効率細胞周期を通る進行におけるわずかな実験間の差異は、間違った結論につながる可能性がある。例えば、ノコダゾール処理は、特定の条件下で有糸分裂チェックポイント機能の不全を引き起こすことが知られている。これは、4C DNA含量を有する細胞の集団を生じるが、有糸分裂マーカーを陰性にし、有糸分裂分裂をスリップし、4C含量を用いて間期に戻る35 。抗ホスホ-H3抗体（ 図2A参照）による免疫染色によって検出することができる細胞のこのサブセットの出現は、ノコダゾール洗浄工程のための冷PBSの使用によって最小限に抑えることができる。細胞の同調性に影響を及ぼす化学的阻害剤の使用に関連する別の効果は、これらの化合物への暴露に伴うチェックポイントの活性化であり、これは、細胞が細胞周期を通じて進行を積極的に阻止するメカニズムであるその正確な点の前のプロセス（例えば、正確なDNA複製、スピンドルアセンブリ）が解決されていることを確認する 。同期方法が適切であるためには、逮捕は効率的であるだけでなく、完全に可逆的でなければならない。したがって、細胞周期阻害剤の放出後、例えばp21 CIPのようなチェックポイントマーカーの発現を分析することによって、阻害剤の効果が回復したかどうかを分析することが重要である。 図5Bは、放出後にp21CIPレベルが基礎発現に減少したので、ヒドロキシ尿素同期U2OS細胞がチェックポイントを効率的に解決したことを示す。
U2OS細胞では、細胞周期停止時の濃縮率は、細胞同期に関する他の研究で報告されている範囲内にある29,30,39：4C DNA含量（PI染色）でおよそ85％チミジン - ノコダゾール処理時に有糸分裂細胞（pH3陽性標識）の約90％、およびヒドロキシ尿素処理後に約80〜90％のG1 / S細胞を含む。細胞周期停止からの解放は、典型的には、均一な様式で次の1つまたは2つの段階を適切に進行させるが、数時間後には常に同期が失われ、細胞は同期して細胞分裂サイクル全体を完了することができない。したがって、細胞周期の全段階を完全に理解するために、この研究で提案されたプロトコルは、細胞周期の異なる部分からの2つの同期方法を利用する。 図3Aに示されるように、個々のプロトコルの各々は、細胞周期全体にわたる同時性を保証しなかった。 Thy-Nocベースの同期化は、G1からSフェーズで発生するプロセスに対して適切なフレームを提供し、HUから放出されたセルは、SおよびG2 / Mの間に発生するイベントの分析に適していた。選択された2つの手続きの相補性細胞周期の異なる段階で同期する2つの方法の組み合わせが、細胞周期調節遺伝子発現を正確に確立する強力なアプローチであるという考えを支持する、E2F転写因子ファミリーの2つのメンバーの分析によって実証された（ 図4 ）彼らの生理学的役割をよりよく理解することができます。
細胞同期手順の魅力的なアプリケーションは、潜在的な治療薬の影響を評価することに焦点を当てています。抗腫瘍活性を有するもののような医薬化合物の効果は、非同期細胞集団においてしばしば研究される。これらの設定の下で、細胞死、細胞周期停止または老化などのいくつかのプロセスの誘導における選択された薬物の含意を決定することが可能である7,40。しかしながら、調節する正確な分子事象の同定のための非同期細胞設定の選択そのようなプロセスは、不完全または部分的に間違った結論につながる可能性があります。この点はしばしば見過ごされているが、E2F1およびp21 Cip1遺伝子発現に対する化学療法薬MMCの効果を分析することにより、本研究に示されている（ 図5 ）。全体として、細胞同期化と遺伝毒性剤による治療との組合せは、遺伝毒性剤に応答する遺伝子の発現を研究し、薬剤によって課される細胞周期摂動によって影響を受ける遺伝子と識別する適切な状況を提供する。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
私たちはZubiagaとAltmeyer研究所のメンバーに、有益な議論や技術サポートに感謝します。この作業は、スペイン国務省（SAF2015-67562-R、MINECO / FEDER、UE）、バスク政府（IT634-13およびKK-2015/89）、およびバスク国UPV / EHU大学のグラントUFI11 / 20）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, high glucose, GutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 61965-059 | |
| FBS, qualified, E.U.-approved, South America origin | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| Thymidine | SIGMA | T1895-5G | Freshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine. |
| Nocodazole | SIGMA | M-1404 | Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots |
| Hydroxyurea | SIGMA | H8627 | Freshly prepared |
| Mitomycin C from Streptomyces caespitosus | SIGMA | M4287 | 1.5 mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4 ºC |
| Dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2650 | |
| Propidium iodide | SIGMA | P4170 | Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4 º C protected from light. |
| PBS pH 7.6 | Home made | ||
| Ethanol | PANREAC | A3678,2500 | |
| Chloroform | SIGMA | C2432 | |
| Sodium Citrate | PANREAC | 131655 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| RNAse A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| TRIzol Reagent | LifeTechnologies | 15596018 | |
| RNeasy Mini kit | QIAGEN | 74106 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Anti-Cyclin E1 antibody | Cell Signaling | 4129 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-Cyclin B1 antibody | Cell Signaling | 4135 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-β-actin | SIGMA | A-5441 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Anti-pH3 (Ser 10) antiboty | Millipore | 06-570 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibody | Invitrogen | R37116 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-mouse-HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-3697 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Forward E2F1 antibody (human) TGACATCACCAACGTCCTTGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F1 antibody (human) CTGTGCGAGGTCCTGGGTC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward E2F7 antibody (human) GGAAAGGCAACAGCAAACTCT | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F7 antibody (human) TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward p21Cip1 antibody (human) AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse p21Cip1 antibody (human) TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward TBP antibody (human) reference gene | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse TBP antibody (human) | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward Oxa1L antibody (human) reference gene CACTTGCCAGAGATCCAGAAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse Oxa1L antibody (human) CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Power SYBRGreen PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4368702 | |
| FACS Tubes | Sarstedt | 551578 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | ||
| Corning Costar cell culture plates 6 well | Corning | 3506 | |
| Refrigerated Bench-Top Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12 | Jouan | 743205604 | |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A28567 |
References
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