Summary
Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de lange termijn ex vivo cultuur en live beeldvorming van een Drosophila imaginaire disc. Het toont fotoreceptor differentiatie en ommatidial rotatie binnen de 10 uur periode van live-imaging van het oog disc. Het protocol is eenvoudig en niet duur setup nodig.
Abstract
Live-Imaging biedt de mogelijkheid om voortdurend bewaken dynamische cellulaire en ontwikkelingsprocessen in real time. Drosophila larven imaginaire schijven zijn gebruikt voor vele biologische processen zoals celproliferatie, differentiatie, groei, migratie, apoptose, concurrentie, cel-cel signaal en compartimenteel grensvorming bestuderen. Echter zijn werkwijzen voor de lange termijn ex vivo cultuur en live beeldvorming van de imaginaire schijven niet bevredigend is geweest, ondanks vele inspanningen. Onlangs ontwikkelden we een methode voor de lange termijn ex vivo cultuur en live beeldvorming van imaginal schijven voor maximaal 18 uur. Naast het gebruik van een hoge concentratie insuline in het kweekmedium werd laagsmeltend agarose ook gebruikt om de schijf te voorkomen afglijden tijdens de beeldvormende periode insluiten. In dit rapport wordt de eye-antennaal schijven als een voorbeeld. Fotoreceptor R3 / 4-specifiek mδ0.5 GA4-expressie werd gevolgd om dat fotoreceptor Gesplitste aantonentiation en ommatidial rotatie gedurende 10 h levende beeldvorming worden ingelast. Dit is een gedetailleerd protocol beschrijft deze eenvoudige methode.
Introduction
De Drosophila larve imaginal discs zijn een geprefereerd experimenteel systeem voor de studie van een breed scala van biologische mechanismen. Deze schijven vallen uit het embryonale epithelium en worden sac-achtige structuren die zijn opgebouwd door twee epitheliale lagen, Peripodial Epithelium (PE) en Disc Proper (DP) 1 , 2 . De imaginale schijfcellen prolifereren en progressief onderscheiden tijdens de larve- en pupale fasen en ontwikkelen zich uiteindelijk tot de volwassen lichaamsstructuren. Door de platte en eenvoudige tweelaagse structuur van de imaginale schijven zijn ze makkelijk te observeren wanneer ze uit larven ontleed worden. Ondanks verschillende inspanningen van veel groepen, zijn de huidige methoden voor de langetermijncultuur van de imaginale schijven echter niet bevredigend. We hebben onlangs een cultuurmethode ontwikkeld die de normale ontwikkeling van meerdere imaginale schijven tot 18 uur kan handhaven en waarmee live imaging 3 3. De werkwijze is eenvoudig en geen speciale beluchten of mediumcirculatie vereist.
Een van de best bestudeerde imaginaire schijven is de eye-antennal disc. De Drosophila oog is opgebouwd uit ongeveer 800 ommatidia. Elke ommatidium bestaat uit acht fotoreceptorcellen (R1-R8). In het larvale oog disc, differentiëren de fotoreceptor cellen na de passage van de morfogenese De Voor (MF), die veegt over het oog disc van posterior naar anterior 4, 5. Fotoreceptoren per ommatidium differentiëren in volgorde, beginnend met R8, gevolgd door R2 / R5, R3 / R4 R1 / R6 en R7 6. De ommatidia in de dorsale en ventral helften van het oog schijf ondergaat een 90 ° rotatie in tegengestelde richtingen, wat resulteert in tegengestelde chiraliteit 7, 8. De rotatie proces vindt plaats in twee stappen: eerst, begint een 45 ° rotatie bij en wordt direct in het zesde ommatidia rij achter de MF; de tweede 45 ° rotatie is voltooid bij ongeveer 16 tr 9, 10. Herbij ommatidial rotatie, gekenmerkt door de R3 / 4-specifiek mδ0.5-GA4 11, de normale celdifferentiatie en dynamiek die door deze werkwijze kan worden waargenomen cultuur demonstreren en live-beeld eye disc.
Protocol
1. Pre-experimentele installatie
- Verzamel een vlieg ei dat nucleair groen fluorescerend eiwit (GFP) onder mδ0.5-Gal4 uitdrukt en cultuur bij 25 ° C gedurende 5 dagen.
- Magnetron 0,7 g laagsmeltende agarose in 10 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) totdat de agarose volledig is opgelost. Houd de 0,7% laagsmeltende gel in een 37 ° C incubator tot aan het gebruik.
- Steriliseer alle apparatuur, inclusief tang, schaar, 42 mm x 0.17 mm dekglazen, een 9-putjes glasplaat en een magnetische cultuurkamer, met 70% ethanol gedurende meer dan 12 uur.
- Bereid het kweekmedium 3 voor : Schneider's Drosophila medium aangevuld met 2% Fetaal Bovine Serum (FBS), 0,5% Penicilline Streptomycine en 1,25 mg / ml Insuline. Om contaminatie te vermijden, bereid het medium in een celkweekkap. Bewaar het bereide kweekmedium bij 4 ° C en gebruik binnen een maand.
- Maak het dissectieplatform en de experimentator 's handen met 70% ethanol voor aanvang van de dissectie.
2. Schijf Dissection
- Air droog alle apparatuur van 70% ethanol.
- Selecteer een derde fase larve van een vlieg flacon. Om besmetting van de vlieg flacon te vermijden, was de larve in 1x PBS 3x om het afval te verwijderen.
- Ontleden de gereinigde larve in 1 ml kweekmedium (bij kamertemperatuur) in 9 wells glazen spot plaat onder een dissectiemicroscoop.
- Pak de larve met een pincet op ongeveer een derde van de weg van het achterste uiteinde en een tang bij de mond haak. Trek de twee tang in tegengestelde richtingen om de interne weefsels los.
- Verwijder de speekselklieren, dik lichaam en cuticula van het oog-hersenen complex aan de mond haak. Als de ventrale zenuwkoord nog bevestigd, knippen met een schaar verwijderd.
- Met een pincet naar de mond haak en een pincet grijpen op een stuk weefsel dat co verwijderennnects de hersenen en ogen schijven in het rugdeel.
Opmerking: Als dit weefsel niet wordt verwijderd, zullen de twee eye-antennaal schijven dicht bij elkaar en de hersenen. Het oog discs dan niet vlak op het dekglaasje omdat dit weefsel, de hersenen en het oog antennaal schijf een driehoek vormen. - Roteert het gehele complex een ventrale bovenste stand. Verwijder het filament dat de haak of schijf naar de hersenen verbindt.
OPMERKING: Indien het filament niet wordt verwijderd, zal het oog antennaal schijf verdeeld in twee delen bij de mond haak wordt verwijderd.- Verwijder de mond haak. Zorg ervoor dat u het oog schijf tijdens het proces kunnen beschadigen.
Opmerking: Het oog schijf nu vrij in het medium en slechts verbonden met hersenen door de optische steel.
- Verwijder de mond haak. Zorg ervoor dat u het oog schijf tijdens het proces kunnen beschadigen.
3. Montage
- Lucht drogen en monteren van de componenten van de kamer met een 42 mm x 0,17 mm dekglaasje. Bevestig een dubbele laag van O-ringen op het midden van het dekglaasje te houden the agarose.
- Monteer de kamer met dekglaasje. Zet de 42 mm x 0,17 mm dekglaasje op het podium acceptor. Plaats de siliconen O-ring op het dekglas. Plaats de basis. Sluit de afdichting kast en de afdekking (figuur 1).
- Breng voorzichtig de uitgesneden oog-hersenen complex naar het centrum van O-ring onder toepassing van een 20 pl micropipet met een 10-200 ul tip.
- Verwijder meeste van het medium en voeg 12 ul van 0,7% laagsmeltende agarose (bij 37 ° C) verdund.
LET OP: De positie van het oog schijf kan worden veranderd met een tang voor het stollen van de agar. De agarose stolt binnen 5 minuten.- Voeg 1 ml kweekmedium bij kamertemperatuur om het centrum van O-ring; elke O-ring maximaal 4 monsters. Zorg ervoor dat de agarose is vastgelijmd aan de O-ring aan de drijvende van het monster te voorkomen.
OPMERKING: Geen beluchting of circulatie van het medium nodig is.
- Voeg 1 ml kweekmedium bij kamertemperatuur om het centrum van O-ring; elke O-ring maximaal 4 monsters. Zorg ervoor dat de agarose is vastgelijmd aan de O-ring aan de drijvende van het monster te voorkomen.
4. confocale microscopie
- Plaats de kamer op het podium van een omgekeerde confocale microscoop voor 30 minuten om de temperatuur in evenwicht komen. Dit kan tijdens de beeldvorming te voorkomen drift Z-as.
- Het duurde niet lang termijn live-imaging, controleer dan of het weefsel intact is door differentiële interferentie contrast microscopie.
- De fototoxiciteit te gebruiken die een laservermogen dan 2 mW. Gebruik een 40X objectief voor de beeldvorming.
- Verwerven 62 urn Z-stack afbeeldingen in 12 minuten bij een optisch interval van 1 urn. Verwerven 40 cycli aftastingen dan in totaal 10 uur. Waarborgen dat elke cyclus bestaat uit 12 min beeldvorming en 3 min rusten.
Representative Results
In dit voorbeeld werden de R3 / R4 fotoreceptoren gelabeld met mδ0.5-+ GA4 te fotoreceptor differentiatie volgen. mδ0.5-GA4 drijft sterke expressie in R4 en zwakkere expressie in R3 11, waardoor het een uitstekende marker voor R3 en R4, alsmede voor de werkwijze volgens ommatidial rotatie. In film 1, R3 en R4 werden gelabeld met GFP. Aan het begin van de 10 h levend beeldvormingssessie er 8 rijen ommatidial clusters (figuur 2A en Film 1) en 14 rijen ommatidial clusters eind (figuur 2B). De mate van differentiatie ommatidial was 1,67 uur per rij, dat dicht bij de snelheid van 1,5-2 h / rij in vivo schijven 7, 8, 9, 10, 11,s = "xref"> 12, 13, 14. Op basis van de relatieve posities van R3 en R4, ommatidial rotatie zich in de ex vivo gekweekt disc in levende imaging (figuur 2A 'A', B' en B'). Eén R3 / R4 cluster werd gelabeld met een witte ruimte in het eerste frame van film 2. Aanvankelijk wordt de R3 / R4 loodrecht op de evenaar (figuur 2C en Film 2) zijn. Het blijkt dan 15 °, 30 ° en 45 ° te roteren in 3 (figuur 2C), 6 (figuur 2C '') en 9 (figuur 2C '' ') h resp. Deze gegevens suggereren dat deze methode fotoreceptor differentiatie tijdens de 10 uur live-beeldvorming kan ondersteunen.
Figure 1: Schematische weergave van Chamber Vergadering. Schematisch diagram van kamer samenstel: (1) Plaats de dubbellaagse O-ring bevestigd dekglaasje op het podium acceptor. (2) Plaats de siliconen O-ring op het dekglas. (3) Plaats de basis. (4) Vergrendel de afdichtende kast. (5) Plaats het monster in het midden van de O-ring en de afdekking. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Live-Imaging R3 / R4 differentiatie en rotatie. R3 / R4 gelabeld met mδ0.5-Gal4 tot expressie nucleaire-vorm GFP tijdens de 10 uur van de live imaging. Alle cijfers werden opgevangen uit Movie 1. (A) Beeld dat bij het begin. (
Film 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi" target = '_ blank'> Klik hier om dit filmpje te downloaden.
Discussion
In deze studie, bieden we een gedetailleerd protocol voor een lange-termijn live-imaging experiment op Drosophila imaginaire schijven. We brachten veel tijd oefenen de zorgvuldige dissectie op schijf schade te voorkomen en om voor de bevestiging van de schijf in de buurt van de dekglaasjes. We hebben geprobeerd Poly-L-lysine (PLL) en een laag smeltende agarose om het weefsel te houden; op het einde, de bij lage temperatuur smeltende agarose liet een beter vermogen om het weefsel te houden. Hoewel slechts het oog disc in dit document gebruikt om de normale voorkomen van fotoreceptor differentiatie en ommatidial rotatie gedurende 10 h levende beeldvormende periode tonen, kan deze werkwijze ook worden toegepast op ten minste één andere plaat, de vleugel schijf, zoals aangetoond in een eerdere studie 3. Bovendien is het kweekmedium voorbereiding en live beeldvorming setup zijn eenvoudig en geen beluchting of medium circulatie niet nodig.
Constante live beeldvorming kan een duidelijke tijdsvolgorde van biologische eve biedenNTS. In onze eerdere verslag van glia differentiatie en migratie in het oog disc, op voorwaarde dat we direct bewijs dat het verpakken van glia te onderscheiden van bestaande glia na de migratie naar de voorste van het oog schijf 3. Langdurige ex vivo cultuur zorgt voor de specifieke laser-geactiveerde labeling van cellen, zoals de foto-conversie van de KAEDE fluorescerend eiwit, om hun gedrag 3 te volgen. Het kan ook het testen van chemische stoffen die direct worden toegevoegd aan het kweekmedium tegemoet; aldus, kan het worden gebruikt als een drug discovery platform. Omdat sommige dynamisch proces optreden binnen seconden of minuten, wordt hoge tijdsresolutie vereist. Om de temporele resolutie, licht blad microscopie 15, 16 of draaiende schijf microscopie 17 te verbeteren kan een goede optie zijn.
De huidige cultuur conditie is niet perfect. Het biedt geen ondersteuning groei disc. Cell proliferation wordt alleen ondersteund voor maximaal 12 h3. Na 12 uur in ex vivo cultuur, de snelheid van de fotoreceptor differentiatie begint af te nemen 3. Dit kan te wijten zijn aan het gebrek aan bepaalde voedingsstoffen of hormonen. Aangezien het grote verschil in deze cultuur medium is de hoge concentratie van insuline, kan het zoogdier insuline gedeeltelijk nabootsen van de werking van endogene insuline-achtige peptiden. De toevoeging van fly-extract, het insect bloed suiker trehalose, en verschillende concentratie van de rui hormoon 20-hydroxyecdysone, waren niet gunstig 3. Echter, de kweekperiode 12-18 uur is voldoende om vele ontwikkelingsprocessen te bestuderen. Alternatieve kweekmethoden voor het kweken van larven imaginaire schijven zijn vergeleken 3, en onze kweken en imaging toestand biedt de langste tijd raam en de meeste duidelijkheid voor live-imaging. Hoewel schijven binnen levende larven en poppen rechtstreeks kan worden afgebeeld18, 19, 20, 21, 22, de resolutie en tijdvenster voor waarnemingen beperkt. Late larvale en popstadium schijven kunnen worden gekweekt lang 23, 24, maar de schijven ondergaan aanzienlijke morfogenese. Om gebruik te maken van de platte, 2D larvale schijven, onze kweken en beeldvormingswerkwijze is de beste oplossing tot nu toe.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor Chun-lan Hsu en Yu-Chi Yang voor het bereiden van de vlieg voedsel en het onderhoud van de vlieg voorraden, en Su-Ping Lee en de IMB Imaging Core voor hun hulp bij de confocale microscopie. Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies aan YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, MOST 103-2311-B-001 -035 -MY3) van de National Science Council en het ministerie van Wetenschap en Technologie van de Republiek China.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | AMRESCO | 0780-2PK | |
| 42 mm x 0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9665 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
| 40X objective | C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective | ||
| Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |
References
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 2, Cold Spring Harbor. NY. 747-842 (1993).
- Auerbach, C. The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster. Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).
- Wolff, T., Ready, D. F. The Development of Drosophila Melanogaster. , Cold Spring Harbor Press. 1277-1316 (1993).
- Adler, P. N. Planar signaling and morphogenesis in Drosophila. Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).
- Choi, K. W., Benzer, S. Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye. Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).
- Strutt, D. I., Mlodzik, M. Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions. Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).
- Gaengel, K., Mlodzik, M. Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6. Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).
- Li, C., Meinertzhagen, I. A. Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy. Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).
- Winter, P. W., Shroff, H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging. Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).
- Bosveld, F., et al. Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
- Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae. Plos One. 7 (1), (2012).
- Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc. Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).
- Taylor, J., Adler, P. N. Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs. Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).
- Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis. Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).
- Gibbs, S. M., Truman, J. W. Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila. Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).
- Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro. Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).
