Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

كشف "يغاندس إستروجين" في "منتجات العناية الشخصية" استخدام "الإستروجين الخميرة الشاشة الأمثل" "المختبر التدريس الجامعي"

doi: 10.3791/55754 Published: January 1, 2018

Summary

ويعرض هذا المقال على شاشة الإستروجين خميرة أمثل للتحديد الكمي يغاندس في "منتجات العناية الشخصية" (PCPs) التي تربط الإستروجين مستقبلات ألفا (ERα) و/أو بيتا (ERβ). الأسلوب يتضمن خيارين الركازة اللونية، حضانة مبردة ستة أيام لاستخدامها في الدورات الجامعية، والأدوات الإحصائية لتحليل البيانات.

Abstract

شاشة الإستروجين الخميرة (نعم) يستخدم للكشف عن يغاندس إستروجين في عينات بيئية، وقد طبقت على نطاق واسع في الدراسات لاختلال الغدد الصماء. وتشمل يغاندس إستروجين سواء كانت طبيعية أو من صنع الإنسان "البيئي الإستروجين" (EEs) وجدت في العديد من السلع الاستهلاكية بما في ذلك "منتجات العناية الشخصية" (بكبس)، والبلاستيك والمبيدات الحشرية، والأطعمة. EEs تعطيل هرمون إشارات في البشر والحيوانات الأخرى، ويحتمل أن خفض معدل الخصوبة وزيادة خطر الإصابة بأمراض. وعلى الرغم من أهمية EEs والغدد الصماء الإخلال بالمواد الكيميائية الأخرى (EDCs) للصحة العامة، غير هو اختلال الغدد الصماء المدرجة عادة في المناهج الجامعية. ويشارك هذا النقص جزئيا بسبب الافتقار إلى أنشطة المختبرات ذات الصلة التي توضح المبادئ حين يجري أيضا متاحة لطلاب المرحلة الجامعية. ويعرض هذا المقال محسنة نعم للتحديد الكمي يغاندس في منتجات العناية الشخصية التي تربط الإستروجين مستقبلات ألفا (ERα) و/أو بيتا (ERβ). يتضمن الأسلوب أحد ركائز اللونية اثنين (اورثو-نيتروفينيل-β-د-جالاكتوبيرانوسيدي (أونبج) أو الكلورية الأحمر-β-د-جالاكتوبيرانوسيدي (كبرج)) التي هي المشقوق من β-جالاكتوسيداسي، 6 أيام حضانة مبردة خطوة إلى تيسير استخدامها في دورات المختبرات الجامعية، وتطبيق الآلي لحسابات لاكز، ورمز R لتحليل الانحدار اللوجستي 4-المعلمة المرتبطة بها. البروتوكول قد صمم للسماح لطلاب المرحلة الجامعية لتطوير وإجراء التجارب التي كانت الشاشة المنتجات التي يختارونها يقلد الإستروجين. في هذه العملية، ويتعلمون عن اختلال الغدد الصماء وخلية ثقافة وملزم مستقبلات، نشاط إنزيم، والهندسة الوراثية، والإحصاءات والتصميم التجريبي. في نفس الوقت، هم أيضا ممارسة المهارات المختبرية الأساسية وقابلة للتطبيق على نطاق واسع، مثل: حساب تركيزات؛ مما يجعل الحلول؛ مما يدل على أسلوب تعقيم؛ متسلسل تمييع المعايير؛ تشييد والتحريف المنحنيات القياسية؛ تحديد المتغيرات والضوابط؛ جمع وتنظيم وتحليل البيانات؛ بناء وتفسير الرسوم البيانية؛ واستخدام معدات المختبرات المشتركة مثل ميكروبيبيتورس والطيفية. وبالتالي، تنفيذ هذا التحليل يشجع الطلاب على الانخراط في التعلم القائم على التحقيق مع استكشاف القضايا الناشئة في مجال العلوم البيئية والصحية.

Introduction

شاشة الإستروجين الخميرة (نعم) يستخدم على نطاق واسع لقياس يغاندس التي تحاكي استراديول (E2 أو 17β-استراديول) في مجموعة متنوعة من المصفوفات، بما في ذلك المياه والأنسجة النباتية والمنتجات الاستهلاكية والأطعمة1،2،3، 4. جماعياً، تسمى هذه يغاندس "الاستروجينات البيئية (EEs)." نعم وضعت أصلاً منخفض التكلفة و في المختبر البديل للاختبارات في فيفو مثل الاعتداء مهبلي القوارض5،6 والمرقط تغذية المقايسة7. والهدف من هذه التجارب هو لتحديد إذا كان منتج يحتوي على المواد الكيميائية التي تحفز أو عرقلة الآليات المعتمدة على الإستروجين. كشف EEs أمر بالغ الأهمية، نظراً لأنها يمكن أن تتداخل مع الإستروجين الذاتية العادية الإشارات، لا سيما أثناء التطور الجنيني. هذا التدخل يهدد الصحة بزيادة مخاطر السمنة والعقم والسرطان وفقدان المعرفي8.

وعلى الرغم من أهمية EEs ويشكل الأخرى للصحة العامة، غير هو اختلال الغدد الصماء المدرجة عادة في المناهج الجامعية. وتشارك هذا النقص جزئيا بسبب قلة الأنشطة التي توضح المبادئ حين يجري أيضا متاحة لطلاب المرحلة الجامعية. بالإضافة إلى ذلك، توجد اختلافات عديدة من البروتوكول نعم9،،من1011،،من1213، ويجعل هذا التنوع الأمثل الفحص وقتاً طويلاً ليس على وجه التحديد تدريب منسقي مختبر التقنيات ذات الصلة. وأخيراً، نعم فحوصات وعادة ما تكتمل يوم طويل ما يزيد على 1 أو 2 أيام متتالية مع حضانة O/N. هذا التوقيت غير متوافقة مع تنسيق دورات المختبرات الجامعية، الذي يجتمع عادة مرة واحدة/الأسبوع لعدة ح.

واستجابة لهذه الاحتياجات، تقارير هذه المخطوطة بروتوكولا نعم 96-جيدا أمثل الذي يتضمن أساليب استخراج ethanolic "منتجات العناية الشخصية" (بكبس)3 ، وهو خطوة تبريد 6 أيام لاستيعاب الاجتماعات الأسبوعية في المختبر. الإيثانول المطلق هو المذيبات عضوية تنوعاً التي يمكن حل مجموعة متنوعة من الذوائب القطبية ونونبولار. وعلاوة على ذلك، ومناسبة للمقررات الجامعية لأنها سهولة المتاحة نسبيا غير سام، بأسعار معقولة والامتزاج مع المياه؛ كما أنه يتبخر بسهولة دون معدات خاصة. ومع ذلك، الإيثانول ليست مثالية لاستخراج عمود المصباح بشدة عوامل اختلال الغدد الصماء أو العديد من الزيوت والشموع، الأخيرين يجري المكونات المشتركة في استخراج ضعف الكفاءة PCPs. يزيد من خطر نتائج سلبية كاذبة. مع هذا القيد في الاعتبار، ينبغي اختيار إجراءات استخراج (مثلاً، واستخراج ethanolic أو استخراج المرحلة الصلبة) أن خصائص نموذج عنوان المحققين وتلبية أهداف الدراسة (البحث مقابل التعليم الجامعي).

نعم تعتمد على المؤتلف Saccharomyces cerevisiae التي أنشئت أصلاً من قبل الدكتور تشارلز ميلر في جامعة تولين. يرجى الاطلاع على ميلر et al. (2010) لخريطة كاملة ل المهندسة بلازميد14. تحول الخميرة مع هذه البلازميدات مؤثرا ERα النووية البشرية صريحة أو ERβ (وتسمى أيضا ESR1 و ESR2، على التوالي) عندما تزرع في الوسائط التي تحتوي على اللبن (بالنسبة ERα) أو السكر أو اللبن (ل ERβ). إذا كانت المواد الكيميائية إستروجين موجودة في وسائل الإعلام، ربط المستقبلات، إنشاء مجمعات مستقبلات يجند أن تنشيط التعبير β-جالاكتوسيداسي (لاكز) على مستوى يتناسب مع تركيز المواد الكيميائية إستروجين. يتم تفكيك خلايا الخميرة ثم إطلاق سراح المتراكمة β-جالاكتوسيداسي. يحتوي المخزن المؤقت تحلل أما أونبج أو كبرج، التي هي المشقوق من β-جالاكتوسيداسي لإنتاج منتجات الأصفر أو الأحمر، على التوالي. منتجات اللونية يمكن قياسها كمياً عن طريق قياس امتصاص استخدام جهاز المطياف الضوئي في لوحة ميكروويل. درجة تغير اللون غير متناسب إلى تركيز يغاندس إستروجين الذي تعرضت له الخميرة.

اختيار الركازة (كبرج أو أونبج) يعتمد على إمكانية امتصاص خلفية الناشئة عن العينات التي يجري اختبارها. على سبيل المثال، غالباً ما إضافة المستخلصات النباتية لوناً أصفر لوسائط الإعلام بشكل مصطنع يضخم التدابير استروجينيسيتي إذا أونبج (كمياً في 405 نانومتر) كالركيزة ل β-جالاكتوسيداسي. مع المستخلصات، كبرج النباتية (كمياً في 574 nm) قد تكون ركيزة اللونية أكثر ملاءمة. كبرج هو أكثر تكلفة من أونبج ولكنه يستخدم في عشر مولاريتي. ويعرض هذا المقال استروجينيسيتيس من حزب المؤتمر الشعبي مقتطفات كمياً باستخدام أونبج وكبرج.

