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Biology

学部の教育研究所の酵母エストロゲンの画面に最適化されたを使用して個人的な心配プロダクトのエストロゲンのリガンドを検出

doi: 10.3791/55754 Published: January 1, 2018

Summary

この記事では、パーソナルケア製品 (PCPs) エストロゲン受容体 α (ERα) および/またはベータ版 (ERβ) を結合するリガンドを定量化するための最適化された酵母エストロゲン画面を示します。メソッドには、2 つの比色基板オプション、学部コースで使用するため 6 日間冷蔵インキュベーションとデータ分析のための統計ツールが組み込まれています。

Abstract

酵母エストロゲン画面 (はい) 環境試料中エストロゲンのリガンドを検出するために使用し、内分泌かく乱作用の研究で広く用いられています。エストロゲン配位子には、自然と人工の両方「環境ホルモン」(EEs) 個人的な心配プロダクト (PCPs)、プラスチック、殺虫剤、食品などを含む多くの消費財が見つかりましたが含まれます。EEs は、ヒトと他の動物のシグナリング、潜在的肥沃度を減らすと病気のリスクを増大させるホルモンを混乱させます。EEs の他内分泌かく乱化学物質 (内分泌かく乱化学物質) 国民の健康に重要であるにもかかわらず、内分泌かく乱は、学部のカリキュラムで通常は含まれません。この欠点は原則を示す関連性の高い研究室の活動の不足のために一部学部生にアクセスしている関与しています。この記事は示すエストロゲン受容体 α (ERα) および/またはベータ版 (ERβ) を結合するパーソナルケア製品有機配位子を定量化するためはいで最大限に活用されました。メソッドに 2 つの比色定量の基板の 1 つが組み込まれています (オルト- ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド (ONPG) またはクロロフェノール赤-β-D-ガラクトピラノシド (CPRG)) β-ガラクトシダーゼによって切断するが、6 日間冷蔵インキュベーションへのステップLacZ の計算、および関連付けられている 4 パラメータ ・ ロジスティック回帰分析の R コードの学部研究所コース、自動アプリケーションでの使用を容易にします。プロトコルは実験、彼らはエストロゲンを模倣の任意の製品を画面を開発して学生を許可するように設計されています。過程で、彼らは内分泌かく乱作用、細胞培養、受容体結合、酵素活性、遺伝子工学、統計、および実験的なデザインについて学ぶ。同時に、基礎的かつ広範に適用される検査スキルをよう練習するも: 計算濃度;ソリューション;生殖不能の技術を実証連続希釈標準;構築し、標準曲線の補間変数とコントロールを識別します。収集、整理、およびデータの分析構築して、グラフの解釈micropipettors、分光光度計など一般的な実験装置を使用して。したがって、このアッセイを実装する環境科学と健康の新たな問題を探索しながら調査に基づく学習に従事する学生を奨励しています。

Introduction

行列、水、植物組織、消費者製品、食品1,2,3などの様々 なエストラジ オール (E2 または 17 β-エストラジ オール) を模倣する配位子の定量に広く用いられて酵母エストロゲン画面 (はい) 4。総称して、このような配位子を「環境エストロゲン (EEs)」と呼ばれている[はい] は、元々 低コスト、体外体内テスト方法のような齧歯動物のピアレビュー アッセイ5,6と餌アッセイ7レインボー ・ トラウトとして開発されました。これらのテストの目的は、製品に刺激したり、エストロゲン依存性のメカニズムをブロックする化学物質が含まれているかどうかです。EEs の検出は、彼らすることができます通常の内因性エストロゲンが胎児の発育、特に中に、信号を妨害するために重要です。この干渉には、肥満、不妊、癌、および認知喪失8の危険性を増やすことによって健康が損なわれます。

EEs と公衆衛生、その他の内分泌かく乱化学物質の重要性にもかかわらず、内分泌かく乱は、学部のカリキュラムで一般は含まれません。この欠乏は部分的に原理を説明活動の不足のため学部学生がアクセスしている関与しています。さらに、[はい] プロトコルのいくつかのバリエーションが存在する9,1011,12,13, と、この多様性は、アッセイ条件の最適化は時間がかかる場合研究室コーディネーターの特に関連技術の訓練。最後に、はいの試金は通常以上 1 の長い一日または完了 O/N 培養で 2 日連続。このタイミングは通常一度を満たす学部研究所講座の形式と互換性がない/週いくつかの時間。

これらのニーズに対応してでは、この原稿は、個人的な心配プロダクト (PCPs)3研究所の例会に合わせて 6 日間冷凍ステップのエタノール抽出メソッドを含む最適化された 96 ウェルはいプロトコルを報告します。無水エタノールは、さまざまな北極および無極性の溶質を溶解できる汎用性の高い有機溶剤です。学部の授業に適していますまた、容易に利用できる、比較的無毒、手頃な価格で、水と混和性であります。それはまた特別な機器なしに簡単に蒸発します。しかし、エタノールは強く疎水性ホルモンの油やワックスの多くを抽出に最適ではない、PCPs 貧しい抽出効率の一般的な成分をされている後者の 2 つは偽否定的な結果のリスクを増加させます。この制約を念頭に置いて、捜査官そのアドレス サンプル特性抽出プロシージャ (例えば、エタノール抽出、固相抽出) を選択し、研究目標 (学部教育と研究) を達成します。

[はい] は、組換え酵母チューレーン大学で博士チャールズ ミラーによって最初に作成されたに依存します。ミラーを参照してください。(2010 年) の組み換えプラスミド14の完全なマップ。酵母これらのプラスミドで形質転換恒常エクスプレス人間核 ERα または ERβ (また呼ばれる ESR1、ESR2、それぞれ) (ERα) のガラクトースやグルコースやガラクトース (ERβ) の培地で成長しました。エストロジェン様化合物がメディアに存在する場合、これらはエストロゲン様化学物質の濃度に比例したレベルの β-ガラクトシダーゼ (lacZ) 式をアクティブ化リガンド-受容体複合体を作成する、受容体に結び付きます。酵母細胞が蓄積した β-ガラクトシダーゼを解放する分離します。換散バッファーには ONPG または CPRG は、黄色または赤の製品をそれぞれ生成する β-ガラクトシダーゼによって裂かれるのいずれかが含まれています。比色製品は、マイクロウェル プレート分光光度計を使用して吸光度を測定することによって定量化することができます。色変化の度合いは酵母だった公開されているエストロゲンのリガンドの濃度に比例します。

(CPRG または ONPG) 基板の選択は、テストされているサンプルから生じるバック グラウンドの吸光度の可能性に依存します。植物エキスが場合エストロゲン対策を人為的に膨らませるメディアに頻繁に黄色の色合いを追加してたとえば、ONPG (定量化 405 nm) β-ガラクトシダーゼの基質として使用されます。植物エキス、CPRG (574 で定量化 nm) より適切な比色の基板があります。CPRG は ONPG より高価ですが 10 分の 1 のモル濃度で使用されます。この記事は、PCP の estrogenicities エキス ONPG および CPRG の両方を使用して量を示されるを示します。

ERα と ERβ の両方を用いた環境試料のエストロゲンの定量化は、これらの受容体の 1 つだけを使用するよりもより包括的なアプローチです。動物では、これらの受容体は差分組織分布、規制活動、エストロゲン、抗エストロゲン配位子15の結合親和性を表わします。たとえば、植物ベースの植物性エストロゲン通常 bind ERβ より強く2、ERα または ERβ のいずれかのための好みを示すことができるか両方の受容体にも同様に15をバインドする合成化学物質に対し。したがって、1 つのエストロゲン受容体に結合は他へのバインドは必ずしもでは想定していません。

PCPs の選択を使用して表示されているデータが得られたが、EEs は、植物だけでなく、多くの消費者製品 (例えば農薬、洗剤、接着剤、潤滑剤、プラスチック、食品、医薬品) で発見され、PCPs、説得力のある、容易に利用可能な予算にやさしいや生の環境に関連します。学生は、実験室でテストするのには自宅から自分のお気に入りの PCPs をもたらすに招待することができます。彼らはまた高 PCPs の仮説ドリブン比較を生成し、低毒性スコア16環境ワーキング グループによって開発された皮膚深部のデータベースを検索できます。これで、学生は同時に高度な研究能力を開発します。自己指示、お問い合わせベースの学習; に従事します。環境科学と健康の新たな問題を探る。

Protocol

1. 試薬

  1. 6.7 g 酵母窒素ベース 20 g ブドウ糖やガラクトース、20 mg アデニン硫酸塩 (200 mg/100 mL の水溶液原液 10 mL として追加されます)、(200 mg/100 mL の水溶液原液 10 mL として追加) 20 mg ウラシルを混合することによってグルコースとガラクトースのメディアを準備します。、60 mg ロイシン (1 g/100 mL 水原液 6 mL として追加されます)、および脱イオン水濾過 (0.2 μ m フィルター) により 1 l. 定置滅菌の最終巻に 20 mg ヒスチジン (1 g/100 mL 水原液 2 mL として追加されます)。メディアは、数週間の 4 ° C で保存できます。
  2. 準備のエストラジ オール (E2) 基準に無水エタノールと適切な作業濃度に希釈溶解粉 E2 (2,275億 nM & 9.75 nM) 50% エタノールで。
    注: エストラジ オール 1 mg のバイアルとして購入した場合は、エストラジ オールの粉末を溶解するバイアルに直接 1 mL のエタノールを追加します。3.67 mM 在庫 #1 が得られます。 株式 #1 990 μ L エタノール 36.71 μ M 株式 #2 の 1 mL の 10 μ L を希釈します。 その後、株式 #2 990 μ 50% エタノール 367.13 nM 株式 #3 の 1 mL の 10 μ L を希釈します。 株式を働いているは、希釈 619.7 μ L 株式 #3 380.3 μ L 50% エタノール 1 mL 227.5 nM 在庫 ERα を表現する酵母の標準曲線を作成するために使用します。 26.56 μ L 株式 #3 9.75 nM 在庫 ERβ を表現する酵母の標準曲線を作成するために使用の 1 mL に 973.44 μ L 50% エタノールで希釈します。パラフィルム-20 で店と基準をシールまたは-70 ° C
    注意: E2 は疑い発がん性、生殖毒性物質です。吸入、飲み込んだ、または皮膚を通して吸収すると有害です。E2 授乳子供や胎児に害があります。E2 は水生生物に非常に有害です。適切な個人用保護具 (手袋、ヒューム フード、防塵マスク) を使用し、妊娠・授乳期の暴露を避けます。E2 有害廃棄物としての処分し、環境に解放しないでください。
  3. 最終的に脱イオン水で 8.52 g Na2HPO4、5.52 g NaH2PO4•H2O、95.21 mg MgCl2、745.5 mg KCl、2 g N lauroylsarcosine ナトリウム塩と ONPG (400 mg) または CPRG (77.7 mg) を混合することにより LacZ バッファーを準備します。20 mL 因数-20 ° C で 1 l. ストア LacZ バッファーのボリューム
    注: 20 mL 分注 1 の 96 ウェル プレート十分です。
  4. 105.9 g 室温 1 l. 店の最終巻に脱イオン水に炭酸ナトリウムを混合することにより炭酸ナトリウムを準備します。
  5. 水で 1 M ジチオトレイトール (DTT) を準備します。-20 ° C で DTT の 25 μ L の因数を凍結します。
    注意: DTT は急性皮膚および眼の刺激です。適切な個人的な保護装置 (手袋、ヒューム フード、防塵マスク) を使用して、皮膚と眼との接触、吸入や摂取を避けるために。
    注: 各因数は 1 つの 96 ウェル プレート十分です。

2. 試料と抽出コントロールの準備

  1. テストするサンプルを選択します。
    注: この記事は、石鹸、クリーム、シャンプー、日焼け止め、リップ クリーム、財団、シェービング クリーム、マニキュア、ローションを含む 15 の PCPs のデータを示します。
  2. 15 mL の円錐管に無水エタノール 10 mL とサンプルの 1 g を組み合わせます。15 mL コニカル チューブ中のエタノールの 11 mL から成る負抽出コントロールを準備します。必要に応じて、複製を準備します。
    注: 提示の実験的なデザインのすべての 15 の PCPs と帳票抽出制御ソリューションの 3 つの因数を作製した、48 サンプルの合計 3 通のセクション 4 のプロトコルを使用してそれぞれを行った.一枚の板をトリプリケートで最大 23 サンプルに対応できます。無水エタノールは、それがすぐに蒸発するので、この手順で使用されます。否定的な抽出コントロールを使用すると、エストロゲンが円錐管からのサンプルに溶出しないことを確認してください。
  3. 手動振動とボルテックスの組み合わせによってまたは多管 vortexer でチューブを揺することによってチューブ内容 30 分間ホモジナイズしてください。
  4. 遠心分離機 10 分デカント バケット遠心分離機の最大許容速度で円錐管各チューブから清 40 μ m 携帯こし器を通って 50 mL の円錐管に。シンチレーション バイアルに各 50 mL のチューブの中身を空けます。
  5. 完全に蒸発し、エタノールを許可する 1 週間換気フードで残してバイアルを開きます。また、回転蒸発器、窒素下換気フードのサンプルを乾燥させます。光の敏感な成分の劣化を避けるためには、(例えば、換気フードのドアの上の場所不透明生地) の光から乾燥試料を保護します。
  6. 50% エタノールと均質化する渦の 1.0 mL のサンプルを再構成します。

3. 培養と二次培養酵母14

  1. 30 ° C でフィルター滅菌グルコース メディアにおける酵母の孵化によってアクティブなイースト文化 (出芽酵母14の組換え株 W303a) を維持します。サブカルチャー酵母毎週新鮮なフィルター滅菌グルコース メディアで。
  2. 2 泊 (約 42 h) はいプレートを準備する前にアクティブなイースト文化の 0.1 mL を 10 mL を無菌フィルター滅菌グルコース メディアに追加することによって酵母のサブカルチャー。 30 ° C で 2 泊分間インキュベートします。 酵母は、浅い文化として滅菌 250 mL エルレンマイヤー フラスコ場合、揺れは必要ありません。
    注: 酵母も格納できます冷蔵寒天版で数ヶ月。長期的なストレージの (年) が 15-50% 滅菌グリセリン、渦、-70 ° C で凍結と O/N 文化を組み合わせる滅菌グリセリンを準備、緩めたキャップ クリオバイアル、オートクレーブに 300 μ L グリセロールを転送するのに注射器を使用します。1,200 μ O/N 酵母培養生殖不能の技術を使用して追加します。

4. 準備はいプレート (アッセイの 1 日)

  1. 610 で 0.065 ± 0.005 の光学濃度 3.2 から酵母を希釈滅菌ビーカーおよび生殖不能の技術を使用して、フィルター滅菌ガラクトース メディア (外径610) nm。
    1. 透明なポリスチレン板に帳票ガラクトース ブランクと一緒に 3 通各酵母サンプルの 120 μ l 分注光学密度を確認 (プレート滅菌する必要はありません)。 プレート分光光度計を使用して、希釈酵母培養酵母のネット外径610を決定する酵母外径610測定値からガラクトース ブランクの 0.065 ± 0.005 減算 OD610 朗読のネット外径610があることを確認します。各 96 ウェル プレートの少なくとも 30 mL 希釈酵母の最終的なボリュームを準備します。
      注: この測定に 595 610 nm の吸光度を測定する分光光度計フィルターが使えます。
おおよそ 1:6 v: v 比酵母: メディアの通常利回り 0.065 近く外径610 、だから 30 mL メディアに 4.5 mL 酵母を追加して起動し、0.060 と 0.070 netOD610を達成するために必要に応じてより多くの酵母やメディアを追加します。
  • 生殖不能の技術を使用して、生殖の井戸、ポリプロピレン、プレート レイアウト (図 1) によると 96 ウェル マイクロ プレートにこの希釈酵母懸濁液を追加します。ピペッティング、間には、継続的にコンテナーを旋回またはピペットとの混合によって中断酵母ソースを保持します。このステップでは、滅菌注射器先端で繰り返し pipettor を使用することをお勧めします。
    注: ポリプロピレン プレート滅菌はオートクレーブ 2 つ重ね板箔に包まれています。 トップ プレート サンプル プレートの蓋として、洗浄、再オートクレーブすることができます、再利用します。
  • 120 μ L フィルター滅菌ガラクトース メディアをプレート レイアウト (図 1) によると 3 追加井戸 (H10 - 12) に追加します。これらの井戸は、単独でのメディアによって貢献した吸光度を考慮してメディア コントロールとして機能します。
  • 直列 E2 作業標準のトリプリケート希釈することによって各プレートの標準曲線を作成 (2,275億 9.75 ERα nM ERβ nM) 井戸酵母懸濁液 (A1 - G3) プレート レイアウト (図 1) によるとを含みます。 A3 から A1 の井戸に E2 の基準の 5 μ L を追加することによって始めます。ピペッティングによるマイクロウェル内容をミックスし、井戸 A1 - 井戸 B1 - 3 に 3 から 205 μ L を移動することによってこの懸濁液を連続希釈します。混合と列 G. を 205 μ L の転送を繰り返す
    注: シリアル希釈後、G1 - 3 の井戸から 205 μ L を破棄します。この手順の最後に、すべての標準的な井戸は 120 μ L を含める必要があります。シリアル希釈表 1に記載されている最終の E2 濃度が得られます。シリアル希釈手順については、滅菌のヒントでマルチ チャンネルの pipettor を使用することをお勧めします。
  • 酵母懸濁液 (H1 - 3) プレート レイアウト (図 1) によるとを含む車両制御井戸に車両 (50% エタノール) の 5 μ L を追加します。
    注: 車両制御井戸、酵母とメディアに関連付けられたバック グラウンドの吸光度を定量化する使用されます。さらに、サンプルの外径610値を比較することにより検出できるテストの細胞毒性または成長促進効果は車両制御井戸と井戸をテストします。
  • プレート レイアウト (図 1) によると酵母懸濁液を含む井戸に 5 μ L をトリプリケートのサンプルおよび否定的な抽出コントロールを追加します。
    注: を書き留めますサンプルまたは否定的な抽出コントロールを追加するのも。 追跡するには、どの井戸があるサンプルとそうでない、ヒントの新鮮なボックスで開始およびプレートに対応する井戸の場所としてボックスで同じ場所からのヒントを使用します。1 つの 96 ウェル プレート 3 通まで 23 サンプルに対応できます。
  • ピペッティングでサンプル抽出制御、車両制御井戸の内容をミックスします。第 1 図の凡例に従ってそれぞれから 205 μ L を削除することによってこれらのウェル 120 μ L のボリュームを調整します。
  • 滅菌、接着剤、多孔質フィルムとプレートをシールします。板にラベルを付けるし、30 ° C で 17 時間インキュベートプレートが潜伏中に動揺する必要はありません。
  • 5. 処理はいプレート (アッセイの 2 日目)

    1. 30 ° C で 17 時間培養後インキュベーターからプレートを削除します。プレートがすぐに処理され場合、は、5.1.1 のステップへ進みます。プレートは、後日処理されます、5.1.2 のステップに進んでください。
      1. 井戸の各行の内容をミックス マルチ チャンネル pipettor を使用し、明確なポリスチレン、96 ウェル マイクロ プレートの対応する各ウェルから酵母懸濁液の 50 μ L を転送します。
        注: ポリスチレン板は無菌である必要はありませんが、蓋がなければなりません。ヒントだけ 3 連セットの間で変更する必要はトリプリケート全体 8 先端マルチ チャンネル ピペットでピペッティングしている場合が井戸の行ごとに新しいピペット先端を使用して、井戸、クロス汚染を避けるために。
        1. 新しい板にラベルを付けます。5.2 手順に進みます。
      2. 処理する前にプレートを格納するには、それらをラップで包み。冷蔵 6 4 ° C でラップされたプレート d. その後、冷蔵庫からプレートを削除、それらの包みを開ける、5.1.1 のステップのようにピペッティングによるすべての井戸の内容を転送します。5.2 手順に進みます。
    2. 1 M の DTT の 20 μ L を 20 mL の最終濃度 1 mM DTT の解凍の室温 LacZ バッファーに追加します。よくミックス LacZ のバッファー。マルチ チャンネル ピペットを使用している場合は、試薬リザーバーに分配します。
      注意: は、手袋を着用し、可能であれば、フードの DTT の作業
    3. どちらかマルチ チャンネル ピペットを使用してまたは pipettor を繰り返し、ポリスチレン板のすべての井戸に DTT と ONPG または CPRG を含む LacZ バッファーを 200 μ l 添加し、すぐに測定し、プレート分光光度計を使用してすべての井戸の外径610を記録します。その他板の必要に応じて繰り返します。
      注: 外径610朗読、LacZ 計算 (ステップ 6.1) の分母に使用されます。このため、測定値を取得するピペッティングした後すぐに、セルの解決する前にまたは LacZ バッファーによって分離します。サンプル井戸の外径610値は著しく高いか車両制御井戸外径610の値より低い場合、サンプル抽出物は、成長促進や酵母、細胞それぞれ。計算は違いがどちらの方向に 30% を超える場合は、井戸に細胞の密度のわずかな違い、矯正する LacZ 追加 50% エタノール (ステップ 2.6) から再構成されたサンプルを希釈し、3.2 の手順に戻って、サンプルを再テスト12
    4. 蓋付きプレートをカバーします。その特急 ERα14 (ONPG) 40 分または 3 h (CPRG) 30 ° C で酵母を含んでいる版を孵化させなさい。その特急 ERβ14 (ONPG) 70 分または 4 h (CPRG) 30 ° C で酵母を含んでいる版を孵化させなさい。
      注: CPRG の操作、インキュベーション時間が柔軟性があります。2 4 時間インキュベート アッセイ感度増加長い孵化と両方の受容体を持つ適切な結果が得られます。
    5. プレートをインキュベート後マルチ チャンネル ピペットまたは繰り返し pipettor を各ウェルに 100 μ L の炭酸ナトリウムを追加するのに使用します。炭酸ナトリウムは pH を発生させ、β-ガラクトシダーゼの反応を停止します。
    6. 測定し、OD405 (ONPG) のまたは OD574 (CPRG) 用プレート分光光度計を使用してすべての井戸の記録。

    6。LacZ の値を計算します。

    注: LacZ 値各サンプルの色変化の度合いを定量化していくつかの変数の別の試金の間で値を比較する正規化された方法を提供 (例えば酵母の光学密度、メディア光学密度、およびインキュベーション時間の場合これは同じプレート上の井戸の中で異なる)12

    1. メディア (ガラクトース) 制御井戸 (H10-12) の帳票の外径610値の平均を計算し、帳票の OD405または車両 (50% エタノール) コントロール (H1-3) の OD574値の手段を計算します。プレートの時間でのこれらの手段と培養時間 (t) をすべて標準の LacZ の値 (各ウェルで色変化の度合いに対応) を計算する (ステップ 5.5) の色を変更する使用し、サンプルは、次の数式を使用して井戸します。
      Equation 1
      Equation 2
      1. また、付録 1の標準およびサンプルの LacZ の値を計算するのに自動アプリケーションを使用します。
        注: アプリケーションに使用されるプレート レイアウトは図 1で示したプレート レイアウトと同じ必要があります。いくつかのサンプルの井戸を使用しない場合は、付録 1 LacZ のアプリケーションに貼り付けられない吸光度データセット内のプレース ホルダーとして空の井戸から吸光度の測定値を保持します。 これはアプリケーションでプレートの空間のレイアウトが保持され、メディア コントロール井戸が必要な場所にあることを保証します。 さらに、空のセルがある場合、アプリケーションは実行されません。
    2. 各 E2 標準の各サンプル帳票の LacZ の値の平均を計算します。LacZ の平均値を μ L-1と報告 h-1。標準的なそれぞれの E2 濃度を対数変換し template.csv ファイル (付録 2) のように書式設定されたスプレッドシート ドキュメントを生成します。

    7. 4 パラメータ ・ ロジスティック回帰を使用してサンプル エストラジ オール等価 (EEQs) の補間

    注: EEQs は LacZ のサンプル値 (色変更) E2 で作成した標準曲線の LacZ の値に関連しています。EEQs はこのように、どのくらいのサンプルは E2 の濃度を既知として同じ色の変更の応答を引き出すために必要な決定します。

    1. テスト サンプルの EEQs を計算するには、最初標準の曲線をプロットします。E2 標準 (y 軸) と、対応するログ変換 E2 濃度 (x 軸) 4 パラメータ ・ ロジスティック回帰モデルにフィットの平均 LacZ の値。
    2. モデルを使用して、テスト サンプル LacZ 値に EEQs を補間します。付録 2に記載されている統計解析ソフトウェアを使用して EEQs のロジスティック回帰計算を実施します。

    8. PCP サンプル質量 EEQs (ng/mL) の標準化

    1. EEQs を PCP サンプルに追加量に関連する各 4.5 の手順でよく容量サンプル井戸 (325 μ L) にメッキを EEQ (ng/mL) を掛けます、追加抽出したサンプルの量で割ります (5 μ L) も。
      注: これらの値は、抽出されたサンプルの mL あたり EEQ を表します。サンプルは、PCP の 1 g を使用して準備された、これらの値は PCP (ng/g) の 1 グラムあたり EEQ も表します。この方法で表される EEQ 値 (ng/g) を比較できる PCPs。 EEQ (ng/g) の異なる値間で今回テストしたパーソナルケア製品、テーブル 2に示すように、プロトコル全体の中で収集されたサンプル データをに含まれています。付録 3

    Representative Results

    15 PCPs の帳票サンプルの estrogenicities は、この [はい] プロトコルを用いて評価しました。ミラーによって書きとめられるように(2010), ERβ を表現する酵母アッセイは、桁 ERα (図 2)14を表現する酵母アッセイより敏感より多くだった。したがって、エストロゲン様活性はより頻繁に ERβ を発現酵母 (表 2) で検出されました。8 PCPs 展示 ERβ のエストロゲン活性と 5 PCPs が ERα とエストロゲン活性を示した。白髪染めクリーム、日焼け止め、ローション、リップ クリームのサンプルが両方の受容体とエストロゲン財団、シェービング クリーム、マニキュアあったテストの濃度で ERβ とエストロゲンのみ。他の 7 つの PCPs (4 シャンプー、2 の石鹸、1 リップ クリーム) は、テストされた濃度でどちらの受容体とエストロゲンでした。

    受容体の感度の違いに加えて各サンプルの EEQs は (表 2) 試金で使用される比色定量の基板 (ONPG または CPRG) によって異なった。すべて 1 つのサンプルが、ONPG を用いて EEQs 高かった CPRG を使用して決定します。また、抽出複製間の変動は EEQs ERβ と CPRG 測定のため最低、ERα と ONPG (表 2) EEQs の最高決定します。

    比色基板を比較する、他 1 目的本研究はインキュベーション研究室の学部コースのスケジュールと互換性のある期間をテストするのにはだった。典型的なのはいアッセイは、17 時間培養後に LacZ バッファー 40 分-4 時間のためにインキュベーション教育研究室毎週のセッションを単一によって制約を実装することはできませんスケジュールが必要です。教育のこの試金の使用を容易にするには、アッセイは 17 時間培養後 6 d 冷凍期間 (ステップ 5.1.2) を導入することで変更されました。冷凍板から標準曲線が非冷蔵のプレートからのそれらに匹敵する (図 2 & 3) すべてのパラメーター 4 パラメータ ・ ロジスティック回帰モデルを用いて推定の標準誤差であったことを除いて、nonrefrigerated プレート (表 3) のより冷凍プレートのために小さい。したがって、6 d のプレートを冷凍エラーが減少、EEQ 見積もりの精度を向上させます。

    Figure 1
    図 1。マイクロウェル プレート レイアウトと標準的な希釈曲線はい試金のための準備。E2 標準 (光灰色の井戸)、サンプルし、負の抽出コントロール (白井) と車 (H1 - 3) とガラクトース メディア (H10 - 12) コントロール (暗い灰色ウェルズ) はすべて 3 通テストしました。E2 標準曲線 (光灰色の井戸) は、A3 と井戸 B1 G3 からに酵母の 120 μ L 井戸 A1 に酵母の 320 μ L をめっきによって建設されました。E2 の 5 μ L (2,275億エクスプレス ERα 酵母の nM; 9.75 エクスプレス ERβ 酵母の nM) A3 から A1 井戸に酵母に追加されました。酵母 + E2 懸濁液は表 1に示した最終の E2 濃度を降伏、その下に各ウェルから 205 μ L を転送することによって希釈した直列。シリアル希釈プロセスの最後に、205 μ L 必要があります各ウェルで 120 μ L の最終巻を達成するために G3 まで G1 の井戸から破棄されること、注意してください。サンプルと負抽出制御井戸は、酵母の 320 μ L を各エキス (50% エタノールに溶解) の 5 μ L を追加することにより作製しました。車両制御井戸 (H1 - 3) 酵母の 320 μ L に 50% エタノールの 5 μ L を追加することによって準備されました。ピペッティングにより混合されたすべてのサンプルとコントロールの井戸と 205 μ L 除去し、120 μ にもボリュームを調整する破棄されます。最後に、メディア コントロールは、H10 - 12 の井戸にガラクトース メディアの 120 μ L をメッキすることによって作製しました。 付録 1 付録 2E2 で説明した R ベース アプリケーションの LacZ の計算機を使用するには、標準曲線と車両とガラクトースのメディア コントロール必要がありますようにがめっきします。 めっきの順序を注意している限り、サンプルおよび否定的な抽出コントロールを白い井戸のいずれかでめっきすることが。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

    Figure 2
    図 2。4 パラメータ ・ ロジスティック回帰を介して生成されたはいプレートの標準曲線にします。2 枚の基板 (ONPG & CPRG) 酵母 2 ヒトエストロゲン受容体 (ERα または ERβ) 両方なし (A) の 1 つを使用してテストされ、17 β-エストラジ オールおよびサンプルの 17 h 孵化後 6 d 冷凍 (B) 期間を抽出します。すべての E2 の基準とメディアと車両コントロールが 3 通でテストされました。ポイントは、LacZ 値が β-ガラクトシダーゼによる色変化の度合いを反映して、帳票の LacZ 値の手段を表します。ロジスティック回帰モデルのパラメーターは表 3のとおりです。ONPG =オルト- ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド;CPRG クロロフェノール赤-β-D-ガラクトピラノシドを =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

    Figure 3
    図 3。開発はいプレートの例。2 枚の基板 (ONPG & CPRG) (ERα または ERβ)、人間のエストロゲンの受容器を表現する酵母を使用してテストされました (左) なしいずれかまたは 17 β-エストラジ オールまたはサンプルの 17 h 孵化後 (右) 6 日間冷蔵期間で抽出します。すべての E2 の基準、メディア、車両トリプリケートでコントロールがテストされました。プレートは、各プレートと図 1によると各板の最下行のコントロール (50% エタノール + 酵母を右上左とガラクトースのメディア) の最上位の行の E2 濃度と整理されました。ONPG =オルト- ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド;CPRG クロロフェノール赤-β-D-ガラクトピラノシドを =。この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。

    標準的な数 [E2] ERα 酵母 (午後) [E2] ERβ 酵母 (午後)
    1 3500 150
    2 2208 94.6
    3 1393 59.7
    4 878 37.6
    5 554 23.7
    6 349 15
    7 220 9.45

    表 1。最終濃度の E2 の規格を使用、はい。
    無水エタノールに溶解し、2,275億ストック濃度に希釈し、粉体の E2 (酵母 ERα を表す) の nM と 9.75 nM (ERβ を表す酵母) の 50% エタノールで。株式を働いているされたガラクトース メディアで酵母を含むマイクロ プレートのウェルに添加し、表に示す濃度に希釈して直列。

    テストのサンプル アッセイ条件 PCPs のエストロゲンの同等 (EEQs)
    PCP # サンプルの種類 受容体 基板 EEQ 1 (ng/g) EEQ 2 (ng/g) EEQ 3 (ng/g) EEQ (ng/g) の意味します。
    1 白髪染めクリーム ERΑ ONPG ND 0.379 ND < 0.379
    1 白髪染めクリーム ERΑ CPRG ND ND ND ND
    1 白髪染めクリーム ERΒ ONPG 0.528 0.338 0.363 0.410
    1 白髪染めクリーム ERΒ CPRG ND 0.215 ND < 0.215
    4 日焼け止め ERΑ ONPG 6.803 1.390 ND < 4.097
    4 日焼け止め ERΑ CPRG ND ND ND ND
    4 日焼け止め ERΒ ONPG 1.321 0.838 0.818 0.992
    4 日焼け止め ERΒ CPRG 0.651 0.591 0.725 0.656
    7 財団 ERΑ ONPG ND ND ND ND
    7 財団 ERΑ CPRG ND ND ND ND
    7 財団 ERΒ ONPG ND 0.158 ND < 0.158
    7 財団 ERΒ CPRG ND ND ND ND
    9 剃るクリーム ERΑ ONPG ND ND ND ND
    9 剃るクリーム ERΑ CPRG ND ND ND ND
    9 剃るクリーム ERΒ ONPG ND 0.256 0.295 < 0.276
    9 剃るクリーム ERΒ CPRG 0.507 0.392 0.560 0.486
    10 爪のポーランド語 ERΑ ONPG ND ND ND ND
    10 爪のポーランド語 ERΑ CPRG ND ND ND ND
    10 爪のポーランド語 ERΒ ONPG 0.916 0.503 0.554 0.658
    10 爪のポーランド語 ERΒ CPRG 0.532 0.628 0.594 0.585
    11 ローション ERΑ ONPG ND ND 2.327 < 2.327
    11 ローション ERΑ CPRG ND ND ND ND
    11 ローション ERΒ ONPG 範囲を超えています。 2.599 1.845 > 2.222
    11 ローション ERΒ CPRG -- 1.986 1.236 1.611
    13 日焼け止め ERΑ ONPG 14.069 11.494 10.189 11.917
    13 日焼け止め ERΑ CPRG 4.773 5.790 5.850 5.471
    13 日焼け止め ERΒ ONPG 範囲を超えています。 258.0万 範囲を超えています。 > 258.0万
    13 日焼け止め ERΒ CPRG 0.292 0.240 ND < 0.266
    15 リップ クリーム ERΑ ONPG ND ND 0.431 < 0.431
    15 リップ クリーム ERΑ CPRG ND ND ND ND
    15 リップ クリーム ERΒ ONPG 12.02 1.060 0.887 1.050
    15 リップ クリーム ERΒ CPRG 0.820 0.871 0.851 0.847

    表 2。非ゼロの EEQs と PCPs の EEQs。15 PCPs と 3 つの抽出コントロールの 3 つの因数が無水エタノールで均質化された、蒸発、はいアッセイを用いた 3 通をそれぞれ行った 48 サンプルの合計は 50% エタノールで再構成します。8 PCPs 7 PCPs がテストされた濃度のエストロゲンが見つかりませんでした、少なくとも 1 の非ゼロ EEQ があった。EEQ 1、EEQ 2 と EEQ 3 各 PCP の 3 つの因数を参照して、それぞれを別の板に 3 通テストします。EEQ 1、EEQ 2 EEQ 3 の値は、各因数のトリプリケートの手段です。試金で使用される酵母には、人間のエストロゲンの受容器 (ERα または ERβ) の 2 アイソ フォームの 1 が表されます。ONPG および CPRG の 2 枚の比色基板が非冷蔵のプロトコルを使用してテストされました。EEQs の E2 の 7 濃度の LacZ 観 (と R2値 ≥ 0.98) 4 パラメーター ロジスティック回帰を用いていた。ND = アッセイの検出限界値以下。― ― 失われた複製を =。

    アッセイ条件 モデルのパラメーター
    受容体 基板 6 d のための 4 ° C で逮捕 モデル R2 成長率 (LacZ ユニット/ng/ml) 変曲点 (ng/mL) 漸近線 (LacZ 単位) を下げる 上部の漸近線 (LacZ 単位)
    ERΑ ONPG 違います > 0.99 8.548 ±1.633 -0.512 ± 0.025 -1.623 ±4.408 128.11 ±6.31
    ERΑ ONPG うん > 0.99 7.618 ±0.758 -0.587 ±0.014 -8.378 ±2.223 99.53 ±2.528
    ERΑ CPRG 違います > 0.99 8.256 ±2.182 -0.610 ±0.033 0.853 ±3.333 62.52 ±3.473
    ERΑ CPRG うん > 0.99 5.068 ±0.616 -0.523 ±0.022 -3.147 ±1.946 68.06 ±3.069
    ERΒ ONPG 違います > 0.99 1.041 ±2.004 -0.898 ±4.410 -32.98 ±86.62 248.6 ±778.9
    ERΒ ONPG うん > 0.99 4.327 ±1.289 -1.736 ±0.087 4.654 ±3.087 66.37 ±10.75
    ERΒ CPRG 違います = 0.99 5.673 ±1.764 -1.914 ±0.052 3.925 ±1.679 28.05 ±2.334
    ERΒ CPRG うん > 0.99 4.412 ±1.142 -1.894 ±0.051 2.052 ±1.303 22.64 ±2.047

    表 3。モデル ・ パラメーターの標準曲線の 4 パラメーター ロジスティック回帰の図 2.ONPG および CPRG、2 枚の基板は、両方と 17 時間培養後 6 日間冷蔵期間 2 の人間のエストロゲンの受容器 (ERα または ERβ) の 1 を表現する酵母を使用してテストされました。パラメーターは、±standard エラーとして報告されます。

    付録 1。LacZ の値を計算するためのアプリケーション。 アプリケーションを使用するには、最初 (材料表に記載) として無料の Java ソフトウェアをダウンロードします。LacZ アプリケーションを開きます。板レイアウトをアプリケーションで使用する必要があります、図 1に示したプレート レイアウトと同じであります。いくつかのサンプルの井戸を使用しない場合は、LacZ のアプリケーションに貼り付けられない吸光度データセット内のプレース ホルダーとして空の井戸から吸光度の測定値を保持します。 これはアプリケーションでプレートの空間のレイアウトが保持され、メディア コントロール井戸が必要な場所にあることを保証します。 さらに、空のセルがある場合、アプリケーションは実行されません。(ONPG) の OD405測定値、または「ctrl + v」のキーボード コマンドを使用してすべての井戸の (CPRG) の OD574朗読で貼り付けまたは「コマンド + v、」使用しているコンピューターのプラットフォームに応じて。時間の色を生成する試金のための培養時間の金額を入力 (ステップ 5.4; から 40 分間たとえば、0.66667 h)。次へをクリックします。ステップ 5.3 から外径610朗読に貼り付けます。[送信] をクリックします。LacZ 結果が表示され、「ctrl + c」を押すか、「コマンド + c,」によって使用されているコンピューターのプラットフォーム上でコピーすることができます。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください

    付録 2。EEQs の計算の統計ソフトウェア オプション。EEQs は、3 つの表示オプションのいずれかを使用して計算できます。 1 を使用してについて説明します。JMP のソフトウェアまたは 2。付録 2 は、R のコードを提供しています。 R コードは、3 に変換されています。https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/ で利用可能なアプリケーション形式。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください

    付録 3。サンプル データ収集酵母そのエクスプレス ERα と CPRG 基板として使用しています。測定610を OD し、単一の代表的な PCP サンプルが含まれ、計算の LacZ 値とともに各 7 E2 の規格・車両メディア コントロールの574を OD します。LacZ の基準値は手順 7 a で説明したように標準曲線の 4 パラメータ ・ ロジスティック回帰モデルを構築に使用された & 上記 B。モデルは、ng/mL のマイクロ プレートのウェルでの代表的なサンプルの EEQs の帳票見積もりの補間に使用されました。これらの値が EEQs ng/g サンプル (ステップ 8.1) の表現に変換されます。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください

    Discussion

    はい、水、食品、植物組織、パーソナルケア製品などの環境試料中エストロゲンのリガンドを検出するために使用する低コストの方法です。データ比較 2 のエストロゲンの受容器 (ERα と ERβ)、2 基板 (ONPG および CPRG)、(冷凍せず 2 d プロトコル) と 7 日間プロトコル 2 のタイムラインで紹介冷凍はいアッセイを介してパーソナルケア製品でエストロゲンを測定するため。7 d CPRG および ERα および/または ERβ を最も表現する酵母を使用して冷蔵プロトコルを定量化 EEQs も時間の制約と互換性があるが一度だけ会う学部実験室のコースによって課される間/週いくつかの時間。実際には、冷凍せず 2 d 分析と比較して、7 日間冷蔵アッセイと関連付けられた差異を低減プレート複製間で。さらに、標準曲線の直線部分は、冷蔵の試金を使用して収集されたデータに少し増築。標準曲線の直線部分はアッセイの検出範囲を定義、サンプル EEQs を補間するために使用できる標準的なカーブの部分だけです。

    すべてがテストされたサンプルの 1 つで EEQs CPRG を使用して測定された ONPG を定量化したものよりも低かった。高い吸光係数と低 Kmと V最大CPRG は ONPG17よりも 10 倍以上敏感。したがって、CPRG は低濃度で使用することができます、β-ガラクトシダーゼの低い量を検出する使用ことができます。これらの理由から、CPRG は ONPG18,19より一般的に優先されます。ただし、大きい基板感度は低い EEQ 値検出 CPRG を説明しません。その他著者2,18によって書きとめられるように、アッセイのマトリックス干渉のため ONPG で検出された高い EEQ 値可能性があります。パーソナルケア製品の抽出物からの黄色い色素は、ONPG で検出 EEQ 値をふくらませることができました。この問題を回避他の人にがの実験的なデザイン2, 実験で皿の数を 2 倍にするアプローチで顔料を含みます。マトリックス干渉は問題が発生する可能性があります、それはより高価な ONPG より長い培養時間を必要とするが、CPRG ははい試金のための望ましい基板をあります。さらに、β-ガラクトシダーゼによって基板の胸の谷間による色変化は CPRG、やすく結果を視覚化する学生のためのより劇的です。

    ミラー(2010), 誰がこのプロトコルで使われる酵母を設計、その酵母 ERβ 30 x を ERα、私たちのデータ14によって実証されて見つけることを表現する酵母より 17 β-エストラジ オールに敏感だったと指摘しました。プラスミド構築、ミラーの潜在的なニュアンスとは別(2010 年) はこの感度14の違いを説明できなかった。1 つ 2 つのプラスミドの構造の違いは、ERβ 式はグルコースやガラクトースのいずれかで調整されるに対し、ERα 式がガラクトース、によって調節されていることです。はい試金で使用される酵母はグルコース メディアで培養、彼らは、アッセイの開始時に希釈されたときのみガラクトースを与えられました。したがって、酵母 ERβ を表現するがそれによってエストロゲンのリガンド感受性を授与、アッセイの開始前に受容体タンパク質の高いコピー数を蓄積しました。

    ERα 発現酵母の低感度は、ERα ERβ と比較して測定試料中エストロゲンの非検出率を説明するかもしれない。可能性を高めるため、このサンプル EEQs、検出ユーザー可能性があります別の抽出溶剤とメソッドを採用してまたは酵母にサンプルの高いボリュームを追加します。高いサンプル ボリュームを使用すると、標準およびサンプルの同じボリュームことができますアッセイに使用するように E2 の基準の濃度が調整必要があります。追加のより多くのサンプルの 1 つの制限は、酵母が培養温度 3035 ° C の20で良い耐性を持つ 6-10% エタノールだけを容認することです。酵母のエタノールの効果を制御するため捜査は帳票「酵母のみ」井戸をプレート レイアウトに追加してこれらの「酵母のみ」井戸の外径610がすぐに車両制御井戸の外径610に匹敵することを確認ください。LacZ バッファーの追加。また、エタノールに溶解した試料は、乾燥マイクロウェル プレートと酵母を追加する前に沸騰エタノールに追加できます。また、ジメチルスルホキシド (DMSO) を使用すると、はいサンプル溶剤が試金が、酵母と DMSO の最終作業の濃度は 112に限定されるべき。

    はいアッセイは、環境試料中エストロゲンを検出するための強力なスクリーニング ツールです。具体的には、[はい] は、遺伝子式14を直接にエストロゲン応答の要素と相互作用する核のエストロゲン受容体に結合するリガンドを検出します。しかし、はい、重要な制限事項があります。はい膜エストロゲン受容体などの非原子力機構や活性剤蛋白質 1 (AP-1) 転写因子などの追加要素を含むメカニズムを通じて働く EEs を検出しません。また、酵母は、哺乳類のセルとして同じ代謝能力を持っていない、ためはいはエストロゲンに代謝活性化を必要とするリガンドを検出できません。

    さらに、はいアッセイは、複雑な試料中エストロゲン配位子間容易に区別できません。代わりに、エストロゲン、抗エストロゲンの配位子の合計効果であるエストロゲンを測定します。ER 拮抗薬の濃度を定量化する混合物の阻害活性の評価するには、標準のアゴニスト (17 β-エストラジ オール) とテスト サンプル濃度12各種酵母を培養してアッセイを変更できます。このプロセスはどう拮抗薬のサンプルでは、アゴニストによるレポーターの活動を減らすことができます、サンプルの ER 拮抗薬の存在を識別するため有用なスクリーンを提供しています。

    ここで提示されたプロトコルは、いくつかのサンプルの抽出およびサンプル準備の手順に変更が必要なものの、サンプル各種を収容できます。たとえば、一部のパーソナルケア製品の EEQs の間では様々 をレプリケートします。可変サンプル油滴を含むがちか完全に均一なより脂溶性溶媒ジエチル エーテルなどが参考になることを示すなかったそれ以外の場合。また、オイルとパーソナルケア製品のワックスは、50% エタノール 100% エタノールの代わりにサンプルを抽出することにより除外できます。50% エタノール抽出はまたより多くの水溶性エストロゲン リガンド (例えば、いくつかの顔料) をキャプチャします。しかし、50% エタノール 100% エタノールよりもゆっくりと蒸発、抽出時間を延ばすことができます。さらに、(石鹸) などのいくつかのサンプルが減らされた細胞密度測定 (外径610) の結果、酵母細胞傷害性。フォックスこのようなサンプルが希釈し、再テストするセル密度の違いは車両制御井戸12と比較して 30% を超える場合、(2008 年) をお勧めします。

    はい試金分析研究目的のため使用する場合は、先手を打って 4.5 の手順で酵母に追加する抽出物の適切なボリュームを決定するサンプル プールの稀釈曲線をテストできます。また、抽出が同時に複数ボリューム (例えば、5 μ L と 4.5 の手順で酵母に追加 20 μ L 抽出) でテストことができますまたは桁 (例えば、0.2 μ L、2 μ L、20 μ L) をまたがる希薄。エキスの「適切な」のボリュームは、標準曲線の線形部分に沿って LacZ 値を照合することによってエストロゲンを識別するものです。最適化は、酵母、細胞毒性、偽陰性は、標準曲線を超えるエストロゲンなどにあまりまたはほんのわずかのサンプルを追加することによって引き起こされる問題を防ぐことができます。前述のようは、酵母がプレート間で一貫性のあるボリュームとエタノールやその他の車両の濃度にさらされているような配位子の量が異なるを使用する場合サンプルおよび E2 標準のボリュームを調整する必要があります。

    偽陰性の可能性、にもかかわらずはいアッセイで識別されている層 3 テスト ツールとして内分泌かく乱物質の Schug(2013) 内分泌かく乱作用 (TiPED)21のための包括的な階層型プロトコルを開発しました。アッセイは、学部教育は、内分泌かく乱、細胞培養、受容体結合、酵素活性、遺伝子工学、統計、および実験の設計に関連する概念を教えるための貴重です。アッセイを使用する学生はまた連続希釈基準など基本的かつ広範に適用される研究室スキルを練習します。抽出サンプルです。ソリューション;構築し、標準曲線の補間計算濃度;ソリューション;生殖不能の技術を実証培養細胞;変数とコントロールを識別します。収集、整理、およびデータの分析構築して、グラフの解釈micropipettors、分光光度計など一般的な実験装置を使用して。

    Disclosures

    著者が明らかに何もありません。

    Acknowledgments

    このプロジェクト立ち上げルイジアナ工科大学、ファーマン大学からそれぞれ TME と AMR に資金によって資金を供給されました。AMR と南から TME に特典旅行とルイジアナ州評議委員会、全米科学財団から TME にルイジアナ州 EPSCoR Pfund グラントの関連付けられている大学から TME 2015 学部発展助成金によって提供された追加資金、南の大学。「私たちに手を与えること"を統計的分析とクリストファー ・ ムーア氏支援のため博士デビッド Eubanks (ファー) を撮影中に感謝いたしますと。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    Vortex Mixer (for single or multiple tubes) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 02-215-365 Any mixer will suffice.
    Bucket centrifuge Fisher Scientific (www.fishersci.com) 75-063-839 Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.
    Bunsen burner Fisher Scientific (www.fishersci.com) 17-012-823 Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.
    Incubator Fisher Scientific (www.fishersci.com) 50125590H Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C.
    Microplate reader BioTek (www.biotek.com) EPOCH2 A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.
    Gen5 microplate reader and imager software BioTek (www.biotek.com) GEN5 Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.
    Refrigerator Fisher Scientific (www.fishersci.com) 05LREEFSA Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C.
    Pipettor or PipetAid compatible with 1 - 10 mL serological pipets Fisher Scientific (www.fishersci.com) 13-681-15E Any pipettors will suffice if they are compatible with 1 & 10 mL serological pipets.
    P10 micropipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F144562G Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl.
    P200 micropipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F144565G Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl.
    P300 multichannel pipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) FBE1200300 Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 - 205 µl.
    Repeating pipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F164001G Must be able to deliver 100 - 320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.
    Name Company Catalog Number Comments
    Supplies
    Sterile 15 mL conical tubes with caps Fisher Scientific (www.fishersci.com) 05-539-801
    Glass scintillation vials Fisher Scientific (www.fishersci.com) 03-337-4
    Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (nonsterile) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 12565501
    Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid  Cole-Parmer (www.coleparmer.com) EW-01728-81
    100 mL glass beakers Fisher Scientific (www.fishersci.com) 02-539H Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.
    250 mL glass Erlenmeyer flasks Fisher Scientific (www.fishersci.com) FB500250 Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.
    Sterile, adhesive, porous film  VWR (www.vwr.com) 60941-086
    Metal forceps Fisher Scientific (www.fishersci.com) 12-000-157 Any metal forceps will suffice.
    Reagent reservoir Fisher Scientific (www.fishersci.com) 07-200-127
    Filtration units (0.2 µm) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 09-761-52
    Squirt bottle (for ethanol) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 02-897-10 Any laboratory squirt bottles will suffice.
    Autoclavable storage bottles Fisher Scientific (www.fishersci.com) 06-414-1D Any autoclavable glass storage bottles will suffice.
    10 mL glass serological pipets (sterile) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 13-678-27F Any glass serological pipets will suffice.
    1 mL glass serological pipets (sterile) Fisher Scientific (www.fishersci.com) 13-678-27C Any glass serological pipets will suffice.
    P10 micropipettor tips USA Scientific (www.usascientific.com) 1120-3810 Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
    P200 micropipettor tips USA Scientific (www.usascientific.com) 1120-8810 Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
    P300 micropipettor tips USA Scientific (www.usascientific.com) 1120-9810 Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
    Syringe tips for repeating pipettor Fisher Scientific (www.fishersci.com) F164150G Only required if a repeating pipettor is used.
    Sterile petri dishes Fisher Scientific (www.fishersci.com) FB0875712 Any sterile petri dishes will suffice.
    Parafilm Fisher Scientific (www.fishersci.com) S37440
    Name Company Catalog Number Comments
    Yeast 
    Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g., W303a) American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) MYA-151 Recombinant yeast are also available upon request from the authors.
    Receptor/reporter plasmid for ERα Addgene (www.addgene.org) pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061) 
    Receptor/reporter plasmid for ERβ Addgene (www.addgene.org) pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062) 
    Name Company Catalog Number Comments
    Chemicals
    Difco agar BD (www.bd.com) 214530
    Dithiothreitol Sigma (www.sigmaaldrich.com) D0632 CAUTION:  Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.  Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.
    Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside Sigma (www.sigmaaldrich.com) N1127
    Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside Sigma (www.sigmaaldrich.com) 10884308001
    Yeast nitrogen base Sigma (www.sigmaaldrich.com) Y0626
    Glucose Sigma (www.sigmaaldrich.com) G8270
    Galactose Sigma (www.sigmaaldrich.com) G5388
    Adenine sulfate Sigma (www.sigmaaldrich.com) A9126
    Uracil Sigma (www.sigmaaldrich.com) U0750
    Leucine Sigma (www.sigmaaldrich.com) L8000
    Histidine Sigma (www.sigmaaldrich.com) H8000
    17 β-Estradiol  Sigma (www.sigmaaldrich.com)                     MP Biomedicals  E8875-250 mg     0219456401 - 1 mg CAUTION:  Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.  It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.  Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.  Estradiol is very toxic to aquatic life.  Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.  Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.
    100% ethanol Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) 111000200
    Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma (www.sigmaaldrich.com) S9638
    Sodium phosphate dibasic (anhydrous) Sigma (www.sigmaaldrich.com) S0876
    Magnesium chloride Sigma (www.sigmaaldrich.com) M8266
    Potassium chloride Sigma (www.sigmaaldrich.com) P9333
    Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt) Sigma (www.sigmaaldrich.com) L5125
    Sodium carbonate Sigma (www.sigmaaldrich.com) S7795
    Name Company Catalog Number Comments
    Software
    Excel spreadsheet software Microsoft  Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.
    Java software (required for Appendix 1 application)  Oracle Corporation To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.  LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards.
    JMP statistical software version 13.0.0 SAS Institute Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.  The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.
    R statistical computing and graphics software R Foundation Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.  Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.

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    References

    1. Agradi, E., Vegeto, E., Sozzi, A., Fico, G., Regondi, S., Tome, F. Traditional healthy Mediterranean diet: estrogenic activity of plants used as food and flavoring agents. Phytother Res. 20, (8), 670-675 (2006).
    2. Morgan, H. E., Dillaway, D., Edwards, T. M. Estrogenicity of soybeans (Glycine max) varies by plant organ and developmental stage. Endocr Disruptors. 2, (1), (2014).
    3. Myers, S. L., Yang, C. Z., Bittner, G. D., Witt, K. L., Tice, R. R., Baird, D. D. Estrogenic and anti-estrogenic activity of off-the-shelf hair and skin care products. J Exp. Sci Environ Epidemiol. 25, (3), 271-277 (2015).
    4. Wagner, M., Oehlmann, J. Endocrine disruptors in bottled mineral water: estrogenic activity in the E-Screen. J Steroid Biochem Mol Biol. 127, (1-2), 128-135 (2011).
    5. Arnold, S. F., Robinson, M. K., Notides, A. C., Guillette, L. J. Jr, McLachlan, J. A. A yeast estrogen screen for examining the relative exposure of cells to natural and xenoestrogens. Environ Health Perspect. 104, (5), 544-548 (1996).
    6. Odum, J., et al. The rodent uterotrophic assay: critical protocol features, studies with nonyl phenols, and comparison with a yeast estrogenicity assay. Regul Toxicol Pharmacol. 25, (2), 176-188 (1997).
    7. Mellanen, P., et al. Wood-derived estrogens: studies in vitro with breast cancer cell lines and in vivo in trout. Toxicol Appl Pharmacol. 136, (2), 381-388 (1996).
    8. Bergman, A., Heindel, J. J., Jobling, S., Kidd, K. A., Zoeller, R. T. State of the science of endocrine disrupting chemicals – 2012. Inter-Organisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC). Available from: http://www.who.int/ceh/publications/endocrine/en/ (2013).
    9. Balsiger, H. A., de la Torre, R., Lee, W. Y., Cox, M. B. A four-hour yeast bioassay for the direct measure of estrogenic activity in wastewater without sample extraction, concentration, or sterilization. Sci Total Environ. 408, (6), 1422-1429 (2010).
    10. Coldham, N. G., Dave, M., Sivapathasundaram, S., McDonnell, D. P., Connor, C., Sauer, M. J. Evaluation of a recombinant yeast cell estrogen screening assay. Environ Health Perspect. 105, (7), 734-742 (1997).
    11. De Boever, P., Demaré, W., Vanderperren, E., Cooreman, K., Bossier, P., Verstraete, W. Optimization of a yeast estrogen screen and its applicability to study the release of estrogenic isoflavones from a soygerm powder. Environ Health Perspect. 109, (7), 691-697 (2001).
    12. Fox, J. E., Burow, M. E., McLachlan, J. A., Miller, C. A. 3d Detecting ligands and dissecting nuclear receptor-signaling pathways using recombinant strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nat Protoc. 3, (3), 637-645 (2008).
    13. Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ Toxicol Chem. 15, (3), 241-248 (1996).
    14. Miller, C. A. 3d, Tan, X., Wilson, M., Bhattacharyya, S., Ludwig, S. Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays. Plasmid. 63, (2), 73-78 (2010).
    15. Delfosse, V., Grimaldi, M., Cavaillès, V., Balaguer, P., Bourguet, W. Structural and functional profiling of environmental ligands for estrogen receptors. Environ Health Perspect. 122, (12), 1306-1313 (2014).
    16. Environmental Working Group. Skin Deep Cosmetics Database. Available from: http://www.ewg.org/skindeep (2016).
    17. Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. H. A sensitive method for the detection of beta-galactosidase in transfected mammalian cells. Biotechniques. 11, (6), (1991).
    18. Buller, C., Zang, X. P., Howard, E. W., Pento, J. T. Measurement of beta-galactosidase tissue levels in a tumor cell xenograft model. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 25, (9), 713-716 (2003).
    19. Pelisek, J., Armeanu, S., Nikol, S. Evaluation of beta-galactosidase activity in tissue in the presence of blood. J Vasc Res. 37, (6), 585-593 (2000).
    20. Gray, W. D. Studies on the alcohol tolerance of yeasts. J Bacteriol. 42, (5), 561-574 (1941).
    21. Schug, T. T., et al. Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals. Green Chem. 15, (1), 181-198 (2013).
    学部の教育研究所の酵母エストロゲンの画面に最適化されたを使用して個人的な心配プロダクトのエストロゲンのリガンドを検出
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    Edwards, T. M., Morgan, H. E., Balasca, C., Chalasani, N. K., Yam, L., Roark, A. M. Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory. J. Vis. Exp. (131), e55754, doi:10.3791/55754 (2018).More

    Edwards, T. M., Morgan, H. E., Balasca, C., Chalasani, N. K., Yam, L., Roark, A. M. Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory. J. Vis. Exp. (131), e55754, doi:10.3791/55754 (2018).

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