Summary
מאמר זה מציג על המסך אסטרוגן שמרים ממוטבת עבור לכימות ליגנדים במוצרי טיפוח אישי (PCPs) אשר כובלים אסטרוגן קולטני אלפא (ERα) ו/או בטא (ERβ). השיטה משלבת שתי אפשרויות מצע ערכי צבע מוחלטים, של שישה ימים דגירה בקירור לשימוש בקורסים לתואר ראשון, כלים סטטיסטיים לניתוח נתונים.
Abstract
מסך אסטרוגן שמרים (כן) משמש כדי לזהות ליגנדים אסטרוגניים בדגימות איכות הסביבה, הוחל בהרחבה במחקרים של ההפרעה האנדוקרינית. ליגנדים אסטרוגניים כוללים הן טבעיות או מעשה ידי אדם "הסביבה אסטרוגנים" (אייתה) נמצאו מוצרי צריכה רבים כולל מוצרי טיפוח אישי (PCPs), פלסטיק, חומרי הדברה של מזונות. העבודה עם EEs לשבש את הורמון איתות על בני אדם וחיות אחרות, פוטנציאל להפחתת הפריון, הגדלת הסיכון למחלות. למרות החשיבות של EEs ושל אחרים האנדוקרינית שיבוש כימיקלים משבשי לבריאות הציבור, ההפרעה האנדוקרינית לא בדרך כלל כלול בלימודים לתואר ראשון. זה חסרון חלקית עקב חוסר פעילות המעבדה הרלוונטיות שממחישים את העקרונות מעורב גם בעת היותו נגיש לסטודנטים לתואר ראשון. מאמר זה מציג של אופטימיזציה כן אורגנים ליגנדים במוצרי טיפוח אישי לאגד אסטרוגן קולטני אלפא (ERα) ו/או בטא (ERβ). השיטה משלבת לאחד שני מצעים ערכי צבע מוחלטים (אורתופדיה- nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) או chlorophenol אדום-β-D-galactopyranoside (CPRG)) כי הם ביקע מאת β-galactosidase, דגירה בקירור 6 ימים צעד להקל על השימוש קורסים לתואר ראשון מעבדה, יישום אוטומטי עבור חישובים LacZ וקוד R לניתוח רגרסיה לוגיסטית 4-פרמטר המשויך. הפרוטוקול תוכנן כדי לאפשר לתלמידים לפתח, לערוך ניסויים שבהם הם מסך המוצרים המעניינים אותם עבור מחקה אסטרוגן. בתהליך, הם לומדים על ההפרעה האנדוקרינית, תרבית תאים, איגוד קולטן, פעילות אנזים, הנדסה גנטית, סטטיסטיקה, תכנון ניסויים. במקביל, הם גם לתרגל מיומנויות היסוד וישימים בקנה מידה נרחב מעבדה, כגון: חישוב ריכוז; ביצוע פתרונות; הוכחת סטרילי טכניקה; באופן סדרתי דילול תקנים; בניית וביצוע אינטרפולציה עקומות רגיל; זיהוי משתנים ופקדים; איסוף, ארגון, ניתוח נתונים; בניית ופרשנות גרפים; בעזרת ציוד מעבדה נפוצות כגון micropipettors ומכשירים. לכן, יישום זה וזמינותו מעודדת סטודנטים לעסוק למידה חקרנית בעת סיור המתעוררים בנושאי מדעי הסביבה ובריאות.
Introduction
מסך אסטרוגן שמרים (כן) נעשה שימוש נרחב לכמת ליגנדים המחקים אסטרדיול (E2 או 17β-אסטרדיול) במגוון של מטריצות, כולל מים, רקמות הצמח, מוצרי צריכה של מזונות1,2,3, 4. באופן קולקטיבי, כזה ליגנדים מכונים "אסטרוגנים סביבתיים (אייתה)." הכן פותח במקור נמוך עלות, במבחנה חלופית ויוו בדיקות כמו מכרסמים uterotrophic assay5,6 , פורל הקשת האכלה assay7. מטרת המבחנים היא כדי לקבוע אם מוצר מכיל כימיקלים לעורר או לחסום מנגנונים תלויי-אסטרוגן. זיהוי של EEs הוא קריטי, כי הם יכולים להפריע נורמלי אסטרוגן אנדוגני איתות, במיוחד במהלך התפתחות העובר. הפרעה זו פוגעת בריאות על ידי הגדלת הסיכון של השמנת יתר, בעיות פוריות, סרטן, ירידה קוגניטיבית8.
למרות החשיבות של EEs ושל אחרים והריון לבריאות הציבור, ההפרעה האנדוקרינית אינו נפוץ כולל לימודים לתואר ראשון. מחסור זה עקב מחסור של פעילויות שממחישים את העקרונות מעורב גם בעת היותו נגיש לסטודנטים לתואר ראשון. בנוסף, מספר וריאציות של פרוטוקול כן קיים9,10,11,12,13, ואת המגוון עושה אופטימיזציה assay גוזלת זמן רב רכזי מעבדה לא מאומנים במיוחד טכניקות הרלוונטיים. בסופו של דבר, כן מבחני בד כ יושלמו יום ארוך יותר מ- 1 או 2 ימים רצופים עם הדגירה O/N. תזמון זה אינה תואמת התבנית של קורסים לתואר ראשון מעבדה, אשר בדרך כלל נפגשים פעם / בשבוע עבור h מספר.
בתגובה צרכים אלה, כתב יד זה מדווח פרוטוקול ממוטבת 96-ובכן כן הכולל שיטות החילוץ ethanolic מוצרי טיפוח אישי (PCPs)3 וצעד 6 ימים קירור לארח פגישות מעבדה שבועיות. אתנול המוחלט הוא הממס האורגני רב-תכליתי זה יכול להמיס מגוון רחב של מומסים בגבול קוטב ו פולרי. יתר על כן, היא מתאימה קורסים לתואר ראשון כי זה זמינות, יחסית רעילים, במחירים סבירים, ולא miscible עם מים; זה גם מתאדים בקלות ללא ציוד מיוחד. אולם, אתנול אינו אידיאלי עבור חילוץ חריפה הידרופובי משבשים האנדוקרינית או שמנים ושעוות רבים, השניים האחרונים להיות מרכיבים נפוצים החילוץ המסכן יעילות PCPs. מגביר את הסיכון של ממצאים שליליים שווא. עם אילוץ זה בראש, החוקרים צריכים לבחור מיצוי הליכים (למשל, ethanolic מיצוי או מיצוי מעבדתי) את מאפייני המדגם מען ולפגוש מטרות המחקר (מחקר לעומת הוראה לתואר ראשון).
הכן מסתמך על רקומביננטי האפייה נוצר במקור על ידי ד ר צ'רלס מילר באוניברסיטת טולאן. נא עיין מילר. et al. (2010) עבור מפה מלאה של פלסמיד מהונדס14. שמרים טרנספורמציה עם פלסמידים אלה צורונים ERα גרעיני אנושי אקספרס או ERβ (נקרא גם ESR1 ו- ESR2, בהתאמה) כאשר גדל בתקשורת המכיל גלקטוז (עבור ERα) או גלוקוז או גלקטוז (עבור ERβ). אם אסטרוגניים כימיקלים קיימים בתקשורת, הם לוחצים הקולטנים, יצירת מתחמי ליגנד קולטן להפעיל β-galactosidase (lacZ) ביטוי ברמה פרופורציונלי לריכוז כימיקלים אסטרוגניים. תאי שמרים הם ואז lysed לשחרר את β-galactosidase שהצטברו. המאגר פירוק מכיל גם ONPG או CPRG, אשר נמצאים ביקע מאת β-galactosidase להניב מוצרים צהוב או אדום, בהתאמה. ניתן לכמת מוצרים ערכי צבע מוחלטים על ידי מדידת ספיגת באמצעות ספקטרופוטומטרים צלחת של microwell. מידת שינוי הצבע הוא יחסי לריכוז ליגנדים אסטרוגניים שאליו נחשף השמרים.
הבחירה של סובסטרט (CPRG או ONPG) תלוי על הפוטנציאל של רקע ספיגת הנובעים הדגימות הנבדקת. לדוגמה, תמציות צמחים לעיתים קרובות יוסיף גוון צהוב לכלי התקשורת כי באופן מלאכותי מנפח אמצעי estrogenicity אם ONPG (לכמת ב 405 ננומטר) משמש את המצע β-galactosidase. עם ותמציות, CPRG (לכמת-574 ננומטר) עשוי להיות מצע ערכי צבע מוחלטים מתאים יותר. CPRG יקר יותר ONPG, אך הוא משמש-עשירית molarity. מאמר זה מציג estrogenicities של פאנציקלידין תמציות לכמת באמצעות ONPG ו- CPRG.
לכימות estrogenicity של דגימות סביבתיים באמצעות ERα ו- ERβ היא גישה מקיפה יותר מאשר שימוש רק באחד רצפטורים אלו. ב בעלי חיים, רצפטורים אלו התערוכה רקמות דיפרנציאלית הפצה פעילויות רגולטוריות, איגוד הזיקות ליגנדים אסטרוגניים, אנטי אסטרוגניים15. לדוגמה, phytoestrogens מבוססת על צמחים בדרך כלל לאגד ERβ יותר חזק2, ואילו כימיקלים סינתטיים יכול להראות העדפה או ERα או ERβ או באפשרותך לאגוד טוב באותה מידה בשני קולטנים15. לכן, מחייב לקולטן אסטרוגן אחת אינה מנבאת בהכרח מחייב אחרת.
למרות אייתה נמצאים מוצרי צריכה רבים (למשלחומרי הדברה, חומרי ניקוי, דבקים, חומרי סיכה, פלסטיק, מזון, תרופות) כמו גם צמחים, הנתונים שהוצגו היו להשיג באמצעות מבחר של PCPs. PCPs הן משכנעות, בקלות זמין ידידותיים, הרלוונטיות. לסביבה עבור סטודנטים לתואר ראשון. ניתן להזמין סטודנטים להביא את PCPs האהוב שלהם מהבית כדי לבדוק במעבדה. גם לערוך חיפוש במסד הנתונים העור עמוק שפותחה על ידי ה-קבוצת העבודה איכות הסביבה16 צור מבוססת על השערה השוואות של PCPs עם גבוה, נמוך רעילות ציונים. בדרך זו, התלמידים יכולים בו זמנית לפתח מיומנויות מעבדה מתקדמת; לעסוק עצמית מכוונת, וסקרנות למידה; ולחקור נושאים המתעוררים מדעי הסביבה ובריאות.
Protocol
1. הכנת נוגדנים
- הכן גלוקוז, גלקטוז מדיה על ידי ערבוב 6.7 גרם שמרים חנקן הבסיס, 20 גרם דקסטרוז או גלקטוז, 20 מ ג אדנין סולפט (נוסף כמו 10 מ"ל של פתרון מניות מימית 200 מ"ג/100 מ"ל), 20 מ ג אורציל (נוסף כמו 10 מ"ל של פתרון מניות מימית 200 מ"ג/100 מ"ל) , לאוצין 60 מ ג (נוסף כמו 6 מ של פתרון מניות מימית 1 g/100 מ"ל), היסטידין 20 מ ג (נוסף כמו 2 מ של פתרון מניות מימית 1 g/100 מ"ל) מים יונים לאמצעי הסופי של Sterilize ל' 1 על-ידי סינון (0.2 µm מסנן). ניתן לאחסן מדיה ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
- להכין אסטרדיול (E2) סטנדרטים על ידי המסת E2 אבקת אתנול נטול מים, דילול ריכוזי עבודה המתאימה (227.5 nM & 9.75 ננומטר) ב- 50% אתנול.
הערה: אם אסטרדיול נרכש כמו בקבוקון של 1 מ ג, להוסיף 1 מ"ל אתנול ישירות אל המבחנה לפזר אבקת אסטרדיול. זה מניב מניה 3.67 מ מ #1... לדלל 10 μL של מניות #1 של אתנול 990 μL לעשות 1 מ"ל μM 36.71 מניות #2. לאחר מכן, לדלל μL 10 מניות #2 באתנול 50% μL 990 לעשות 1 מ"ל של nM 367.13 מניות #3. כדי להפוך את העבודה מניות, לדלל מניות μL 619.7 #3 באתנול 50% μL 380.3 כדי להפוך 1 מ"ל של 227.5 מלאי עבודה של nM, המשמש ליצירת עקומות סטנדרטי עם שמרים לבטא ERα. לדלל מניות μL 26.56 #3 באתנול 50% μL 973.44 כדי להפוך 1 מ"ל של 9.75 מלאי עבודה של nM, המשמש ליצירת עקומות סטנדרטי עם שמרים לבטא ERβ. חותם סטנדרטים עם מצלמות-מיקרוסקופים וחנות ב-20 או-70 מעלות צלזיוס.
התראה: E2 הוא מסרטן חשד, toxicant הרבייה. . זה מזיק אם נשאף, נבלע, או נספג דרך העור. E2 עלולה להזיק עם ההנקה עוברים וילדים. E2 רעיל מאוד חיים מימיים. משתמש הגנה אישית המתאימה (כפפות, fume הוד, מסכת אבק), להימנע מחשיפה במהלך ההריון וההנקה. להיפטר E2 כמו פסולת מסוכנת, אל תשחררי לסביבה. - הכנת מאגר LacZ על ידי ערבוב 8.52 גרם נה2HPO4, g 5.52 NaH2PO4•H2O, מ ג 95.21 MgCl2, 745.5 מ"ג אשלגן כלורי, מלח נתרן 2 g N-lauroylsarcosine, ONPG (400 מ"ג) או CPRG (77.7 מ ג) במים יונים כדי מבחן סופי נפח של 1 ל חנות LacZ מאגר ב- 20 מ ל aliquots ב-20 ° C.
הערה: aliquot 20 מ ל מספיקה לצלחת 96-ובכן אחד. - הכן נתרן פחמתי באמצעות ערבוב 105.9 g סודיום קרבונט במים יונים לאמצעי הסופי של ל' 1, בחנות RT.
- להכין dithiothreitol 1 מ' (DTT) במים. הקפאת 25 aliquots µL של DTT ב-20 ° C.
התראה: DTT הוא עור חריפה ו עין מגרה. השתמש ציוד למיגון אישי המתאים (כפפות, fume הוד, מסכת אבק) כדי להימנע העור, קשר עין, שאיפה, בליעה.
הערה: כל aliquot מספיקה לצלחת 96-ובכן אחד.
2. הכנת מיצוי פקדים ודוגמאות
- בחר דוגמאות כדי לבחון.
הערה: מאמר זה מציג נתונים על PCPs 15, לרבות סבון קרם שיער, שמפו, קרם הגנה, שפתון, קרן, קצף גילוח, לק, קרם. - לשלב 1 g מדגם עם 10 מ"ל אתנול נטול מים צינור חרוטי 15 מ"ל. להכין את פקד החילוץ שלילי בהיקף של 11 מ"ל אתנול צינור חרוטי 15 מ"ל. להכין משכפל כנדרש.
הערה: עבור עיצוב ניסיוני, הציג שלוש aliquots של כל 15 PCPs, פתרונות בקרה החילוץ triplicate היו מוכנים, מניב סכום כולל של 48 דוגמאות, שכל אחד מהם היה מנותח שהפקידים באמצעות הפרוטוקול בסעיף 4. צלחת יחיד יכול להכיל עד 23 דוגמיות ב- triplicates. אתנול נטול מים משמש בשלב זה מכיוון שהוא מתאדה בקלות. השתמש בפקדי החילוץ שלילי כדי לוודא כי האסטרוגן לא שטיפת לתוך דגימות מן הצינורות חרוט. - Homogenize הרכבת התחתית תוכן למשך 30 דקות על-ידי שילוב של טלטול ידני vortexing או ע י ניעור צינורות על vortexer שפופרת מרובה.
- Centrifuge צינורות חרוט מהירות המותר המקסימלי ומפרידה דלי במשך 10 דקות Decant את תגובת שיקוע מהצינור כל דרך מסננת תא 40 µm לתוך צינור חרוטי 50 מ. תוכן ריק כל שפופרת 50 מ לתוך בקבוקון זכוכית נצנוץ.
- בקבוקונים. השאירו פתח בשכונה מאוורר לשבוע אחד לאפשר אתנול מתמוססות לחלוטין. לחלופין, יבש דגימות בשכונה מאוורר תחת חנקן או עם המאדה סובב. כדי למנוע השפלה של המרכיבים רגיש אור, להגן על דגימות ייבוש אור (למשל, בד אטום במקום מאוורר המנוע הדלת).
- לשקם דוגמאות 1.0 מ"ל של 50% אתנול וביו -מערבולת כדי homogenize.
3. culturing, Subculturing שמרים14
- לשמור על תרביות שמרים פעילים (recombinant W303a זן של cerevisiae ס14) על ידי המקננת שמרים בתקשורת גלוקוז מחוטא-מסנן ב 30 º C. תת-תרבות שמרים שבועי בתקשורת גלוקוז מחוטא-מסנן טריים.
- שני לילות (כ ח 42) לפני הכנת לוחיות הרישוי. כן, תת-תרבות שמרים על-ידי הוספת 0.1 מ"ל של תרביות שמרים פעילים 10 מ"ל של גלוקוז מחוטא-מסנן התקשורת בטכניקה סטרילי. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך שני לילות. טלטול אינו נדרש, אם שמרים גדלים כמו תרבויות רדוד סטרילי 250 מ ל Erlenmeyer המבחנות.
הערה: שמרים ניתן גם לאחסן על פלטות אגר בקירור למשך מספר חודשים. לאחסון לטווח ארוך (שנים), שילוב תרבויות O/N עם 15-50% גליצרול סטרילי, מערבולת ההקפאה ב-70 מעלות צלזיוס. כדי להכין גליצרול סטרילי, להשתמש מזרק להעביר גליצרול µL 300 לתוך cryovial החיטוי עם הפקק השתחררו. לאחר מכן להוסיף 1,200 µL O/N שמרים תרבות בטכניקה סטרילי.
4. הכנת לוחות כן (יום 1 וזמינותו)
- גביע סטרילי, בטכניקה סטרילי, לדלל שמרים משלב 3.2 צפיפות אופטית של ±0.005 0.065-610 nm (OD610) בתקשורת מחוטא-מסנן גלקטוז.
- לאשר צפיפות אופטית pipetting 120 μL של כל מדגם שמרים שהפקידים יחד עם גלקטוז triplicate ריקים לתוך צלחת ברור פוליסטירן (צלחת לא צריך להיות סטרילי). השתמש ספקטרופוטומטרים צלחת כדי לוודא שיש התרבות שמרים מדולל OD נטו610 של קריאות OD610 לחסר ±0.005 0.065 גלקטוז החסר שמרים OD610 בהנחה כדי לקבוע OD נטו610 של השמרים. היכונו נפח סופי לפחות 30 מ"ל מדולל שמרים כל צלחת 96-ובכן.
הערה: מסננים ספקטרופוטומטרים מדידת ספיגת בין 595, 610 nm יכול לשמש עבור יחידת מידה זו.
- לאשר צפיפות אופטית pipetting 120 μL של כל מדגם שמרים שהפקידים יחד עם גלקטוז triplicate ריקים לתוך צלחת ברור פוליסטירן (צלחת לא צריך להיות סטרילי). השתמש ספקטרופוטומטרים צלחת כדי לוודא שיש התרבות שמרים מדולל OD נטו610 של קריאות OD610 לחסר ±0.005 0.065 גלקטוז החסר שמרים OD610 בהנחה כדי לקבוע OD נטו610 של השמרים. היכונו נפח סופי לפחות 30 מ"ל מדולל שמרים כל צלחת 96-ובכן.
הערה: לוחות פוליפרופילן סטריליים על ידי שני autoclaving לוחות מוערמים עטופה בנייר כסף. הפלטה משמשת מכסה הצלחת מדגם יכול להיות שטף, בלוקי רי ו לעשות בה שימוש חוזר.
הערה: לאחר השלמת דילול טורי, להתעלם μL 205 מבארות G1 - 3. בסוף שלב זה, כל בארות רגיל צריך להכיל 120 μL. דילול טורי תניב הריכוזים E2 הסופי המפורטים בטבלה1. עבור הצעדים דילול סדרתי, זה עוזר להשתמש pipettor רב-ערוצי עם טיפים סטרילי.
הערה: הרכב שליטה הבארות משמשים לכמת רקע ספיגת המשויך תאי שמרים ומדיה. בנוסף, אפקטים קידום cytotoxicity או גדילה של הבדיקה דוגמאות יכול להתגלות על ידי השוואת הערכים610 OD של מבחן וולס עם אלה של הרכב שליטה בארות.
הערה: רשום אשר דוגמאות או מיצוי שלילי פקדים נוספים כדי מכל קידוח. כדי לעקוב אחר אילו וולס יש דוגמאות אשר לא, להתחיל עם ארגז של טיפים, השתמש בעצות החל מהמיקומים בתיבה המיקומים של הבארות המתאימים בצלחת. לוח 96-ובכן אחד יכול להכיל עד 23 דגימות דולר.
5. עיבוד כן צלחות (יום 2 וזמינותו)
- לאחר הדגירה 17 h ב- 30 מעלות צלזיוס, להסיר את הלוחות של החממה. אם הצלחות יעובדו מיד, להמשיך לצעוד 5.1.1. אם הצלחות יעובדו במועד מאוחר יותר, להמשיך לצעוד 5.1.2.
- השתמש pipettor רב-ערוצי לערבב את התוכן של כל שורה של וולס, ולאחר מכן להעביר 50 µL של שמרים השעיה מכל קידוח כדי המתאימה גם של microplate ברור, פוליסטירן, 96-ובכן.
הערה: לוחות פוליסטירן לא צריך להיות סטרילי אך עם מכסה. השתמש עצות pipet חדשות עבור כל שורה של בארות כדי להימנע מזהם-קרוס וולס, אף אם pipetting על פני triplicates עם פיפטה רב-ערוצי 8-עצה, טיפים רק צריך להשתנות בין קבוצות triplicate.- תווית לצלחת חדשה. המשך לשלב 5.2.
- לאחסון צלחות לפני עיבוד, עוטף אותם בניילון נצמד. להכניס למקרר עטוף צלחות ב 4 ° C 6 ד לאחר מכן, להסיר את הלוחות מהמקרר לפתוח אותם, להעביר את התוכן של כל בארות על-ידי pipetting כמו שלב 5.1.1. המשך לשלב 5.2.
- השתמש pipettor רב-ערוצי לערבב את התוכן של כל שורה של וולס, ולאחר מכן להעביר 50 µL של שמרים השעיה מכל קידוח כדי המתאימה גם של microplate ברור, פוליסטירן, 96-ובכן.
- הוסף 20 µL של 1 מ' DTT 20 מיליליטר המופשרים, מאגר LacZ בטמפרטורת החדר עבור ריכוז סופי של 1 מ מ DTT. מאגר LacZ לערבב היטב. אם באמצעות פיפטה של רב ערוצית, לוותר על לשמורה מגיב.
התראה: ללבוש כפפות ולעבוד עם DTT בשכונה, אם אפשר - משתמש או פיפטה רב-ערוצי או חוזרים pipettor, להוסיף µL 200 LacZ מאגר המכיל DTT, ONPG או CPRG כדי בארות כל צלחת פוליסטירן, ואני מיד למדוד ולהקליט OD610 של בארות כל שימוש ספקטרופוטומטרים צלחת. חזור על נדרש עבור לוחות נוספים.
הערה: הקריאות610 OD משמשים במכנה של LacZ החישוב (שלב 6.1). מסיבה זו, לקבל מיד לאחר pipetting ולפני תאים ליישב המקראות או הן lysed על ידי LacZ מאגר. אם יתר הערכים610 עבור מדגם בארות באופן ניכר גבוהה או נמוכה יותר מאשר יתר הערכים610 עבור הרכב שליטה בארות, תמציות לדוגמה הם הצמיחה וקידום או ציטוטוקסיות כדי שמרים, בהתאמה. LacZ חישוב לתקן על הבדלים קטנים בצפיפויות התא על פני וולס, אבל אם ההבדלים יעלה על 30% בשני הכיוונים, ואז לדלל את הדגימה משוקם (מתוך שלב 2.6) באתנול 50% נוספים ובדוק את הדגימה על-ידי החזרת לשלב 3.2 12. - מכסים צלחות עם מכסה. דגירה לוחות המכילים שמרים את ERα אקספרס14 ב 30 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות (עבור ONPG) או h 3 (עבור CPRG). דגירה לוחות המכילים שמרים את ERβ אקספרס14 ב 30 מעלות צלזיוס במשך 70 דקות (עבור ONPG) או 4 h (עבור CPRG).
הערה: בעת עבודה עם CPRG, דגירה פעמים גמישים; המקננת עבור 2-4 h מניבה תוצאות מתאים עם שני רצפטורים, עם incubations יותר הגדלת הרגישות וזמינותו. - לאחר המקננת צלחות, להשתמש פיפטה רב-ערוצי או pipettor חוזר כדי להוסיף 100 µL של נתרן פחמתי מכל קידוח. נתרן פחמתי מעלה את רמת החומציות, עוצר את התגובה β-galactosidase.
- למדוד ולהקליט את יתר405 (עבור ONPG) או OD574 (עבור CPRG) של בארות כל שימוש ספקטרופוטומטרים צלחת.
6.חישוב ערכים LacZ
הערה: ערכי LacZ לכמת את מידת שינוי הצבע עבור כל דגימה ומציעים שיטה המנורמל של השוואת ערכים בין מבחני נפרד על ידי הנהלת חשבונות עבור מספר משתנים (למשלצפיפות אופטית שמרים, צפיפות אופטית מדיה, דגירה זמן אם הדבר שונה בין בארות באותה צלחת)12.
- לחשב אמצעים OD triplicate610 ערכים עבור מדיה (גלקטוז) שליטה וולס (H10-12), חישוב triplicate OD405 או OD574 ערכים עבור הרכב (50% אתנול) פקדים (H1-3). להשתמש באמצעים אלה, זמן הדגירה (t) בשעות לצלחת לשינוי צבע (שלב 5.5) לחישוב ערכי LacZ (תואם למידת שינוי צבע מכל קידוח) עבור כל תקן, דוגמת בארות באמצעות המשוואות הבאות:
- לחלופין, להשתמש היישום אוטומטית בנספח 1 לחישוב LacZ ערכים עבור תקנים ודוגמאות.
הערה: הפריסה צלחת עם היישום להיות זהים על פריסת צלחת המוצג באיור1. אם לא היו מספר בארות לדוגמה, שומרים על ספיגת קריאות מן הבארות ריק כבעלי המקום ב- dataset ספיגת הדבקה ליישום LacZ נספח 1 . זה שומר על הפריסה המרחבית של הצלחת ביישום ומבטיחה כי בארות בקרת מדיה הם במיקום הנדרש שלהם. בנוסף, היישום לא תופעל אם קיימים תאים ריקים.
- לחלופין, להשתמש היישום אוטומטית בנספח 1 לחישוב LacZ ערכים עבור תקנים ודוגמאות.
- לחשב אמצעי triplicate LacZ ערכים עבור כל רמת E2 וכל דגימה. הדו ח אומר LacZ ערכים כמו µL-1h-1. יומן-שינוי הריכוזים של כל E2 סטנדרטי ולהפיק מסמך גיליון אלקטרוני שעוצב כמו הקובץ template.csv (נספח 2).
7. אינטרפולציה מדגם אסטרדיול מקבילות (EEQs) באמצעות רגרסיה לוגיסטית 4-פרמטר
הערה: EEQs מתייחסים ערכים LacZ לדוגמה (שינוי צבע) הערכים LacZ של העקומה סטנדרטיים שנוצרו באמצעות E2. EEQs אפוא לקבוע כמה דוגמאות נדרש להפיק את ההיענות שינוי צבע באותו ריכוז ידוע של E2.
- לחישוב EEQs עבור הבדיקה דוגמאות, תחילה להתוות העקומה סטנדרטי. מתאים רשע LacZ ערכים עבור תקנים E2 (ציר y) והמקביל טרנספורמציה-יומן E2 הריכוזים (ציר x) מודל רגרסיה לוגיסטית ארבע-פרמטר.
- להשתמש את המודל כדי לבצע אינטרפולציה EEQs עבור ערכים LacZ דגימה לבדיקה. לערוך חישובים רגרסיה לוגיסטית של EEQs באמצעות תוכנה סטטיסטית כפי שמתואר בספר נספח 2.
8. סטנדרטיזציה EEQs (ng/mL) למיסה מדגם פאנציקלידין
- להתייחס EEQs כמות הדגימה פאנציקלידין הוסיף אחד טוב בשלב 4.5, להכפיל הנפח הכולל ציפוי לתוך הבארות מדגם (325 µL) EEQ (ng/mL) ולאחר מכן לחלק על ידי כמות הדגימה שחולצו הוסיף את כל טוב (5 µL).
הערה: ערכים אלה מייצגים EEQ לכל מ של דגימה שחולצו. אם הדגימות היו מוכנים באמצעות 1g של פאנציקלידין, ערכים אלה מייצגים גם EEQ לגרם של פאנציקלידין (ng/g). לידי ביטוי בדרך זו, EEQ ערכים (ng/g) ניתן להשוות על פני ערכים PCPs. EEQ (ng/g) שונים מוצרי טיפוח אישי שנבדקו במחקר זה מוצגות בטבלה מס ' 2, ואת נתוני דגימה שנאספו לאורך כל פרוטוקול כולו הכלולים נספח 3.
Representative Results
Estrogenicities של triplicate דוגמאות 15 PCPs הוערכו באמצעות פרוטוקול זה כן. כאמור על ידי מילר. et al. (2010), מבחני עם שמרים לבטא ERβ היו יותר בסדר גודל רגיש יותר מבחני עם שמרים לבטא ERα (איור 2)14. לפיכך, פעילות אסטרוגניים לעתים קרובות יותר זוהה עם שמרים לבטא ERβ (טבלה 2). PCPs שמונה הציג פעילות אסטרוגניים עם ERβ ו 5 PCPs הציג פעילות אסטרוגניים עם ERα. קרם לחות לשיער, קרם הגנה, קרם, ודוגמאות lip balm היו אסטרוגניים עם שני רצפטורים, ואילו קרן, קצף גילוח, לק היו רק אסטרוגניים עם ERβ בריכוזים שנבדקו. שבע PCPs אחרים (4 שמפו, סבונים 2 ו 1 שפתון) לא היו אסטרוגניים עם קולטן גם בריכוזים שנבדקו.
בנוסף קולטן הבדלי רגישות, EEQs עבור כל דגימה שונה בהתאם המצע ערכי צבע מוחלטים (ONPG או CPRG) בשימוש וזמינותו (טבלה 2). בסך הכל, אבל דוגמא אחת, EEQs באמצעות ONPG היו גבוהות מאלו באמצעות CPRG. יתר על כן, וריאציה בין החילוץ משכפל היה הנמוך ביותר עבור EEQs נמדד עם ERβ ו- CPRG, נחוש הגבוה ביותר עבור EEQs עם ERα ו- ONPG (טבלה 2).
בנוסף השוואת ערכי צבע מוחלטים סובסטרטים, 1 מטרת המחקר הנוכחי היה לבחון הדגירה פעמים משך התואמים לוח הזמנים של קורס מעבדה לתואר ראשון. וזמינותו כן אופייני מצריך שדגירה 17 h כשמיד הדגירה במאגר LacZ במשך 40 דקות - 4h, לוח זמנים זה בלתי אפשרי ליישם במעבדה הוראה מוגבל על ידי יחיד מפגש שבועי. כדי להקל על השימוש הזה assay בהוראה, וזמינותו שונתה על ידי החדרת תקופה קירור 6 d (שלב 5.1.2) לאחר הדגירה 17 h. עקומות סטנדרטי של לוחות קירור היו דומות לאלה של צלחות שאינם בקירור (2 דמויות & 3), חוץ מזה השגיאות תקן של פרמטרים באמצעות רגרסיה לוגיסטית ארבע-פרמטר מודלים היו כל קטן יותר עבור לוחות קירור יותר עבור לוחות nonrefrigerated (טבלה 3). לפיכך, קרור לוחות עבור 6 d מפחית את השגיאה ומשפר את הדיוק של הערכות EEQ.
איור 1. Microwell צלחת הפריסה של דילול סטנדרטי עקומת הכנה וזמינותו כן. E2 סטנדרטים (וולס אפור בהיר), דוגמאות ושלילי החילוץ פקדים (וולס לבן), ואת הרכב (H1 - 3) גלקטוז מדיה (H10 - 12) פקדים (הבארות האפור כהה) נבדקו כל דולר. מעגל סטנדרטי E2 (בארות אפור בהיר) נבנה על ידי ציפוי µL 320 של שמרים לתוך בארות A1 עד A3 ו- 120 µL של שמרים לתוך בארות B1 עד G3. לאחר מכן, 5 µL של E2 (227.5 ננומטר על שמרים לבטא ERα; 9.75 ננומטר על שמרים לבטא ERβ) נוספו השמרים בבארות A1 עד A3. שמרים + E2 הבולם היה מדולל באופן סדרתי על ידי העברת 205 µL מכל קידוח הבאר מתחתיו, מניב הריכוזים E2 הסופי המפורטים בטבלה1. שימו לב, כי בסופו של תהליך דילול טורי, 205 µL חייב להיות מושלך מבארות G1 עד G3 כדי להשיג נפח סופי של 120 µL היטב בכל. לדוגמה, בארות שאיבה שלילי שליטה הוכנו על-ידי הוספת 5 µL של כל תמצית (מומס באתנול 50%) כדי µL 320 של שמרים. הרכב שליטה וולס (H1 - 3) הוכנו על-ידי הוספת 5 µL של 50% אתנול µL 320 של שמרים. כל בארות מדגם ושליטה, מעורבים מאת pipetting, 205 µL הבדלקינו שנמחקו להתאמת אמצעי אחסון טוב עד 120 µL. לבסוף, בקרת מדיה הוכנו על ידי ציפוי µL 120 של גלקטוז מדיה לתוך בארות H10 - 12. להשתמש את המחשבון LacZ ב נספח 1 לבין היישום מבוסס-R שמתואר נספח 2, E2 עקומת תקן רכב, גלקטוז ופקדים מדיה חייב להיות מצופה כפי שמוצג. להיות מצופה דגימות ופקדים החילוץ שליליות מכל הבארות לבן כל עוד הצו של ציפוי הוא ציין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. תקן ' עקומות ' עבור לוחות כן שנוצר באמצעות רגרסיה לוגיסטית פרמטר 4. מצעים שני (ONPG & CPRG) נבדקו באמצעות שמרים לבטא לאחד שני האדם קולטני אסטרוגן (ERα או ERβ) הן ללא (A), עם תקופת (B) קירור 6 d לאחר הדגירה 17 h עם 17β- אסטרדיול מדגם תמציות. E2 סטנדרטים וכל מדיה והרכב נבדקו דולר. נקודות מייצגים אמצעים ערכים LacZ triplicate, בהם ערכי LacZ משקפות את מידת שינוי הצבע שנגזרות β-galactosidase. פרמטרים מודל רגרסיה לוגיסטית מפורטים בטבלה3. ONPG = אורתופדיה- nitrophenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG = chlorophenol אדום-β-D-galactopyranoside. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. דוגמאות צלחות כן מפותחת. מצעים שני (ONPG & CPRG) נבדקו באמצעות שמרים ביטוי קולטני האסטרוגן האנושית (ERα או ERβ), גם בלי (משמאל) או עם (מימין) קירור ששת הימים תקופת לאחר הדגירה 17 h עם 17β-אסטרדיול או לטעום תמציות. כל E2 סטנדרטים, מדיה, הרכב פקדים נבדקו ב- triplicates. הצלחות היו מסודרים עם הריכוז E2 הגבוה ביותר בשורה העליונה של כל צלחת ופקדים (50% אתנול + שמרים באמצעי התקשורת על ימין ועל שמאל גלקטוז מימין) בשורה התחתונה של כל צלחת על פי איור 1. ONPG = אורתופדיה- nitrophenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG = chlorophenol אדום-β-D-galactopyranoside.אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מספרים רגילים | [E2] עבור ERα שמרים (pM) | [E2] עבור ERβ שמרים (pM) |
| 1 | 3500 | 150 |
| 2 | 2208 | 94.6 |
| 3 | 1393 | 59.7 |
| 4 | 878 | 37.6 |
| 5 | 554 | 23.7 |
| 6 | 349 | 15 |
| 7 | 220 | 9.45 |
טבלה 1. סופי ריכוזים של E2 תקנים בשימוש הכן.
אבקת E2 היה מומס באתנול נטול מים, ואז מדולל לעבוד מניות ריכוזי 227.5 nM (עבור שמרים לבטא ERα) ו- 9.75 nM (עבור שמרים לבטא ERβ) ב- 50% אתנול.מניות עבודה מצורף בארות microplate המכילים שמרים בתקשורת גלקטוז, מדולל באופן סדרתי ריכוזי שמוצג בטבלה.
| הדגימות שנבדקו | תנאים assay | מקבילות אסטרוגניים (EEQs) PCPs | |||||
| פאנציקלידין # | סוג המדגם | קולטן | המצע | EEQ 1 (ng/g) | EEQ 2 (ng/g) | EEQ 3 (ng/g) | זאת אומרת EEQ (ng/g) |
| 1 | קרם לחות לשיער | ERΑ | ONPG | ND | 0.379 | ND | < 0.379 |
| 1 | קרם לחות לשיער | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 1 | קרם לחות לשיער | ERΒ | ONPG | 0.528 | 0.338 | 0.363 | 0.410 |
| 1 | קרם לחות לשיער | ERΒ | CPRG | ND | 0.215 | ND | < 0.215 |
| 4 | קרם הגנה | ERΑ | ONPG | 6.803 | 1.390 | ND | < 4.097 |
| 4 | קרם הגנה | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 4 | קרם הגנה | ERΒ | ONPG | 1.321 | 0.838 | 0.818 | 0.992 |
| 4 | קרם הגנה | ERΒ | CPRG | 0.651 | 0.591 | 0.725 | 0.656 |
| 7 | קרן | ERΑ | ONPG | ND | ND | ND | ND |
| 7 | קרן | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 7 | קרן | ERΒ | ONPG | ND | 0.158 | ND | < 0.158 |
| 7 | קרן | ERΒ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 9 | קרם גילוח | ERΑ | ONPG | ND | ND | ND | ND |
| 9 | קרם גילוח | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 9 | קרם גילוח | ERΒ | ONPG | ND | 0.256 | 0.295 | < 0.276 |
| 9 | קרם גילוח | ERΒ | CPRG | 0.507 | 0.392 | 0.560 | 0.486 |
| 10 | לק | ERΑ | ONPG | ND | ND | ND | ND |
| 10 | לק | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 10 | לק | ERΒ | ONPG | 0.916 | 0.503 | 0.554 | 0.658 |
| 10 | לק | ERΒ | CPRG | 0.532 | 0.628 | 0.594 | 0.585 |
| 11 | קרם | ERΑ | ONPG | ND | ND | 2.327 | < 2.327 |
| 11 | קרם | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 11 | קרם | ERΒ | ONPG | חורג טווח | 2.599 | 1.845 | > 2.222 |
| 11 | קרם | ERΒ | CPRG | -- | 1.986 | 1.236 | 1.611 |
| 13 | קרם הגנה | ERΑ | ONPG | 14.069 | 11.494 | 10.189 | 11.917 |
| 13 | קרם הגנה | ERΑ | CPRG | 4.773 | 5.790 | 5.850 | 5.471 |
| 13 | קרם הגנה | ERΒ | ONPG | חורג טווח | 2.580 | חורג טווח | > 2.580 |
| 13 | קרם הגנה | ERΒ | CPRG | 0.292 | 0.240 | ND | < 0.266 |
| 15 | הליפסטיק | ERΑ | ONPG | ND | ND | 0.431 | < 0.431 |
| 15 | הליפסטיק | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 15 | הליפסטיק | ERΒ | ONPG | 1.202 | 1.060 | 0.887 | 1.050 |
| 15 | הליפסטיק | ERΒ | CPRG | 0.820 | 0.871 | 0.851 | 0.847 |
בטבלה 2. EEQs של PCPs עם EEQs שאינו אפס. Aliquots 3 15 PCPs והפקדים חילוץ שלושה היו הומוגני באתנול נטול מים, התאדו, מחדש באתנול 50% עבור סכום כולל של 48 דגימות, שכל אחד מהם היה מנותח שהפקידים באמצעות וזמינותו. כן. PCPs שמונה היו לפחות 1 אפס EEQ, בעוד 7 PCPs לא נמצאו להיות אסטרוגניים בריכוזים שנבדקו. EEQ 1, EEQ 2 ו- EEQ 3 להפנות aliquots 3 של פאנציקלידין כל, כל נבדק שהפקידים בצלחת נפרדת. הערכים עבור EEQ 1, EEQ 2 ו- EEQ 3 הם אמצעי triplicates עבור כל aliquot. שמרים המשמשים וזמינותו הביע 1 מתוך 2 איזופורמים של קולטני האסטרוגן האנושית (ERα או ERβ). שני מצעים ערכי צבע מוחלטים, ONPG, CPRG, נבדקו באמצעות פרוטוקול שאינו בקירור. EEQs היו נחושים באמצעות ארבע-פרמטר regressions לוגיסטיים (עם R2 ערכים ≥ 0.98) של LacZ ערכים בכל אחד 7 ריכוזי E2. ND = מתחת למגבלה זיהוי של וזמינותו.-= אבוד שכפול.
| תנאים assay | מודל פרמטרים | ||||||
| קולטן | המצע | מעצר ב 4 ° C עבור 6 יח | דגם R2 | שיעור הצמיחה (LacZ יחידות/ng/ml) | נקודת פיתול (ng/mL) | אסימפטוטה התחתון (LacZ יחידות) | אסימפטוטה העליון (LacZ יחידות) |
| ERΑ | ONPG | לא | > 0.99 | 8.548 ±1.633 | -0.512 ±0.025 | -1.623 ±4.408 | 128.11 ±6.31 |
| ERΑ | ONPG | כן | > 0.99 | 7.618 ±0.758 | -0.587 ±0.014 | -8.378 ±2.223 | 99.53 ±2.528 |
| ERΑ | CPRG | לא | > 0.99 | 8.256 ±2.182 | -0.610 ±0.033 | 0.853 ±3.333 | 62.52 ±3.473 |
| ERΑ | CPRG | כן | > 0.99 | 5.068 ±0.616 | -0.523 ±0.022 | -3.147 ±1.946 | 68.06 ±3.069 |
| ERΒ | ONPG | לא | > 0.99 | 1.041 ±2.004 | -0.898 ±4.410 | -32.98 ±86.62 | 248.6 ±778.9 |
| ERΒ | ONPG | כן | > 0.99 | 4.327 ±1.289 | -1.736 ±0.087 | 4.654 ±3.087 | 66.37 ±10.75 |
| ERΒ | CPRG | לא | = 0.99 | 5.673 ±1.764 | -1.914 ±0.052 | 3.925 ±1.679 | 28.05 ±2.334 |
| ERΒ | CPRG | כן | > 0.99 | 4.412 ±1.142 | -1.894 ±0.051 | 2.052 ±1.303 | 22.64 ±2.047 |
בטבלה 3. דגם הפרמטרים של Regressions 4-פרמטר לוגיסטית על העיקולים רגיל ב איור 2. מצעים שני, ONPG, CPRG, נבדקו באמצעות שמרים לבטא 1 של קולטני האסטרוגן האנושית 2 (ERα או ERβ) ללא ועם תקופת ששת הימים קירור לאחר הדגירה 17 h. פרמטרים מדווחים כפי הערכות ±standard שגיאות.
נספח 1. היישום עבור חישוב ערכים LacZ. כדי להשתמש ביישום, תחילה להוריד חינם תוכנת Java (שכאמור טבלה שלחומרים). ואז לפתוח את היישום LacZ. הפריסה צלחת עם היישום להיות זהים על פריסת צלחת המוצג באיור1. אם לא היו מספר בארות לדוגמה, שומרים על ספיגת קריאות מן הבארות ריק כבעלי המקום ב- dataset ספיגת הדבקה ליישום LacZ. זה שומר על הפריסה המרחבית של הצלחת ביישום ומבטיחה כי בארות בקרת מדיה הם במיקום הנדרש שלהם. בנוסף, היישום לא תופעל אם קיימים תאים ריקים. הדבק קריאות OD405 (עבור ONPG) או קריאות OD574 (עבור CPRG) של כל הבארות באמצעות הפקודה מקלדת "שליטה (ctrl) + v" או "הפקודה + v," בהתאם פלטפורמת המחשוב בשימוש. הזן את משך זמן הדגירה שעות עבור וזמינותו לייצר צבע (מהצעד 5.4; לדוגמה, 0.66667 h למשך 40 דקות). לחץ על הבא. הדבק קריאות OD610 מ שלב 5.3. לחץ על שלח. תוצאות LacZ יוצגו, ניתן להעתיק על-ידי לחיצה על "שליטה (ctrl) + c" או "הפקודה + c," סומך על פלטפורמת מחשב בשימוש. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
נספח 2. תוכנות סטטיסטיות אפשרויות לחישוב EEQs. ניתן לחשב EEQs באחת משלוש האפשרויות שהוצגו. ההנחיות לשימוש 1. JMP תוכנה או 2. קוד R ניתנים נספח 2. הקוד R גם המומר 3. תבנית היישום זמין במלון https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
נספח 3. דגום נתונים שנאספו באמצעות שמרים את ERα אקספרס, CPRG כמו המצע. מדידות של כמנת610 כמנת574 עבור כל אחד שבע פקדים סטנדרטים, הרכב ומדיה E2 ו כלולים במדגם פאנציקלידין יחיד מייצג, יחד עם ערכים LacZ מחושבים. LacZ ערכים של סטנדרטים שימשו לבניית מודל רגרסיה לוגיסטית ארבע-פרמטר של העקומה רגיל כפי שמתואר 7 שלבים א' & ב' לעיל. הדגם שימש כדי לבצע אינטרפולציה הערכות triplicate של EEQs של המדגם מייצג ב ng/mL ב הבארות microplate. ערכים אלה היו ואז להמיר EEQs המבוטא ng/g מדגם (שלב 8.1). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Discussion
הכן היא שיטה זולה המשמשים לזיהוי ליגנדים אסטרוגניים בדגימות סביבתיים, כגון מים, מזון, רקמות הצמח או מוצרי טיפוח אישי. הנתונים המובאים כאן להשוות בין 2 קולטני אסטרוגן (ERα ו- ERβ), מצעים 2 (ONPG ו- CPRG) ו- 2 צירי זמן (פרוטוקול 2 d ללא קירור) ופרוטוקול שבעה ימים עם קירור למדידת estrogenicity במוצרי טיפוח אישי באמצעות וזמינותו. כן. 7 d, פרוטוקול קירור באמצעות CPRG ושמרים לבטא ERα ו/או ERβ הטוב ביותר מכמתת EEQs בזמן גם להיות תואם אילוצי זמן המוטלים על-ידי קורסים לתואר ראשון מעבדה להיפגש רק פעם אחת / בשבוע עבור h מספר. למעשה, בהשוואה וזמינותו 2 d ללא קירור, וזמינותו בקירור שבעה ימים היה קשור סטיה מופחת על פני צלחת משכפל. בנוסף, החלק הליניארי של העקומה סטנדרטי הורחב מעט על הנתונים שנאספו באמצעות וזמינותו בקירור. החלק הליניארי של העקומה סטנדרטי מגדיר את טווח גילוי assay, החלק היחיד של העקומה תקן זה יכול לשמש כדי לבצע אינטרפולציה מדגם EEQs.
בסך הכל חוץ מאחד הדגימות שנבדקו, EEQs נמדד באמצעות CPRG היו נמוכות יותר מאשר לכמתו ONPG. עם מקדם הכחדה גבוהה יותר ו- K נמוךמ' , Vmax, CPRG רגיש פי 10 יותר מאשר ONPG17. לפיכך, CPRG יכול לשמש בריכוזים נמוכים, יכול לשמש כדי לזהות כמויות נמוכות של β-galactosidase. מסיבות אלו, CPRG היא עדיפה בדרך כלל על פני18,ONPG19. עם זאת, רגישות המצע אינו מסביר ערכי EEQ נמוכים יותר מזוהה עם CPRG. הערכים EEQ גבוה יותר מזוהה עם ONPG יכול להיות בגלל הפרעה מטריקס וזמינותו, כאמור על ידי סופרים אחרים,2,18. פיגמנטים צהובים של תמציות מוצר טיפוח אישי יכול לנפח הערכים EEQ מזוהה עם ONPG. לאחרים יש מצויין בעיה זו כולל פקדי פיגמנט שלהם עיצוב ניסיוני2, גישה אשר מכפיל את מספר צלחות בניסוי. כאשר הפרעה מטריקס, עשוי להיות בעייתי, CPRG עשוי להיות מצע עדיפה על כן וזמינותו, למרות זה יקר יותר ודורש זמן דגירה פעמים מאשר ONPG. יתר על כן, שינוי הצבע שנגזרות את המחשוף של מצע מאת β-galactosidase הוא דרמטי יותר עם CPRG, ובכך להקל על הסטודנטים לדמיין תוצאות.
מילר. et al. (2010), מי מהונדסים השמרים בשימוש פרוטוקול זה, ציין כי שמרים לבטא ERβ היו 30 x יותר רגישים 17β-אסטרדיול יותר שמרים לבטא ERα, ממצא, לקורבן שלנו נתונים14. מלבד ניואנסים פוטנציאליים בבנייה פלסמיד, מילר. et al. (2010) לא יכולתי להסביר את ההבדל הזה רגישות14. הבדל אחד בין המבנה פלסמיד שני היא כי הביטוי ERα מוסדר על ידי גלקטוז, בעוד ERβ ביטוי מוסדר על ידי גלוקוז או גלקטוז. שמרים המשמשים וזמינותו כן תרבותי בתקשורת גלוקוז, ניתן רק גלקטוז, כאשר הם נמצאים מדולל בתחילת וזמינותו. לכן, שמרים לבטא ERβ עלול לצבור מספרים גבוהים יותר עותק של קולטן חלבונים לפני תחילת וזמינותו, ובכך היוועצות רגישות גבוהה יותר ליגנדים אסטרוגניים.
הרגישות הנמוכה של שמרים לבטא ERα עשוי להסביר את שיעור גבוה יותר של אי-גילוי של estrogenicity בדגימות נמדד עם ERα לעומת ERβ. כדי להגדיל את הסבירות הדגימה EEQs יזוהו, משתמשים יכול להעסיק ממיסים חילוץ שונים ושיטות או להוסיף אמצעי אחסון גבוה יותר מדגם השמרים. אם אמצעי אחסון מדגם גבוה משמשים, הריכוזים של E2 סטנדרטים צריך להיות מותאם כזה ניתן להשתמש באותו אמצעי אחסון של סטנדרטים ודוגמאות וזמינותו. מגבלה אחת של הוספת מדגם יותר היא כי שמרים יכולים לסבול רק 6-10% אתנול, עם עמידות טובה יותר בטמפרטורת דגירה של 30 לעומת 35 ° C20. כדי לשלוט על ההשפעות של אתנול על שמרים, חוקרים צריך להוסיף בארות "שמרים בלבד" triplicate הפריסה צלחת, לאשר יתר610 הבארות הללו "שמרים בלבד" הוא להשוות יתר610 של הרכב שליטה בארות מיד לאחר התוספת של LacZ מאגר. לחלופין, ניתן להוסיף דוגמאות מומס באתנול microwell יבשה לוחות ואתנול התאדו לפני הוספת שמרים. Dimethylsulfoxide (דימתיל סולפוקסיד) משמשת גם מבחני הממס לדוגמה בכן, אבל הריכוז העבודה הסופית של דימתיל סולפוקסיד עם שמרים צריך להיות מוגבל ל- 1%12.
וזמינותו כן הוא כלי סינון רב עוצמה לגילוי estrogenicity בדגימות איכות הסביבה. באופן ספציפי, הכן מזהה ליגנדים שקושרים קולטני אסטרוגן גרעיני המקיימים אינטראקציה עם אסטרוגן אלמנטים תגובה ישירה ביטוי גנים14. עם זאת, הכן יש גם מגבלות חשובות. הכן אינו מזהה אייתה שעובדים דרך מנגנוני לא גרעיני כגון קולטני אסטרוגן ממברנה או מנגנוני שכוללות רכיבים נוספים כגון גורמי שעתוק Activator חלבון 1 (AP-1). יתר על כן, מכיוון שמרים אין היכולת המטבולית אותו כמו בתרבית של תאים, הכן אינו יכול לזהות ליגנדים הדורשים הפעלה מטבולית להיות אסטרוגניים.
בנוסף, וזמינותו כן לא יכולים להבדיל בקלות בין ליגנדים אסטרוגניים, אנטי אסטרוגניים בדגימות מורכבים. במקום זאת, זה מודד estrogenicity נטו , אשר השפעת סכום ליגנדים אסטרוגניים, אנטי אסטרוגניים. כדי לכמת את הריכוז של היריבים מיון או להעריך את פעילות המעכבת של תערובות, וזמינותו יכול להיות שונה על-ידי המקננת שמרים עם אגוניסט סטנדרטי (17β-אסטרדיול) וגם מגוון רחב של מבחן לדוגמה ריכוזים12. תהליך זה קובע אם היריבים הדגימות יכולים להפחית פעילות כתב אגוניסט-induced ומספק מסך שימושי עבור זיהוי הנוכחות של ER היריבים בדגימות.
פרוטוקול המובאת כאן יכול להכיל מגוון סוגי דגימה, למרות כמה דגימות עשויים לדרוש שינויים לשלבי הכנה החילוץ ולדגום. לדוגמה, EEQs מגוונות בין משכפל של כמה מוצרי טיפוח אישי. הדגימות משתנה יותר נטו מכילים טיפות שמן או אחרת לא היו לגמרי הומוגנית, המציין כי הממס יותר lipophilic כגון דיאתיל אתר יהיה מועיל. לחלופין, שמנים ושעווה במוצרי טיפוח אישי יכול להיות מהכלל על-ידי חילוץ דגימות עם 50% אתנול במקום 100% אתנול.הפקת אתנול 50% גם ללכוד יותר מסיסים במים אסטרוגניים ליגנדים (למשל, פיגמנטים מסוימים). עם זאת, 50% אתנול מתאדה לאט יותר מאשר 100% אתנול, ולכן רשאי להאריך זמן החילוץ. בנוסף, כמה דגימות (כגון סבונים) היו ציטוטוקסיות כדי שמרים, וכתוצאה מכך מדידות צפיפות מופחתת תא (OD610). פוקס ואח (2008) מציע כי כזה צריך להיות מדולל ודוגמאות מחדש תא צפיפות ההבדלים יעלה על 30% לעומת הרכב שליטה בארות12.
אם וזמינותו כן משמש למטרות מחקר אנליטי, דילול עקומות דוגמת בריכות יכול להיבדק כאמצעי מנע לקבוע אמצעי אחסון המתאים של תמצית להוסיף שמרים בשלב 4.5. לחלופין, ניתן לבחון תמציות בו זמנית את בעוצמות מרובות (לדוגמה, 5 µL, תמצית 20 µL הוסיף שמרים בשלב 4.5) או דילולים המתפרסים על סדרי גודל (למשל0.2 µL, 2 µL, 20 µL). "המתאים" אמצעי אחסון של תמצית הם אלה לזהות estrogenicity על ידי התאמת ערכי LacZ לאורך החלק הליניארי של העקומה סטנדרטי. אופטימיזציה מונע בעיות הנגרמות על-ידי הוספת יותר מדי או מעט מדי מדגם השמרים, כגון cytotoxicity, שווא שליליות או estrogenicity שחורג העקומה סטנדרטי. כפי שהוזכר לעיל, צריך להיות מותאם הכרכים של דוגמאות ותקנים E2 כאשר כמויות שונות של ליגנד משמשים כך שמרים נחשפים ריכוז של אתנול או רכב אחר ונפח עקבית על-פני הלוח.
למרות הפוטנציאל התשלילים שווא, וזמינותו כן זוהה כלי בדיקה Tier 3 עבור משבשים האנדוקרינית מאת הסחוג. et al. (2013), אשר פיתחו פרוטוקול שכבתית מקיף ההפרעה האנדוקרינית (TiPED)21. תואר ראשון בתחום החינוך, וזמינותו יקר להוראת מושגים הקשורים ההפרעה האנדוקרינית תרבית תאים, איגוד קולטן, פעילות אנזים, הנדסה גנטית, סטטיסטיקה, תכנון ניסויים. תלמידים המשתמשים וזמינותו גם לתרגל מיומנויות היסוד וישימים בקנה מידה נרחב מעבדה כגון באופן סדרתי דילול תקנים; חילוץ דגימות; ביצוע פתרונות; בניית וביצוע אינטרפולציה עקומות רגיל; חישוב ריכוז; ביצוע פתרונות; הוכחת סטרילי טכניקה; תאים culturing; זיהוי משתנים ופקדים; איסוף, ארגון, ניתוח נתונים; בניית ופרשנות גרפים; בעזרת ציוד מעבדה נפוצות כגון micropipettors ומכשירים.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
הפרויקט מומן על ידי סטארט-אפ מימון טיים, עמר מאוניברסיטת טק לואיזיאנה ו אוניברסיטת פורמן, בהתאמה. מימון נוסף סופק על ידי מענק לקידום סגל 2015 עמר, טיים של המכללות הקשורים של הדרום, מענק לואיזיאנה EPSCoR Pfund טיים של הקרן הלאומית למדע והנאמנים לואיזיאנה, פרס נסיעות כדי טיים מ האוניברסיטה של הדרום. אנו מודים ד ר דוד יובנקס (פורמן) לקבלת סיוע עם ניתוחים סטטיסטיים, מר כריסטופר מור על "". נותנים לנו יד-במהלך הצילומים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Vortex Mixer (for single or multiple tubes) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-215-365 | Any mixer will suffice. |
| Bucket centrifuge | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 75-063-839 | Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm. |
| Bunsen burner | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 17-012-823 | Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead. |
| Incubator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 50125590H | Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C. |
| Microplate reader | BioTek (www.biotek.com) | EPOCH2 | A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm. |
| Gen5 microplate reader and imager software | BioTek (www.biotek.com) | GEN5 | Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader. |
| Refrigerator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05LREEFSA | Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C. |
| Pipettor or PipetAid compatible with 1 - 10 mL serological pipets | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-681-15E | Any pipettors will suffice if they are compatible with 1 & 10 mL serological pipets. |
| P10 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144562G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl. |
| P200 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144565G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl. |
| P300 multichannel pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FBE1200300 | Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 - 205 µl. |
| Repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164001G | Must be able to deliver 100 - 320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Sterile 15 mL conical tubes with caps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05-539-801 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 03-337-4 | |
| Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (nonsterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12565501 | |
| Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid | Cole-Parmer (www.coleparmer.com) | EW-01728-81 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-539H | Any glass beakers will suffice if they are autoclavable. |
| 250 mL glass Erlenmeyer flasks | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB500250 | Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable. |
| Sterile, adhesive, porous film | VWR (www.vwr.com) | 60941-086 | |
| Metal forceps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12-000-157 | Any metal forceps will suffice. |
| Reagent reservoir | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 07-200-127 | |
| Filtration units (0.2 µm) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 09-761-52 | |
| Squirt bottle (for ethanol) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-897-10 | Any laboratory squirt bottles will suffice. |
| Autoclavable storage bottles | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 06-414-1D | Any autoclavable glass storage bottles will suffice. |
| 10 mL glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27F | Any glass serological pipets will suffice. |
| 1 mL glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27C | Any glass serological pipets will suffice. |
| P10 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-3810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
| P200 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-8810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
| P300 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-9810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
| Syringe tips for repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164150G | Only required if a repeating pipettor is used. |
| Sterile petri dishes | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB0875712 | Any sterile petri dishes will suffice. |
| Parafilm | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | S37440 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast | |||
| Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g., W303a) | American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) | MYA-151 | Recombinant yeast are also available upon request from the authors. |
| Receptor/reporter plasmid for ERα | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061) | |
| Receptor/reporter plasmid for ERβ | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Difco agar | BD (www.bd.com) | 214530 | |
| Dithiothreitol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | D0632 | CAUTION: Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant. Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion. |
| Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | N1127 | |
| Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 10884308001 | |
| Yeast nitrogen base | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | Y0626 | |
| Glucose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G8270 | |
| Galactose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G5388 | |
| Adenine sulfate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | A9126 | |
| Uracil | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | U0750 | |
| Leucine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L8000 | |
| Histidine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | H8000 | |
| 17 β-Estradiol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) MP Biomedicals | E8875-250 mg 0219456401 - 1 mg | CAUTION: Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant. It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin. Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses. Estradiol is very toxic to aquatic life. Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation. Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment. |
| 100% ethanol | Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) | 111000200 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S0876 | |
| Magnesium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | M8266 | |
| Potassium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | P9333 | |
| Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L5125 | |
| Sodium carbonate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S7795 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis. | |
| Java software (required for Appendix 1 application) | Oracle Corporation | To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1. LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards. | |
| JMP statistical software version 13.0.0 | SAS Institute | Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve. The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve. | |
| R statistical computing and graphics software | R Foundation | Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/. Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2. |
References
- Agradi, E., Vegeto, E., Sozzi, A., Fico, G., Regondi, S., Tome, F. Traditional healthy Mediterranean diet: estrogenic activity of plants used as food and flavoring agents. Phytother Res. 20 (8), 670-675 (2006).
- Morgan, H. E., Dillaway, D., Edwards, T. M. Estrogenicity of soybeans (Glycine max) varies by plant organ and developmental stage. Endocr Disruptors. 2 (1), (2014).
- Myers, S. L., Yang, C. Z., Bittner, G. D., Witt, K. L., Tice, R. R., Baird, D. D. Estrogenic and anti-estrogenic activity of off-the-shelf hair and skin care products. J Exp. Sci Environ Epidemiol. 25 (3), 271-277 (2015).
- Wagner, M., Oehlmann, J. Endocrine disruptors in bottled mineral water: estrogenic activity in the E-Screen. J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (1-2), 128-135 (2011).
- Arnold, S. F., Robinson, M. K., Notides, A. C., Guillette, L. J. Jr, McLachlan, J. A. A yeast estrogen screen for examining the relative exposure of cells to natural and xenoestrogens. Environ Health Perspect. 104 (5), 544-548 (1996).
- Odum, J., et al. The rodent uterotrophic assay: critical protocol features, studies with nonyl phenols, and comparison with a yeast estrogenicity assay. Regul Toxicol Pharmacol. 25 (2), 176-188 (1997).
- Mellanen, P., et al. Wood-derived estrogens: studies in vitro with breast cancer cell lines and in vivo in trout. Toxicol Appl Pharmacol. 136 (2), 381-388 (1996).
- Bergman, A., Heindel, J. J., Jobling, S., Kidd, K. A., Zoeller, R. T. State of the science of endocrine disrupting chemicals – 2012. Inter-Organisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC). , Available from: http://www.who.int/ceh/publications/endocrine/en/ (2013).
- Balsiger, H. A., de la Torre, R., Lee, W. Y., Cox, M. B. A four-hour yeast bioassay for the direct measure of estrogenic activity in wastewater without sample extraction, concentration, or sterilization. Sci Total Environ. 408 (6), 1422-1429 (2010).
- Coldham, N. G., Dave, M., Sivapathasundaram, S., McDonnell, D. P., Connor, C., Sauer, M. J. Evaluation of a recombinant yeast cell estrogen screening assay. Environ Health Perspect. 105 (7), 734-742 (1997).
- De Boever, P., Demaré, W., Vanderperren, E., Cooreman, K., Bossier, P., Verstraete, W. Optimization of a yeast estrogen screen and its applicability to study the release of estrogenic isoflavones from a soygerm powder. Environ Health Perspect. 109 (7), 691-697 (2001).
- Fox, J. E., Burow, M. E., McLachlan, J. A., Miller, C. A. 3d Detecting ligands and dissecting nuclear receptor-signaling pathways using recombinant strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nat Protoc. 3 (3), 637-645 (2008).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ Toxicol Chem. 15 (3), 241-248 (1996).
- Miller, C. A. 3d, Tan, X., Wilson, M., Bhattacharyya, S., Ludwig, S. Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays. Plasmid. 63 (2), 73-78 (2010).
- Delfosse, V., Grimaldi, M., Cavaillès, V., Balaguer, P., Bourguet, W. Structural and functional profiling of environmental ligands for estrogen receptors. Environ Health Perspect. 122 (12), 1306-1313 (2014).
- Environmental Working Group. Skin Deep Cosmetics Database. , Available from: http://www.ewg.org/skindeep (2016).
- Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. H. A sensitive method for the detection of beta-galactosidase in transfected mammalian cells. Biotechniques. 11 (6), (1991).
- Buller, C., Zang, X. P., Howard, E. W., Pento, J. T. Measurement of beta-galactosidase tissue levels in a tumor cell xenograft model. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 25 (9), 713-716 (2003).
- Pelisek, J., Armeanu, S., Nikol, S. Evaluation of beta-galactosidase activity in tissue in the presence of blood. J Vasc Res. 37 (6), 585-593 (2000).
- Gray, W. D. Studies on the alcohol tolerance of yeasts. J Bacteriol. 42 (5), 561-574 (1941).
- Schug, T. T., et al. Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals. Green Chem. 15 (1), 181-198 (2013).