التحديد الكمي استروجينيسيتي عينات البيئية باستخدام ERα و ERβ اتباع نهج أكثر شمولاً من استخدام واحد فقط من هذه المستقبلات. في الحيوانات، يحمل هذه المستقبلات توزيع الأنسجة المتمايزة والأنشطة التنظيمية والانتماءات الملزمة يغاندس إستروجين ومكافحة إستروجين15. على سبيل المثال، فيتويستروغنز النباتية عادة ربط ERβ أكثر بقوة2، في حين أن المواد الكيميائية الاصطناعية يمكن إظهار الأفضلية لأي من ERα أو ERβ أو يمكن ربط كلا مستقبلات جيدا أيضا15. ولذلك، لا يتنبأ ملزمة لمستقبلات الإستروجين واحد ملزمة للآخر بالضرورة.

على الرغم من أن EEs توجد في كثير من المنتجات الاستهلاكية (مثلاً، مبيدات الآفات، المنظفات، المواد اللاصقة، ومواد التشحيم، والبلاستيك والأطعمة، والمستحضرات الصيدلانية) فضلا عن النباتات، البيانات المقدمة تم الحصول عليها باستخدام مجموعة مختارة من بكبس. بكبس مقنعة، سهولة المتاحة والميزانية ودية وذات الصلة بيئياً لطلاب المرحلة الجامعية. يمكن دعوة الطلاب لجلب ما بكبس المفضلة من المنزل الاختبار في المختبر. أنها أيضا البحث في قاعدة "الجلد العميقة" وضعها الفريق العامل البيئي16 لتوليد مقارنات تستند إلى فرضية من بكبس مع ارتفاع وانخفاض درجات السمية. وبهذه الطريقة، يمكن الطلاب في نفس الوقت على تطوير مهارات مختبرية متقدمة؛ الانخراط في التعلم الموجه ذاتيا، وعلى أساس التحقيق؛ وتستكشف القضايا الناشئة في مجال العلوم البيئية والصحية.

Protocol

1-صنع الكواشف

  1. تحضير الوسائط السكر واللبن بخلط ز 6.7 الخميرة النيتروجين قاعدة، 20 غ سكر العنب أو اللبن، 20 ملغ كبريتات الأدنين (إضافة 10 مل من الأسهم المحلول 200 مغ/100 مل)، اليوراسيل 20 ملغ (يضاف 10 مل من الأسهم المحلول 200 مغ/100 مل) ، لوسين 60 ملغ (يضاف 6 مل من حل مخزون مائي 1 غ/100 مل)، والحامض الأميني 20 ملغ (يضاف 2 مل من حل مخزون مائي 1 غ/100 مل) في المياه إلى وحدة تخزين نهائي لتعقيم L. 1 عن طريق الترشيح (0.2 ميكرون فلتر). ويمكن تخزين الوسائط عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع.
  2. إعداد استراديول (E2) لمعايير حل E2 المجفف في الإيثانول اللامائى، وتمييع لتركيزات العامل المناسبة (227.5 نانومتر & 9.75 nM) في الإيثانول 50%.
    ملاحظة: إذا تم شراء استراديول كقنينة من 1 ملغ، إضافة الإيثانول 1 مل مباشرة إلى القنينة لإذابة مسحوق استراديول. وهذا غلة أسهم مم 3.67 #1.  تمييع 10 ميكروليتر من الأسهم #1 في الإيثانول ميكروليتر 990 جعل 1 مل أسهم ميكرومترات 36.71 #2.  بعد ذلك، يضعف 10 ميكروليتر من الأسهم #2 في الإيثانول 50% ميكروليتر 990 جعل 1 مل من 367.13 نانومتر الأسهم #3.  لجعل الأرصدة العامل، تضعف الأسهم ميكروليتر 619.7 #3 في الإيثانول 50% ميكروليتر 380.3 جعل مل 1 نانومتر 227.5 العامل المخزون المستخدمة لإنشاء منحنيات قياسية مع الخميرة معربا عن ERα.  تمييع 26.56 ميكروليتر الأسهم #3 في ميكروليتر 973.44 50% إيثانول جعل مل 1 نانومتر 9.75 العامل المخزون المستخدمة لإنشاء منحنيات قياسية مع الخميرة معربا عن ERβ. ختم المعايير مع بارافيلم ومخزن في-20 أو-70 درجة مئوية.
    تنبيه: هو E2 مسرطنة مشتبه فيها وأنها سامة للإنجاب. أنها ضارة إذا استنشق، ابتلع، أو الامتصاص من خلال الجلد. هاء-2 قد يسبب ضررا للرضاعة الطبيعية الأطفال والأجنة. E2 سامة جداً للأحياء المائية. استخدام الحماية الشخصية المناسبة (قفازات وغطاء الدخان، قناع الغبار) وتجنب التعرض أثناء الحمل والرضاعة. التصرف E2 كنفايات خطرة ولا تطلق في البيئة.
  3. إعداد المخزن المؤقت لاكز بخلط 8.52 ز غ2هبو4، ز 5.52 NaH2بو4•H2س، ملغ 95.21 مجكل2، 745.5 مغ بوكل، ز 2 لاورويلساركوسيني ن ملح الصوديوم، وأما ONPG (400 مغ) أو كبرج (77.7 ملغ) في المياه إلى نهائي حجم المخزن المؤقت "ل مخزن لاكز" 1 في 20 مل مختبرين في-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: 20 مل اليكووت غير كافية للوح 96-بئر واحد.
  4. تحضير كربونات الصوديوم بخلط ز 105.9 كربونات الصوديوم في المياه إلى وحدة تخزين نهائي 1 ل. مخزن في الرايت
  5. تحضير 1 م ديثيوثريتول (DTT) في المياه. تجميد 25 ميليلتر مختبرين للقيمة عند-20 درجة مئوية.
    تنبيه: هو DTT الجلد الحادة والعين مهيجة. استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة (قفازات وغطاء الدخان، قناع الغبار) لتجنب الجلد والاتصال بالعين والاستنشاق والابتلاع.
    ملاحظة: كل قاسمة غير كافية للوح 96-بئر واحد.

2-إعداد العينات، وضوابط استخراج

  1. تحديد عينات لاختبار.
    ملاحظة: هذا المقال يعرض البيانات لخمسة عشر بكبس، بما في ذلك الصابون وكريم الشعر، شامبو، واقية من الشمس، مرهم الشفة، مؤسسة، كريم الحلاقة، وطلاء الأظافر، ومحلول.
  2. الجمع بين ز 1 عينة مع 10 مل إيثانول اللامائى في أنبوب مخروطي 15 مل. إعداد عنصر تحكم استخراج سلبية تتكون من 11 مل إيثانول في أنبوب مخروطي 15 مل. إعداد replicates حسب الحاجة.
    ملاحظة: لعرض التصميم التجريبي، مختبرين ثلاثة من جميع بكبس 15 وحلول التحكم استخراج ثلاث أعدت، تسفر عن مجموعة من 48 عينات، وقد تم تحليل كل منها في ثلاث نسخ باستخدام البروتوكول في القسم 4. لوحة واحدة يمكن أن تستوعب عينات تصل إلى 23 في تريبليكاتيس. يستخدم الإيثانول اللامائى في هذه الخطوة نظراً لأنه يتبخر في سهولة. استخدام عناصر تحكم استخراج السلبية للتحقق من أن لا يتم النض الإستروجين في عينات من أنابيب مخروطية الشكل.
  3. مجانسة محتويات الأنبوبة لمدة 30 دقيقة بمزيج من الهز اليدوي وفورتيكسينج أو بالهز أنابيب في فورتيكسير أنبوب متعدد.
  4. الطرد المركزي الأنابيب المخروطية في السرعة القصوى المسموح بها الطرد مركزي دلو لأدنى 10 صب المادة طافية من كل أنبوبة من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. محتويات كل أنبوب 50 مل في قنينة زجاج التﻷلؤ فارغة.
  5. فتح قارورة إجازة في غطاء التهوية لمدة أسبوع للسماح الإيثانول تتبخر تماما. وبدلاً من ذلك، الجافة عينات في غطاء التهوية تحت النيتروجين أو مع مبخر دوراني. لتجنب تدهور مكونات حساسة الخفيفة، حماية تجفيف عينات من الضوء (مثلالنسيج مكان معتم على باب هود التهوية).
  6. إعادة تشكيل العينات في 1.0 مل من الإيثانول 50% ودوامه تجانسه.

3-استزراع وسوبكولتورينج الخميرة14

  1. الحفاظ على الثقافات الخميرة النشطة (المؤتلف سلالة W303a S. cerevisiae14) التي تفرخ الخميرة في وسائل الإعلام تصفية تعقيم الجلوكوز في 30 درجة مئوية. ثقافة فرعية الخميرة أسبوعيا في وسائل الإعلام الجلوكوز تعقيم تصفية جديدة.
  2. ليلتين (حوالي 42 ح) قبل إعداد لوحات نعم، وثقافة فرعية الخميرة بإضافة 0.1 مل ثقافات الخميرة النشطة إلى 10 مل الإعلام الجلوكوز تعقيم عامل تصفية باستخدام تقنية تعقيم.  احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة ليلتين.  هز غير مطلوبة إذا كان يزرع الخميرة كثقافات ضحلة في معقم 250 مل Erlenmeyer قوارير.
    ملاحظة: الخميرة يمكن أيضا تخزين على لوحات أجار مبردة لعدة أشهر. للتخزين على المدى الطويل (سنة)، تجمع بين الثقافات O/N مع والغليسيرول العقيمة 15-50%، ودوامه، والتجميد في-70 درجة مئوية. إعداد والغليسيرول العقيمة، استخدام المحاقن لنقل 300 ميليلتر والغليسيرول إلى كريوفيال والاوتوكلاف مع سقف خففت. قم بإضافة الثقافة الخميرة 1,200 O/N ميليلتر باستخدام تقنية معقمة.

4-إعداد لوحات نعم (اليوم 1 للفحص)

  1. وفي كوب معقم واستخدام تقنية تعقيم تمييع الخميرة من الخطوة 3، 2 كثافة بصرية من قريبة 0.065 في 610 نيوتن متر (OD610) في وسائل الإعلام تصفية تعقيم اللبن.
    1. تأكيد الكثافة البصرية بواسطة ميكروليتر 120 بيبيتينج من كل عينة الخميرة في ثلاث نسخ جنبا إلى جنب مع اللبن ثلاث فراغات في لوحة البوليستيرين واضحة (اللوحة لا تحتاج أن تكون عقيمة).  استخدام جهاز المطياف الضوئي لوحة للتحقق من وجود ثقافة الخميرة المخفف OD صافي610 0.065 القراءات طرح OD610 قريبة من الفراغات اللبن من الخميرة OD610 قراءات لتحديد صافي OD610 من الخميرة. إعداد وحدة تخزين نهائي على الأقل 30 مل مخففة الخميرة لكل لوحة 96-جيدا.
      ملاحظة: يمكن استخدام مرشحات جهاز المطياف الضوئي قياس امتصاص بين nm 595 و 610 لهذا القياس.
تقريبية نسبة 1:6 الخامس: الخامس من الخميرة: وسائل الإعلام عادة غلة التطوير التنظيمي610 قريبة من 0.065 وحتى ابدأ بإضافة الخميرة مل 4.5 إلى وسائل الإعلام 30 مل وإضافة مزيد من الخميرة أو وسائل الإعلام كمناسبة لتحقيق نيتود610 بين 0.060 و 0.070.
  • باستخدام تقنية تعقيم، إضافة هذا التعليق الخميرة المخفف لآبار عقيمة، وبولي بروبلين، الميكروسكوبية 96-جيدا وفقا لتخطيط اللوحة (الشكل 1). أثناء بيبيتينج، تبقى المصدر الخميرة علقتها باستمرار يحوم الحاوية أو خلط مع ماصة. لهذه الخطوة، يكون من المفيد استخدام بيبيتور مكرر مع تلميح المحاقن معقمة.
    ملاحظة: يتم تعقيم لوحات البولي بروبلين بلوحات مكدسة اثنين التعقيم ملفوفة في إحباط.  اللوحة العلوية بمثابة غطاء للوحة عينة ويمكن غسلها، وإعادة يعقم، وإعادة استخدامها.
  • إضافة وسائط تصفية تعقيم اللبن ميليلتر 120 3 آبار إضافية (H10-12) وفقا لتخطيط اللوحة (الشكل 1). هذه الآبار كعناصر تحكم وسائل الإعلام لحساب امتصاص ساهمت وسائل الإعلام وحدها.
  • بناء منحنى المعياري في كل لوح بتمييع متسلسل تريبليكاتيس لمعايير العمل E2 (227.5 شمال البحر الأبيض المتوسط ل ERα، 9.75 نانومتر ل ERβ) في الآبار التي تحتوي على تعليق الخميرة (A1-G3) وفقا لتخطيط اللوحة (الشكل 1).  ابدأ بإضافة 5 ميليلتر من المعايير E2 إلى الآبار A1 من خلال A3. خلط محتويات ميكروويل بيبيتينج، وثم متسلسل يؤدي إلى تمييع هذا التعليق عن طريق تحريك ميليلتر 205 من آبار A1-3 في آبار ب 1-3. كرر بخلط ونقل 205 ميليلتر من خلال صف غ.
    ملاحظة: بعد اكتمال تمييع المسلسل، تجاهل ميكروليتر 205 من آبار G1-3. في نهاية هذه الخطوة، ينبغي أن تتضمن جميع الآبار القياسية 120 ميكروليتر. سوف تسفر عن تمييع المسلسل النهائي E2 التركيزات المدرجة في الجدول 1. خطوات تمييع المسلسل، أنها مفيدة لاستخدام بيبيتور متعدد القنوات مع نصائح العقيمة.
  • إضافة 5 ميليلتر للمركبات (50% إيثانول) لآبار مراقبة المركبات التي تحتوي على تعليق الخميرة (H1-3) وفقا لتخطيط اللوحة (الشكل 1).
    ملاحظة: تستخدم آبار مراقبة المركبات للتحديد الكمي لامتصاص الخلفية المرتبطة بخلايا الخميرة ووسائط الإعلام. بالإضافة إلى ذلك، آثار تعزيز النمو أو سيتوتوكسيسيتي لاختبار عينات يمكن الكشف عن طريق مقارنة قيم610 OD اختبار الآبار مع تلك الآبار مراقبة المركبات.
  • إضافة 5 ميليلتر تريبليكاتيس من العينات، وضوابط استخراج السلبية إلى الآبار التي تحتوي على تعليق الخميرة وفقا لتخطيط اللوحة (الشكل 1).
    ملاحظة: جعل ملاحظة العينات أو ضوابط استخراج السلبية التي يتم إضافتها لكل بئر.  لتعقب فيها الآبار عينات، والتي لم تفعل ذلك والبدء بعلبة جديدة من نصائح واستخدم التلميحات من نفس المواقع في المربع مواقع الآبار المقابلة في اللوحة. 96-جيدا لوح واحد يمكن أن تستوعب عينات تصل إلى 23 في ثلاث نسخ.
  • خلط محتويات العينة واستخراج عنصر التحكم، وآبار مراقبة المركبات التي بيبيتينج. ضبط كميات من هذه الآبار إلى 120 ميليلتر بإزالة ميليلتر 205 من كل منها كما هو موضح في وسيلة الإيضاح الرقم 1.
  • ختم plate(s) مع فيلم العقيمة، لاصقة، المليئة بالثغرات. قم بتسمية لوحات واحتضانها ح 17 في 30 درجة مئوية. اللوحة لا تحتاج إلى أن تهتز أثناء الحضانة
  • 5-تجهيز لوحات نعم (يوم 2 الفحص)

    1. وبعد تفريخ ح 17 عند 30 درجة مئوية، إزالة لوحات من الحاضنة. إذا كان سيتم تجهيز لوحات فورا، تابع إلى الخطوة 5.1.1. إذا كان سيتم تجهيز لوحات في وقت لاحق، انتقل إلى الخطوة 5.1.2.
      1. استخدام بيبيتور متعدد القنوات لخلط محتويات كل صف من الآبار، وثم نقل 50 ميليلتر من تعليق الخميرة من كل بئر للمقابلة جيدا من الميكروسكوبية واضحة، البوليستيرين، 96-جيدا.
        ملاحظة: ألواح البوليسترين لا تحتاج إلى أن تكون عقيمة ولكن يجب أن يكون غطاء. استخدام نصائح بيبيت جديدة لكل صف من الآبار لتجنب تلويث عبر الآبار، على الرغم من أن إذا بيبيتينج عبر تريبليكاتيس مع ماصة الأقنية 8-نصيحة، نصائح تحتاج فقط إلى تغيير بين ثلاث مجموعات.
        1. قم بتسمية لوحة جديدة. انتقل إلى الخطوة 5، 2.
      2. لتخزين لوحات قبل المعالجة، التفاف عليها في غلاف بلاستيكي. بردت لوحات ملفوفة في 4 درجات مئوية عن 6 د بعد ذلك، إزالة اللوحات من الثلاجة وبسط لهم، ونقل محتويات جميع الآبار التي بيبيتينج كما في الخطوة 5.1.1. انتقل إلى الخطوة 5، 2.
    2. إضافة 20 ميليلتر 1 م DTT إلى 20 مل من درجة حرارة الغرفة المذابة، لاكز العازلة لتركيز نهائي من 1 مم DTT. المخزن المؤقت "لاكز المزيج" جيدا. إذا كان استخدام ماصة متعددة القنوات، الاستغناء عن خزان كاشف.
      تنبيه: ارتداء القفازات، والعمل مع DTT في غطاء محرك السيارة، إذا كان ذلك ممكناً
    3. استخدام أما ماصة الأقنية أو تكرار بيبيتور، إضافة 200 ميليلتر لاكز المخزن المؤقت الذي يحتوي على القيمة وأما أونبج أو كبرج لجميع الآبار من لوحة البوليستيرين، ومباشرة قياس وتسجيل OD610 من جميع الآبار باستخدام جهاز المطياف الضوئي لوحة. كرر حسب الحاجة لألواح إضافية.
      ملاحظة: يتم استخدام القراءات610 OD في مقام حساب لاكز (الخطوة 6، 1). ولهذا السبب، الحصول على القراءات مباشرة بعد بيبيتينج وقبل تسوية الخلايا أو يتم تفكيك قبل لاكز المخزن المؤقت. إذا كانت القيم610 التطوير التنظيمي للآبار نموذج ملحوظ أعلى أو أقل من القيم610 التطوير التنظيمي لآبار مراقبة المركبات، تستخرج العينة أما تعزيز النمو أو السامة للخلايا للخميرة، على التوالي. لاكز سيتم تصحيح حساب الفروق الصغيرة في كثافة الخلية عبر الآبار، ولكن إذا كانت الاختلافات تتجاوز 30% في أي من الاتجاهين، ثم تمييع عينة المعاد تشكيلها (من الخطوة 2، 6) في الإيثانول 50% إضافية وإعادة اختبار العينة بالعودة إلى الخطوة 3، 2 12.
    4. تغطي لوحات مع غطاء. احتضان لوحات تحتوي على الخميرة أن ERα إكسبرس14 في 30 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة (بالنسبة أونبج) أو ح 3 (كبرج). احتضان لوحات تحتوي على الخميرة أن ERβ إكسبرس14 في 30 درجة مئوية لمدة 70 دقيقة (بالنسبة أونبج) أو ح 4 (كبرج).
      ملاحظة: عند العمل مع كبرج، حضانة أوقات مرنة؛ حضانة ح 2-4 غلة نتائج مناسبة مع كل المستقبلات، مع إينكوبيشنز أطول زيادة حساسية المقايسة.
    5. بعد حضانة لوحات، استخدام ماصة متعددة القنوات أو بيبيتور مكرر لإضافة 100 ميليلتر من كربونات الصوديوم لكل بئر. كربونات الصوديوم يرفع درجة الحموضة ويوقف رد فعل β-جالاكتوسيداسي.
    6. قياس وتسجيل OD405 (أونبج) أو OD574 (بالنسبة كبرج) لجميع الآبار باستخدام جهاز المطياف الضوئي لوحة.

    6.حساب القيم لاكز

    ملاحظة: القيم لاكز قياس درجة تغير اللون لكل عينة وتوفر طريقة طبيعية لمقارنة القيم بين فحوصات منفصلة بالمحاسبة بالنسبة لعدة متغيرات (مثلالكثافة البصرية الخميرة والكثافة البصرية وسائل الإعلام، وحضانة الوقت إذا وهذا يختلف بين آبار على نفس اللوحة)12.

    1. حساب وسائل ثلاث قيم610 التطوير التنظيمي لوسائط الإعلام (اللبن) مراقبة الآبار (H10-12)، وحساب وسائل ثلاث OD405 أو OD574 القيم لعناصر التحكم المركبة (50% إيثانول) (H1-3). استخدام هذه الوسائل وفترة الحضانة (t) في ساعات اللوحة لتغيير اللون (الخطوة 5، 5) لحساب قيم لاكز (المقابلة لدرجة تغير اللون في كل بئر) لكل معيار، والآبار العينة باستخدام المعادلات التالية:
      Equation 1
      Equation 2
      1. وبدلاً من ذلك، استخدم التطبيق الآلي في التذييل 1 لحساب القيم لاكز للمعايير والعينات.
        ملاحظة: يجب أن يكون تخطيط اللوحة المستخدمة مع التطبيق مطابق لتخطيط اللوحة المعروضة في الشكل 1. إذا لم تستخدم بعض الآبار عينة، الاحتفاظ بامتصاص قراءات من آبار فارغة كأصحاب المكان في dataset امتصاص يتم لصقه في تطبيق لاكز التذييل 1 .  هذا يحافظ على التخطيط المكاني اللوحة في التطبيق، ويضمن آبار مراقبة وسائط الإعلام في مواقعها المطلوبة.  بالإضافة إلى ذلك، لن يتم تنفيذ التطبيق إذا كان هناك خلايا فارغة.
    2. حساب وسائل ثلاث قيم لاكز لكل معيار E2 وكل عينة. تقرير يعني لاكز القيم ميليلتر-1h-1. سجل تحويل تركيزات E2 كل معيار، وإنشاء مستند جدول بيانات منسقة كما هو الحال في الملف template.csv (التذييل 2).

    7-التحريف عينة استراديول مكافئات (إيكس) استخدام الانحدار اللوجستي 4-معلمة

    ملاحظة: تتعلق إيكس عينة لاكز القيم (تغيير اللون) قيم لاكز المنحنى القياسي تم إنشاؤها بواسطة E2. ومن ثم تحديد إيكس كم عينة مطلوب للحصول على نفس اللون تغير الاستجابة كتركيز معلوم من E2.

    1. لحساب إيكس لعينات الاختبار، أولاً رسم المنحنى المعياري. تتناسب مع قيم لاكز يعني E2 معايير المحور (ص) والمقابلة سجل تحول E2 تركيزات محور (س) لنموذج انحدار اللوجستي المعلمة أربعة.
    2. استخدام النموذج لاقحم إيكس لقيم لاكز عينة الاختبار. إجراء عمليات حسابية الانحدار اللوجستي من إيكس استخدام البرمجيات الإحصائية كما ورد في التذييل 2.

    8-توحيد إيكس (نانوغرام/مل) إلى كتلة عينة الترابي

    1. تتصل إيكس كمية العينة الترابي إضافة إلى كل جيدا في الخطوة 4، 5 وضرب إيك (نانوغرام/مل) بإجمالي حجم مطلي في الآبار عينة (325 ميليلتر) وثم قسمة حجم العينة المستخرجة أضيف لكل بئر (5 ميليلتر).
      ملاحظة: تمثل هذه القيم إيك الواحد مل عينة المستخرجة. إذا أعدت العينات باستخدام 1 غ من حزب المؤتمر الشعبي، تمثل هذه القيم أيضا إيك جرام من حزب المؤتمر الشعبي (نانوغرام/غرام). التعبير عنه بهذه الطريقة، يق القيم (نانوغرام/غرام) ويمكن مقارنة عبر مختلف PCPs. يق (نانوغرام/غرام) القيم لمنتجات العناية الشخصية التي اختبرت في هذه الدراسة مبينة في الجدول 2، ويتم تضمين نموذج بيانات جمعت في جميع أنحاء البروتوكول بأكمله في التذييل 3.

    Representative Results

    وتم تقييم استروجينيسيتيس لثلاث عينات من بكبس 15 استخدام هذا البروتوكول نعم. وكما لاحظ ميلر et al. (2010)، فحوصات مع الخميرة معربا عن ERβ كانت أكثر من مجرد أمر من حجم أكثر حساسية من فحوصات مع الخميرة معربا عن ERα (الشكل 2)14. لذلك، تم اكتشاف النشاط الاستروجيني أكثر في كثير من الأحيان مع الإعراب عن ERβ الخميرة (الجدول 2). PCPs ثمانية معارضها النشاط الاستروجيني مع ERβ ومعارضها 5 PCPs النشاط الاستروجيني مع ERα. كريم الشعر وواقية من الشمس، ومحلول وعينات بلسم الشفاه بإستروجين مع كل المستقبلات، في حين مؤسسة، والحلاقة، وطلاء الأظافر كانت فقط إستروجين مع ERβ في تركيزات تم اختبارها. سبعة بكبس الأخرى (4 الشامبو والصابون 2 مرهم الشفة 1) لم تكن إستروجين مع أما مستقبلات في تركيزات تم اختبارها.

    بالإضافة إلى الاختلافات حساسية مستقبلات، تختلف إيكس لكل عينة حسب الركيزة اللونية (أونبج أو كبرج) المستخدمة في التحليل (الجدول 2). في جميع ولكن عينة واحدة، إيكس تحدد باستخدام أونبج كانت أعلى من تلك التي تحدد باستخدام كبرج. وعلاوة على ذلك، كان التباين بين replicates استخراج أدنى إيكس تقاس ب ERβ وكبرج ويحدد أعلى إيكس مع ERα وأونبج (الجدول 2).

    بالإضافة إلى المقارنة بين ركائز اللونية، 1 والهدف من هذه الدراسة هو اختبار حضانة مرات المدة التي تتوافق مع الجدول الزمني لدورة المختبرات الجامعية. يتطلب مقايسة نعم نموذجي حضانة ح 17 تليها مباشرة حضانة في لاكز المخزن المؤقت ل 40 دقيقة-4 ح، جدولاً زمنياً أن من المستحيل تنفيذ في مختبر تدريس مقيدة بواحد الجلسة الأسبوعية. لتسهيل استخدام هذا التحليل في التدريس، تعديل المقايسة بإدخال فترة تبريد د 6 (الخطوة 5.1.2) بعد الاحتضان ح 17. المنحنيات القياسية من لوحات المبردة كانت مماثلة لتلك التي من لوحات غير المبردة (الأرقام 2 & 3)، إلا أن كلها كانت الأخطاء المعيارية للمعلمات المقدرة باستخدام نماذج الانحدار اللوجستي المعلمة أربعة أصغر لوحات مبردة من لوحات نونريفريجيراتيد (الجدول 3). وهكذا، التبريد ألواح د 6 يقلل من خطأ ويحسن من دقة التقديرات يق.

    Figure 1
    رقم 1. تخطيط لوحة ميكروويل وتمييع القياسية منحنى التحضير مقايسة نعم. معايير E2 (الآبار رمادية خفيفة)، عينات والسلبية ضوابط استخراج (آبار بيضاء)، والمركبات (H1-3) واللبن وسائط الإعلام (H10-12) تم اختبار كافة عناصر التحكم (الآبار رمادي داكن) في ثلاث نسخ. شيد منحنى قياسي E2 (الآبار رمادية خفيفة) بواسطة الطلاء ميليلتر 320 من الخميرة في آبار A1 من خلال 120 ميليلتر من الخميرة في آبار B1 خلال G3 و A3. ثم، 5 ميليلتر من E2 (227.5 نانومتر للخميرة التي تعبر عن ERα؛ 9.75 نانومتر للخميرة التي تعبر عن ERβ) وأضيفت إلى الخميرة في الآبار A1 من خلال A3. الخميرة + E2 تعليق كان متسلسل المخفف بنقل 205 ميليلتر من كل بئر للبئر تحتها، مما أسفر عن تركيزات E2 النهائية المدرجة في الجدول 1. علما بأنه في نهاية عملية تمييع المسلسل، يجب تجاهل ميليلتر 205 من الآبار G1 من خلال G3 لتحقيق وحدة تخزين نهائي من 120 ميليلتر في كل بئر. أعدت العينة واستخراج السلبية مراقبة الآبار بإضافة 5 ميليلتر لاستخراج كل (الذائبة في الإيثانول 50%) إلى 320 ميليلتر من الخميرة. أداة مراقبة الآبار (H1-3) أعدت بإضافة 5 ميليلتر من الإيثانول 50% إلى 320 ميليلتر من الخميرة. كانت مختلطة جميع الآبار عينة والتحكم بها بيبيتينج، وتم إزالة ميليلتر 205 وتجاهل لضبط أحجام جيدا لكل 120 ميليلتر. وأخيراً، أعدها عناصر الوسائط تصفيح ميليلتر 120 من وسائل الإعلام اللبن في آبار H10-12.  لاستخدامه في الحاسبة لاكز في التذييل 1 والتطبيق القائم على البحث والتطوير المبينة في التذييل 2، E2 يجب مطلي المنحنى المعياري وعناصر الوسائط المركبة واللبن كما هو موضح.  يمكن مطلي عينات وضوابط استخراج السلبية في أي من الآبار الأبيض طالما يلاحظ ترتيب الطلاء.  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 2
    رقم 2. المنحنيات القياسية لوحات نعم المتولدة عن طريق الانحدار اللوجستي المعلمة 4- ركائز اثنين (أونبج & كبرج) تم اختباره باستخدام الخميرة معربا عن واحد من اثنين البشرية الإستروجين مستقبلات (ERα أو ERβ) على حد سواء دون (A) ومع الفترة (ب) تبريد د 6 بعد الاحتضان ح 17 مع 17β استراديول وعينه مقتطفات. تم اختبار جميع المعايير E2 وعناصر الإعلام ومركبة في ثلاث نسخ. وتمثل النقاط وسائل ثلاث قيم لاكز، حيث تعكس القيم لاكز درجة تغير اللون الناجم عن β-جالاكتوسيداسي. وترد في الجدول 3معلمات نموذج الانحدار اللوجستي. أونبج = اورثو-نيتروفينيل-β-د-جالاكتوبيرانوسيدي؛ كبرج = الكلورية الأحمر-β-د-جالاكتوبيرانوسيدي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 3
    الشكل 3. أمثلة للوحات نعم المتقدمة. ركائز اثنين (أونبج & كبرج) تم اختباره باستخدام الخميرة التعبير عن مستقبلات الإستروجين البشري (ERα أو ERβ)، أما دون (يسار) أو مع الفترة (يمين) تبريد ستة أيام بعد الاحتضان ح 17 مع 17β استراديول أو عينة مقتطفات. جميع المعايير E2 ووسائط الإعلام ومركبة تم اختبار عناصر التحكم في تريبليكاتيس. وتم ترتيب لوحات مع أعلى تركيز E2 في الصف العلوي من كل لوحة والضوابط (الإيثانول 50% + الخميرة على وسائط اليسار واللبن على اليمين) في الصف السفلي لكل لوحة وفقا الرقم 1. أونبج = اورثو-نيتروفينيل-β-د-جالاكتوبيرانوسيدي؛ كبرج = الكلورية الأحمر-β-د-جالاكتوبيرانوسيدي.الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الرقم القياسي [هاء-2] للخميرة ERα (بعد الظهر) [هاء-2] للخميرة ERβ (بعد الظهر)
    1 3500 150
    2 2208 94.6
    3 1393 59.7
    4 878 37.6
    5 554 23.7
    6 349 15
    7 220 9.45

    الجدول 1. النهائي "تركيزات من E2 المعايير" المستخدمة في نعم.
    الذائبة في الإيثانول اللامائى E2 المجفف وتضعف ثم إلى العمل الأسهم تركيزات 227.5 شمال البحر الأبيض المتوسط (بالنسبة للخميرة التي تعبر عن ERα) و 9.75 شمال البحر الأبيض المتوسط (بالنسبة للخميرة التي تعبر عن ERβ) في الإيثانول 50%.أسهم العمل ثم إضافة إلى الآبار ميكروسكوبية تحتوي على الخميرة في اللبن وسائل الإعلام ومتسلسل المخفف للتركيزات الموضحة في الجدول.

    عينات اختبار شروط المقايسة مكافئات إستروجين (إيكس) من بكبس
    حزب المؤتمر الشعبي # نوع العينة مستقبلات الركيزة 1 يق (نانوغرام/غرام) إيك 2 (نانوغرام/غرام) 3 يق (نانوغرام/غرام) يعني إيك (نانوغرام/غرام)
    1 كريم الشعر ERΑ أونبج وفيات المواليد 0.379 وفيات المواليد < 0.379
    1 كريم الشعر ERΑ كبرج وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد
    1 كريم الشعر ERΒ أونبج 0.528 0.338 0.363 0.410
    1 كريم الشعر ERΒ كبرج وفيات المواليد 0.215 وفيات المواليد < 0.215
    4 واقية من الشمس ERΑ أونبج 6.803 1.390 وفيات المواليد < 4.097
    4 واقية من الشمس ERΑ كبرج وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد
    4 واقية من الشمس ERΒ أونبج 1.321 0.838 0.818 0.992
    4 واقية من الشمس ERΒ كبرج 0.651 0.591 0.725 0.656
    7 مؤسسة ERΑ أونبج وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد
    7 مؤسسة ERΑ كبرج وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد
    7 مؤسسة ERΒ أونبج وفيات المواليد 0.158 وفيات المواليد < 0.158
    7 مؤسسة ERΒ كبرج وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد
    9 كريم للحلاقة ERΑ أونبج وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد
    9 كريم للحلاقة ERΑ كبرج وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد
    9 كريم للحلاقة ERΒ أونبج وفيات المواليد 0.256 0.295 < 0.276
    9 كريم للحلاقة ERΒ كبرج 0.507 0.392 0.560 0.486
    10 طلاء الأظافر ERΑ أونبج وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد
    10 طلاء الأظافر ERΑ كبرج وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد
    10 طلاء الأظافر ERΒ أونبج 0.916 0.503 0.554 0.658
    10 طلاء الأظافر ERΒ كبرج 0.532 0.628 0.594 0.585
    11 محلول ERΑ أونبج وفيات المواليد وفيات المواليد 2.327 < 2.327
    11 محلول ERΑ كبرج وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد
    11 محلول ERΒ أونبج يتجاوز نطاق 2.599 1.845 > 2.222
    11 محلول ERΒ كبرج -- 1.986 1.236 1.611
    13 واقية من الشمس ERΑ أونبج 14.069 11.494 10.189 11.917
    13 واقية من الشمس ERΑ كبرج 4.773 5.790 5.850 5.471
    13 واقية من الشمس ERΒ أونبج يتجاوز نطاق 2.580 يتجاوز نطاق > 2.580
    13 واقية من الشمس ERΒ كبرج 0.292 0.240 وفيات المواليد < 0.266
    15 بلسم الشفاه ERΑ أونبج وفيات المواليد وفيات المواليد 0.431 < 0.431
    15 بلسم الشفاه ERΑ كبرج وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد وفيات المواليد
    15 بلسم الشفاه ERΒ أونبج 1.202 1.060 0.887 1.050
    15 بلسم الشفاه ERΒ كبرج 0.820 0.871 0.851 0.847

    الجدول 2. إيكس بكبس مع إيكس غير صفرية. مختبرين ثلاثة 15 PCPs وضوابط استخراج ثلاث تجانس في الإيثانول اللامائى، وتبخرت، وتشكيلها في الإيثانول 50% لإجمالي 48 عينات، وقد تم تحليل كل منها في ثلاث نسخ باستخدام مقايسة نعم. قد PCPs ثمانية على الأقل 1 إيك غير الصفر، بينما بكبس 7 ولا تبين أن إستروجين في تركيزات تم اختبارها. إيك 1 و 2 إيك إيك 3 تشير إلى مختبرين ثلاثة من كل من حزب المؤتمر الشعبي، وكل اختبار في ثلاث نسخ على لوحة منفصلة. القيم لايك 1 و 2 إيك إيك 3 هي وسائل تريبليكاتيس لكل قاسمة. وأعرب الخميرة المستخدمة في الفحص 1 isoforms 2 مستقبلات الإستروجين البشري (ERα أو ERβ). تم اختبار اثنين من ركائز اللونية، أونبج، وكبرج، باستخدام البروتوكول غير المبردة. وتحددت إيكس استخدام المعلمة أربعة انحدارات السوقي (مع قيم R2 ≥ 0.98) من قيم لاكز في كل من 7 تجمعات E2. ND = الكشف عن الحد الأدنى للمقايسة.-= تكرار المفقودة.

    شروط المقايسة معلمات النموذج
    مستقبلات الركيزة القبض على 4 درجة مئوية عن د 6 نموذج ص2 معدل النمو (لاكز وحدات/ng/ml) نقطة انعطاف (ng/mL) الخط السفلي المقارب (لاكز وحدات) الخط العلوي المقارب (لاكز وحدات)
    ERΑ أونبج لا > 0.99 8.548 ±1.633 -0.512 ±0.025 -1.623 ±4.408 128.11 ±6.31
    ERΑ أونبج نعم > 0.99 7.618 ±0.758 -0.587 ±0.014 -8.378 ±2.223 99.53 ±2.528
    ERΑ كبرج لا > 0.99 8.256 ±2.182 -0.610 ±0.033 0.853 ±3.333 62.52 ±3.473
    ERΑ كبرج نعم > 0.99 5.068 ±0.616 -0.523 ±0.022 -3.147 ±1.946 68.06 ±3.069
    ERΒ أونبج لا > 0.99 1.041 ±2.004 -0.898 ±4.410 -32.98 ±86.62 248.6 ±778.9
    ERΒ أونبج نعم > 0.99 4.327 ±1.289 -1.736 ±0.087 4.654 ±3.087 66.37 ±10.75
    ERΒ كبرج لا = 0.99 5.673 ±1.764 -1.914 ±0.052 3.925 ±1.679 28.05 ±2.334
    ERΒ كبرج نعم > 0.99 4.412 ±1.142 -1.894 ±0.051 2.052 ±1.303 22.64 ±2.047

    الجدول 3. نموذج المعلمات للمعلمة 4 التراجعات السوقي للمنحنيات القياسية في الشكل 2. تم اختبار ركائز اثنين، أونبج، وكبرج، باستخدام الخميرة معربا عن 1 2 مستقبلات الإستروجين البشري (ERα أو ERβ) على حد سواء دون ومع فترة تبريد ستة أيام بعد الاحتضان ح 17. يتم الإعلام عن المعلمات كتقديرات الأخطاء ±standard.

    التذييل 1 من . تطبيق لحساب القيم لاكز.  لاستخدام التطبيق، أولاً تنزيل برامج Java مجاناً (كما ورد في الجدول للمواد). قم بفتح تطبيق لاكز. تخطيط لوحة المستخدمة مع التطبيق يجب أن يكون مماثلاً لتخطيط اللوحة المعروضة في الشكل 1. إذا لم تستخدم بعض الآبار عينة، الاحتفاظ بامتصاص قراءات من آبار فارغة كأصحاب المكان في dataset امتصاص يتم لصقه في تطبيق لاكز.  هذا يحافظ على التخطيط المكاني اللوحة في التطبيق، ويضمن آبار مراقبة وسائط الإعلام في مواقعها المطلوبة.  بالإضافة إلى ذلك، لن يتم تنفيذ التطبيق إذا كان هناك خلايا فارغة. قم بلصق OD405 القراءات (بالنسبة أونبج) أو OD القراءات574 (بالنسبة كبرج) لجميع الآبار باستخدام أوامر لوحة المفاتيح "التحكم (ctrl) + v" أو "command + v،" اعتماداً على منصة الكمبيوتر قيد الاستخدام. أدخل مقدار الوقت حضانة في ساعات للمقايسة لإنتاج اللون (من الخطوة 5، 4؛ فعلى سبيل المثال، 0.66667 ح لمدة 40 دقيقة). انقر فوق التالي. لصق في التطوير التنظيمي610 قراءات من الخطوة 5.3. انقر فوق إرسال. سيتم عرض النتائج لاكز ويمكن نسخها بالضغط على "عنصر التحكم (ctrl) + c" أو "command + c," اعتماداً على منصة الكمبيوتر قيد الاستخدام. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

    التذييل 2 من . خيارات البرامج الإحصائية لحساب إيكس- ويمكن حساب إيكس باستخدام أحد الخيارات الثلاثة المعروضة.  توجيهات لاستخدام 1. أحزاب اللقاء المشترك البرامج أو 2. وترد في التذييل 2 رمز R.  كما تم تحويل التعليمات البرمجية R إلى 3. صيغة تطبيق متاح في https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

    التذييل 3 من . نموذج "جمع البيانات" استخدام كبرج والخميرة ERα التعبير عن ذلك كالركيزة. قياسات OD610 والتطوير التنظيمي574 لكل من سبعة عناصر المعايير والمركبات والوسائط E2، والترابي عينة واحدة مدرجة، جنبا إلى جنب مع القيم المحسوبة لاكز. استخدمت قيم لاكز المعايير لبناء نموذج انحدار اللوجستي المعلمة أربعة من المنحنى القياسي كما هو موضح في الخطوات 7A & ب أعلاه. واستخدمت النموذج لاقحم ثلاث تقديرات ايقس العينة التمثيلية في نانوغرام/مل في الآبار الميكروسكوبية. ثم تم تحويل هذه القيم إلى ايقس معبراً نانوغرام/غرام عينة (الخطوة 8، 1). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

    Discussion

    نعم طريقة منخفضة تكلفة المستخدمة للكشف عن يغاندس إستروجين في عينات بيئية، مثل المياه، والغذاء، والأنسجة النباتية، أو منتجات العناية الشخصية. البيانات المقدمة هنا مقارنة 2 مستقبلات الإستروجين (ERα و ERβ)، وركائز 2 (أونبج وكبرج)، والجداول الزمنية 2 (بروتوكول 2 (د) دون التبريد) والمتعلق بسبعة أيام بالنسبة للتبريد لقياس استروجينيسيتي في منتجات العناية الشخصية عن طريق التحليل نعم. د 7، بروتوكول مبردة باستخدام كبرج والخميرة معربا عن ERα و/أو ERβ أفضل يوضحها ايقس بينما أيضا كونها متوافقة مع ضيق الوقت الذي تفرضه دورات المختبرات الجامعية التي تجتمع مرة واحدة فقط/الأسبوع لعدة ح. في الواقع، مقارنة بمقايسة د 2 دون التبريد، مقايسة المبردة سبعة أيام ارتبط بانخفاض التباين عبر لوحة replicates. وبالإضافة إلى ذلك، تم توسيع الجزء الخطي من المنحنى المعياري قليلاً للبيانات التي تم جمعها باستخدام مقايسة المبردة. يحدد نطاق الكشف والرزن الجزء المنحنى القياسي الخطي وهي الجزء الوحيد من المنحنى المعياري الذي يمكن استخدامه لاقحم إيكس عينة.

    في جميع ولكن واحدة من العينات التي تم اختبارها، إيكس تقاس باستخدام كبرج كانت أقل من تلك الكمية مع أونبج. مع معامل الانقراض أعلى وأدنى كم والخامسكحد أقصى، كبرج عشر مرات أكثر حساسية من أونبج17. وبالتالي، يمكن استخدامه في تركيزات أقل كبرج ويمكن استخدامها للكشف عن كميات أقل من β-جالاكتوسيداسي. لهذه الأسباب، كبرج المفضل عموما على مدى18،أونبج19. بيد لا يفسر حساسية الركازة أكبر اكتشاف القيم إيك السفلي مع كبرج. يمكن أن تكون القيم يق أعلى الكشف مع أونبج بسبب التدخل مصفوفة مع المقايسة، كما لاحظ المؤلفون الآخرون2،18. أصباغ الصفراء من مقتطفات منتجات العناية الشخصية يمكن تضخيم قيم يق الكشف مع أونبج. الآخرين قد التحايل على هذه المشكلة قبل بما في ذلك الضوابط المخضب التصميم التجريبي2، نهج أن يضاعف عدد اللوحات في تجربة. عندما تدخل المصفوفة قد تكون إشكالية، قد يكون كبرج الركازة أفضل مقايسة نعم، على الرغم من أنها أكثر تكلفة ويتطلب أوقات أطول في الحضانة من أونبج. وعلاوة على ذلك، تغير لون الناجمة عن انقسام الركازة من β-جالاكتوسيداسي أكثر مأساوية مع كبرج، مما يجعل من الأسهل للطلاب لوضع تصور لنتائج.

    ميلر وآخرون (2010)، الذين هندسيا الخميرة المستخدمة في هذا البروتوكول، ولاحظ أن الخميرة معربا عن ERβ كانت 30 x أكثر حساسية ل 17β-استراديول من الخميرة معربا عن ERα، استنتاج مدعومة ب البيانات لدينا14. وبصرف النظر عن الفروق المحتملة في بلازميد البناء، ميلر وآخرون (2010) لا يمكن أن يفسر هذا الاختلاف في حساسية14. اختلاف واحد بين بنيات بلازميد اثنين أن التعبير ERα ينظمها اللبن، بينما يخضع التعبير ERβ السكر أو اللبن. الخميرة المستخدمة في التحليل نعم مثقف في وسائل الإعلام الجلوكوز ويعطي اللبن إلا عند هي تضعف في بداية المقايسة. ولذلك، قد تتراكم الخميرة معربا عن ERβ إعداد نسخة أعلى من البروتينات مستقبلات قبل بدء الفحص، مما يمنح حساسية أعلى لأستروجين يغاندس.

    حساسية أقل للتعبير عن ERα الخميرة قد يفسر ارتفاع معدلات عدم الكشف عن استروجينيسيتي في عينات تقاس بالمقارنة مع ERβ ERα. لزيادة احتمالية أن عينة إيكس سوف يتم الكشف عن، المستخدمين يمكن أن تستخدم المذيبات استخراج مختلفة وأساليب أو إضافة كميات أعلى من عينة للخميرة. إذا استخدمت زيادة حجم العينة، ينبغي تعديل تركيزات المعايير E2 بنفس الحجم من معايير ونماذج يمكن استخدامها في المقايسة. واحد الحد من إضافة نموذج أكثر أن الخميرة يمكن أن يتسامح مع الإيثانول 6-10% فقط، مع التسامح أفضل في درجة حرارة الحضانة من 30 مقابل 35 درجة مئوية20. للتحكم في التأثيرات الإيثانول في الخميرة، ينبغي إضافة ثلاث آبار "الخميرة فقط" إلى تخطيط لوحة المحققين وتأكيد أن التطوير التنظيمي610 من هذه الآبار "الخميرة فقط" قابلة للمقارنة ل التطوير التنظيمي610 من آبار مراقبة المركبات فورا بعد إضافة لاكز المخزن المؤقت. وبدلاً من ذلك، يمكن إضافة العينات الذائبة في الإيثانول إلى لوحات ميكروويل الجافة والايثانول تبخرت قبالة قبل إضافة الخميرة. ديميثيلسولفوكسيدي ([دمس]) يستخدم أيضا فحوصات مذيب عينة بنعم، ولكن ينبغي أن يكون تركيز العامل النهائي [دمس] مع الخميرة محدودة إلى 1%12.

    مقايسة نعم أداة فحص قوية للكشف عن استروجينيسيتي في عينات بيئية. على وجه التحديد، نعم يكشف يغاندس التي تربط مستقبلات الإستروجين النووية التي تتفاعل مع عناصر الإستروجين استجابة لتوجيه التعبير الجيني14. ومع ذلك، قد نعم أيضا أوجه القصور الهامة. نعم لم يكشف EEs التي تعمل من خلال آليات غير النووية مثل الغشاء مستقبلات الإستروجين أو الآليات التي تنطوي على عناصر إضافية مثل عوامل النسخ 1 البروتين المنشط (AP-1). وعلاوة على ذلك، نظراً لأن الخميرة لا تملك نفس القدرة الأيضية كخلايا الثدييات، لا يمكن الكشف عن نعم يغاندس التي تتطلب التنشيط الأيضي لتكون إستروجين.

    وباﻹضافة إلى ذلك، مقايسة نعم لا يمكن سهولة التفريق بين يغاندس إستروجين ومكافحة إستروجين في العينات المعقدة. بدلاً من ذلك، أنه يقيس صافي استروجينيسيتي، وهو تأثير مجموع يغاندس إستروجين واستروجين لمكافحة. لقياس تركيز الخصوم ER أو تقييم النشاط المثبطة للخلائط، يمكن تعديل المقايسة التي تفرخ الخميرة مع مؤثر القياسية (17β-استراديول) ومجموعة من اختبار عينة تركيزات12. يحدد إذا كان الخصوم في العينات التي يمكن أن تقلل نشاط فعل مؤثر مراسل هذه العملية وتوفر شاشة مفيدة لتحديد وجود الخصوم ER في عينات.

    البروتوكول المعروضة هنا يمكن استيعاب مجموعة متنوعة من أنواع العينات، وعلى الرغم من أن بعض العينات قد تتطلب إدخال تعديلات على خطوات الإعداد الاستخراج وعينه. على سبيل المثال، يتطابق إيكس تباينا كبيرا فيما بين بعض منتجات العناية الشخصية. تميل إلى احتواء قطرات النفط العينات أكثر من متغير أو خلاف ذلك ليست متجانسة تماما، مما يشير إلى أن من المفيد أكثر محبتين مذيب مثل إثيل الاثير. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يستبعد الزيوت والشمع في منتجات العناية الشخصية عن طريق استخراج العينات مع الإيثانول 50% بدلاً من 100% إيثانول.استخراج إيثانول 50% أيضا التقاط المزيد يغاندس الاستروجيني للذوبان في الماء (مثلاً، بعض أصباغ). ولكن الإيثانول 50% يتبخر ببطء أكثر من 100% إيثانول وهكذا يجوز تمديد وقت استخراج. بالإضافة إلى ذلك، كانت بعض العينات (مثل الصابون) السامة للخلايا للخميرة، الناتج في الخلية انخفاض كثافة القياسات (OD610). فوكس et al. (2008) نقترح أن تكون تضعف هذه العينات واختبارها إذا كانت الخلية كثافة الخلافات تتجاوز 30% مقارنة بالسيارة مراقبة الآبار12.

    إذا تم استخدام مقايسة نعم لأغراض البحوث التحليلية، يمكن اختبار منحنيات تمييع عينة برك وقائيا تحديد الكميات المناسبة من استخراج المراد إضافتها إلى الخميرة في الخطوة 4، 5. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يكون اختبار مقتطفات في وقت واحد على وحدات تخزين متعددة (مثلاً، 5 ميليلتر واستخراج 20 ميليلتر إضافة إلى الخميرة في الخطوة 4، 5) أو تخفيف تمتد للحجم (مثلاً، ميليلتر 0.2، ميليلتر 2 و 20 ميليلتر). وحدات التخزين "مناسبة" لاستخراج هي تلك التي تحديد استروجينيسيتي عن طريق مطابقة القيم لاكز على طول الجزء الخطي من المنحنى المعياري. التحسين يمنع المشاكل الناجمة عن إضافة عينة كبيرة جداً أو صغيرة جداً للخميرة، مثل سيتوتوكسيسيتي، وسلبيات كاذبة، أو استروجينيسيتي أن تجاوز المنحنى القياسي. وكما ذكر أعلاه، ينبغي أن تعدل أحجام العينات ومعايير E2 عند استخدام كميات مختلفة من يجند أن الخميرة معرضون إلى حجم متسقة وتركيز الإيثانول أو أي مركبة أخرى عبر اللوحة.

    على الرغم من إمكانية السلبيات الكاذبة، مقايسة نعم قد حددت كأداة اختبار الطبقة 3 لاختلال الغدد الصماء شوج et al. (2013)، وضعت منظمة الصحة العالمية "بروتوكول الطبقات" شامل "اختلال الغدد الصماء" (تيبيد)21. للتعليم الجامعي، المقايسة ثمين لتدريس المفاهيم المرتبطة باختلال الغدد الصماء وخلية ثقافة وملزم مستقبلات، نشاط إنزيم، والهندسة الوراثية، والإحصاءات والتصميم التجريبي. الطلاب الذين يستخدمون المقايسة أيضا ممارسة المهارات المختبرية الأساسية وقابلة للتطبيق على نطاق واسع مثل متسلسل تمييع المعايير؛ استخراج العينات؛ مما يجعل الحلول؛ تشييد والتحريف المنحنيات القياسية؛ حساب تركيزات؛ مما يجعل الحلول؛ مما يدل على أسلوب تعقيم؛ استزراع الخلايا؛ تحديد المتغيرات والضوابط؛ جمع وتنظيم وتحليل البيانات؛ بناء وتفسير الرسوم البيانية؛ واستخدام معدات المختبرات المشتركة مثل ميكروبيبيتورس والطيفية.

    Disclosures

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    Acknowledgments

    وكان تمويل هذا المشروع قبل بدء التمويل TME وعمرو من جامعة ولاية لويزيانا للتكنولوجيا وجامعة فيرمان، على التوالي. تم توفير التمويل الإضافي "منحة النهوض بكلية الحقوق" عام 2015 إلى عمرو و TME من "الكليات المرتبطة" الجنوب، ومنحة "ولاية لويزيانا" ابسكور بفوند TME من المؤسسة الوطنية للعلوم والمجلس ولاية لويزيانا من الحكام، وعلى جائزة سفر إلى TME من جامعة الجنوب. نشكر الدكتور ديفيد يوبانكس (قضية فورمان) للمساعدة في التحليل الإحصائي والسيد كريستوفر مور على "إعطاء لنا يد" أثناء التصوير.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    Vortex Mixer (for single or multiple tubes) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 02-215-365 Any mixer will suffice.
    Bucket centrifuge Fisher Scientific (www.fishersci.com) 75-063-839 Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.
    Bunsen burner Fisher Scientific (www.fishersci.com) 17-012-823 Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.
    Incubator Fisher Scientific (www.fishersci.com) 50125590H Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C.
    Microplate reader BioTek (www.biotek.com) EPOCH2 A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.
    Gen5 microplate reader and imager software BioTek (www.biotek.com) GEN5 Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.
    Refrigerator Fisher Scientific (www.fishersci.com) 05LREEFSA Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C.
    Pipettor or PipetAid compatible with 1 - 10 mL serological pipets Fisher Scientific (www.fishersci.com) 13-681-15E Any pipettors will suffice if they are compatible with 1 & 10 mL serological pipets.
    P10 micropipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F144562G Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl.
    P200 micropipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F144565G Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl.
    P300 multichannel pipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) FBE1200300 Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 - 205 µl.
    Repeating pipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F164001G Must be able to deliver 100 - 320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.
    Name Company Catalog Number Comments
    Supplies
    Sterile 15 mL conical tubes with caps Fisher Scientific (www.fishersci.com) 05-539-801
    Glass scintillation vials Fisher Scientific (www.fishersci.com) 03-337-4
    Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (nonsterile) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 12565501
    Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid  Cole-Parmer (www.coleparmer.com) EW-01728-81
    100 mL glass beakers Fisher Scientific (www.fishersci.com) 02-539H Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.
    250 mL glass Erlenmeyer flasks Fisher Scientific (www.fishersci.com) FB500250 Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.
    Sterile, adhesive, porous film  VWR (www.vwr.com) 60941-086
    Metal forceps Fisher Scientific (www.fishersci.com) 12-000-157 Any metal forceps will suffice.
    Reagent reservoir Fisher Scientific (www.fishersci.com) 07-200-127
    Filtration units (0.2 µm) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 09-761-52
    Squirt bottle (for ethanol) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 02-897-10 Any laboratory squirt bottles will suffice.
    Autoclavable storage bottles Fisher Scientific (www.fishersci.com) 06-414-1D Any autoclavable glass storage bottles will suffice.
    10 mL glass serological pipets (sterile) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 13-678-27F Any glass serological pipets will suffice.
    1 mL glass serological pipets (sterile) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 13-678-27C Any glass serological pipets will suffice.
    P10 micropipettor tips USA Scientific (www.usascientific.com) 1120-3810 Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
    P200 micropipettor tips USA Scientific (www.usascientific.com) 1120-8810 Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
    P300 micropipettor tips USA Scientific (www.usascientific.com) 1120-9810 Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
    Syringe tips for repeating pipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F164150G Only required if a repeating pipettor is used.
    Sterile petri dishes Fisher Scientific (www.fishersci.com) FB0875712 Any sterile petri dishes will suffice.
    Parafilm Fisher Scientific (www.fishersci.com) S37440
    Name Company Catalog Number Comments
    Yeast 
    Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g., W303a) American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) MYA-151 Recombinant yeast are also available upon request from the authors.
    Receptor/reporter plasmid for ERα Addgene (www.addgene.org) pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061) 
    Receptor/reporter plasmid for ERβ Addgene (www.addgene.org) pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062) 
    Name Company Catalog Number Comments
    Chemicals
    Difco agar BD (www.bd.com) 214530
    Dithiothreitol Sigma (www.sigmaaldrich.com) D0632 CAUTION:  Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.  Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.
    Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside Sigma (www.sigmaaldrich.com) N1127
    Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside Sigma (www.sigmaaldrich.com) 10884308001
    Yeast nitrogen base Sigma (www.sigmaaldrich.com) Y0626
    Glucose Sigma (www.sigmaaldrich.com) G8270
    Galactose Sigma (www.sigmaaldrich.com) G5388
    Adenine sulfate Sigma (www.sigmaaldrich.com) A9126
    Uracil Sigma (www.sigmaaldrich.com) U0750
    Leucine Sigma (www.sigmaaldrich.com) L8000
    Histidine Sigma (www.sigmaaldrich.com) H8000
    17 β-Estradiol  Sigma (www.sigmaaldrich.com)                     MP Biomedicals  E8875-250 mg     0219456401 - 1 mg CAUTION:  Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.  It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.  Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.  Estradiol is very toxic to aquatic life.  Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.  Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.
    100% ethanol Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) 111000200
    Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma (www.sigmaaldrich.com) S9638
    Sodium phosphate dibasic (anhydrous) Sigma (www.sigmaaldrich.com) S0876
    Magnesium chloride Sigma (www.sigmaaldrich.com) M8266
    Potassium chloride Sigma (www.sigmaaldrich.com) P9333
    Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt) Sigma (www.sigmaaldrich.com) L5125
    Sodium carbonate Sigma (www.sigmaaldrich.com) S7795
    Name Company Catalog Number Comments
    Software
    Excel spreadsheet software Microsoft  Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.
    Java software (required for Appendix 1 application)  Oracle Corporation To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.  LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards.
    JMP statistical software version 13.0.0 SAS Institute Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.  The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.
    R statistical computing and graphics software R Foundation Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.  Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Agradi, E., Vegeto, E., Sozzi, A., Fico, G., Regondi, S., Tome, F. Traditional healthy Mediterranean diet: estrogenic activity of plants used as food and flavoring agents. Phytother Res. 20, (8), 670-675 (2006).
    2. Morgan, H. E., Dillaway, D., Edwards, T. M. Estrogenicity of soybeans (Glycine max) varies by plant organ and developmental stage. Endocr Disruptors. 2, (1), (2014).
    3. Myers, S. L., Yang, C. Z., Bittner, G. D., Witt, K. L., Tice, R. R., Baird, D. D. Estrogenic and anti-estrogenic activity of off-the-shelf hair and skin care products. J Exp. Sci Environ Epidemiol. 25, (3), 271-277 (2015).
    4. Wagner, M., Oehlmann, J. Endocrine disruptors in bottled mineral water: estrogenic activity in the E-Screen. J Steroid Biochem Mol Biol. 127, (1-2), 128-135 (2011).
    5. Arnold, S. F., Robinson, M. K., Notides, A. C., Guillette, L. J. Jr, McLachlan, J. A. A yeast estrogen screen for examining the relative exposure of cells to natural and xenoestrogens. Environ Health Perspect. 104, (5), 544-548 (1996).
    6. Odum, J., et al. The rodent uterotrophic assay: critical protocol features, studies with nonyl phenols, and comparison with a yeast estrogenicity assay. Regul Toxicol Pharmacol. 25, (2), 176-188 (1997).
    7. Mellanen, P., et al. Wood-derived estrogens: studies in vitro with breast cancer cell lines and in vivo in trout. Toxicol Appl Pharmacol. 136, (2), 381-388 (1996).
    8. Bergman, A., Heindel, J. J., Jobling, S., Kidd, K. A., Zoeller, R. T. State of the science of endocrine disrupting chemicals – 2012. Inter-Organisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC). Available from: http://www.who.int/ceh/publications/endocrine/en/ (2013).
    9. Balsiger, H. A., de la Torre, R., Lee, W. Y., Cox, M. B. A four-hour yeast bioassay for the direct measure of estrogenic activity in wastewater without sample extraction, concentration, or sterilization. Sci Total Environ. 408, (6), 1422-1429 (2010).
    10. Coldham, N. G., Dave, M., Sivapathasundaram, S., McDonnell, D. P., Connor, C., Sauer, M. J. Evaluation of a recombinant yeast cell estrogen screening assay. Environ Health Perspect. 105, (7), 734-742 (1997).
    11. De Boever, P., Demaré, W., Vanderperren, E., Cooreman, K., Bossier, P., Verstraete, W. Optimization of a yeast estrogen screen and its applicability to study the release of estrogenic isoflavones from a soygerm powder. Environ Health Perspect. 109, (7), 691-697 (2001).
    12. Fox, J. E., Burow, M. E., McLachlan, J. A., Miller, C. A. 3d Detecting ligands and dissecting nuclear receptor-signaling pathways using recombinant strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nat Protoc. 3, (3), 637-645 (2008).
    13. Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ Toxicol Chem. 15, (3), 241-248 (1996).
    14. Miller, C. A. 3d, Tan, X., Wilson, M., Bhattacharyya, S., Ludwig, S. Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays. Plasmid. 63, (2), 73-78 (2010).
    15. Delfosse, V., Grimaldi, M., Cavaillès, V., Balaguer, P., Bourguet, W. Structural and functional profiling of environmental ligands for estrogen receptors. Environ Health Perspect. 122, (12), 1306-1313 (2014).
    16. Environmental Working Group. Skin Deep Cosmetics Database. Available from: http://www.ewg.org/skindeep (2016).
    17. Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. H. A sensitive method for the detection of beta-galactosidase in transfected mammalian cells. Biotechniques. 11, (6), (1991).
    18. Buller, C., Zang, X. P., Howard, E. W., Pento, J. T. Measurement of beta-galactosidase tissue levels in a tumor cell xenograft model. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 25, (9), 713-716 (2003).
    19. Pelisek, J., Armeanu, S., Nikol, S. Evaluation of beta-galactosidase activity in tissue in the presence of blood. J Vasc Res. 37, (6), 585-593 (2000).
    20. Gray, W. D. Studies on the alcohol tolerance of yeasts. J Bacteriol. 42, (5), 561-574 (1941).
    21. Schug, T. T., et al. Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals. Green Chem. 15, (1), 181-198 (2013).
    كشف "يغاندس إستروجين" في "منتجات العناية الشخصية" استخدام "الإستروجين الخميرة الشاشة الأمثل" "المختبر التدريس الجامعي"
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Edwards, T. M., Morgan, H. E., Balasca, C., Chalasani, N. K., Yam, L., Roark, A. M. Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory. J. Vis. Exp. (131), e55754, doi:10.3791/55754 (2018).More

    Edwards, T. M., Morgan, H. E., Balasca, C., Chalasani, N. K., Yam, L., Roark, A. M. Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory. J. Vis. Exp. (131), e55754, doi:10.3791/55754 (2018).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter