Summary
Этот протокол описывает подробный способ долгосрочного экс виво культуры и живое изображение из имагинального диска Drosophila. Это демонстрирует фоторецепторы дифференцировку и ommatidial вращения в течение 10 ч периода живого изображения глазного диска. Протокол прост и не требует дорогостоящей установки.
Abstract
Живая визуализация дает возможность непрерывно отслеживать динамические клеточные и развитие процессов в реальном масштабе времени. Дрозофилы личиночные имагинальные диски были использованы для изучения многих биологических процессов, такие как клеточная пролиферация, дифференцировки, рост, миграция, апоптоз, конкуренция, сигнализация межклеточной и полигамным границе пласта. Однако методы долгосрочной культуры экс естественных и живых изображений имагинальных дисков не были удовлетворительными, несмотря на многочисленные усилия. В последнее время мы разработали метод долгосрочного экс Vivo культуры и живые изображения воображаемых дисков до 18 часов. В дополнении к использованию высокой концентрации инсулина в культуральной среде, агарозное с низкой температурой плавления было также использовано для встраивания диска, чтобы предотвратить его дрейфовать в течение периода отображения. Этот отчет использует привлекающие усиков дисков в качестве примера. / 4-специфической экспрессии фоторецептора R3 mδ0.5-GA4 последовало, чтобы продемонстрировать, что фоторецептор диффереtiation и ommatidial вращения можно наблюдать в течение 10-часового периода с живым изображением. Это подробный протокол, описывающий этот простой метод.
Introduction
Личинки имагинальных дисков дрозофил были излюбленной экспериментальной системой для исследования широкого спектра биологических механизмов , . Эти диски инвагинировать из эмбрионального эпителия и становятся бурса-подобные структуры , построенные на двух эпителиальных слоев, Peripodial эпителием (ПЭ) и диск Правильное (ДП) 1, 2. Имагинальные дисковые клетки пролиферируют и постепенно дифференцироваться во время личиночных и куколок, и в конечном итоге развиваются в структуры взрослого организма. Благодаря плоской и простой конструкции двухслойной имагинальных дисков, они легко наблюдать, когда рассекали от личинок. Однако, несмотря на ряд усилий многих групп, современные методы для долгосрочной культуры имагинальных дисков не были удовлетворительными. Недавно мы разработали метод культуры , который может поддерживать нормальное развитие нескольких воображаемых дисков до 18 ч, что позволяет жить изображения 3 3. Метод прост и не требует никакой специальной аэрации или средней циркуляции.
Одним из наиболее изученных имагинальных дисков глаз-усиков диска. Глаз дрозофилы построен приблизительно из 800 омматидиев. Каждый омматидий состоит из восьми клеток фоторецепторов (R1-R8). В личиночном глазе диске, фоторецепторные клетки дифференцируются после прохождения морфогенетической борозды (MF), который подметает через глаз диск от заднего к переднему 4, 5. Фоторецепторы в качестве омматидия дифференцироваться в последовательности, начиная с R8, а затем R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, R7 и 6. Омматидии в спинном и веntral половинки глаз диска пройти поворот на 90 ° в противоположных направлениях, что приводит к противоположной хиральности 7, 8. Процесс вращения протекает в две стадии: во-первых, 45 ° поворот на начинается на и завершается на шестой строке омматидиев позади МФ; второе вращение на 45 ° завершается примерно в строке 16 9, 10. В этом исследовании использовали ommatidial вращения, отмеченный R 3/4-специфической mδ0.5-GA4 11, чтобы продемонстрировать нормальную клеточную дифференциацию и динамику , которые можно наблюдать с помощью этого метода к культуре и жить-образа диска глаз.
Protocol
1. Предварительная экспериментальная настройка
- Сбор летучей яйцо, которое экспрессирует ядерный зеленый флуоресцентный белок (GFP) под mδ0.5-Gal4 и культуры при 25 ° С в течение 5 дней.
