Rilevamento di ligandi estrogenici nei prodotti di cura personale utilizzando un lievito estrogeno schermo ottimizzato per il laboratorio di insegnamento universitari

Summary

Questo articolo presenta una schermata di estrogeno ottimizzato lievito per quantificare ligandi in prodotti di cura personale (PCPs) che legano l'alfa recettori dell'estrogeno (ERα) e/o beta (ERβ). Il metodo incorpora due opzioni di substrato colorimetrico, una sei giorni incubazione refrigerata per uso nei corsi di laurea e gli strumenti statistici per l'analisi dei dati.

Abstract

Il lievito dell'estrogeno Screen (Sì) viene utilizzato per rilevare estrogenici ligandi in campioni ambientali ed è stato ampiamente applicato negli studi dell'endocrino. Ligandi estrogenici comprendono sia naturali che artificiali "estrogeni ambientali" (EEs) trovato in molti beni di consumo, tra cui Personal Care Products (PCPs), plastica, pesticidi e alimenti. EEs perturbare ormone segnalazione negli esseri umani e altri animali, potenzialmente riducendo fertilità e aumentando il rischio di malattia. Nonostante l'importanza della SEO e altri Endocrine interrompere Chemicals (EDCs) per la salute pubblica, endocrino non è in genere incluso nei programmi di studio dello studente non laureato. Questa lacuna è in parte a causa di una mancanza di attività di laboratorio pertinenti che illustrano i principi coinvolti mentre anche essere accessibile a studenti universitari. Questo articolo presenta un ottimizzato Sì per quantificare ligandi in prodotti di cura personale che legano l'alfa recettori dell'estrogeno (ERα) e/o beta (ERβ). Il metodo incorpora uno dei due substrati colorimetrici (ortho- nitrofenil-β-D-galattopiranoside (ONPG) o clorofenoli rosso-β-D-galattopiranoside (CPRG)) che sono scisso dalla β-galattosidasi, un'incubazione refrigerata 6 giorni passo per facilitare l'uso nei corsi di laboratorio dello studente non laureato, un programma automatico per calcoli LacZ e codice R per l'analisi di regressione logistica di associato 4 parametri. Il protocollo è stato progettato per consentire agli studenti universitari di sviluppare e condurre esperimenti in cui hanno schermo i prodotti di loro scelta per estrogeno imita. Nel processo, imparano circa endocrino, coltura cellulare, grippaggio del ricevitore, l'attività dell'enzima, ingegneria genetica, statistiche e disegno sperimentale. Contemporaneamente, si esercitano anche competenze di laboratorio fondamentali e ampiamente applicabili, come: calcolo delle concentrazioni; rendendo le soluzioni; dimostrazione tecnica sterile; diluizione in serie standard; costruzione e interpolando curve standard; identificazione di variabili e controlli; raccolta, organizzazione e analisi dei dati; costruire e interpretare grafici; e utilizzando attrezzature di laboratorio comuni quali micropipettors e spettrofotometri. Così, questo saggio di esecuzione incoraggia gli studenti a impegnarsi nell'apprendimento basato sulla ricerca esplorando questioni emergenti in scienze ambientali e la salute.

Introduction

Il lievito dell'estrogeno Screen (Sì) viene ampiamente utilizzato per quantificare ligandi che imitano l'estradiolo (E2 o 17 β-estradiolo) in una varietà di matrici, tra cui acqua, tessuti vegetali, prodotti di consumo e alimenti^{1,2,3, 4}. Collettivamente, tali ligandi sono chiamati "Estrogeni ambientali (EEs)." Lo sì è stato originariamente sviluppato come un basso costo, in vitro alternativa alle prove di in vivo come il roditore uterotrofico dosaggio^5,6 e la trota iridea alimentazione dosaggio⁷. Lo scopo di queste prove è quello di determinare se un prodotto contiene sostanze chimiche che stimolano o bloccano meccanismi estrogeno-dipendenti. Rilevamento della SEO è fondamentale, perché possono interferire con la segnalazione, particolarmente durante lo sviluppo fetale normale dell'estrogeno endogeno. Questa interferenza compromette la salute aumentando il rischio di obesità, sterilità, cancro e perdita conoscitiva⁸.

Nonostante l'importanza della SEO e altri EDCs per la salute pubblica, endocrino non è comunemente incluso nei programmi di studio dello studente non laureato. Questa carenza è parzialmente a causa di una carenza di attività che illustrano i principi coinvolti mentre anche essere accessibile a studenti universitari. Inoltre, esistono numerose varianti del protocollo Sì^{9,10,11,12,13}, e questa diversità rende saggio ottimizzazione richiede molto tempo per coordinatori di laboratorio non specificamente addestrati nelle tecniche pertinenti. Infine, sì analisi vengono completate solitamente lunga oltre 1 giorno o 2 giorni consecutivi con un'incubazione di O/N. Questa tempistica non è compatibile con il formato dei corsi di laboratorio dello studente non laureato, che in genere si incontrano una volta / settimana per diverse ore.

In risposta a queste esigenze, questo manoscritto segnala un protocollo ottimizzato di sì 96 pozzetti che include metodi di estrazione etanolica per Personal Care Products (PCPs)³ e un passo di refrigerazione di 6 giorni per ospitare riunioni settimanali di laboratorio. Etanolo assoluto è un solvente organico versatile che può sciogliere una varietà di soluti polari e non polari. Inoltre, è indicato per i corsi di laurea perché è prontamente disponibile, relativamente non tossico, a prezzi accessibili e miscibile con l'acqua; evapora facilmente anche senza attrezzature speciali. Tuttavia, l'etanolo non è ideale per l'estrazione fortemente idrofobici interferenti endocrini o molti oli e cere, gli ultimi due ingredienti comuni in PCPs. efficienza di estrazione povera aumenta il rischio di risultati falsi negativi. Con questo vincolo in mente, gli investigatori dovrebbero scegliere le procedure di estrazione (ad es., estrazione etanolica o estrazione in fase solida) che le caratteristiche del campione di indirizzo e soddisfare obiettivi di studio (ricerca contro istruzione dello studente non laureato).

Lo sì si basa su ricombinante Saccharomyces cerevisiae originariamente creato da Dr. Charles Miller all'Università di Tulane. Si prega di vedere Miller et al. (2010) per una mappa completa del plasmide derivati dal¹⁴. Lievito trasformato con questi plasmidi costitutivamente espresso umano ERα nucleare o ERβ (anche chiamato ESR1 ed ESR2, rispettivamente) quando coltivate in media che contengono galattosio (per ERα) o glucosio o galattosio (per ERβ). Se estrogenici prodotti chimici sono presenti nei media, si legano ai recettori, creazione di complessi ligando-recettore che attivare l'espressione di β-galattosidasi (lacZ) ad un livello proporzionale alla concentrazione di sostanze chimiche estrogenici. Cellule di lievito vengono poi lisate per rilasciare la β-galattosidasi accumulata. Il buffer di lisi contiene ONPG o CPRG, che sono scisso dalla β-galattosidasi per produrre prodotti di gialli o rossi, rispettivamente. Colorimetrici prodotti possono essere quantificati misurando l'assorbanza usando uno spettrofotometro di piastra microtiter. Il grado di cambiamento di colore è proporzionale alla concentrazione di ligandi estrogeniche a cui era esposto il lievito.

La scelta del substrato (CPRG o ONPG) dipende dal potenziale dell'assorbanza di fondo derivanti dai campioni in fase di test. Ad esempio, estratti di piante spesso aggiungerà una tonalità gialla ai media che gonfia artificialmente misure estrogenicità se ONPG (quantificato a 405 nm) è usato come substrato per la β-galattosidasi. Con estratti della pianta, CPRG (quantificato a 574 nm) può essere un substrato colorimetrico più appropriato. CPRG è più costoso di ONPG ma è usato a un decimo la molarità. Questo articolo presenta estrogenicities di PCP estratti quantificati utilizzando sia ONPG e CPRG.

Quantificare la estrogenicità di campioni ambientali utilizzando sia ERα ed ERβ è un approccio più globale rispetto all'utilizzo di uno solo di questi recettori. Negli animali, questi recettori espositivo distribuzione tissutale differenziale, attività di carattere normativo e affinità di legame per ligandi estrogenica e anti-estrogenici¹⁵. Ad esempio, i fitoestrogeni vegetali in genere associare ERβ più fortemente², considerando che prodotti chimici sintetici possono mostrare preferenza per ERα o ERβ o possono essere associati sia recettori ugualmente ben¹⁵. Di conseguenza, un estrogeno recettore non necessariamente prevedere associazione a altra.

Sebbene SEO si trovata in molti prodotti di consumo (ad es., pesticidi, detergenti, adesivi, lubrificanti, materie plastiche, alimenti e prodotti farmaceutici) così come le piante, i dati presentati sono stati ottenuti utilizzando una selezione di PCPs. PCPs sono convincenti, prontamente disponibile, buon rapporto qualità-prezzo e ambientali rilevanti per gli studenti universitari. Gli studenti possono essere invitati a portare loro PCPs preferita da casa per testare in laboratorio. Possono anche cercare il database Skin Deep, sviluppato Environmental Working Group¹⁶ per generare confronti basati su ipotesi di PCPs con alta e bassi punteggi di tossicità. In questo modo, gli studenti possono sviluppare contemporaneamente competenze di laboratorio avanzato; impegnarsi nell'apprendimento auto-diretto, basata sull'indagine; ed esplorare questioni emergenti in scienze ambientali e la salute.

Protocol

1. preparazione reagenti

1. Preparare il supporto di glucosio e galattosio mescolando 6,7 g lievito azoto base, 20 g di destrosio o galattosio, solfato di adenina 20 mg (aggiunto come 10 mL di una soluzione acquosa stock di 200 mg/100 mL), uracile 20mg (aggiunto come 10 mL di una soluzione acquosa stock di 200 mg/100 mL) , leucina 60mg (aggiunto come 6 mL di una soluzione acquosa 1 g/100 mL) e 20 mg istidina (aggiunto come 2 mL di una soluzione acquosa 1 g/100 mL) in acqua deionizzata fino ad un volume finale di 1 L. sterilizzare mediante filtrazione (filtro 0,2 µm). Media può essere memorizzato a 4 ° C per diverse settimane.
2. Preparare estradiolo (E2) standard di dissoluzione in polvere E2 in etanolo anidro e diluire le concentrazioni di lavoro appropriato (227.5 nM & 9.75 nM) in etanolo al 50%.
   Nota: Se l'estradiolo è acquistato come una fiala da 1 mg, aggiungere 1 mL di etanolo direttamente al flaconcino per sciogliere la polvere di estradiolo. Questo produce uno stock di 3,67 mM #1.  Diluire 10 μL di stock #1 in etanolo al 990 μL di rendere 1 mL di brodo μM 36,71 #2.  Quindi, diluire 10 μL di stock #2 in etanolo al 50% 990 μL di rendere 1 mL di brodo di 367.13 nM #3.  Per rendere il lavoro delle scorte, diluire stock μL 619.7 #3 in etanolo di 50% 380.3 μL di rendere 1 mL di 227.5 nM lavoro magazzino utilizzato per creare curve standard con lievito che esprimono ERα.  Diluire il magazzino μL 26.56 #3 in etanolo al 50% 973.44 μL per fare 1 mL di 9,75 nM lavoro magazzino utilizzato per creare curve standard con lievito esprimendo ERβ. Guarnizione standard con parafilm e conservare a -20 o -70 ° C.
   Attenzione: E2 è un sospetto cancerogeno e tossico riproduttiva. È nocivo se inalato, ingerito o assorbito attraverso la pelle. E2 può provocare danni all'allattamento al seno i bambini e feti. E2 è molto tossico per la vita acquatica. Utilizzare protettivi appropriati (guanti, cappa aspirante, mascherina antipolvere) ed evitare l'esposizione durante la gravidanza e l'allattamento. Alienare E2 come rifiuti pericolosi e non rilasciano nell'ambiente.
3. Preparare il tampone di LacZ mescolando 8,52 g Na₂HPO₄, 5,52 g NaH₂PO₄•H₂O, mg 95,21 MgCl₂, 745,5 mg KCl, sale di sodio di 2 g N-lauroylsarcosine e ONPG (400 mg) o CPRG (77,7 mg) in acqua deionizzata per un finale volume di 1 L. Store LacZ tampone in aliquote di mL 20 a-20 ° C.
   Nota: Un 20ml aliquota è sufficiente per una piastra a 96 pozzetti.
4. Preparare il carbonato di sodio mescolando 105,9 g di carbonato di sodio in acqua deionizzata fino ad un volume finale di 1 L. negozio a TA.
5. Preparare 1 M ditiotreitolo (DTT) in acqua. Congelare 25 aliquote µ l di DTT a-20 ° C.
   Attenzione: Il DTT è un'acuta della pelle e irritante per gli occhi. Utilizzare indumenti protettivi appropriati (guanti, cappa aspirante, mascherina antipolvere) per evitare la pelle e contatto con gli occhi, inalazione e ingestione.
   Nota: Ciascuna aliquota è sufficiente per una piastra a 96 pozzetti.

2. preparazione di campioni e controlli di estrazione

1. Prelevare campioni da testare.
   Nota: Questo articolo presenta i dati per quindici PCPs, tra cui sapone, crema per capelli, shampoo, crema solare, burrocacao, Fondazione, crema da barba, smalto e lozione.
2. Unire 1 g del campione con 10 mL di etanolo anidro in una provetta conica da 15 mL. Preparare un controllo negativo estrazione costituito da 11 mL di etanolo in una provetta conica da 15 mL. Preparare replicati.
   Nota: Per il disegno sperimentale presentato, sono state preparate tre aliquote di tutti i 15 PCPs e soluzioni di controllo estrazione triplicate, producendo un totale di 48 campioni, ciascuno dei quali è stato analizzato in triplice copia utilizzando il protocollo nella sezione 4. Un piatto unico può ospitare fino a 23 campioni in triplici copie. Etanolo anidro è usato in questo passaggio perché evapora prontamente. Utilizzare i controlli negativi estrazione per verificare che gli estrogeni non sono lisciviazione in campioni da provette coniche.
3. Da una combinazione di agitazione manuale e Vortex o agitando tubi su un vortex multi-provette, omogeneizzare tubo contenuto per 30 min.
4. Centrifugare provette coniche alla massima velocità consentita in una centrifuga di secchio per 10 min. decantare il supernatante da ciascuna provetta attraverso un colino di cella di 40 µm in una provetta conica da 50 mL. Vuoto contenuto di ogni provetta da 50 mL in un flacone di vetro scintillazione.
5. Fiale di lasciare aperto in un cappuccio ventilato per una settimana consentire etanolo farlo evaporare completamente. In alternativa, asciugare i campioni in un cappuccio ventilato sotto azoto o con un evaporatore rotante. Per evitare la degradazione dei costituenti sensibili luce, proteggere i campioni essiccazione dalla luce (ad esempio, il tessuto opaco posto sopra porta cappuccio ventilato).
6. Ricostituire i campioni in 1,0 mL di etanolo al 50% e vortexare per omogeneizzare.

3. messa in coltura e subcoltura lievito¹⁴

1. Mantenere le colture di lievito attivo (ceppo batterico di W303a di S. cerevisiae¹⁴) incubando lievito nei mezzi di glucosio filtro-sterilizzato a 30 ° C. Lievito di sottocultura settimanale media fresco glucosio filtro-sterilizzato.
2. Due notti (circa 42 h) prima di preparare le piastre Sì, sottocultura lievito aggiungendo 0,1 mL di colture di lievito attivo a 10 mL di media filtro-sterilizzato glucosio utilizzando una tecnica sterile.  Incubare a 30 ° C per due notti.  Agitazione non è necessaria se lievito vengono coltivata come culture poco profonde in sterile 250 mL Erlenmeyer boccette.
   Nota: Lievito può essere conservato anche su piastre di agar refrigerati per diversi mesi. Per archiviazione a lungo termine (anni), unire culture O/N con glicerolo sterile 15-50%, vortice e congelare a-70 ° C. Per preparare il glicerolo sterile, è necessario utilizzare una siringa per trasferire 300 glicerolo µ l in un cryovial ed autoclave con il tappo svitato. Quindi aggiungere 1.200 coltura di lievito O/N µ l utilizzando una tecnica sterile.

4. preparazione sì piastre (giorno 1 del dosaggio)

1. In un becher di sterile e utilizzando una tecnica sterile, diluire il lievito da passo 3.2 a una densità ottica di 0.065 ± 0.005 a 610 nm (OD₆₁₀) in media filtro-sterilizzato galattosio.
   1. Confermare la densità ottica di pipettaggio 120 µ l di ogni campione di lievito in triplice copia insieme con spazi vuoti galattosio triplicate in un piatto chiaro polistirolo (piastra non deve necessariamente essere sterile).  Utilizzare uno spettrofotometro di piastra per verificare che la coltura di lievito diluito ha un netto OD₆₁₀ di 0,065 ± 0.005 sottrarre OD610 letture di spazi di galattosio da letture di₆₁₀ OD lievito per determinare netto OD₆₁₀ del lievito. Preparare un volume finale di almeno 30 lievito mL diluito per ogni piastra a 96 pozzetti.
      Nota: Spettrofotometro filtri misurare l'assorbanza tra 610 e 595 nm possono essere utilizzati per questa misura.

Un approssimativo rapporto 1:6 v: v: media del lievito in genere produce un OD₆₁₀ vicino 0,065, quindi iniziare con l'aggiunta di lievito di 4,5 mL ai media di 30 mL e aggiungere più lievito o supporti appropriati ottenere un netOD₆₁₀ tra 0.060 e 0.070.

Utilizzando una tecnica sterile, aggiungere questa sospensione di lievito diluito ai pozzetti di una sterile, polipropilene, micropiastra a 96 pozzetti in base al layout della piastra (Figura 1). Durante il pipettaggio, mantenere la fonte lievito sospesa continuamente agitando il contenitore o la miscelazione con la pipetta. Per questo passaggio, è utile usare un pipettatore ripetuto con una punta di siringa sterile.
Nota: Placche in polipropilene sono sterilizzati con due piastre impilate in autoclave, avvolti in carta stagnola.  La piastra superiore funge da un coperchio per piatto del campione e può essere lavato, re-autoclavato e riutilizzato.

Aggiungere 120 µ l filtro-sterilizzato galattosio media a 3 ulteriori pozzi (H10 - 12) in base al layout della piastra (Figura 1). Questi pozzi servono come controlli multimediali per contabilizzare assorbanza contribuito dai media da solo.

Costruire una curva standard in ogni piastra diluendo in modo seriale triplici copie di standard lavorativi E2 (227.5 nM per ERα, 9.75 nM per ERβ) in pozzetti contenenti la sospensione di lievito (A1 - G3) in base al layout della piastra (Figura 1).  Iniziare aggiungendo 5 µ l di standard di E2 pozzetti A1 e A3. Mescolare microtiter contenuto pipettando e poi diluire in serie questa sospensione spostando µ l 205 da pozzetti A1 - 3 nei pozzetti B1 - 3. Ripetere la miscelazione e il trasferimento di µ l 205 attraverso riga G.
Nota: Una volta completata la diluizione seriale, scartare 205 μL da pozzi G1 - 3. Alla fine di questo passaggio, tutti i pozzetti standard dovrebbero contenere 120 μL. La diluizione seriale produrrà le concentrazioni finali di E2 elencate nella tabella 1. Per i passaggi di diluizione seriale, è utile usare un pipettatore multicanale con puntali sterili.

Aggiungere 5 µ l del veicolo (50% di etanolo) nei pozzetti di controllo del veicolo contenente la sospensione di lievito (H1 - 3) in base al layout della piastra (Figura 1).
Nota: I pozzetti di controllo del veicolo vengono utilizzati per quantificare dell'assorbanza di fondo connesso con i media e le cellule di lievito. Inoltre, citotossicità o crescita promuovendo effetti del test campioni possono essere rilevati confrontando i valori di₆₁₀ OD di testare pozzetti con quelli dei pozzetti di controllo del veicolo.

Aggiungere 5 triplici copie µ l dei campioni ed estrazione negativa dei pozzetti contenente la sospensione di lievito secondo il layout della piastra (Figura 1).
Nota: Prendere nota dei quali campioni o estrazione negativa controlli vengono aggiunti a ciascun pozzetto.  Per tenere traccia di quali pozzi hanno campioni e che non lo fanno, iniziare con una scatola di fresca di suggerimenti e utilizzare punte dalle stesse posizioni nella casella le posizioni dei rispettivi pozzetti della piastra. Una piastra a 96 pozzetti può ospitare fino a 23 campioni in triplice copia.

Mescolare il contenuto del campione, controllo di estrazione e pozzetti di controllo del veicolo di pipettaggio. Regolare i volumi di questi pozzi a 120 µ l rimuovendo µ l 205 da ciascuno come descritto nella legenda per Figura 1.

