Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Glycoengineering מטבולית של חומצה Sialic באמצעות N-acyl השומן-שונה Mannosamines

Published: November 25, 2017 doi: 10.3791/55746
Automatic Translation
1,2, 3
1Max von Pettenkofer-Institut & Genzentrum, Virologie, Nationales Referenzzentrum für Retroviren, Medizinische Fakultät, LMU München, 2Institut für Laboratoriumsmedizin, klinische Chemie und Pathobiochemie, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Institut für Physiologische Chemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Summary

חומצה sialic היא אופיינית חד-סוכר-יחידה נמצאו ב- glycoconjugates. זה מעורב שפע של אינטראקציות מולקולרית, תאית. כאן אנו מציגים שיטה כדי לשנות את תא השטח חומצה sialic הביטוי תוך שימוש glycoengineering מטבולית עם N- acetylmannosamine נגזרים.

Abstract

חומצה sialic (Sia) הוא נתין מאוד חשוב glycoconjugates, כגון N-, O- glycans או glycolipids. בשל מיקומו בתחנת טרמיני ללא צמצום של oligo - סוכרים, וכן כימי מאפייניו הייחודיים, חומצה sialic מעורב שפע של קולטן שונים-ליגנד אינטראקציות. על-ידי שינוי הביטוי של חומצה sialic על פני התא, כתוצאה מכך מימוש אינטראקציות תלויי-חומצה sialic. זה יכול להיות מועיל לחקור אינטראקציות תלויי-חומצה sialic, יש פוטנציאל להשפיע על מחלות מסוימות בצורה מועילה. Via glycoengineering מטבולית (MGE), הביטוי של חומצה sialic על פני התא יכול להיות מאופנן. במסמך זה, תאים, רקמות או אפילו כל בעלי החיים מטופלים עם C2-השתנה נגזרות של N- acetylmannosamine (ManNAc). אלה סוכרים אמינו לשמש sialic חומצה קודמן מולקולות, ולכן מטבוליזם המינים חומצה sialic המתאימים, הביע על glycoconjugates. יישום שיטה זו יוצרת אפקטים מסקרן על תהליכים ביולוגיים שונים. לדוגמה, הוא יכול להפחית באופן דרסטי את הביטוי של חומצה polysialic (polySia) התייחס תאים עצביים, ובכך משפיע על גדילה עצביים ובידול. . הנה, אנחנו מראים את הסינתזה של שני נגזרות - acylmannosamine הנפוץ ביותר C2-השתנה N, N- propionylmannosamine (ManNProp) כמו גם N- butanoylmannosamine (ManNBut), בהמשך להראות כיצד אלה הלא טבעי ניתן להחיל אמינו סוכרים בניסויים התרבות תאים. הביטוי של חומצה sialic ששונה מינים לכמת באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC), בהמשך נותחו באמצעות ספקטרומטר מסה. ההשפעות על הביטוי חומצה polysialic הם הובהר באמצעות תספיג באמצעות נוגדן חומצה polysialic זמינים מסחרית.

Introduction

חומצה sialic היא חד-סוכר כי בדרך כלל ניתן למצוא בתחנת טרמיני ללא הפחתת של glycoconjugates, כגון N-, O- glycans או glycolipids. בין כל monosaccharides, חומצה sialic יש כמה מאפיינים כימיים ייחודיים. יש שדרה 9 C-אטום, קבוצה קרבוקסילית במיקום C-1, deprotonated, טעונים שלילית ובכך תחת התנאים הפיזיולוגיים, ותפקוד אמינו במצב C-5. למרות מעל 50 באופן טבעי וריאציות של חומצה sialic מאפינים תאריך1, הצורה הדומיננטית של חומצה sialic נמצאו אצל בני אדם הוא N- acetylneuraminic חומצה (Neu5Ac). יונקים אחרים מבטאים גם את כמויות גבוהות יותר של N- glycolylneuraminic חומצה (Neu5Gc)2,3.

בשל מעמדה חשוף glycoconjugates, חומצה sialic מעורב שפע של אינטראקציות קולטן-ליגנד, למשל, הכריכה תלויים hemagglutinin של נגיף שפעת מארח תאים4. Epitope sialic חומצה עם תפקודים ביולוגיים חשובים, במיוחד במהלך מופרה, במערכת העצבים, היא חומצה polysialic. חומצה Polysialic הוא פולימר של עד 200 חומצות sialic אלפא מקושרים-2,8. החלבון העיקרי המוביל של חומצה polysialic היא מולקולת אדהזיה תא עצבי (NCAM). הביטוי חומצה Polysialic שמחליש את המאפיין דבק של NCAM בכך ביטוי חומצה polysialic מקטין את הידבקות ומגביר את הפלסטיות עם מערכת העצבים5.

שינויים בביטוי של חומצה sialic (פולי) בסופו של דבר משפיעים שפע של אינטראקציות ביולוגיים שונים. זה יכול לשמש כדי לחקור תהליכים התלויים חומצה sialic ידועים ברמה המולקולרית, לחשוף את הרומן glycoconjugate אינטראקציות, או לחקור גישות טיפוליות אפשריות. ישנן שיטות שונות זמינים שלפיו הביטוי של חומצה sialic על פני התא יכול להיות מאופנן, למשל טיפול עם חומצה sialic glycosidases ספציפיים (sialidases), עיכוב של אנזימים המעורבים ביוסינטזה חומצה sialic6 7, ,8, או הורסים או שינוי הביטוי של האנזים מפתח של חומצה sialic ביוסינטזה9.

שיטה נוספת תכליתי כדי לווסת את הביטוי חומצה sialic היא MGE (הנדסה מטבולית הידוע גם פחמימה # מיון הפחמימות, מו). במסמך זה, תאים, רקמות או אפילו חיות מטופלים עם נגזרות הלא טבעי של ManNAc אשר C2-אמינו שינויים. להיות קודמן מולקולות של חומצה sialic, לאחר ספיגת תאית, תחליפי ManNAc אלה הן חומצות חד כיווני sialic אל הלא טבעי מטבוליזם, יכול לבוא לידי ביטוי sialylated glycoconjugates. תאים שטופלו ManNAc נגזרים נושאת אליפטיות C2-שינויים, כגון ManNProp או ManNBut, לשלב N- propionylneuraminic חומצה (Neu5Prop) או חומצה - butanoylneuraminic N(Neu5But) שלהם glycoconjugates10 , 11. באמצעות קבוצות פונקציונליות הציג C2-העמדה של ManNAc, חומצות sialic המתרחשים את הלא טבעי יכול להיות יחד, למשל, דרך מצדו Staudinger או את cycloaddition alkine של אזיד, עם צבעי פלורסנט, ולכן דמיינו על פני שטח התא12.

הביטוי של חומצות אלה sialic הלא טבעי יש השפעות מסקרן על תהליכים ביולוגיים רבים, כולל זיהומים הפתוגן, אדהזיה נדידה של תאים סרטניים, אדהזיה תא הכללית, כמו גם vascularization, בידול (לסקירה ראה:. Wratil et al. 13). מעניין, MGE עם N-acyl השומן שונה mannosamines יכול לשמש גם כדי להפריע הביטוי של חומצה polysialic. חומצה Polysialic נוצר על ידי שני polysialyltransferases שונים (ST8SiaII, ST8SiaIV). זה הוכח, כי polysialyltransferase ST8SiaII מעוכבת על ידי סימנים מקדימים חומצה sialic לא טבעי, כגון ManNProp או ManNBut14,15. בנוסף, זה הוכח בתאים אנושיים נוירובלסטומה ManNProp או ManNBut יישום גם מפחית sialylation הכולל15.

MGE עם N-acyl השומן שונה mannosamines הוא קל ליישם את השיטה כבר בהצלחה בשימוש, לא רק מידע יונקים והתרבות תאי חיידקים אלא גם אצל בעלי חיים שלם של מינים שונים, כגון Caenorhabditis elegans16, דג זברה17, או עכברים18,19,20,21. במיוחד ManNAc נגזרים הנושאת שינויים אליפטיות, כולל ManNProp ו- ManNBut, הם החזרה ציטוטוקסיות, אפילו בריכוזים millimolar תא תרבות בינוני או פלזמה. יתר על כן, הם יחסית קל לסנתז.

כאן, אנו מספקים פרטים על אופן השימוש MGE עם N-acetyl שונה mannosamines. קודם כל, הסינתזה של שני נגזרות ManNAc הנפוצה ביותר בתחום זה, ManNProp, ManNBut, הוא הסביר. בשלב הבא, אנו מראים כיצד ניתן ליישם MGE ניסוי ויוו . כדוגמה, שורת התאים נוירובלסטומה קלי נבחר כדי להדגים ירידה בביטוי של epitope polysialic על ידי המערבי כתם לאחר הטיפול עם נגזרות ManNAc. חומצות sialic את הלא טבעי על פני התא לכמת על ידי HPLC, בהמשך נותחו באמצעות ספקטרומטר מסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת Buffers וראגנטים

  1. הכנה של 3 מ מ נתרן methoxide פתרון
    1. להמיס 8.1 מ ג נתרן methoxide ב 50 מ ל מתנול (3 מ"מ) בבקבוק זכוכית 100 מ עם בר מערבבים. לאחסן בטמפרטורת החדר (RT) למשך מספר שבועות.
  2. הכנת מאגר טריס-HCl
    1. לשלב 8.766 g NaCl, 157 מ ג טריס-HCl ו- 146 מ ג EDTA בבקבוק זכוכית 100 מ עם בר stir, להתמוסס במים 80 מ.
    2. הוספת סודיום הידרוקסיד (1 מ', במים) או HCl (20%, במים) הפתרון מלהיב, תוך התבוננות על ה-pH עם מד pH, והתאם את ה-pH ל 8.0.
    3. להוסיף נפח המים הדרושים על מנת להגיע נפח סופי של 100 מ. לסנן את הפתרון באמצעות מערכת סינון סטרילי 0.22 מיקרומטר.
      הערה: 100 מ"ל HCl-טריס מאגר יכיל 150 מ מ NaCl טריס-HCl 10 מ"מ, 5 מ"מ EDTA (pH 8.0). ניתן לאחסן את הפתרון ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  3. הכנת aprotinin פתרון
    1. להמיס 10 מ ג aprotinin במים 1 מ"ל (1.54 מ מ). Aliquot הפתרון aprotinin לתוך 10 x 1.5 mL-פלסטיק צינורות (100 µL כל אחד). לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  4. הכנת leupeptin פתרון
    1. להמיס leupeptin 10 מ ג 2 מ"ל מים (10 מ מ). Aliquot הפתרון leupeptin 10 x 1.5 mL-פלסטיק צינורות. לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  5. הכנה של פתרון פלואוריד (PMSF) phenylmethylsulfonyl
    1. להמיס 34.8 מ ג PMSF 2 מ"ל אתנול (100 מ מ). Aliquot הפתרון PMSF ב- 10 x 1.5 mL-פלסטיק צינורות. לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  6. הכנה של פתרון 1, 2-diamino-4, 5-methyldioxybenzol-dihydrochloride (DMB)
    1. לשלב מ"ג 15.62 אינצ DMB, 352 µL β-mercaptoethanol וביסולפאט נתרן 48 µL-פתרון (39%), וכן להוסיף 9.6 מ ל מים (6.9 מ"מ DMB, 500 מ מ β-mercaptoethanol ו- 0.19% ביסולפיט). Aliquot הפתרון DMB ב 40 x 1.5 mL-פלסטיק צינורות (250 µL כל אחד). חנות מוגן מפני אור ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  7. הכנה של 1 מ' trifluoroacetic חומצה (TFA) פתרון
    1. הוספת µL 770.3 של 100% TFA 9.23 מ"ל מים צינור פלסטיק 15 מ"ל (1 מ'). לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  8. הכנה של פתרון TFA 120 מ מ
    1. להוסיף µL 92.4 TFA (100%) 9.91 מ"ל מים (120 מ"מ) צינור פלסטיק 15 מ"ל. לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  9. הכנת תמיסת נתרן הידרוקסידי (NaOH) 400 מ
    1. להמיס 160 מ"ג NaOH 10 מ"ל מים (400 מ מ) צינור פלסטיק 15 מ"ל. לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  10. הכנת מאגר פירוק תספיג חלבון
    1. להמיס 5.84 g NaCl, 0.1 g טריס (hydroxymethyl)-aminomethan (טריס), 0.1 g CaCl2, 0.95 g MgCl2ו- 1 g טריטון-X100 ב- 100 מ ל מים ולהתאים את ה-pH ל 7.8. חנות ב 4 º C. להוסיף 100 µL של כל מעכב פרוטאז (aprotinin, leupeptin ו PMSF) לפני השימוש המאגר פירוק.
  11. הכנה של נתרן dodecyl סולפט לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) מאגר
    1. להמיס 0.3 g טריס, 1.5 גרם גליצין ו- 0.1 g מרחביות במים 100 מ ל ולהתאים את ה-pH ל 7.3. החנות RT.
  12. הכנת מאגר תספיג חלבון
    1. להמיס 0.3 g טריס, 1.1 גרם גליצין במים 90 מ"ל ולהוסיף 10 מ"ל אתנול. החנות RT.
  13. הכנה של חסימת פתרון
    1. להמיס 1 גר' שומן חלב חינם כוח בתוך 25 מ ל תמיסת מלח פוספט buffered (PBS). תמיד להכין טרי.

2. סינתזה של ManNProp וקשורים N-acyl השומן-שונה Mannosamines

  1. להמיס מ"ג 431.2 הידרוכלוריד mannosamine ב פתרון methoxide של נתרן 3 מ מ 10 מ ל בקבוק זכוכית 50 מ עם בר מערבבים.
  2. מגניב את התערובת על קרח כדי 0 ° C. הפיתרון מלהיב, להוסיף לאט µL dropwise 210 propionyl כלוריד (2.4 mmol), או 248 כלוריד butanoyl µL (2.4 mmol) לסנתז ManNProp או ManNBut, בהתאמה. דגירה התערובת מלהיב ב-0 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
  3. להעביר את הפתרון לתוך צינור פלסטיק 50 מל. דווח 4-8 חורים המכסה של צינור פלסטיק עם מחט דקה. במהירות להקפיא את הפתרון בעזרת חנקן נוזלי, לאחר מכן lyophilize (להקפיא יבש) זה למשך 48 שעות או עד זה התייבש לחלוטין.
  4. מערבבים 350 גר' סיליקה ג'ל 60 עם 750 מ ל אתיל-אצטט/מתנול/מים (15:2:1) (זו השעיה). מילוי עמודה זכוכית (35 מ מ קוטר ו- 70 ס מ אורך) עם המתלה סיליקה ג'ל 60 ולשטוף את העמודה מוכן עם 100 מ ל נוספים אתיל-אצטט/מתנול/מים (15:2:1) לפני השימוש.
  5. להמיס את המוצרים מיובשים מהשלב 2.3 (5 g מיובשים מוצר) 10 מ"ל אתיל-אצטט/מתנול/מים (15:2:1), טען אותם באמצעות פיפטה על גבי סיליקה ג'ל עמודה. לאסוף 4 מ"ל שברים לאחר 500 מ"ל (עבור ManNProp). הערה: ManNBut elute עמודה כ לאחר 700 מ"ל.
  6. העברת שברים eluted לתוך צינורות פלסטיק 15 מ"ל. דווח 3-6 חורים המכסה של צינור פלסטיק עם מחט דקה. רפיד להקפיא את הפתרון בעזרת חנקן נוזלי, לאחר מכן lyophilize את זה עד זה התייבש לחלוטין.
    הערה: המוצרים lyophilized ניתן לאחסן במשך מספר חודשים-RT.
  7. לאמת את הטוהר של המוצרים על ידי ספקטרומטר מסה (ראה סעיף 9).
    הערה: לחלופין, טוהר גם ניתנת לאימות כמקורית על-ידי 1H תהודה מגנטית גרעינית (NMR).

3. תרבית תאים

  1. התרבות התאים נוירובלסטומה קלי במדיום המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI), המכיל 10% סרום שור עוברית, 100 U פניצילין, סטרפטומיצין 100 מ ג, 2 מ מגלוטמין המכילה 5 מ מ ManNAc, 5 מ מ ManNProp או 5 מ מ. ManNBut, ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2.
    הערה: תאים תרבותי בינוני ללא ManNAc או מקבילים שלו משמשים פקד.
  2. לפני היישום של mannosamines, לנתק את התאים נוירובלסטומה קלי מאת המקננת בהם במשך 10 דקות עם טריפסין/EDTA (0.25%, 0.02%, ב- PBS) ולספור באמצעות מונה נויבאואר-חדר או תא. הזרע התאים במספרים מוגדרת בהתבסס על גודל המנה/הצלחת.
    1. כדי למדוד חומצה sialic monosaccharides, זרע עונה 1 פרק 10 תאים5 בינוני µL 500 לתוך צלחת תרביות רקמה 48-. טוב. לניתוח של חומצות polysialic, זרע עונה 1 פרק 10 תאים6 מ"ל 3 בינוני על גבי צלחת תרבות תא בקוטר 6 ס מ. דגירה-CO 37 ° C ו-5%2. החלף את המדיום כל 24 שעות.
      הערה: מגביר האפקט של MGE עם הזמן הכולל של הטיפול. עבור יעילות מטבולית גבוהה לפנק את התאים במשך 5-7 ימים.
  3. לאחר הטיפול, decant של המדיום. לשטוף את הכלים/הצלחות עם PBS. ניתוק התאים על ידי המקננת בהם במשך 10 דקות עם טריפסין/EDTA (0.25%, 0.02%, ב- PBS). לנטרל את טריפסין על-ידי הוספת באותו אמצעי אחסון בינוני התרבות התא לתאים מנותקת. העבר את התאים מנותקת לתוך צינורות פלסטיק 15 מ"ל. Centrifuge את הדגימות למשך 3 דקות ב 500 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
    1. הוסף 5 מ ל תאים PBS וצנטריפוגה (ראה שלב 3.3). חזור על הפעולות כביסה עוד פעמיים.
      הערה: בגדר תא שטף ללא תגובת שיקוע ניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס במשך מספר ימים. אם הביטוי של חומצה polysialic כדי להיות הובהר להמשיך סעיף 10.

4. תא פירוק לניתוח HPLC

  1. הכנת מאגר פירוק HPLC
    1. לשלב 5 מ"ל HCl-טריס מאגר 5 µL aprotinin פתרון, פתרון 20 של leupeptin µL, 50 µL PMSF פתרון.
      הערה: מאגר HPLC פירוק 5 מ"ל יכיל 150 מ מ NaCl, 10 מ מ טריס-HCl, 5 מ מ EDTA, aprotinin 1.54 מיקרומטר, 40 µM Leupeptin, ו- 1 מ מ PMSF (pH 8.0). מאגר זה צריך תמיד להיות מוכן טרי לפני פירוק התא.
  2. מחדש להשעות את התא שנאספו כדורי (שלב 3.3) כל 500 µL קר כקרח HPLC פירוק-מאגר ולאחר אולטרה-sonicate הדגימות עם המחט מעבד אולטרה קוליים שלוש פעמים במשך תקופה של 30 s ב amplitudes בינונית-גבוהה. מגניב הדגימות על קרח לפחות 1 דקות בין המחזורים.

5. ההפרדה של השבר ממברנה

  1. Centrifuge הדגימות תא lysed עבור 2 h ב- 20,000-g ו- 4 מעלות צלזיוס. הפרד את תגובת שיקוע (µL כ 480), המייצג חלבונים cytosolic, צינורות פלסטיק 1.5 מ. לקבוע ריכוז חלבון אלו שברים באמצעות, למשל, של ברדפורד או חומצה bicinchoninic (BCA) וזמינותו.
    הערה: ריכוז חלבון (כ 1 מ"ג/מ"ל) של שברים cytosolic אחר כך שניתן לקשר את כמויות מדודות של המין חומצה sialic מכובד. בגדר מייצג את השבר הממברנה, אשר משמש בשלב 6.1.

6. הידרוליזה חומצית

הערה: Oligo - ופוליסכרידים ב קרום התא הן הידרוליזה ל monosaccharides. עוד, ניתן O-שינויים ב- monosaccharides הן הידרוליזה, גם כן. זה נחוץ לצורך ניתוח כמותי HPLC, כי הרוב המכריע של חומצות sialic בחלקים קרום משולבים באופן טבעי glycoconjugates, אולי יכול לסבול O-אצטיל או O- lactolyl שינויים.

  1. להוסיף 150 µL 1 מ' TFA-פתרון שברים קרום מופרד (גלולה של סעיף 5). דגירה בדגימות במשך 4 שעות ב 80 ° C ברעידות-200-600 סל ד.
  2. Centrifuge את הדגימות כ 30 דקות ב- 20,000-g ו- 21 ° C באמצעות צינורות מסנן 0.5 mL עם 3 kDa אי-הכללה של ממברנות, עד שאמצעי האחסון העליון µL פחות מ-20.
    הערה: השלב זה חשוב להשליך פסולת מולקולרית גבוהה יותר.
  3. העברת השלב התחתון המכילה מולקולות קטנות יותר, כולל המין חומצה sialic, לתוך צינורות פלסטיק 2 מ"ל. דווח 2-4 חורים הפקקים של צינורות פלסטיק עם מחט דקה. רפיד להקפיא את הדגימות בעזרת חנקן נוזלי, ואז lyophilize אותם בן לילה.
    הערה: הדגימות יבשים ניתן לאחסן במשך מספר ימים-RT. להחליף כובע בלי חורים לאחסון ארוך יותר.

7. תיוג פלורסנט

  1. מחדש להשעות את הדגימות מיובשים בפתרון TFA 120 מ"מ µL 10 ולהוסיף 50 µL DMB פתרון. העברת דגימות לתוך צינורות mL 1.5 כהה כדי להגן עליהם מפני האור האולטרה סגול.
  2. עבור תקנים, להמיס 1 µL Neu5Ac (60 ng/mL, במים) או 1 µL Neu5Gc (60 ng/mL, במים) פתרון TFA 120 מ"מ µL 10 mL 1.5 כהה צינורות. להוסיף 50 µL DMB פתרון.
  3. דגירה בדגימות קרום התא, תקני 1.5 h ב 56 ° C מוגן מפני אור. לאחר דגירה, להוסיף 4 µL 400 מ NaOH פתרון כל דגימה כדי לעצור את התגובה תיוג.

8. hplc, קורס ניתוח

הערה: דגימות שכותרתו מנותחים על מערכת HPLC מצויד עמודה סי18 RP (110, גודל החלקיקים מיקרומטר 3, 4.6 x 150 מ מ), גלאי קרינה פלואורסצנטית, ואני אספן שבר. ממיסים המשמש הן מתנול, acetonitrile ומים. הקפד דגה ממיסים כל לפני המדידות, אם מערכת HPLC חסר של degasser פנימית.

  1. הגדר את הטמפרטורה של העמודה עד 40 ° צלזיוס ולהגדיר את גלאי קרינה פלואורסצנטית עם 373 nm עירור, 448 ננומטר על פליטה, בהתאמה. להזריק 10 נפח דגימה µL ולהפריד את הגששים למשך 50 דקות בקצב זרימת 0.5 mL/min כשהמים מתנול/acetonitrile / (6:8:86) eluent. לניתוח ספקטרומטר מסה, לאסוף את הפסגות של ריבית.
    הערה: Neu5Gc צפוי eluate לאחר 6-8 דקות, Neu5Ac לאחר 9-12 דקות, Neu5Prop לאחר 17-23 דקות, Neu5But לאחר 38-44 דקות. ניתן לאחסן את הדגימות fractionated h מספר 4 ° C מוגן מפני אור.
  2. לאחר מדידת כל דגימה, לשטוף את העמודה עבור 7.5 דקות בקצב זרימת 1.0 mL/min (≈ עמודה 1.5 כרכים) עם מתנול/acetonitrile/מים (6:25:69), equilibrate מחדש את המערכת. של 7.5 דקות בקצב זרימת 1.0 mL/min עם מתנול/acetonitrile/מים (6:8:86).
  3. עבור ניתוח כמותי, לחשב את השטח מתחת העקומה של הפסגות חומצה sialic עניין באמצעות תוכנות הפעלה של מערכת HPLC בהתאמה22.
    הערה: נתונים המתקבלים שניתן לקשר את Neu5Ac או תקן Neu5Gc, ריכוז חלבון נמדד בחלקים cytosolic (ראו סעיף 5.1).

9. ספקטרומטר מסה ניתוח של חומצה Sialic Monosaccharides

הערה: HPLC פסגות השמירה של עניין ניתן עוד לנתח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית (LC) ספקטרומטריית electrospray-יינון ספקטרומטר מסה (ESI-MS), על מנת לוודא המין חומצה sialic לא טבעי.

  1. לניתוח ספקטרומטר מסה, להחדיר µL 20 מדגם שנאספו אל תוך מערכת גלאי סלקטיבי LC/מסה (MSD) 79.9% מתנול, אלכוהול איזופרופיל 20% ו- 0.1% חומצה פורמית כמו eluent, קצב הזרימה 0.5 mL/min, 4 kV מתח נימי חום קפילרי 350 ° C 22 , 23.
  2. התוכנה הערכה של מערכת LC/MSD בהתאמה, בחר הפסגה של עניין chromatogram יון סה. להציג את הספקטרום המונית של הפסגה נפתרה. להציג את יחס מסה/מטען חיובי בין 300 ל- 700.
    הערה: בנק דיסקונט למשכנתאות תיוג של חומצות sialic מוביל לעלייה המסה המולקולרית של 116.2 גרם/מול. המין התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות חומצה sialic יש את ההמונים מולקולרית הבאים: בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Ac = 424.2 g/mol, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Gc = 441.8 g/mol, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Prop = 436.2 g/mol, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5But = 453.2 g/משותף mol. adducts acetonitrile, נתרן או אלכוהול איזופרופיל.

10. תספיג ניתוח של חומצה Polysialic בתאים נוירובלסטומה קלי

  1. הכנת תא lysates
    1. להוסיף 1 מ"ל תספיג פירוק מאגר כדורי תא מ שלב 3.3 ו מערבולת. תקופת דגירה של 30 דקות על קרח. מערבולת כל 5 דקות. Centrifuge את הדגימות עבור h 1.5 ב20, 000-g ו- 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את תגובת שיקוע המכיל את החלבונים את התאים lysed.
    2. לקבוע ריכוז חלבון של שברים חלבון, למשל, של ברדפורד או BCA וזמינותו. לדלל את הדוגמאות כדי ריכוז חלבון של 1.5 µg µL במאגר פירוק.
    3. להכין את הדגימות מרחביות-הדף על-ידי הוספת 10 µL Laemmli מדגם מאגר µL 90 חלבון שבר (1.5 µg µL), מרתיחים את הדגימה עבור 5 דקות24.
  2. Immunoblotting
    1. השתמש 8% מרחביות-אקרילאמיד ג'לים עם כיסים µL ו- 0.75 או 1 מ"מ עובי 20-30. הפעל את הג'ל בגיל 25 מא עבור 2 h-RT.
    2. הסר בזהירות את מכסה הזכוכית של הג'ל. לגזור ולמחוק את החלק העליון של הג'ל המכיל את הכיסים טעינה. מקם את הג'ל על קרום ניטרוצלולוזה (0.2 µm) בעבר טבולים תספיג מאגר. להעביר את החלבונים ניטרוצלולוזה לפי המלצתם של המערכת (למשל, 250 mA עבור h 1 ב 4 ° C).
    3. הסר את הקרום ניטרוצלולוזה ממערכת blotting. מכתים את האבן החשופה עם צבע מאכל פונסו אדום כדי להמחיש את החלבונים. להעביר את הקרום ניטרוצלולוזה לתוך תא פלסטיק ולהוסיף 10 מ"ל חסימת פתרון. תקופת דגירה של 1 h RT או למשך הלילה ב 4 º C.
    4. Decant הפתרון חסימה ולהוסיף נוגדן monoclonal anti-polySia 735 (1 µg/mL) ב- PBS. דגירה הקרום עבור 1 h RT או למשך הלילה ב 4 º C. לאחר דגירה, לשטוף את הקרום לפחות שלוש פעמים במשך חמש דקות עם PBS.
    5. הוסף polyclonal העכבר אנטי איג משני נוגדנים (1 µg/mL) מצמידים חזרת peroxidase (HRP) או בתווית פלורסנט ב- PBS. דגירה הקרום עבור h 1-RT. לאחר דגירה, לשטוף את הקרום לפחות שלוש פעמים במשך חמש דקות עם PBS.
    6. להעביר את הקרום על גבי צלחת imager המתאים. לזהות את האות לפי הוראות היצרן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Chromatograms HPLC של פלורסנט תווית Neu5Ac ואת הסטנדרטים Neu5Gc מתוארת באיור2. באמצעות השיטה המתוארת במסמך זה, התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות Neu5Gc בדרך כלל elutes בין 7-9 דקות • תנאי הזמן, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Ac בין 10-12 דקות. מספר פסגות ההרים קטנים יותר chromatogram מופיעים בדרך כלל בין 2-6 דקות. בפסגות אלה מייצגים unreacted DMB, התגובה intermediates25.

איור 3 מראה chromatograms הנציגה של התא lysates. בהשוואה של chromatograms את הסטנדרטים התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות (איור 2), ב- chromatograms אלה גלויים במספר פסגות לא מוגדר. . זה קרוב לוודאי שהסיבה הטומאה הפנימי של התא lysates, את העובדה כי DMB לא רק מגיב עם חומצה sialic מינים, אלא גם עם אחרים חומצות α-קטו נוכח תא lysates, כולל פירובט, succinate וα-ketoglutarate26. הנוכחות של כמויות קטנות של חומצות sialic הנושאת O-שינויים אצטיל זה לא ביקע על ידי הידרוליזה אצטית אולי התייחס גם סיבה אלה פסגות לא מוגדר23. Chromatograms מתאי לא מטופל lysed לעומת chromatograms מתאי בעבר שטופלו ManNAc או תחליפי שלה. כפי שמוצג להלן, טיפול עם ManNAc לעיתים קרובות מוביל דלדול כמעט שלם של Neu5Gc על פני התא. ב- chromatograms של תאים lysed שטופלו Neu5Prop או Neu5But, פסגות גלויים זה אינם מופיעים ב- chromatograms של תאים שלא טופלו. בפסגות אלה (עבור ManNProp תאים בערך 19 דקות • תנאי זמן ובא עבור ManNBut התייחסו תאים על 42 דקות) מציינים את המראה המתאים הלא טבעי sialic חומצות, Neu5Prop ו- Neu5Gc. כמתואר בסעיף 8.3 של הפרוטוקול, ניתן לנתח את chromatograms hplc, קורס על מנת לכמת את הכמויות של מינים שונים חומצה sialic ב lysates התא.

העובדה כי פסגות השמירה HPLC נפרדות תואמות מינים מסוימים sialic חומצה אומתה באמצעות ספקטרומטר מסה. נציג ESI-MS נתונים שנאספו פסגות HPLC עניין מתוארת באיור4: הספקטרום של הפסגה השמירה DMB-Neu5Ac שנאספו בחלונית השמאלית העליונה, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Gc נכון הפאנל העליון, ואת שני הגזעים הלא טבעי sialic חומצה. Neu5Prop-בנק דיסקונט למשכנתאות, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5But נמוך ימינה ושמאלה הפאנלים. התגובה עם בנק דיסקונט למשכנתאות מוביל לעלייה המסה המולקולרית של דה 116.2, לעומת המין חומצה sialic זה לא מסומנים עם צבע זו. ב ספקטרום המוני, בעת הצגת היחס מסה/מטען חיובי של הדגימות מוזרק בין 300 ל- 700, במספר פסגות גלויים. . זה אמורים adduct היווצרות של המכשיר מכובד התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות. חוץ protonated יון [M + H]+, הנתרן adducts [M + Na]+ , [M + 2Na-H]+ להופיע. כמו acetonitrile (לחצן מצוקה) הוא נוכח במהלך הניתוח LC, אותו ניתן למצוא כמו adduct ב ספקטרום המוני (המוצג עבור DMB-Neu5Gc, איור 4: לוח נכון העליון). עקב פיצול הנגרמת על ידי הפעלות ההחרפה collisional שנוצר באזור תחבורה electronspray בין את נימי גזרן הראשון את, מיובש sialic חומצה גם יכול להיות שנצפו מינים [M + H]+-H2O (מוצג עבור DMB-Neu5Ac, איור 4: פאנל שמאלי עליון)23,27. בכיוונון LC, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Gc elutes זמן קצר לאחר unreacted או חלקית יפעלו ויגיבו DMB-המינים. לכן, החללית DMB-Neu5Gc שנאספו עשויים להכיל זיהומים שנגרמו על ידי אלה intermediates התגובה. זה משמש הסבר המראה של פסגות לא מוגדר בספקטרום המונית של בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Gc (איור 4: לוח נכון העליון).

טיפול תאי נוירובלסטומה קלי עם ManNProp או ManNBut מובילה לביטוי מופחת של חומצה polysialic על NCAM, כפי שמוצג על ידי ניתוח תספיג של קרום התא מתאי lysed (איור 5). חומצה Polysialic מופיע בדרך כלל כתם לעשות שלה הטרוגניות פיקוד (≈ 200 kDa) ובגודל. טיפול תחליפי ManNAc שמוביל ההפחתה של חומצה polysialic על פני תאים: ככל אליפטיות N-שרשרת הצד acyl השומן, חזקה יותר של הפחתת28.

Figure 1
איור 1: העיקרון הכללי של MGE עם N-acyl השומן שונה mannosamines. לאחר הטיפול עם N-ליפיד שונה mannosamines, תחליפי ManNAc הללו הם unidirectionally מטבוליזם (תאיים החומרים) חומצות sialic הלא טבעי המקביל. אלה מועבר גולג'י, להעביר את מקבל פחמימה # מיון הפחמימות בהתאמה על ידי sialyltransferases, המבוטא על פני תא sialosides (כאן, גליקופרוטאין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: chromatograms הנציגה של סטנדרטים התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות חומצה sialic. Neu5Ac התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות (החלונית העליונה), Neu5Gc (החלונית התחתונה) נותחו על ידי HPLC. השמירה פעמים (קווים מקווקווים) ואזורי שיא של שתי חומצות sialic נקבעו לאחר הזרקת 10 ng המינים התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות מכובד לתוך מערכת HPLC. ב שמוצג במסמך זה נציג chromatograms, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Gc eluted לאחר כ 8 דקות זמן השמירה ואת DMB-Neu5Ac ב- 11 דקות, בהתאמה. מספר פסגות ההרים קטנים יותר chromatogram מופיעים בדרך כלל בין 2-6 דקות, המייצג unreacted intermediates DMB ותגובה. חלק קטן של Neu5Ac התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות מופיע הטומאה קטין בתקן DMB-Neu5Gc (החלונית התחתונה). נתון זה משתנה מהפניה22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: אפיון של קרום מכורך חומצות sialic על ידי בנק דיסקונט למשכנתאות-HPLC- התאים היו תרבותי בתוך העדר (לוח אינו מטופל, העליון) או נוכחות עם 5 מ מ ManNAc (הפאנל השני מלמעלה), ManNProp (לוח השלישית מלמעלה), או ManNBut (החלונית התחתונה), בהתאמה במשך 7 ימים. המדיום השתנה כל ה 24 תאים נקטפו, ממברנה שברים היו מוכנים, המסומנת DMB, נותחו על ידי HPLC. By comparison with chromatograms של סטנדרטים התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות חומצה sialic (איור 2), פסגות במועדים השמירה בין 8-9 דקות אותרו כמו בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Gc, ואת פסגות בין 10-11 דקות כמו בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Ac. לעומת הפסגות המתקבל הזרקת חומצה sialic התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות סטנדרטים, chromatograms מן lysates תא להראות פסגות נוספות, לא מוגדר. זאת בשל הטומאה פנימי של הגששים, כמו גם את העובדה כי DMB יכול להגיב לא רק עם חומצה sialic נוכח lysates התא, אלא גם עם אחרים חומצות α-קטו נוכח תא lysates, כולל פירובט, succinate וα-ketoglutarate. פסגות המופיעים רק chromatograms של דגימות מתאי תרבותי בנוכחות N-acyl השומן ששינה תחליפי mannosamine לציין את המקביל התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות הלא טבעי sialic חומצות. נתון זה משתנה מהפניה22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: המוני ספקטרום של המינים התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות חומצה sialic תא lysates. פסגות השמירה HPLC עניין (ראה איור 3) נאספו, לאחר מכן נותחו על ידי 20. גברת ESI µL של retentions שנאספו פסגות הוזרקו לתוך מערכת LC-MSD. התגובה עם בנק דיסקונט למשכנתאות מוביל לעלייה המסה המולקולרית של Da 116.2 לעומת המין חומצה sialic unreacted המתאימים. Spectrograms יחס מסה/מטען חיובי מתקבל ממינים שונים חומצה sialic מתוארים (DMB-Neu5Ac: פאנל שמאלי עליון, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Gc: לוח נכון העליון, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5Prop: פאנל שמאלי תחתון, בנק דיסקונט למשכנתאות-Neu5But: לוח נכון נמוכה יותר). בשל כדי adduct היווצרות במספר פסגות גלויים. חוץ protonated יון [M + H]+, סודיום adducts [M + Na]+ , [M + 2Na-H]+ להופיע. Acetonitrile, אשר נוכח במהלך הניתוח LC, ניתן למצוא גם בתור adduct (לוח נכון העליון). בנק דיסקונט למשכנתאות מיובש-Neu5Ac, אשר מופק על ידי פיצול בכלי [M + H]+-H2O יכול להיות שנצפו (פאנל שמאלי עליון). החללית DMB-Neu5Gc שנאספו עשויים להכיל זיהומים שנגרמו על ידי בנק דיסקונט למשכנתאות unreacted, כמו גם התגובה intermediates לראות פסגות נוספות לא מוגדר (לוח נכון העליון). לחצן מצוקה, acetonitrile; H, המימן; נה, נתרן. נתון זה משתנה מהפניה22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: ניתוח של polysialylation של NCAM. קלי נוירובלסטומה התאים היו תרבותי היעדרות או נוכחות של 5 מ מ ManNAc, ManNProp, או ManNBut במשך 7 ימים. תאים נקטפו, חלבונים היו מופרדים על 8% מרחביות-אקרילאמיד ג'לים, נותחו על ידי תספיג באמצעות נוגדן monoclonal anti-polySia 735. שימו לב ש-polysia הזה מופיע כתם בשל הטרוגניות שלה במספר Sia, וכתוצאה מכך בגדלים שונים וחיובים של polySia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אם נגזרות מסונתז כימית ManNAc, ManNProp ו- ManNBut הם ניתחו באמצעות ספקטרומטר מסה, צריך להיות מזוהה רק הפסגה המוני הנכון עבור שתי דגימות. לכן, ניתן להניח את המוצרים יש טוהר של מעל 99%. כמויות קטנות של Neu5Gc, אשר בדרך כלל לא נמצא תאים אנושיים29, מזוהים בחלקים הממברנה של התאים lysed. זה קרוב לוודאי מתרחשת דרך שביל הצלה זה מגייס Neu5Gc מ- sialoglycoconjugates העובר סרום שור ב- media30. בתמציות למבשר הטבעי של הביוסינתזה חומצה sialic, ManNAc, מוריד באופן דרסטי את הביטוי של epitope Neu5Gc על פני התא.

היישום של mannosamines ששונה רעיל החזרה על כל התאים נחקרו עד כה. תאים מקבלים ריכוזי הסוכר millimolar מוגברת בתוך המדיום, אשר הוא הכרחי, שכן אין שנאים ספציפי עבור N- acylmannosamines. זה הוכח, כי האות התמרה חושית המסלולים מופעלים על יישום של N- acylmannosamines, אשר יכול להשפיע על התא צמיחה או בידול31,32. זה נובע דפוס sialylation שהשתנו או משקף השפעה ישירה על sialylation ששונה לא ידוע עד כה. הצמיחה של תאים בנוכחות אנלוגים C2-השתנה ManNAc, ManNProp או ManNBut תוצאות בביטוי של חומצה sialic הלא טבעי מינים נושאת את המקביל N-החלפת ליפיד. יעילות מטבולית של השני נבדק N-acyl השומן שונה mannosamines משתנה. הטיפול עם ManNProp בדרך כלל מוביל הבעת Neu5Prop המתאים על פני התא, ביטוי ירידה של Neu5Ac, כמו גם Neu5Gc. אחרים N-acyl השומן ששינה תחליפי mannosamine, כמו mannosamine - cyclopropylcarbamyl N, נוטים להיות בעלי יעילות מטבולית גבוהה יותר של22.

מחקרים קודמים חשף כי סימנים מקדימים sialic להפריע polysialylation. חומצות Polysialic באים לידי ביטוי כמעט באופן בלעדי על NCAM. מעניין, NCAM יכול להיות polysialylated על ידי שני polysialyltransferases נפרדים לידי ביטוי גולג'י (ST8SiaII ו- ST8SiaIV). התברר ManNProp הזה, ManNBut, אחרים N-acyl השומן-mannosamines ששונה להפריע polysialylation וכי זה נובע בעיקר אינטראקציה עם ST8SiaII14. Sialyltransferase הזה בא לידי ביטוי במהלך הפיתוח ועל חשוב להתפתחות המוח. מעניין גם רבים גידולים מהעלאת מקור עצביים מחדש אקספרס ST8SiaII ממאירות שלהם, עוד יותר וגורם להם לגילוי של המערכת החיסונית33. לעומת זאת, היישום של ManNAc מובילה לעליה של polySia, מאז היא מובילה לעליה של CMP-Neu5Ac, אשר הוא המצע הטבעי של שני polysialyltransferases.

MGE הינה שיטה ייחודית להציג את הרומן חומצות sialic על חלבונים עניין (למשל, אריתרופויאטין), ובכך לווסת את תפקידה. יתר על כן, זה יכול לשמש כדי לווסת גליקוזילציה פני שטח התא, אשר עשוי להיות עניין למחלות רבות, כגון סרטן, מאז תאים סרטניים רבים לנסות לברוח את המערכת החיסונית על ידי הבעת רמות גבוהות של חומצה sialic. השיטה המוצגת כאן מאפשר: ראשית, כדי לבצע glycoengineering באמצעות תרביות תאים, ודבר שני, לנתח מהונדסים glycans להוכיח glycoengineering מוצלח. השיטה היא מאוד חזקים, עד כה, ללא החסרונות מדווחות; לעומת זאת, השיטה הורחבה כדי להציג את קבוצות פעילים כימית כדי לבצע לחיצה-כימיה על תאים13.

כאן אנו מציגים שני ManNAc תחליפי עם אליפטיות N-שינויים שרשרת הצד ליפיד וזהובה פשוט לסנתז, אפילו על ידי מעבדות עם ציוד פחות ופחות ניסיון סינתזה. קבוצות שהם מוכרים יותר כימיה אורגנית יכול לסנתז אחרים תחליפי ManNAc עם מבנים מורכבים יותר, להשתמש בהם עבור MGE, כולל אנלוגים שנקרא 'bioorthogonal', אשר יכול להיות מנוצל, לדוגמה, לדמיין sialylated glycoconjugates. ישנם מאמרים סקירה נותן מבט כולל N-acetyl-נגזרות mannosamine צריך להיות מסונתז עד כה13,34. N- azidoacetyl mannosamine (ManNAz), חומר זה משמש לעתים קרובות, כדי להמחיש sialylated glycans, זמין מסחרית. בגלל החדירות הממברנה נמוכה של תחליפי ManNAc, זה יכול להיות יתרון לשימוש נגזרות של סוכרים אלה עם מוגן-קבוצות הידרוקסיל, למשל, peracetylated ManNAc תחליפי. לאחר הזנת הציטופלסמה, שיגן על הקבוצות הן ביקע מאת cytoplasmic esterases, ובכך לשחרר את36,35,monosaccharides פעיל37. עם זאת, peracetylated ManNAc תחליפי לחשוף cytotoxicity גבוהה יותר בהשוואה את המתאים נגזרות לא מוגן.

כתב יד זה, בחרנו נוירובלסטומה מונצחים תאים לניסויים שלנו עם MGE. באופן כללי, MGE (במיוחד עם ManNProp ו- ManNBut) יכול להיות מיושם במגוון רחב של שורות תאים, כולל שורות תאים מונצחים (ראה Wratil. et al. 13 לדוגמאות) ראשי תאים38,39. יתר על כן, MGE היה מנוצל בהצלחה לשנות sialylation ויוו 40 C. elegans, דג זברה17,41, העכבר19,20,42ו עכברים 43 , 44. את שעת הטיפול ואת הריכוז של אנלוגים ManNAc בניסויים MGE יכולים להיות מגוונים להשפיע על יעילות מטבולית של שיטה זו. מהניסיון שלנו, ריכוז גבוה וטיפול ארוך להתכתב עם יותר החלפת המינים sialic חומצה המתרחשים באופן טבעי במערכת glycoconjugates על ידי Neu5R שונה. אם ריכוז גבוה מאוד של נגזרות ManNAc כדי לשמש, כדאי להעריך את cytotoxicity של הטיפול, למשל, על-ידי וזמינותו MTT או הפחתה resazurin וזמינותו.