- Микроволновая печь 0,7 г легкоплавких агарозы в 10 мл 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) до тех пор, пока агарозном полностью не растворится. Хранить гель с низким уровнем плавления в 0,7% при 37 ° C инкубаторе до использования.
- Стерилизовать все оборудование, включая щипцы, ножницы, 42 мм х 0,17 мм покровные, 9-луночного стекла пятна пластиной и магнитной культуральной камеры, с 70% -ным этанолом в течение более 12 часов.
- Подготовьте питательную среду 3: среда Drosophila Шнайдера с добавлением 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 0,5% пенициллина-стрептомицина и 1,25 мг / мл инсулина. Для того, чтобы избежать загрязнений, подготовить среду в капоте культуры клеток. Хранить подготовленную питательную среду при температуре 4 ° С и использовали в течение одного месяца.
- Очистите платформу рассечения и экспериментатор»s руки с 70% этанолом перед началом рассечения.
2. Диск Препарирование
- Воздух сухой все оборудование от 70% этанола.
- Выберите третью возрастную стадию личинку из флакона мухи. Во избежание загрязнения из флакона мухи, моют личинку в 1x PBS 3x для удаления отходов.
- Рассеките очищенный личинку в 1 мл культуральной среды (при комнатной температуре) в 9-луночной стеклянной пластине точечной под микроскопом рассечения.
- Возьмитесь личинку с парой щипцов около одной трети пути от заднего конца и еще щипцов во рту крючок. Потяните два щипцов в противоположных направлениях , чтобы освободить внутренние ткани.
- Удалите слюнные железы, жировое тело и кутикулу от комплекса глаз-мозг, прикрепленного к рту крючок. Если брюшная нервная цепь еще прилагается, его вырезать ножницами.
- Используйте одну пару щипцов, чтобы схватить крючок рта и одну пару щипцов, чтобы удалить кусок ткани, CoПроникает в мозг и глазные диски в спинной части.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если эта ткань не удаляется, два глазно-антенных диска будут находиться близко друг к другу и к мозгу. Глазные диски не будут лежать ровно на покровном стекле, потому что эта ткань, мозг и глаз-антенна образуют треугольник. - Поверните весь комплекс в брюшную сторону вверх. Удалите нить, которая соединяет крюк или диск с мозгом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если нить не удаляется, глазно-антенный диск будет разделен на две части, когда рот щенка удаляется.- Снимите рта. Будьте осторожны, чтобы не повредить глазной диск во время процесса.
ПРИМЕЧАНИЕ. Глазной диск теперь свободен в среде и только подключен к мозгу оптическим рычагом.
- Снимите рта. Будьте осторожны, чтобы не повредить глазной диск во время процесса.
3. Монтаж
- Воздух сухой и собрать компоненты камеры с покровным слоем 42 мм x 0,17 мм. Прикрепите двойной слой уплотнительных колец к центру крышки для удерживанияе агарозы.
- Собрать камеру с покровным. Поместите 42 мм х 0,17 мм покровное на стадии акцептора. Поместите кремний уплотнительное кольцо на покровным. Поместите основание. Замок шкафчика уплотнительного и поместите крышку (Рисунок 1).
- Аккуратно перенести расчлененный комплекс глаз мозга к центру уплотнительного кольца с использованием 20 мкл микропипетки с наконечником 10-200 мкл.
- Удалить большую часть среды и добавить 12 мкл 0,7% агарозы с низким уровнем плавления (при 37 ° C) к образцу.
Примечание: Положение глазного диска может быть изменено с помощью щипцов до затвердевания агарозы. Агарозы будет затвердевать в течение 5 мин.- Добавить 1 мл культуральной среды при комнатной температуре до центра O-кольцо; каждое уплотнительное кольцо может загрузить до 4-х образцов. Убедитесь, что агарозном приклеивается к уплотнительным кольцом, чтобы избежать дрейфующих образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не аэрации или циркуляции среды не требуется.
- Добавить 1 мл культуральной среды при комнатной температуре до центра O-кольцо; каждое уплотнительное кольцо может загрузить до 4-х образцов. Убедитесь, что агарозном приклеивается к уплотнительным кольцом, чтобы избежать дрейфующих образца.
4. конфокальной микроскопии
- Поместите камеру на стадии перевернутой конфокальной микроскопии в течение 30 минут, чтобы уравновесить температуру. Это может предотвратить дрейф Z-оси во время визуализации.
- До долгосрочного живого изображения, проверить, является ли нетронутой с помощью дифференциальной интерференции контрастной микроскопии ткани.
- Чтобы избежать фототоксичности, использовать мощность лазера ниже 2 мВт. Используйте объектив 40X для работы с изображениями.
- Acquire 62 мкм Z-стека изображений в 12 мин при оптическом интервале 1 мкм. Acquire 40 циклов сканирования в течение в общей сложности 10 часов. Убедитесь, что каждый цикл содержит 12 мин и визуализации 3 мин отдыха.
Representative Results
В этом примере, фоторецепторы R3 / R4 были помечены mδ0.5-GA4 для контроля фоторецепторов дифференциации. mδ0.5-GA4 диски сильной экспрессии в R4 и более слабую экспрессии в R3 11, что делает его отличным маркер для R3 и R4, а также для процесса ommatidial вращения. В Movie 1, R3 и R4 были помечены GFP. В начале 10 ч сеанса живого изображения, было 8 рядов ommatidial кластеров (фиг.2А и Movie 1) и 14 рядов ommatidial кластеров в конце (рис 2В). Скорость ommatidial дифференцировки 1,67 ч для каждой строки, которая близка к скорости 1,5-2 ч / в строке дисков в естественных условиях 7, 8, 9, 10, 11,s = "Xref"> 12, 13, 14. На основании относительных положений R3 и R4, ommatidial вращение происходило в естественных условиях экс культивируемого диска во время живого изображения (рисунок 2А «А„“, В» и В „“). Один кластер R3 / R4 , метили с белой областью в первом кадре Movie 2. В начале, ось R3 / R4 , по- видимому, перпендикулярной к экватору (рис 2C и Movie 2). Затем он появляется , чтобы повернуть 15 °, 30 ° и 45 ° в 3 (фиг.2С '), 6 (Рисунок 2C '') и 9 (рис 2с ''') ч соответственно. Эти данные указывают на то, что этот метод может выдержать фоторецепторов дифференциации во время живого изображения 10 ч.
FIGUповторно 1: Принципиальная схема узла камеры. Принципиальная электрическая схема узла камеры: (1) Поместите двухслойное уплотнительное кольцо-прикрепленное покровную на стадии акцепторе. (2) Поместите кремний уплотнительное кольцо на покровным. (3) Поместите основание. (4) Замок шкафчик запечатывания. (5) Загрузить образец в центре уплотнительного кольца и поместить крышку. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Живая съемка R3 / R4 Дифференцирования и вращения. R 3 / R 4 метили mδ0.5-Gal4, экспрессирующих ядерно-форма GFP в течение 10 ч живого изображения. Все фигуры были захвачены из фильма 1, (А) Изображение размещено в начале. (
Фильм 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 1: Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы скачать этот фильм.
Discussion
В данном исследовании мы предлагаем подробный протокол для долгосрочного эксперимента живой визуализации на воображаемые дисках дрозофилы. Мы потратили много времени на практику тщательного препарирования во избежание повреждение диска и разрешить для крепления диска близко к покровным. Мы попытались поли-L-лизин (PLL) и с низкой температурой плавления агарозы для удержания ткани; в конце концов, агарозы с низкой температурой плавления показали лучшую способность удерживать ткань. Хотя только глаз диск был использован в данной работе, чтобы продемонстрировать нормальное возникновение фоторецептора дифференциации и ommatidial вращения в течение 10-часового периода живого изображения, этот способ также может быть применен, по меньшей мере, одного другого диска, крыло диска, как показано в предыдущее исследование 3. Кроме того, препарат питательной среды и настройка живых изображений просты и не требует аэрации или среду распространения.
Непрерывная живая визуализация может обеспечить четкую временную последовательность биологических наканунеNTS. В нашем более раннем отчете о дифференцировке и миграции глии в глазном диске мы дали прямое доказательство того, что обертывание glia дифференцируется от существующей глии после миграции к переднему от глаза диска 3 . Долгосрочная культура ex vivo позволяет специфической лазерной активации клеток, такой как фотопревращение флуоресцентного белка KAEDE, следить за их поведением 3 . Он также может приспосабливаться к тестированию химических веществ, которые добавляются непосредственно в культуральную среду; Таким образом, его можно использовать в качестве платформы для скрининга лекарств. Поскольку некоторый динамический процесс происходит в течение минут или секунд, требуется высокое временное разрешение. Для улучшения временного разрешения может быть хорошим выбором микроскопия 15 , 16 листа светлых листов или микроскопия 17 вращающегося диска.
Текущее состояние культуры не является совершенным. Он не поддерживает рост дисков. Ячейка proliferation поддерживается только до 12 ч 3. Через 12 ч в культуре экс виво, скорость фоторецептора дифференциации начинает уменьшаться 3. Это может быть из-за отсутствия определенных питательных веществ или гормонов. Так как основное отличие в этой культуральной среде является высокой концентрацией инсулина, инсулин млекопитающих может быть частично имитируя функцию эндогенного инсулина, как пептиды. Добавление летучего экстракта, насекомых сахар в крови трегалоза, и различных концентраций гормона линьки 20-гидроксиэкдизон, не было полезно 3. Тем не менее, 12-18 ч период культивирования достаточно для изучения многих процессов развития. Альтернативные методы культивирования для культивирования личиночных имагинальных дисков сравнивали 3, и наше Культивирование и визуализация состояние обеспечивает самое длинное окно времени и наиболее четкости для живого изображения. Хотя диски внутри живых личинок и куколок могут быть отображены непосредственно18, 19, 20, 21, 22, окно разрешения и время для наблюдений ограничены. В конце личиночной и куколок диски могут быть культивированы в течение длительного времени 23, 24, но диски подвергаются значительным морфогенез. Для того, чтобы воспользоваться преимуществами плоских 2D личиночных дисков, наше Культивирования и изображений методом является лучшим решением до сих пор.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарны Чунь-лань Хсу и Ю-Чи Ян приготовления летучей пищи и поддержания запасов летать, и Су-Пин Ли и IMB изображений сердечниками для их помощи с конфокальной микроскопии. Это исследование было поддержано грантами на YHS (НСК 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, MOST 103-2311-B-001 -035 -MY3) от Национального научного совета и Министерства науки и техники КНР.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | AMRESCO | 0780-2PK | |
| 42 mm x 0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9665 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
| 40X objective | C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective | ||
| Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |
References
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 2, Cold Spring Harbor. NY. 747-842 (1993).
- Auerbach, C. The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster. Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).
- Wolff, T., Ready, D. F. The Development of Drosophila Melanogaster. , Cold Spring Harbor Press. 1277-1316 (1993).
- Adler, P. N. Planar signaling and morphogenesis in Drosophila. Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).
- Choi, K. W., Benzer, S. Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye. Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).
- Strutt, D. I., Mlodzik, M. Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions. Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).
- Gaengel, K., Mlodzik, M. Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6. Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).
- Li, C., Meinertzhagen, I. A. Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy. Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).
- Winter, P. W., Shroff, H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging. Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).
- Bosveld, F., et al. Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
- Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae. Plos One. 7 (1), (2012).
- Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc. Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).
- Taylor, J., Adler, P. N. Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs. Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).
- Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis. Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).
- Gibbs, S. M., Truman, J. W. Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila. Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).
- Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro. Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).