Sigillare le piastre con un film sterile, adesiva, porosa. Etichettare le piastre e incubare per 17 ore a 30 ° C. La piastra non deve necessariamente essere agitato durante l'incubazione

5. elaborazione sì piastre (giorno 2 del dosaggio)

1. Dopo le 17 ore di incubazione a 30 ° C, è necessario rimuovere piastre dall'incubatrice. Se piastre saranno evasi immediatamente, passare al punto 5.1.1. Se piastre saranno trattati in un secondo momento, passare al punto 5.1.2.
   1. Utilizzare un pipettatore multicanale per mescolare il contenuto di ogni fila di pozzetti e quindi trasferire 50 µ l di sospensione di lievito da ogni pozzetto per il corrispondente bene di una micropiastra chiara, polistirolo, 96 pozzetti.
      Nota: Lastre di polistirolo non è necessario essere sterile ma dovrebbero avere un coperchio. Utilizzare nuove punte di pipetta per ogni fila di pozzetti per evitare la cross-contaminazione pozzi, anche se pipettaggio attraverso triplici copie con una pipetta multicanale 8-punta, suggerimenti solo bisogno di essere cambiato tra insiemi triplicate.
      1. Etichettare la nuova piastra. Procedere al punto 5.2.
   2. Per memorizzare le piastre prima dell'elaborazione, eseguirne il wrapping in involucro di plastica. Conservare in frigorifero avvolti piastre a 4 ° C per 6 d. in seguito, rimuovere le piastre dal frigorifero, scartare li e trasferire il contenuto di tutti i pozzetti pipettando come descritto al punto 5.1.1. Procedere al punto 5.2.
2. Aggiungere 20 µ l di 1 M DTT a 20 mL di tampone di LacZ scongelati, temperatura per una concentrazione finale di 1 millimetro DTT. Buffer di LacZ mix bene. Se utilizzando una pipetta multicanale, dispensare in un serbatoio di reagente.
   Attenzione: Indossare guanti e lavorare con DTT in una cappa, se possibile
3. Usando sia una pipetta multicanale o ripetendo pipettatore, aggiungere 200 µ l di tampone di LacZ contenente DTT e ONPG o CPRG in tutti i pozzetti della piastra in polistirolo e immediatamente misurare e registrare il OD₆₁₀ di tutti i pozzetti usando uno spettrofotometro di piastra. Ripetere per piastre aggiuntive.
   Nota: Le letture di₆₁₀ OD sono utilizzate nel denominatore del calcolo LacZ (punto 6.1). Per questo motivo, ottenere le letture immediatamente dopo il pipettaggio e prima settle di cellule o vengono lisate dai buffer di LacZ. Se i valori di₆₁₀ OD per pozzetti sono notevolmente superiori o inferiori ai valori di₆₁₀ OD per pozzetti di controllo del veicolo, gli estratti di campione sono dipromozione o citotossici ai lieviti, rispettivamente. LacZ calcolo verrà corretto per piccole differenze nella densità delle cellule attraverso pozzi, ma se le differenze superino il 30% in entrambe le direzioni, quindi diluire il campione ricostituito (dal punto 2.6) in ulteriori 50% etanolo e verificare nuovamente il campione restituendo al punto 3.2 ¹².
4. Coprire le piastre con un coperchio. Incubare piastre contenenti lievito quello espresso ERα¹⁴ a 30 ° C per 40 min (per ONPG) o 3 h (per CPRG). Incubare piastre contenenti lievito quello espresso ERβ¹⁴ a 30 ° C per 70 min (per ONPG) o 4 h (per CPRG).
   Nota: Quando si lavora con CPRG, tempi di incubazione sono flessibili; Incubare per 2-4 h produce risultati idonei con entrambi i recettori, con incubazioni più lunghe, aumentando la sensibilità del test.
5. Dopo incubazione piastre, utilizzare una pipetta multicanale o ripetuta pipettatore per aggiungere 100 µ l di carbonato di sodio in ciascun pozzetto. Carbonato di sodio aumenta il pH e interrompe la reazione di β-galattosidasi.
6. Misurare e registrare il OD₄₀₅ (per ONPG) o OD₅₇₄ (per CPRG) di tutti i pozzetti usando uno spettrofotometro di piastra.

6.Calcolo dei valori LacZ

Nota: I valori LacZ quantificare il grado di cambiamento di colore per ogni campione e offrono un metodo normalizzato di confrontare valori tra saggi separati di contabilità per diverse variabili (ad es., densità ottica lievito, densità ottica media e incubazione tempo se Questo differisce tra pozzi sulla stessa piastra)¹².

1. Calcolare mezzo di valori di₆₁₀ OD triplici per pozzetti di controllo multimediale (galattosio) (H10-12) e calcolare mezzo di triplice copia OD₄₀₅ o valori₅₇₄ OD per comandi del veicolo (50% di etanolo) (H1-3). Utilizzare questi mezzi ed il tempo di incubazione (t) in ore per la piastra per cambiare colore (punto 5.5) per calcolare i valori di LacZ (corrispondente al grado di cambiamento di colore in ogni pozzetto) per tutti gli standard e campione pozzi utilizzando le seguenti equazioni:
   
   
   1. In alternativa, utilizzare l'applicazione automatizzata nell'appendice 1 per calcolare valori di LacZ per standard e campioni.
      Nota: Il layout di piastra utilizzato con l'applicazione deve essere identico al layout del piatto presentato nella Figura 1. Se non sono stati utilizzati alcuni pozzetti, mantenere letture di assorbenza dei pozzi vuoti come segnaposto nel dataset assorbanza viene incollato nell'applicazione LacZ appendice 1 .  Ciò mantiene la disposizione spaziale della piastra nell'applicazione ed assicura che i pozzetti di controllo multimediale sono nella loro posizione richiesta.  Inoltre, l'applicazione non verrà eseguito se non ci sono celle vuote.
2. Calcolare mezzo di triplice copia LacZ valori per ogni standard di E2 e di ogni campione. Segnalare i valori medi di LacZ come µ l^-1h^-1. Registro-trasformazione delle concentrazioni di ciascun E2 standard e generare un documento di foglio di calcolo, formattato come file CSV (appendice 2).

7. campione estradiolo equivalenti (EEQs) utilizzando la regressione logistica 4 parametri di interpolazione

Nota: EEQs riguardano valori di esempio LacZ (cambiamento di colore) i valori di LacZ della curva standard creato con E2. EEQs così determinare quanto campione è necessaria per suscitare la stessa risposta di cambiamento di colore come una concentrazione nota di E2.

1. Per calcolare EEQs per campioni di prova, prima di tracciare la curva standard. Misura i valori medi di LacZ per E2 standard (asse y) e il registro-trasformate E2 concentrazioni corrispondenti (asse x) per un modello di regressione logistica quattro-parametro.
2. Utilizzare il modello per interpolare EEQs per i valori di test campione LacZ. Condurre i calcoli di regressione logistica di EEQs utilizzando il software statistico come descritto nell'appendice 2.

8. standardizzazione EEQs (ng/mL) alla massa del campione di PCP

1. Di relazionarsi EEQs con la quantità di campione di PCP aggiunto a ciascun pozzetto nel passaggio 4.5, moltiplicare EEQ (ng/mL) per il volume totale placcato nei pozzetti (325 µ l) ed poi dividere per il volume di campione estratto aggiunto ad ogni pozzetto (5 µ l).
   Nota: Questi valori rappresentano EEQ per mL di campione estratto. Se i campioni sono stati preparati usando 1 g di PCP, questi valori rappresentano anche EEQ per grammo di PCP (ng/g). Espresso in questo modo, valori EEQ (ng/g) possono essere confrontati attraverso valori diversi PCPs. EEQ (ng/g) per i prodotti di cura personale testati in questo studio sono riportati nella tabella 2, e raccolti in tutta l'intero protocollo di dati di esempio sono inclusi in Appendice 3.

Representative Results

Il estrogenicities di campioni triplici di 15 PCPs sono stati valutati usando questo protocollo di sì. Come notato da Miller et al. (2010), analisi con lievito esprimendo ERβ erano più di un ordine di grandezza più sensibile di saggi con lievito che esprimono ERα (Figura 2)¹⁴. Pertanto, l'attività estrogena più spesso è stata rilevata con lievito che esprimono ERβ (tabella 2). Otto PCPs ha esibito l'attività estrogenica con ERβ e 5 PCPs ha esibito l'attività estrogenica con ERα. Capelli crema, crema solare, lozione e labbro balsamo campioni erano estrogenici con entrambi i recettori, mentre Fondazione, crema da barba e smalto erano solo estrogeniche con ERβ alle concentrazioni testate. Sette altri PCPs (1 burrocacao, 2 saponi e 4 shampoo) non erano estrogenica con entrambi recettore alle concentrazioni testate.

Oltre alle differenze di sensibilità del ricevitore, EEQs per ogni campione differiva a seconda del substrato colorimetrico (ONPG o CPRG) usato nell'analisi (tabella 2). In tutto solo un campione, EEQs determinato utilizzando ONPG erano superiori a quelli determinati utilizzando CPRG. Inoltre, variazioni tra le repliche di estrazione era più basso per EEQs misurata con ERβ e CPRG e determinato più alto per EEQs con ERα e ONPG (tabella 2).

Oltre al confronto tra substrati colorimetrici, 1 solo obiettivo del presente studio era di verificare incubazione tempi di durata che sono compatibili con il programma di un corso di laboratorio dello studente non laureato. Il dosaggio tipico di sì richiede che un'incubazione 17 h seguita immediatamente da incubazione nel buffer di LacZ per 40 min - 4h, una pianificazione che è impossibile da attuare in un laboratorio di insegnamento vincolato da una singola sessione settimanale. Per facilitare l'uso di questo test nell'insegnamento, il dosaggio è stato modificato con l'introduzione di un periodo di refrigerazione 6D (punto 5.1.2) dopo l'incubazione 17 h. Le curve standard da piastre refrigerate erano paragonabili a quelli da piastre non refrigerato (figure 2 & 3), tranne per il fatto che gli errori standard dei parametri stimati utilizzando modelli di regressione logistica quattro-parametro erano tutti più piccolo per piastre refrigerate rispetto per piastre nonrefrigerated (tabella 3). Così, piastre per 6D di refrigerazione riduce l'errore e migliora la precisione delle stime EEQ.

Figura 1. Piastra microtiter Layout e diluizione normale curva di preparazione per il dosaggio di sì. E2 standard (pozzi di luce grigi), i campioni e negativo controlli di estrazione (bianchi pozzi) e veicolo (H1 - 3) e media di galattosio (H10 - 12) controlli (pozzi grigi scuri) sono stati tutti testati in triplice copia. Una curva standard di E2 (pozzi di luce grigi) è stata costruita da placcatura 320 µ l di lievito nei pozzetti A1 attraverso A3 e 120 µ l di lievito nei pozzetti B1 attraverso G3. Quindi, 5 µ l di E2 (227.5 nM per il lievito che esprimono ERα; 9,75 nM per il lievito che esprimono ERβ) sono stati aggiunti al lievito nei pozzetti A1 e A3. Il lievito + E2 sospensione è stato diluito serialmente trasferendo µ l 205 da ogni pozzetto per il ben di sotto di esso, producendo le concentrazioni finali di E2 elencate nella tabella 1. Si noti che, alla fine del processo di diluizione seriale, µ l 205 devono essere scartati dai pozzi G1 a G3 per ottenere un volume finale di 120 µ l in ogni pozzetto. Campione e pozzetti di controllo estrazione negativa sono stati preparati aggiungendo 5 µ l di ciascun estratto (disciolto in 50% etanolo) a 320 µ l di lievito. Pozzetti di controllo del veicolo (H1 - 3) sono stati preparati aggiungendo 5 µ l di etanolo al 50% a 320 µ l di lievito. Tutti i pozzetti del campione e controllo sono stati mescolati pipettando e 205 µ l sono stati rimossi e scartato per regolare i volumi ben a 120 µ l ciascuna. Infine, i controlli multimediali sono stati preparati da placcatura 120 µ l di media di galattosio in pozzetti H10 - 12.  Per utilizzare la calcolatrice di LacZ in appendice 1 e l'applicazione basata su R descritto nell' appendice 2, E2 curva standard e controlli multimediali galattosio e il veicolo devono essere placcati come mostrato.  Campioni e controlli di estrazione negativa possono essere placcati in uno qualsiasi dei pozzetti bianchi, purché l'ordine di placcatura è notato.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Curve standard per le piastre di sì generate tramite regressione logistica 4-parametro. Due substrati (ONPG & CPRG) sono stati testati utilizzando lievito esprimere uno dei due umana recettori per gli estrogeni (ERα o ERβ) entrambi senza (A) e con (B) una refrigerazione 6D periodo dopo l'incubazione 17h con 17 β-estradiolo e campione estratti. Tutte le norme di E2 e controlli multimediali e veicolo sono stati testati in triplice copia. I punti rappresentano mezzi di triplici valori LacZ, dove LacZ valori riflettono il grado di cambiamento di colore indotto dalla β-galattosidasi. Nella tabella 3sono elencati i parametri del modello di regressione logistica. ONPG = ortho- nitrofenil-β-D-galattopiranoside; CPRG = Clorofenolo rosso-β-D-galattopiranoside. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Esempi di piatti sviluppati Sì. Due substrati (ONPG & CPRG) sono stati testati utilizzando lievito che esprimono recettori estrogeno umano (ERα o ERβ), sia senza (sinistra) o con il periodo (a destra) una refrigerazione di sei giorni dopo l'incubazione 17h con 17 β-estradiolo o campione estrae. Tutte le norme di E2, media e veicolo i controlli sono stati testati in triplici copie. Piastre sono state organizzate con la più alta concentrazione di E2 nella riga superiore di ogni piastra e controlli (50% etanolo + lievito sul supporto di galattosio e di sinistra a destra) nella riga inferiore di ciascuna piastra secondo la Figura 1. ONPG = ortho- nitrofenil-β-D-galattopiranoside; CPRG = Clorofenolo rosso-β-D-galattopiranoside.Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Numero standard	[E2] per lievito ERα (pM)	[E2] per lievito ERβ (pM)
1	3500	150
2	2208	94,6
3	1393	59,7
4	878	37,6
5	554	23,7
6	349	15
7	220	9,45

Tabella 1. Finale concentrazioni di E2 standard utilizzati nel sì.
In polvere E2 è stato disciolto in etanolo anidro e poi diluita a lavorare stock concentrazioni di 227,5 nM (per lievito che esprimono ERα) e 9,75 nM (per lievito che esprimono ERβ) in etanolo al 50%.Scorte di lavoro erano quindi aggiunto ai pozzetti di micropiastra contenenti lievito nei media di galattosio e in serie diluite ad una concentrazione indicata nella tabella.

Campioni testati		Condizioni di test		Estrogenici equivalenti (EEQs) di PCPs
PCP N.	Tipo di campione	Recettore	Substrato	1 sistema EEQ (ng/g)	2 EEQ (ng/g)	3 EEQ (ng/g)	Significa EEQ (ng/g)
1	Crema per capelli	ERΑ	ONPG	ND	0.379	ND	< 0.379
1	Crema per capelli	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
1	Crema per capelli	ERΒ	ONPG	0.528	0,338	0.363	0,410
1	Crema per capelli	ERΒ	CPRG	ND	0,215	ND	< 0,215
4	Protezione solare	ERΑ	ONPG	6.803	1.390	ND	< 4,097
4	Protezione solare	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
4	Protezione solare	ERΒ	ONPG	1,321	0.838	0.818	0,992
4	Protezione solare	ERΒ	CPRG	0.651	0,591	0,725	0.656
7	Fondazione	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
7	Fondazione	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
7	Fondazione	ERΒ	ONPG	ND	0,158	ND	< 0,158
7	Fondazione	ERΒ	CPRG	ND	ND	ND	ND
9	Shave cream	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
9	Shave cream	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
9	Shave cream	ERΒ	ONPG	ND	0,256	0.295	< 0,276
9	Shave cream	ERΒ	CPRG	0.507	0.392	0,560	0.486
10	Smalto per unghie	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
10	Smalto per unghie	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
10	Smalto per unghie	ERΒ	ONPG	0.916	0,503	0,554	0.658
10	Smalto per unghie	ERΒ	CPRG	0,532	0.628	0.594	0,585
11	Lozione	ERΑ	ONPG	ND	ND	2.327	< 2.327
11	Lozione	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
11	Lozione	ERΒ	ONPG	Supera la gamma	2.599	1.845	> 2.222
11	Lozione	ERΒ	CPRG	--	1.986	1.236	1,611
13	Protezione solare	ERΑ	ONPG	14.069	11.494	10,189	11.917
13	Protezione solare	ERΑ	CPRG	4,773	5.790	5.850	5.471
13	Protezione solare	ERΒ	ONPG	Supera la gamma	2.580	Supera la gamma	> 2.580
13	Protezione solare	ERΒ	CPRG	0.292	0,240	ND	< 0,266
15	Balsamo per le labbra	ERΑ	ONPG	ND	ND	0,431	< 0,431
15	Balsamo per le labbra	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
15	Balsamo per le labbra	ERΒ	ONPG	1.202	1.060	0,887	1.050
15	Balsamo per le labbra	ERΒ	CPRG	0.820	0,871	0.851	0.847

Tabella 2. EEQs di PCPs con EEQs diverso da zero. Tre aliquote di 15 PCPs e tre controlli di estrazione sono state omogeneizzate in etanolo anidro, evaporate e ricostituite in etanolo al 50% per un totale di 48 campioni, ciascuno dei quali è stato analizzato in triplice copia usando l'analisi di sì. Otto PCPs ha avuto almeno 1 EEQ diverso da zero, mentre 7 PCPs non sono stati trovati per essere estrogenici alle concentrazioni testate. EEQ 1 e 2 di EEQ EEQ 3 vedere le tre aliquote di ogni PCP, ogni testata in triplice copia su un piatto a parte. I valori per EEQ 1 e 2 di EEQ EEQ 3 sono i mezzi per i triplici copie per ciascuna aliquota. Lievito usato nell'analisi espresso 1 delle 2 isoforme dei recettori estrogeno umano (ERα o ERβ). Due substrati colorimetrici, ONPG e CPRG, sono stati testati utilizzando il protocollo non refrigerato. EEQs sono stati determinati utilizzando quattro-parametro regressioni logistiche (con R² valori ≥ 0,98) di LacZ valori in ciascuna delle 7 concentrazioni di E2. ND = sotto il limite di rilevamento del test.-= replica perso.

Condizioni di test			Parametri del modello
Recettore	Substrato	Arresto a 4 ° C per 6 d	Modello R2	Tasso di crescita (LacZ unità/ng/ml)	Punto di flesso (ng/mL)	Asymptote inferiore (LacZ unità)	Asymptote superiore (LacZ unità)
ERΑ	ONPG	No	> 0,99	8.548 ±1.633	-0.512 ± 0,025	-1.623 ±4.408	±6.31 128.11
ERΑ	ONPG	SÌ	> 0,99	7.618 ±0.758	-0.587 ±0.014	-8.378 ±2.223	±2.528 99.53
ERΑ	CPRG	No	> 0,99	8.256 ±2.182	-0.610 ±0.033	0,853 ±3.333	±3.473 62.52
ERΑ	CPRG	SÌ	> 0,99	5.068 ±0.616	-0.523 ±0.022	-3.147 ±1.946	±3.069 68,06
ERΒ	ONPG	No	> 0,99	1.041 ±2.004	-0.898 ±4.410	-32.98 ±86.62	248.6 ±778.9
ERΒ	ONPG	SÌ	> 0,99	4.327 ±1.289	-1.736 ±0.087	4.654 ±3.087	±10.75 66,37
ERΒ	CPRG	No	= 0.99	5.673 ±1.764	-1.914 ±0.052	3.925 ±1.679	±2.334 28.05
ERΒ	CPRG	SÌ	> 0,99	4.412 ±1.142	-1.894 ±0.051	2.052 ±1.303	22.64 ±2.047

Tabella 3. Modello parametri di 4 parametri regressioni logistiche per le curve Standard in Figura 2. Due substrati, ONPG e CPRG, sono stati testati utilizzando lievito esprimere 1 di 2 recettori estrogeno umano (ERα o ERβ) sia senza che con un periodo di sei giorni refrigerazione dopo l'incubazione 17 h. I parametri vengono segnalati come stime ±standard errori.

Appendice 1. Applicazione per calcolare i valori LacZ.  Per utilizzare l'applicazione, prima di scaricare il software gratuito Java (come indicato in Tabella materiali). Quindi aprire l'applicazione di LacZ. Il layout di piastra utilizzato con l'applicazione deve essere identico al layout del piatto presentato nella Figura 1. Se non sono stati utilizzati alcuni pozzetti, mantenere letture di assorbenza dei pozzi vuoti come segnaposto nel dataset assorbanza viene incollato nell'applicazione LacZ.  Ciò mantiene la disposizione spaziale della piastra nell'applicazione ed assicura che i pozzetti di controllo multimediale sono nella loro posizione richiesta.  Inoltre, l'applicazione non verrà eseguito se non ci sono celle vuote. Incolla in letture di OD₄₀₅ (per ONPG) o letture di₅₇₄ OD (per CPRG) di tutti i pozzetti usando tastiera comando "control (ctrl) + v" o "comando + v," a seconda della piattaforma di computer in uso. Immettere la quantità di tempo di incubazione in ore per il dosaggio per produrre il colore (dal passaggio 5.4; ad esempio, 0,66667 h per 40 min). Fare clic su Avanti. Incollare in letture di₆₁₀ OD dal punto 5.3. Fare clic su Invia. LacZ risultati verranno visualizzati e possono essere copiati premendo "control (ctrl) + c" o "command + c," a seconda della piattaforma del computer utilizzata. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Appendice 2. Opzioni di Software statistico per il calcolo EEQs. EEQs può essere calcolato utilizzando una delle tre opzioni presentate.  Indicazioni per l'uso 1. Il software JMP o 2. Codice R sono forniti nell'appendice 2.  Il codice R inoltre è stato convertito in 3. un formato di applicazione disponibile presso https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Appendice 3. I dati raccolti utilizzando lievito che ERα Express e CPRG come il substrato di esempio. Misurazioni di OD₆₁₀ e OD₅₇₄ per ciascuno dei sette controlli standard, veicolo e media di E2, e un singolo campione rappresentativo di PCP sono inclusi, insieme con i valori calcolati di LacZ. LacZ valori standard sono stati utilizzati per costruire un modello di regressione logistica quattro-parametro della curva standard, come descritto nella procedura 7A & B di cui sopra. Il modello è stato utilizzato per interpolare triplicate stime di EEQs del campione rappresentativo in ng/mL nei pozzetti per micropiastre. Questi valori sono stati poi convertiti in EEQs espressa in ng/g di campione (passo 8.1). Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Lo sì è un metodo a basso costo utilizzato per rilevare estrogenici ligandi in campioni ambientali, quali acqua, cibo, tessuti vegetali o prodotti di cura personale. I dati presentati qui confrontare 2 recettori per gli estrogeni (ERα ed ERβ), 2 substrati (ONPG e CPRG) e 2 linee temporali (protocollo 2 d senza refrigerazione) e protocollo di sette giorni con refrigerazione per misurare estrogenicità nei prodotti di cura personale via l'analisi Sì. La 7D, refrigerato protocollo utilizzando CPRG e lievito che esprimono ERα e/o ERβ meglio quantifica EEQs mentre anche essendo compatibile con i vincoli di tempo imposto da corsi di laboratorio dello studente non laureato che si incontrano solo una volta / settimana per diverse ore. Infatti, rispetto al dosaggio 2 d senza refrigerazione, il dosaggio di refrigerati di sette giorni è stato associato con varianza ridotta attraverso piastra replicati. Inoltre, la parte lineare della curva standard è stato leggermente ampliata per i dati raccolti mediante il saggio refrigerato. La parte lineare della curva standard definisce la gamma di rilevazione di analisi ed è l'unica parte della curva standard che può essere utilizzata per interpolare campione EEQs.

In tutti, ma uno dei campioni testati, EEQs misurato utilizzando CPRG erano inferiori rispetto a quelli quantificati con ONPG. Con un più elevato coefficiente di estinzione e inferiore K_m e V_max, CPRG è dieci volte più sensibile di ONPG¹⁷. Così, CPRG possono essere usate alle concentrazioni più basse e può essere utilizzato per rilevare gli importi più bassi di β-galattosidasi. Per questi motivi, è in genere preferibile CPRG ONPG^18,19. Tuttavia, una maggiore sensibilità di substrato non spiega i valori inferiori di EEQ rilevato con CPRG. I valori più elevati di EEQ rilevati con ONPG potrebbero essere a causa dell'interferenza di matrice con il dosaggio, come osservato da altri autori^2,18. Pigmenti gialli da estratti di prodotto di cura personale potrebbero gonfiare i valori EEQ rilevati con ONPG. Altri hanno aggirato questo problema includendo i controlli del pigmento nel loro disegno sperimentale², un approccio che raddoppia il numero di piastre in un esperimento. Quando interferenze di matrice possono essere problematica, CPRG potrebbe essere un substrato preferibile per il dosaggio di sì, anche se è più costoso e richiede tempi di incubazione più lunghi rispetto a ONPG. Inoltre, il cambiamento di colore indotto tramite la fenditura del substrato di β-galattosidasi è più drammatico con CPRG, rendendo più facile per gli studenti a visualizzare i risultati.

Miller et al. (2010), chi ingegnerizzato il lievito utilizzato nel presente protocollo, notato che il lievito esprimendo ERβ erano più sensibili al 17 β-estradiolo che lievito che esprimono ERα, un'individuazione suffragata da nostri dati¹⁴x 30. Oltre a potenziali sfumature nella costruzione del plasmide, Miller et al. (2010) non poteva spiegare questa differenza di sensibilità¹⁴. Una differenza tra i due costrutti di plasmide è che ERα espressione è regolata da galattosio, mentre ERβ espressione è regolata da glucosio o galattosio. Il lievito usato per il test di sì sono coltivate in media del glucosio e solo dato galattosio quando essi sono diluiti all'inizio del test. Di conseguenza, lievito esprimendo ERβ potrebbe accumulare più alti numeri di copia di proteine recettoriali prima dell'inizio del test, quindi che conferisce maggiore sensibilità ai leganti estrogenici.

La minore sensibilità di lievito che esprimono ERα può spiegare i tassi più elevati di mancato rilevamento di estrogenicità nei campioni misurati con ERα confrontato con ERβ. Per aumentare le probabilità che EEQs il campione verrà rilevato, gli utenti potrebbero impiegare metodi e solventi di estrazione differenti o aggiungere maggiori volumi di campione al lievito. Se vengono utilizzati più elevati volumi di campione, le concentrazioni di E2 standard devono essere regolate tale che lo stesso volume di standard e di campioni può essere utilizzato nell'analisi. Una limitazione di aggiunta più campione è che il lievito può tollerare solo 6-10% di etanolo, con migliore tolleranza alle temperature di incubazione di 30 vs 35 ° C²⁰. Per controllare per gli effetti di etanolo sui lieviti, gli investigatori dovrebbero aggiungere triplice copia "lievito solo" pozzi al layout della piastra e confermare che il OD₆₁₀ di questi pozzi "lievito solo" è paragonabile alla OD₆₁₀ di pozzetti di controllo del veicolo immediatamente dopo l'aggiunta del LacZ buffer. In alternativa, possono essere aggiunti campioni disciolti in etanolo a piastre microtiter asciutto e l'etanolo evaporato fuori prima di lievito vengono aggiunti. Dimetilsulfossido (DMSO) è anche usato come un solvente di campione in sì saggi, ma la concentrazione finale del lavoro di DMSO con lievito dovrebbe essere limitata a 1%¹².

Il dosaggio di sì è uno strumento di screening potente per la rilevazione estrogenicità in campioni ambientali. In particolare, lo sì rileva ligandi che legano i recettori per gli estrogeni nucleari che interagiscono con gli elementi di risposta dell'estrogeno per dirigere gene espressione¹⁴. Tuttavia, lo sì ha anche alcune importanti limitazioni. Lo sì non rileva EEs che funzionano attraverso meccanismi non-nucleari come recettori di membrana estrogeno o meccanismi che coinvolgono elementi aggiuntivi come fattori di trascrizione di attivatore della proteina 1 (AP-1). Inoltre, perché il lievito non hanno la stessa capacità metabolica come cellule di mammifero, lo sì non riesce a rilevare ligandi che richiedono l'attivazione metabolica di essere estrogenici.

Inoltre, il dosaggio di sì prontamente non può distinguere tra estrogeni e anti-estrogenici ligandi in campioni complessi. Invece, misura estrogenicità netto , che è l'effetto della somma dei ligandi estrogeniche e anti-estrogenici. Per quantificare la concentrazione di antagonisti ER o valutare l'attività inibitoria di miscele, il dosaggio può essere modificato incubando il lievito con l'agonista standard (17 β-estradiolo) e una gamma di concentrazioni di prova campione¹². Questo processo determina se antagonisti nei campioni possono diminuire l'attività del reporter indotta da agonista e fornisce uno schermo utile per identificare la presenza di antagonisti di ER in campioni.

Il protocollo qui presentato può ospitare una varietà di tipi di campione, anche se alcuni campioni potrebbero richiedere modifiche per la procedura di preparazione di estrazione e campione. Ad esempio, EEQs varia ampiamente tra replica di alcuni prodotti di cura personale. I campioni più variabili tendevano a contenere le goccioline di olio o altrimenti non erano completamente omogenei, che indica che un solvente più lipofilico come etere dietilico sarebbe utile. In alternativa, oli e cera in prodotti di cura personale potrebbe escludersi estraendo campioni con etanolo al 50% invece di etanolo al 100%.Un'estrazione di etanolo 50% anche catturare altri ligandi estrogenici solubile in acqua (ad es., alcuni pigmenti). Tuttavia, l'etanolo 50% evapora più lentamente di etanolo al 100% e così può estendere il tempo di estrazione. Inoltre, alcuni campioni (ad esempio saponi) erano citotossici ai lieviti, conseguente misure di densità riduttrice delle cellule (OD₆₁₀). Volpe et al. (2008) suggeriscono che tali campioni devono essere diluiti e ritestati se differenze di densità delle cellule superino il 30% rispetto al veicolo controllo pozzi¹².

Se l'analisi Sì è usata per scopi di ricerca analitica, curve di diluizione delle piscine di campione possono essere testate per determinare preventivamente volumi appropriati di Estratto da aggiungere al lievito al punto 4.5. In alternativa, gli estratti possono essere testati contemporaneamente a più volumi (per esempio, 5 µ l e 20 µ l di Estratto aggiunto al lievito nel passaggio 4.5) o diluizioni che si estendono su ordini di grandezza (ad es., 0,2 µ l, 2 µ l e 20 µ l). "Appropriati" volumi dell'estratto sono quelli che identificano estrogenicità abbinando LacZ valori lungo la parte lineare della curva standard. Ottimizzazione previene i problemi causati dall'aggiunta di campione troppo o troppo poco al lievito, quali citotossicità, falsi negativi o estrogenicità che supera la curva standard. Come accennato in precedenza, i volumi di campioni ed E2 standard devono essere regolati quando diverse quantità di legante vengono utilizzati tali che lievito sono esposti a un volume costante e la concentrazione di etanolo o altro veicolo su tutta la piastra.

Nonostante il potenziale di falsi negativi, il dosaggio di sì è stato identificato come uno strumento di test di livello 3 per gli interferenti endocrini di Schug et al. (2013), che ha sviluppato un protocollo completo di Tiered per endocrino (TiPED)²¹. Per la formazione universitaria, il dosaggio è prezioso per l'insegnamento di concetti relazionati alla endocrino, coltura cellulare, grippaggio del ricevitore, l'attività dell'enzima, ingegneria genetica, statistiche e disegno sperimentale. Gli studenti che usano l'analisi praticano anche competenze di laboratorio fondamentali e largamente applicabile ad esempio diluendo in modo seriale standard; estrazione di campioni; rendendo le soluzioni; costruzione e interpolando curve standard; calcolo delle concentrazioni; rendendo le soluzioni; dimostrazione tecnica sterile; coltura delle cellule; identificazione di variabili e controlli; raccolta, organizzazione e analisi dei dati; costruire e interpretare grafici; e utilizzando attrezzature di laboratorio comuni quali micropipettors e spettrofotometri.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Vortex Mixer (for single or multiple tubes)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-215-365	Any mixer will suffice.
Bucket centrifuge	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	75-063-839	Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.
Bunsen burner	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	17-012-823	Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.
Incubator	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	50125590H	Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C.
Microplate reader	BioTek (www.biotek.com)	EPOCH2	A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.
Gen5 microplate reader and imager software	BioTek (www.biotek.com)	GEN5	Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.
Refrigerator	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	05LREEFSA	Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C.
Pipettor or PipetAid compatible with 1 - 10 mL serological pipets	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-681-15E	Any pipettors will suffice if they are compatible with 1 & 10 mL serological pipets.
P10 micropipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F144562G	Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl.
P200 micropipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F144565G	Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl.
P300 multichannel pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FBE1200300	Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 - 205 µl.
Repeating pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F164001G	Must be able to deliver 100 - 320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Sterile 15 mL conical tubes with caps	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	05-539-801
Glass scintillation vials	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	03-337-4
Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (nonsterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	12565501
Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid	Cole-Parmer (www.coleparmer.com)	EW-01728-81
100 mL glass beakers	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-539H	Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.
250 mL glass Erlenmeyer flasks	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FB500250	Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.
Sterile, adhesive, porous film	VWR (www.vwr.com)	60941-086
Metal forceps	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	12-000-157	Any metal forceps will suffice.
Reagent reservoir	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	07-200-127
Filtration units (0.2 µm)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	09-761-52
Squirt bottle (for ethanol)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-897-10	Any laboratory squirt bottles will suffice.
Autoclavable storage bottles	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	06-414-1D	Any autoclavable glass storage bottles will suffice.
10 mL glass serological pipets (sterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-678-27F	Any glass serological pipets will suffice.
1 mL glass serological pipets (sterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-678-27C	Any glass serological pipets will suffice.
P10 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-3810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P200 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-8810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P300 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-9810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
Syringe tips for repeating pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F164150G	Only required if a repeating pipettor is used.
Sterile petri dishes	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FB0875712	Any sterile petri dishes will suffice.
Parafilm	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	S37440
Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast
Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g., W303a)	American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)	MYA-151	Recombinant yeast are also available upon request from the authors.
Receptor/reporter plasmid for ERα	Addgene (www.addgene.org)	pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061)
Receptor/reporter plasmid for ERβ	Addgene (www.addgene.org)	pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Difco agar	BD (www.bd.com)	214530
Dithiothreitol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	D0632	CAUTION:  Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.  Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	N1127
Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	10884308001
Yeast nitrogen base	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	Y0626
Glucose	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	G8270
Galactose	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	G5388
Adenine sulfate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	A9126
Uracil	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	U0750
Leucine	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	L8000
Histidine	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	H8000
17 β-Estradiol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)                     MP Biomedicals	E8875-250 mg     0219456401 - 1 mg	CAUTION:  Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.  It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.  Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.  Estradiol is very toxic to aquatic life.  Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.  Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.
100% ethanol	Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)	111000200
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S9638
Sodium phosphate dibasic (anhydrous)	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S0876
Magnesium chloride	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	M8266
Potassium chloride	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	P9333
Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt)	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	L5125
Sodium carbonate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S7795
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Excel spreadsheet software	Microsoft		Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.
Java software (required for Appendix 1 application)	Oracle Corporation		To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.  LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards.
JMP statistical software version 13.0.0	SAS Institute		Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.  The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.
R statistical computing and graphics software	R Foundation		Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.  Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.