כתב יד זה, אנו מציעים באמצעות אולטרה-sonication עבור תא המגון. שיטות אחרות של פירוק התא נבדקו במעבדה שלנו, כולל douncing על הקרח (כ-250 משיכות), צרפתית שיבוש התקשורת (10,000 psi, 4 מעברים), עם תוצאות דומות לגבי כמות חומצה sialic שאותרו בדגימות. היתרון של אולטרא סאונד המגון הוא כי היא צריכה קצת זמן, אינו מחייב את התוספת של DNAase הדגימות לפני פירוק.

אנחנו התמקדנו הניתוח שלנו שברים הממברנה של התא lysates, כי רצינו להראות שינויים sialylation של הממברנה מאוגדים glycoconjugates. חומצה sialic נגזרים וריכוזי שלהם ניתן גם למדוד את ציטוזול של תאים, לאחר השבר ממברנה הופרד על ידי צנטריפוגה במהירות גבוהה, תוך שימוש באותה השיטה כפי שתואר לעיל. עם זאת, הריכוזים של חומצה sialic ציטוזול הם נמוכים עד 100 x לעומת הביטוי sialic חומצה על קרום התא7. לפיכך, נדרשים כמויות גדולות יותר של תאים כדי להפיק תוצאות אמינות. הבריכה של חומצה CMP-sialic cytosolic, מופעל נמדד באופן עקיף על ידי מראש לטיפול שברים cytosolic של תאים lysates עם נתרן borohydride לפני הידרוליזה7,45. על מנת hydrolyze sialic חומצה glycoconjugates, חומצה sialic עם שינויים הידרוקסיל, התאים היו מודגרות עם 1 מ' TFA. פתרונות חומציים אחרים יכול לשמש הידרוליזה, כמו גם, למשל, 2 מ' חומצה propionic, חומצה אצטית 2 מ' או 1 M HCl.

בעיית המערכת נתקלה אפשרי במהלך ניתוח HPLC היא כי פסגות עניין חופפות עם פסגות לא מוגדר. זה בעייתי במיוחד כאשר הכמות של חומצה sialic דוגמאות יש לחשב לפי האזור מתחת העקומה לשיא מסוים. להפריד לשיא של ריבית שיא לא מוגדר, אולי ניתן לכוונן את הריכוז acetonitrile של הממס HPLC (± 3%). אנו מציעים שימוש קבוע ריכוזים הממס לצורך, hplc, קורס ניתוח נותן היתרון של הכנת התערובת ממס לפני כרומטוגרפיה. לכן, השיטה שלנו דורש משאבת hplc, קורס אחד בלבד, הוא ריאלי עבור מגוון רחב של מערכות שונות HPLC. אם המשאבה אחד או יותר זמין במערכת HPLC, יכול להיות מיושם הדרגתי איזוקראטית עם הגדלת ריכוזים של acetonitrile, למשל, 4-9% ב- 35 דקות45. באמצעות טכניקה זו, זמן השמירה של פסגות HPLC מסוימים ישונו באופן משמעותי. אסטרטגיה זו יכולה גם לעזור להשיג הפרדה טובה יותר חופפים פסגות. לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון ספקטרומטר מסה (MALDI-MS) נוצר בהצלחה כדי לאמת את הביטוי שונה חומצה sialic המינים על פני שטח התא45, ובכך משמש כמו השקולה ל השיטה ESI-MS המובאת כאן .

בשל את hydrophilicity של ManNAc תחליפי ואת חוסר שנאים ספציפי הקליטה של אלה derivates46, ריכוזים גבוהים יש צורך בניסויים MGE עם תרכובות אלו. לכן, בניסויים קנה המידה למעלה, במיוחד, ניסויים ויוו , כמויות גדולות של אנלוגים ManNAc בהתאמה נחוצים מראה מגבלה אפשרי של טכניקה זו. מצד שני, בהתאם הקווים תא המשמשים, מספר מינימלי מסוים של תאים שטופלו יש צורך להשיג תוצאות אמינות בניתוח HPLC. מהניסיון שלנו, מספיקה מינימום של-100,000 תאים חסיד או ההשעיה 150,000 תאים (1-2 בארות של צלחת 96-ובכן עם תאים confluent). זה יכול להיות צוואר בקבוק, אם הניתוח הוא יפוטר, לדוגמה בהקרנה גישות.

עם השיטות שהוצגו בכתב היד, חומצה sialic ונגזרותיו יכול להתגלות ב תא lysates. עם זאת, המבנה ואת הרכב glycoconjugates תאים שטופלו נגזרים ManNAc לא יכול להיות מוערך עם טכניקה המתוארים במסמך זה. פענוח המבנה של glycoconjugates, e.g.,N- O- glycans, בדרך כלל דורש ניסיון רב יותר של המתקן מטבולומיקס47. לידע שלנו, עד כה, אין נתונים זמינים על מבנה מובהק glycoconjugates של תאים שטופלו עם תחליפי ManNAc.

תספיג חלבון ניתוח של חומצה polysialic היא שיטה מאוד מהירה וקלה. עם זאת, נתונים שהושגו על ידי שיטה זו אינם כמותיים, מאז הזיהוי משתמש נוגדנים chemiluminescence. לכן, השימוש בשיטות HPLC הוא יתרון על פני סופג המערבי. עם זאת, אנו מציעים שימוש בשיטת immunoblotting, שכן הוא קל ליישום וידועים לעבוד בצורה אמינה במיוחד.

הביטוי של חומצה sialic על פני התא יכול להשתנות גם על ידי שיטות MGE. כמתואר לעיל, תאים יכולים להיות מטופלים עם sialidase, אנזים cleaves sialic חומצה שאריות של glycoconjugates בצורה יחסית לא ספציפי. טיפול Sialidase וכתוצאה מכך גורם hyposialylation בתאים שטופלו. למרבה הצער, טיפול sialidase היא טכניקה מוגבל למדי, כפי שהוא ציטוטוקסיות, לא ריאלי עבור זמן זמן הטיפול, לא ישים בניסויים ויוו . טכניקה נוספת לזירוז hyposialylation בתאים היא באמצעות מעכבים של הביוסינתזה חומצה sialic. מגוון רחב של מעכבי זמין גם כוון את האנזים מפתח של חומצה sialic ביוסינטזה, UDP -N- acetylglucosamine-2-epimerase /N- acetylmannosamine-קינאז (GNE/MNK), או את קבוצת sialyltransferases6, 7,8,48. אחד של תרכובות אלו, חומצה sialic C3-fluorinated אנלוגי, הוצגה כדי להוריד את הביטוי של חומצה sialic חי עכברים49. חיות מטופלים עם החומר הזה, לעומת זאת, הראה פגיעה בכבד, חוסר תפקוד כלייתי בלתי הפיך, כשלון לשגשג49. תוצאות אלו לאשר את תפקיד מכריע Neu5Ac בתפקוד כבד וכליות, עוד יותר לציין את הגבולות של מעכבי sialylation ויוו לניסויים. שיטה שלישית כדי ליצור תאים עם sialylation פני שטח התא השונה היא על ידי הפרעה את הביטוי של אנזימים מכריעים של הביוסינתזה חומצה sialic. דפיקה למטה של GNE/MNK בתאים מונצחים, לדוגמה, הוצגה לעיבוד אלה תאים hyposialylated 9. האפשרות לקבל בקלות יחסית טוק-in והחוצה גנים ב סלולרי ושימוש ויוו הרומן והטכניקה CRISPR-Cas9 מוכרת היטב עלול להוביל הרומן גילויים לגבי חומצה sialic ביוסינטזה וסלולרי לפני השטח sialylation.

היתרון של MGE בהשוואה מהטכניקות שתוארו כאן, היא שזה קל ליישום וישימה יומי ניסויים שונים, של ניסויים במבחנה לתא מבחני מבוסס וניסויים ויוו . שיטה חלופית כדי למדוד את הביטוי ואת ריכוזים של מינים שונים sialic חומצה בדגימות תא היא על ידי ביצועים גבוהים אניון חילופי גזים (HPAEC) עם זיהוי אלקטרוכימי פעמו50. על ידי שימוש בשיטה זו, הביטוי של חומצה sialic נמדד באופן ישיר, לא אחרי תיוג עם הפלורסנט. היתרון של שיטה זו הוא כי זה יכול להיות מנוצל גם לנתח monosaccharides מלבד חומצה sialic ונגזרותיו בתוך התא-חלבון-דגימות. למרבה הצער, הרגישות של HPAEC נמוכה לעומת fluorometric זיהוי של חומצה sialic-בנק דיסקונט למשכנתאות. לפיכך, HPAEC מוגבלת ניסויים עם הזמינות של מדגמים גדולים כמויות51.

השיטות המתוארים במסמך זה יכול לשמש כדי לחשוף את מאפייני glycoconjugates לא ידוע. שפע של דוגמאות לשימוש של MGE לחקור חומצה sialic תלויים אינטראקציות כבר קיימת13, מציג את הכדאיות של טכניקה זו בהקשר של מגוון רחב של כיוונונים ניסיוני.

כיום, MGE עם N- acetylmannosamines משמש בעיקר על ידי חוקרים בתחום glycobiology. אנו מקווים כי טכניקה זו תוכר על ידי קהל רחב יותר כלי רב-תכליתי לשינוי glycoconjugates. שדות אחרים, כולל אימונולוגיה, וירולוגיה, נוירולוגיה, אונקולוגיה ייהנו באמצעות התאמת טכניקה זו למטרותיהם. מחקר צולבות על כזה עשוי לאפשר הגילוי של איזורים. עדיין לא ידועים, ולכן נותן הבנה טובה יותר של מחלה ובריאות. מחקרים מוקדם, לדוגמה, טכניקה זו שימשה כדי לייצר glycoproteins עם גליקוזילציה שונה, אשר מאוחר יותר לשמש ויוו חיסון. במקרים מסוימים, טיפול עם חיסונים glycoengineered כזה להוביל בייצור נוגדנים נחשף ובצמא מתקדם ורעילות ל-52,מטרות בהתאמה53. אחרים משתמשים בהצלחה MGE לפתח מודל לטיפול ממוקד הגידול עכברים54. מחקר אחר הראה מערכתית ויוו הזרקה של ManNProp קידום התחדשות העצבים55. במקרה של polySia, זה הוצג כי הולכת ופוחתת הביטוי של זה epitope בתאים נוירובלסטומה על ידי שיטות שהוצגו בכתב היד, מגביר את הרגישות של אלו תאים סרטניים לקרינה או טיפול עם תרופות נגד סרטן56.

הכמויות של חומצה sialic נמדד בתוך דגימות עשוי להשתנות בהתאם השיטה שבה נעשה שימוש כדי לנתק את התאים שטופלו. כתב יד זה, דגירה עם טריפסין שימש להתנתק תאים. אם טכניקות אחרות לשמש, כמו גירוד את התאים או טיפול ותיק עם PBS + EDTA, הכמויות של חומצה sialic נמדד הדגימות עשויים להיות שונים. אפילו התאמת זמן הדגירה עם טריפסין יכולה להיות לו השפעה על ריכוז חומצה sialic נמדד בהמשך. מהניסיון שלנו, ההשפעה של שיטת ניתוק התא על הסכומים של חומצה sialic שנמדד הוא מתחת ל-15%, אבל אם התוצאות המתקבלות אינן מנורמל, בהשוואה, זה עלול להפוך חשוב צוואר בקבוק. בנוסף, השיטה עבור פירוק של התאים יכולים להשפיע על התוצאה של הניתוח HPLC. לפיכך, אנו ממליצים לקורא לתקנן את ניתוק התא והמסה בניסויים שלהם.

כדי להשיג הפרדה של השבר הממברנה של התא lysates, השתמשנו צנטריפוגה עבור 2 h ב 20,000 x g ו- 4 ° C (סעיף 5.1). פרוטוקולים צנטריפוגה אחרים עשויים להשפיע על ההפרדה ולכן הכמויות של חומצה sialic שאותרו בדגימות. . תרכובת קריטיות בתוך פרוטוקול זה הוא בנק דיסקונט למשכנתאות, כי זה מאוד רגיש לאור ופוגם לאורך זמן. כאן אנו ממליצים למנות קטנות aliquot של בנק דיסקונט למשכנתאות-פתרונות, מאגר זה כמו מניות ב- 20 ° C, מוגן מפני אור (סעיף 1.6.1). בדרך זו, בנק דיסקונט למשכנתאות-הפתרון ניתן לאחסן במשך מספר שבועות. אם התוצאות של בנק דיסקונט למשכנתאות-hplc, קורס ניתוח להראות הפחתה אותות עבור מינים חומצה sialic או חיזוק אותות במרחק 6 דקות הראשונה המדידה HPLC, המייצג את בנק דיסקונט למשכנתאות, מוצריה התגובה, בנק דיסקונט למשכנתאות-פתרון חדש צריך להיות מוכן. לא מחדש להקפיא ולהשתמש מחדש DMB-פתרון לאחר מפשיר את זה. לאחר תיוג בנק דיסקונט למשכנתאות, כל דוגמאות צריך להיות מנותח באופן מיידי. אם מספר גדול של דוגמאות (> 10) כדי להיות מנותח, דגימות אלה צריך להיות מחולק תגים קטנים ומוענקת בהדרגה בנק דיסקונט למשכנתאות. התגובה בשני תיוג כמו גם הגששים התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות צריך להיות מוגן מפני אור בכלל פעמים. לאחר • תנאי, המין התווית על-ידי בנק דיסקונט למשכנתאות חומצה sialic צריך להיות מנותח מיד על ידי ישיר. גברת ESI זיווג HPLC עם מערכת ESI-MS (בתוך מלכודת LC-ESI-MS) אינה נחוצה, אבל יכול להיות יתרון כדי להשיג איכות גבוהה יותר ספקטרומטר מסה ניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים ל' ד נגוין להגהת כתב היד ועל דיונים פוריים. יתר על כן, אנו מודים Dernedde ג' וה' ג' נגוין שעזרת לנו להכין את. הצילומים. רוב סצנות של הווידאו נורו במעבדות ר טאובר. אנו מודים גם מכון מקס פלנק קולואידים ואמולסיות, ממשקים, ואשר נתן לנו גישה חופשית למתקן ספקטרומטר מסה שלהם. RH נתמכה על ידי DFG (ProMoAge).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. , 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 129 חומצה Sialic חומצה polysialic כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים תרבית תאים glycoengineering מטבולית הנדסה מטבולית פחמימה # מיון הפחמימות
Glycoengineering מטבולית של חומצה Sialic באמצעות <em>N</em>-acyl השומן-שונה Mannosamines
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wratil, P. R., Horstkorte, R.… More

Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter