Oppdage Estrogenic ligander i personlig pleie-produkter bruker en gjær østrogen skjermen optimert for undervisning undervisning laboratoriet

Summary

Denne artikkelen presenterer en optimalisert gjær østrogen skjermen for kvantifisere ligander i personlig pleieprodukter (PCPs) som binder østrogen reseptorer alpha (ERα) og/eller beta (ERβ). Metoden inneholder to kolorimetrisk substrat alternativer, en seks dagers nedkjølt inkubasjonstiden for bruk i undervisning kurs og statistiske verktøy for dataanalyse.

Abstract

Gjær østrogen skjermen (Ja) brukes til å oppdage estrogenic ligander i miljøprøver og har vært grovt brukt i studier av endokrine forstyrrelser. Estrogenic ligander inkluderer både naturlige og menneskeskapte "miljømessige østrogener" (EØS) funnet i mange konsumvarer inkludert personlig pleieprodukter (PCPs), plast, plantevernmidler og mat. EØS forstyrre hormon signalering i mennesker og andre dyr, potensielt redusere fruktbarhet og økt risiko for sykdom. Til tross for betydningen av EØS og andre endokrine forstyrre kjemikalier (EDCs) for folkehelsen, er hormonforstyrrende ikke vanligvis inkludert i undergraduate læreplaner. Dette brist er delvis på grunn av mangel på relevante laboratorie aktiviteter som illustrerer prinsippene involvert samtidig være tilgjengelig for studenter. Denne artikkelen presenterer en optimalisert Ja for kvantifisere ligander i personlig pleieprodukter som binder østrogen reseptorer alpha (ERα) og/eller beta (ERβ). Metoden opptar en av de to kolorimetrisk underlag (Orto- nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) eller chlorophenol rød-β-D-galactopyranoside (CPRG)) som er kløyvde av β-galactosidase, en 6-dagers nedkjølt inkubasjon skritt lette bruk undergraduate laboratorium kurs, et automatisert program for LacZ beregninger og R koden for den tilknyttede 4-parameteren logistisk regresjonsanalysen. Protokollen er utviklet for å tillate studentene å utvikle og gjennomføre eksperimenter der de skjermen produkter av deres valg for østrogen imiterer. I prosessen lærer de om hormonforstyrrende, cellekultur, reseptor bindende, enzym aktivitet, genetisk engineering, statistikk og eksperimentell design. Samtidig, de også praksis grunnleggende og bredt aktuelt laboratorium ferdigheter, som: beregne konsentrasjoner; gjør løsninger; demonstrere steril teknikk; å fortynne serier standarder; konstruere og interpolere standard kurver; identifisere variabler og kontroller. samle, ordne og analysere data. konstruere og tolke grafer; og bruker vanlige laboratorieutstyr som micropipettors og Spektrofotometrene. Dermed oppfordrer implementere denne analysen studenter å engasjere seg i inquiry-basert læring mens å utforske aktuelle problemstillinger i miljølære og helse.

Introduction

Gjær østrogen skjermen (Ja) er mye brukt å kvantifisere ligander som etterligner østradiol (E2 eller 17β-østradiol) i en rekke matriser, inkludert vann, plante vev, forbrukerprodukter og mat^{1,2,3, 4}. Kollektivt, kalles slik ligander "Miljømessige østrogener (EØS)." Ja ble opprinnelig utviklet som en lav kostnad, i vitro alternativ til i vivo tester som gnager uterotrophic analysen^5,6 og regnbueørret fôring analysen⁷. Målet med disse testene er å avgjøre om et produkt inneholder kjemikalier som stimulerer eller blokkerer østrogen-avhengige mekanismer. Påvisning av EØS er viktig, fordi de kan forstyrre normal endogene østrogen signalnettverk, spesielt under fosterets utvikling. Denne innblandingen kompromisser helse ved å øke risikoen for overvekt, ufruktbarhet, kreft og kognitive tap⁸.

Til tross for betydningen av EØS og andre EDCs for folkehelsen, er hormonforstyrrende ikke vanligvis inkludert i undergraduate læreplaner. Denne mangelen er delvis på grunn av en mangel på aktiviteter som illustrerer prinsippene involvert samtidig være tilgjengelig for studenter. I tillegg flere varianter av Ja-protokollen finnes^{9,10,11,12,13}, og dette mangfoldet gjør analysen optimalisering tidkrevende for laboratoriet koordinatorer ikke spesielt opplært i relevante teknikker. Til slutt, ja analyser er vanligvis gjennomført over 1 lang dag eller 2 dager med en O/N inkubasjon. Denne tidsangivelsen er ikke kompatibel med formatet for undergraduate laboratorium kursene, som vanligvis møtes en gang / uke for flere h.

Svar på disse behovene rapporterer dette manuskriptet en optimalisert 96-Vel ja protokoll som inkluderer ethanolic utvinning metoder for personlig pleieprodukter (PCPs)³ og et 6-dagers kjøling skritt å imøtekomme ukentlige laboratorium møter. Absolutt etanol er et allsidig organisk løsemiddel som kan oppløse en rekke polar og forbindelser solutes. Videre er det egnet for undergraduate kurs fordi det er lett tilgjengelig, relativt nontoxic, rimelig og blandbar med vann. det fordamper også lett uten spesialutstyr. Men etanol er ikke ideelt for å trekke ut sterkt hydrofobe endokrine disruptors eller mange olje og voks, de to sistnevnte er vanlige ingredienser i PCPs. dårlig utvinning effektivitet øker risikoen for falsk negativt funn. Med denne betingelsen i tankene bør etterforskere velge utvinning prosedyrer (f.eks, ethanolic utvinning eller solid fase utvinning) som eksempel kjennetegn og møte studie mål (forskning versus undervisning undervisning).

Ja, er avhengig av rekombinant Saccharomyces cerevisiae opprinnelig opprettet av Dr. Charles Miller ved Tulane University. Se Miller et al. (2010) for kart fullstendig konstruert plasmider¹⁴. Gjær forvandlet disse plasmider constitutively uttrykke menneskelige kjernefysiske ERα eller ERβ (også kalt ESR1 og ESR2, henholdsvis) når dyrket i media som inneholder galaktose (for ERα) eller glukose eller galaktose (for ERβ). Hvis estrogenic kjemikalier finnes i media, binder de på reseptorene, opprette ligand-reseptor komplekser som aktiverer β-galactosidase (lacZ) uttrykk på et nivå som er proporsjonal med konsentrasjonen av estrogenic kjemikalier. Gjærceller er så lysed for å løslate den akkumulerte β-galactosidase. Lyseringsbuffer inneholder ONPG eller CPRG, som er kløyvde av β-galactosidase til gul eller rød produkter, henholdsvis. Kolorimetrisk produkter kan kvantifiseres ved å måle absorbansen ved hjelp av en microwell plate spektrofotometeret. Graden av fargeendring er proporsjonal med konsentrasjonen av estrogenic ligander som gjær ble utsatt.

Valget av substrat (CPRG eller ONPG) avhenger av potensialet for bakgrunnen absorbansen fremkommer fra prøvene testet. For eksempel planteekstrakter legges ofte en gul fargetone til media som utløses kunstig estrogenicity tiltak hvis ONPG (kvantifisert ved 405 nm) brukes som underlaget for β-galactosidase. Med plante ekstrakter, CPRG (kvantifisert på 574 nm) kan være et mer passende kolorimetrisk substrat. CPRG er dyrere enn ONPG, men brukes på en tiendedel av molarity. Denne artikkelen presenterer estrogenicities av PCP ekstrakter kvantifisert med både ONPG og CPRG.

Kvantifisere estrogenicity av miljøprøver med både ERα og ERβ er en mer helhetlig tilnærming enn å bruke bare én av disse reseptorene. I dyr viser disse reseptorene differensial vev distribusjon, regulatoriske aktiviteter og bindende slektskap for estrogenic og anti-estrogenic ligander¹⁵. For eksempel bind plantebaserte fytoøstrogener vanligvis ERβ mer sterkt²mens syntetiske kjemikalier kan vise preferanse for enten ERα eller ERβ eller kan binde både reseptorer like godt¹⁵. Derfor binding til en østrogenreseptor ikke nødvendigvis forutsi binding til den andre.

Selv om EØS finnes i mange forbrukerprodukter (f.eks, plantevernmidler, vaskemidler, lim, smøremidler, plast, mat og legemidler) og planter, presenteres dataene ble hentet ved hjelp av et utvalg av PCPs. PCPs er overbevisende, lett tilgjengelig rimelig og miljømessig relevant for studenter. Studenter kan bli invitert til å bringe deres favoritt PCPs hjemmefra å teste i laboratoriet. De kan også søke huden dyp databasen utviklet av Environmental Working Group¹⁶ for å generere hypotese-drevet sammenligninger av PCPs med høy og lav toksisitet score. På denne måten kan studenter samtidig utvikle avanserte laboratorium ferdigheter; delta i selvstyrt, inquiry-basert læring; og utforske aktuelle problemstillinger i miljølære og helse.

Protocol

1. gjør reagenser

1. Forberede glukose og galaktose medier ved å blande 6,7 g gjær nitrogen base, 20 g druesukker eller galaktose, 20 mg adenine sulfate (lagt som 10 mL av en 200 mg/100 mL lager vannoppløsning), 20 mg uracil (lagt som 10 mL av en 200 mg/100 mL lager vannoppløsning) , 60 mg leucine (lagt som 6 mL av en 1 g/100 mL lager vannoppløsning) og 20 mg histidin (lagt som 2 mL av en 1 g/100 mL lager vannoppløsning) i deionisert vann til et endelig antall 1 L. Sterilize ved filtrering (0,2 µm filter). Media kan lagres på 4 ° C i flere uker.
2. Forberede østradiol (E2) standarder av oppløsning pulverisert E2 vannfri etanol og fortynne til de aktuelle arbeider konsentrasjonene (227.5 nM & 9,75 nM) i 50% etanol.
   Merk: Hvis østradiol er kjøpt som ampuller med 1 mg, legge til 1 mL etanol direkte ampullen å oppløse østradiol pulver. Dette gir en 3,67 mM lager #1.  Fortynne 10 μL lager #1 i 990 μL etanol å 1 mL av 36.71 μM lager #2.  Deretter fortynne 10 μL lager #2 i 990 μL 50% etanol å 1 mL av 367.13 nM lager #3.  For å gjøre arbeidet aksjer, fortynne 619.7 μL lager #3 i 380.3 μL 50% etanol å 1 mL av 227.5 nM arbeider lager brukes til å opprette standard kurver med gjær uttrykke ERα.  Fortynn 26.56 μL lager #3 i 973.44 μL 50% etanol å 1 mL av 9.75 nM arbeider lager brukes til å opprette standard kurver med gjær uttrykke ERβ. Forsegle standarder med parafilm og butikk på -20 eller-70 ° C.
   FORSIKTIG: E2 er mistenkt kreftfremkallende og reproduktiv toxicant. Det er skadelig ved innånding, svelges eller absorberes gjennom huden. E2 kan skade til amming barn og fostre. E2 er svært giftig for vannlevende organismer. Bruke riktig personlig verneutstyr (hansker, avtrekksvifte, støvmaske) og unngå eksponering under graviditet og amming. Kast E2 som spesialavfall og ikke slipp i miljøet.
3. Forberede LacZ buffer ved å blande 8.52 g Na₂HPO₄, 5.52 g NaH₂PO₄•H₂O, 95.21 mg MgCl₂, 745.5 mg KCl, 2 g N-lauroylsarcosine natrium salt, og ONPG (400 mg) eller CPRG (77.7 mg) i deionisert vann til en endelig volumet av 1 L. butikken LacZ buffer i 20 mL dele på 20 ° C.
   Merk: En 20 mL aliquot er tilstrekkelig for en 96-brønns plate.
4. Forberede natriumkarbonat ved å blande 105.9 g natriumkarbonat i deionisert vann til et endelig antall 1 L. butikken på RT.
5. Forberede 1 M dithiothreitol (DTT) i vann. Fryse 25 µL dele DTT på 20 ° C.
   FORSIKTIG: DTT er en akutt hud og øyne irriterende. Bruke riktig personlig verneutstyr (hansker, avtrekksvifte, støvmaske) for å unngå hud og øyekontakt, innånding og svelging.
   Merk: Hver aliquot er tilstrekkelig for en 96-brønns plate.

2. forbereder prøver og utvinning kontroller

1. Velg å teste.
   Merk: Denne artikkelen presenterer data for femten PCPs, inkludert såpe, hår krem, sjampo, solkrem, leppepomade, foundation, barberskum, neglelakk og lotion.
2. Kombiner 1 g utvalg med 10 mL av vannfri etanol i et 15 mL konisk rør. Forberede en negativ utvinning kontroll bestående av 11 mL av etanol i et 15 mL konisk rør. Forberede gjentak etter behov.
   Merk: For presentert eksperimentell design, tre dele alle 15 PCPs og tre eksemplarer utvinning fjernkontrolløsninger ble utarbeidet, gir totalt 48 prøver, hver ble analysert i tre eksemplarer bruker protokollen i delen 4. En enkelt plate rommer opptil 23 prøver triplicates. Vannfri etanol brukes i dette trinnet fordi det fordamper lett. Bruk negative utvinning Kontroller at østrogen ikke er leaching inn prøver fra konisk rørene.
3. Homogenize innhold for 30 min ved en kombinasjon av manuell risting og vortexing eller rister rør på en flere rør vortexer.
4. Sentrifuge konisk rør maksimalt tillatte hastighet i en bøtte centrifuge for 10 min. Decant nedbryting fra hver rør gjennom en 40 µm celle sil i et 50 mL konisk rør. Tom innholdet i hver 50 mL tube i et hetteglass for scintillation.
5. La ampuller åpne i ventilert hette for en uke å tillate etanol fordampe helt. Alternativt, tørke prøver ventilert hette under nitrogen eller med en roterende fordamperen. For å unngå nedbrytning av lys følsom bestanddeler, beskytte tørking prøver fra lys (f.ekssted ugjennomsiktig stoff over ventilert hette døren).
6. Rekonstituer prøver 1,0 mL av 50% etanol og vortex til homogenize.

3. dyrking og Subculturing gjær¹⁴

1. Vedlikeholde aktiv gjær kulturer (rekombinant W303a belastning S. cerevisiae¹⁴) ved rugende gjær i filter-steriliseres glukose medier på 30 ° C. Subkultur gjær ukentlig i frisk filter-steriliseres glukose medier.
2. To netter (ca 42 h) før forberede Ja platene, subkultur gjær ved å legge til 0,1 mL av aktiv gjær kulturer 10 mL av filter-steriliseres glukose media bruker steril teknikk.  Ruge på 30 ° C i to netter.  Risting er ikke nødvendig hvis gjær er dyrket som grunne kulturer i sterilt 250 mL Erlenmeyer flasker.
   Merk: Gjær kan også lagres på nedkjølt agar plater i flere måneder. For lengre sikt lagring (år), kombinere O/N kulturer med 15-50% sterilt glyserol, vortex og Frys på-70 ° C. For å forberede sterilt glyserol, bruk en sprøyte overføre 300 µL glyserol i en cryovial og autoklav med cap løsnet. Deretter Legg 1200 µL O/N gjær kultur bruker steril teknikk.

4. forberede Ja plater (dag 1 av analysen)

1. I et sterilt beaker og bruker steril teknikk, fortynne gjær fra trinn 3.2 en optisk tetthet av 0.065 ±0.005 på 610 nm (OD₆₁₀) i filter-steriliseres galaktose medier.
   1. Bekreft optisk densitet ved pipettering 120 μL av hver gjær prøve i tre eksemplarer sammen med tre eksemplarer galaktose tomme i en klar polystyren plate (plate trenger ikke å være sterilt).  Bruke en plate spektrofotometer kontrollere at utvannet gjær kulturen har en netto OD₆₁₀ 0.065 ±0.005 trekke OD610 opplesning av galaktose tomromene fra gjær OD₆₁₀ opplesninger å bestemme netto OD₆₁₀ av gjær. Forberede en endelig mengde minst 30 mL utvannet gjær hver 96-brønns plate.
      Merk: Spektrofotometer filtre måle absorbansen mellom 595 og 610 nm kan brukes for dette målet.

En omtrentlig 1:6 v: v forholdet mellom gjær: media vanligvis gir et OD₆₁₀ nær 0.065, så starter ved å legge 4,5 mL gjær til 30 mL media og legge mer gjær eller media som hensiktsmessige for å oppnå en netOD₆₁₀ mellom 0.060 og 0.070.

Bruke steril teknikk, legge til denne utvannet gjær suspensjon brønner i et sterilt, polypropylen, 96-brønnen microplate i henhold til oppsettet plate (figur 1). Under pipettering, holde kilden gjær suspendert av kontinuerlig virvlende beholderen eller blande med pipette. For dette trinnet er det nyttig å bruke en gjentatt hindre med sterile sprøyter tips.
Merk: Polypropylen plater er steriliseres med autoklavering to stablet plater innpakket i folie.  Den øverste platen fungerer som et lokk for eksempel plate kan være vasket, re-autoklaveres og gjenbrukt.

Legge til 120 µL filter-steriliseres galaktose media 3 flere brønner (H10 - 12) i henhold til oppsettet plate (figur 1). Disse brønnene tjene som media kontrollene til kontoen absorbansen bidratt av media alene.

Konstruere en standardkurve i hver tallerken ved å fortynne serier triplicates E2 arbeider standarder (227.5 nM for ERα, 9,75 nM for ERβ) i brønner med gjær suspensjon (A1 - G3) i henhold til oppsettet plate (figur 1).  Begynn med ved å legge til 5 µL av E2 brønner A1 gjennom A3. Bland microwell innholdet av pipettering, og deretter serielt fortynne denne suspensjon ved å flytte 205 µL fra brønner A1 - 3 i brønner B1 - 3. Gjenta miksing og overføring av 205 µL gjennom G.
Merk: Etter føljetong fortynning er fullført, forkaste 205 μL fra brønner G1 - 3. På slutten av dette trinnet, skal alle standard brønner inneholde 120 μL. Seriell fortynning vil gi de endelige E2 konsentrasjonene i tabell 1. Seriell fortynning trinnene er det nyttig å bruke analyser sterilt tips.

Legge til 5 µL av kjøretøy (50% etanol) kjøretøy kontroll brønner med gjær suspensjon (H1 - 3) i henhold til oppsettet plate (figur 1).
Merk: Kjøretøy kontroll brønner brukes å kvantifisere bakgrunn absorbansen forbundet med gjærceller og media. Cytotoksisitet eller veksten fremme effekter av test prøver kan oppdages ved å sammenligne OD₆₁₀ verdiene for test brønner med de kjøretøy kontroll brønner.

Legge til 5 µL triplicates av prøver og negative utvinning kontroller brønner med gjær suspensjon etter oppsettet plate (figur 1).
Merk: Noter som eksempler eller negativ utvinning kontroller legges i hver brønn.  Å holde oversikt over hvilke brønner har eksempler og som ikke starter med en frisk tips og bruk tips fra de samme stedene i boksen som plasseringen av tilsvarende brønnene i platen. En 96-brønns plate rommer opptil 23 prøver tre eksemplarer.

Bland innholdet av utvalg, utvinning kontroll og kjøretøy kontroll brønner ved pipettering. Juster volumer med disse brønnene til 120 µL ved å fjerne 205 µL fra hver som beskrevet i forklaringen for figur 1.

Forsegle plate(s) med en steril, lim, porøse film. Etiketten plater og Inkuber 17 h på 30 ° C. Tallerkenen trenger ikke rokkes under inkubasjonen

5. behandling Ja plater (dag 2 av analysen)

1. Etter den 17 h inkubering på 30 ° C, fjerne plater fra inkubator. Hvis platene bli behandlet umiddelbart, fortsetter du til trinn 5.1.1. Hvis platene skal behandles senere, går du til trinn 5.1.2.
   1. Bruk analyser for å blande innholdet i hver rad av brønner, og deretter overføre 50 µL av gjær suspensjon fra hver brønn til tilsvarende godt av en klar, polystyren, 96-brønnen microplate.
      Merk: Polystyren plater trenger ikke å bli sterile, men bør ha et lokk. Bruke nye Pipetter tips for hver rad brønner for å unngå kryss-forurensende brønner, men hvis pipettering over triplicates med en 8-tip flerkanals pipette, tips bare trenger å skiftes mellom tre eksemplarer setter.
      1. Merke den nye platen. Fortsett med trinn 5.2.
   2. For å lagre plater før behandling, pakk dem i plastfolie. Kjøle innpakket plater på 4 ° C for 6 d. etterpå fjerne platene fra kjøleskap, pakk dem og overføre innholdet i alle brønnene ved pipettering som i trinn 5.1.1. Fortsett med trinn 5.2.
2. Legge til 20 µL av 1 M DTT 20 mL tinte, romtemperatur LacZ buffer for en siste konsentrasjon av 1 mM DTT. Blanding LacZ buffer godt. Hvis bruker en flerkanals pipette, dispensere til en reagens reservoaret.
   FORSIKTIG: Bruk hansker og arbeide med DTT i hette, hvis mulig
3. Ved hjelp av enten en flerkanals pipette eller gjentatt hindre legge 200 µL LacZ bufferen som inneholder DTT og ONPG eller CPRG alle brønner av polystyren plate, og umiddelbart måle og registrere OD₆₁₀ alle brønner med en plate spektrofotometeret. Gjenta etter behov for flere plater.
   Merk: OD₆₁₀ målingene brukes i nevneren i LacZ beregningen (trinn 6.1). Derfor få målingene umiddelbart etter pipettering og før celler bosette eller er lysed av LacZ buffer. Hvis OD₆₁₀ verdier for eksempel brønner er betydelig høyere eller lavere enn OD₆₁₀ verdier for kjøretøy kontroll brønner, er prøve ekstrakter vekst-fremme eller cytotoksiske til gjær, henholdsvis. LacZ beregning vil rette små forskjeller i cellen tettheter over brønner, men hvis forskjeller overstige 30% i begge retninger, deretter fortynne rekonstituert prøven (fra trinn 2.6) i ytterligere 50% etanol og retest prøven ved å gå tilbake til trinn 3.2 ¹².
4. Adskilte dekkplater med lokk. Inkuber plater som inneholder gjær som uttrykkelig ERα¹⁴ på 30 ° C i 40 minutter (for ONPG) eller 3t (for CPRG). Inkuber plater som inneholder gjær som uttrykkelig ERβ¹⁴ på 30 ° C i 70 min (for ONPG) eller 4 h (for CPRG).
   Merk: Når du arbeider med CPRG, inkubasjon times er fleksibelt. rugende for 2-4 h gir egnet resultater med både reseptorer, med lengre incubations øke analysen følsomhet.
5. Etter rugende plater, kan du bruke en flerkanals pipette eller gjentatt hindre til 100 µL av natriumkarbonat i hver brønn. Natriumkarbonat hever pH og stopper β-galactosidase reaksjonen.
6. Mål og Registrer OD₄₀₅ (for ONPG) eller OD₅₇₄ (for CPRG) av alle med en plate spektrofotometeret.

6.Beregne LacZ verdier

Merk: LacZ verdier kvantifisere endringsgraden farge for hver prøve og gir en normalisert metode for å sammenligne verdier for forskjellige analyser av regnskap for flere variabler (f.eks, gjær optisk densitet, media optisk tetthet og inkubasjon tid hvis Dette varierer blant brønner på samme plate)¹².

1. Beregne betyr tre eksemplarer OD₆₁₀ verdier for media (galaktose) kontroll brønner (H10-12), og beregne betyr tre eksemplarer OD₄₀₅ eller OD₅₇₄ verdier for kjøretøy (50% etanol) kontroller (H1-3). Bruk disse og inkubasjon tid (t) i timer for platen endre farge (trinn 5.5) for å beregne LacZ verdier (tilsvarende graden av endring i hver brønn) for alle standard og prøve brønn ved hjelp av følgende formler:
   
   
   1. Alternativt bruke automatiserte programmet i vedlegg 1 til å beregne LacZ verdier for standarder og eksempler.
      Merk: Oppsettet plate med programmet må være identiske på plate oppsettet i figur 1. Hvis enkelte eksempel brønner ikke ble brukt, beholde absorbansen målinger fra Tom brønnene som plassholdere i absorbansen datasettet limes inn i vedlegg 1 LacZ.  Dette bevarer romlige oppsettet av platen i programmet og sikrer at media kontroll brønner i deres påkrevd lokasjon.  I tillegg vil programmet ikke kjøre hvis det finnes tomme celler.
2. Beregne betyr tre eksemplarer LacZ verdier for hver E2 standard og hvert utvalg. Rapportere mener LacZ verdier som µL^-1h^-1. Logg-transform konsentrasjonen av hver E2 standard, og generere et regnearkdokument formatert som filen template.csv (vedlegg 2).

7. interpolere eksempel Estradiol ekvivalenter (EEQs) bruker 4-parameteren logistisk regresjon

Merk: EEQs gjelder LacZ eksempelverdier (farge endre) LacZ verdiene av standardkurve opprettet med E2. EEQs dermed finne ut hvor mye utvalg er nødvendig å framprovosere samme farge endre svaret som en kjent konsentrasjon av E2.

1. For å beregne EEQs for testprøvene, først tegne standardkurven. Passer mener LacZ verdier for E2 standarder (y-aksen) og tilsvarende Logg-forvandlet E2 konsentrasjonen (x-aksen) til en fire-parameteren logistisk regresjonsmodell.
2. Bruke modell til interpolere EEQs for test eksempelverdier LacZ. Gjennomføre logistisk regresjon beregninger av EEQs med statistisk programvare som beskrevet i vedlegg 2.

8. standardisere EEQs (ng/mL) til PCP eksempel masse

1. EEQs gjelder mengden PCP eksempel lagt til hver godt i trinn 4.5, multiplisere EEQ (ng/mL) med det totale volumet belagt i prøven brønner (325 µL) og deler av volumet av utdraget eksempel lagt i hver brønn (5 µL).
   Merk: Disse verdiene representerer EEQ per mL av utdraget prøve. Hvis prøver ble tilberedt med 1 g PCP, representerer disse verdiene også EEQ per gram PCP (ng/g). Uttrykt på denne måten, kan EEQ verdiene (ng/g) sammenlignes på tvers av forskjellige PCPs. EEQ (ng/g) verdier for personlig pleie-produkter som er testet i denne studien er vist i tabell 2og eksempeldata samlet gjennom hele protokollen er inkludert i Vedlegg 3.

Representative Results

Estrogenicities av tre eksemplarer prøver av 15 PCPs ble vurdert bruker denne Ja-protokollen. Som det fremgår av Miller et al. (2010), var analyser med gjær uttrykke ERβ mer enn en størrelsesorden mer følsom enn analyser med gjær uttrykke ERα (figur 2)¹⁴. Derfor fant oftere estrogenic aktivitet med ERβ-uttrykke gjær (tabell 2). Åtte PCPs viste estrogenic aktivitet med ERβ og 5 PCPs utstilt estrogenic aktivitet med ERα. Hår krem, solkrem, lotion og lip balm prøvene var estrogenic med både reseptorer, mens foundation, barberkrem og neglelakk var bare estrogenic med ERβ på de testede konsentrasjonene. Sju andre PCPs (4 sjampo, 2 såper og 1 leppepomade) var ikke estrogenic med enten reseptoren i de testet konsentrasjonene.

I tillegg til reseptoren følsomhet forskjeller forskjellig EEQs for hver prøve avhengig av kolorimetrisk underlaget (ONPG eller CPRG) brukt i analysen (tabell 2). I alle unntatt ett utvalg var EEQs bestemmes ved hjelp av ONPG høyere enn bestemmes ved hjelp av CPRG. Videre er variant blant utvinning gjentak var lavest for EEQs målt med ERβ og CPRG og høyest for EEQs bestemt med ERα og ONPG (tabell 2).

I tillegg til sammenlignende kolorimetrisk underlag, var 1 målet med denne studien å teste inkubasjon varigheten ganger som er kompatible med tidsplanen for en lavere laboratorium kurs. Typisk Ja analysen krever en 17 h inkubasjon fulgte umiddelbart etter inkubasjon LacZ buffer for 40 min - 4 h, en tidsplan som er umulig å gjennomføre i et undervisning laboratorium begrenset av en ukentlig økt. For å lette bruken av denne analysen i undervisning, ble analysen endret ved å innføre en 6 d kjøling periode (trinn 5.1.2) etter 17 h inkubasjon. Standard kurver fra kjøleskap platene var sammenlignes med de fra ikke-kjøling plater (tall 2 & 3), bortsett fra at den vanlige feilene parametere anslått bruker fire-parameteren logistisk regresjon modeller var alle mindre for nedkjølt plater enn nonrefrigerated plater (tabell 3). Dermed kjøle plater for 6 d reduserer feil og forbedrer nøyaktigheten til EEQ estimater.

Figur 1. Microwell Plate Layout og Standard fortynning kurven forberedelse til Ja analysen. E2 standarder (lys grå wells), prøver og negative utvinning kontroller (hvit wells), og bilen (H1 - 3) og galaktose media (H10 - 12) kontroller (mørk grå wells) ble testet i tre eksemplarer. En E2 standardkurve (lys grå wells) ble konstruert av plating 320 µL av gjær i brønner A1 gjennom A3 og 120 µL av gjær i brønner B1 til G3. Deretter 5 µL av E2 (227.5 nM for gjær som uttrykker ERα; 9,75 nM for gjær som uttrykker ERβ) ble lagt til gjær i brønner A1 gjennom A3. Den gjær + E2 suspensjon var serielt utvannet ved å overføre 205 µL fra hver brønn brønn under den, gir de endelige E2 konsentrasjonene i tabell 1. Merk at på slutten av føljetong fortynning, må 205 µL forkastes fra brønner G1 gjennom G3 å oppnå et endelig antall 120 µL i hver brønn. Prøve og negative utvinning kontroll brønner ble utarbeidet ved å legge til 5 µL av hver ekstrakt (oppløst i 50% etanol) til 320 µL av gjær. Kjøretøy kontroll brønner (H1 - 3) ble utarbeidet ved å legge til 5 µL av 50% etanol 320 µL av gjær. Alle prøve og kontroll brønner ble mikset av pipettering, og 205 µL ble fjernet og forkastet for å justere godt volumer til 120 µL hver. Til slutt, media kontrollene ble utarbeidet av plating 120 µL av galaktose media i brønner H10 - 12.  Hvis du vil bruke LacZ kalkulatoren i vedlegg 1 og R-baserte programmet beskrevet i vedlegg 2til E2 må standardkurve og kjøretøy og galaktose media kontrollene være belagt som vises.  Prøver og negative utvinning kontroller kan være belagt i noen av hvite som rekkefølgen på plating er kjent.  Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Standard kurver for Ja platene generert via 4-parameteren logistisk regresjon. To underlag (ONPG & CPRG) ble testet med gjær uttrykke en av to menneskelige østrogen-reseptorer (ERα eller ERβ) begge uten (A) og (B) en 6 d kjøling punktum etter 17 h inkubasjon med 17β-østradiol og prøve ekstrakter. Alle E2 standarder og media og bilen ble testet i tre eksemplarer. Poeng representerer betyr tre eksemplarer LacZ verdier, hvor LacZ gjenspeiler graden av endring av β-galactosidase. Logistisk regresjon modell parametere er oppført i tabell 3. ONPG = Orto- nitrophenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG = chlorophenol rød-β-D-galactopyranoside. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Eksempler på utviklet Ja plater. To underlag (ONPG & CPRG) ble testet med gjær uttrykke menneskelige østrogen-reseptorer (ERα eller ERβ), enten uten (venstre) eller med (høyre) en seks dagers kjøling perioden etter den 17 h inkubering med 17β-østradiol eller prøve ekstrakter. Alle E2 standarder, media og bilen kontroller ble testet i triplicates. Platene ble arrangert med høyest E2 konsentrasjon i den øverste raden i hver plate og kontroller (50% etanol + gjær på venstre og galaktose media til høyre) i den nederste raden av hver plate ifølge figur 1. ONPG = Orto- nitrophenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG = chlorophenol rød-β-D-galactopyranoside.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Standardantallet	[E2] for ERα gjær (pM)	[E2] for ERβ gjær (pM)
1	3500	150
2	2208	94.6
3	1393	59.7
4	878	37.6
5	554	23,7
6	349	15
7	220	9,45

Tabell 1. Siste konsentrasjoner av E2 standarder som brukes i Ja.
Pulverisert E2 ble oppløst i vannfri etanol og deretter fortynnet arbeider lager konsentrasjoner av 227.5 nM (for gjær som uttrykker ERα) og 9,75 nM (for gjær som uttrykker ERβ) i 50% etanol.Arbeider aksjer ble deretter lagt microplate brønner med gjær i galaktose media og serielt utvannet til konsentrasjoner vises i tabellen.

Prøvene testet		Analysen forhold		Estrogenic ekvivalenter (EEQs) av PCPs
PCP #	Eksempel Type	Reseptor	Substrat	EEQ 1 (ng/g)	EEQ 2 (ng/g)	EEQ 3 (ng/g)	Mener EEQ (ng/g)
1	Hår fløte	ERΑ	ONPG	ND	0.379	ND	< 0.379
1	Hår fløte	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
1	Hår fløte	ERΒ	ONPG	0.528	0.338	0.363	0.410
1	Hår fløte	ERΒ	CPRG	ND	0.215	ND	< 0.215
4	Solkrem	ERΑ	ONPG	6.803	1.390	ND	< 4.097
4	Solkrem	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
4	Solkrem	ERΒ	ONPG	1.321	0.838	0.818	0.992
4	Solkrem	ERΒ	CPRG	0.651	0.591	0.725	0.656
7	Stiftelsen	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
7	Stiftelsen	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
7	Stiftelsen	ERΒ	ONPG	ND	0.158	ND	< 0.158
7	Stiftelsen	ERΒ	CPRG	ND	ND	ND	ND
9	Barbering krem	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
9	Barbering krem	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
9	Barbering krem	ERΒ	ONPG	ND	0.256	0.295	< 0.276
9	Barbering krem	ERΒ	CPRG	0.507	0.392	0.560	0.486
10	Neglelakk	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
10	Neglelakk	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
10	Neglelakk	ERΒ	ONPG	0.916	0.503	0.554	0.658
10	Neglelakk	ERΒ	CPRG	0.532	0.628	0.594	0.585
11	Lotion	ERΑ	ONPG	ND	ND	2.327	< 2.327
11	Lotion	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
11	Lotion	ERΒ	ONPG	Overskrider området	2.599	1.845	> 2.222
11	Lotion	ERΒ	CPRG	--	1.986	1.236	1.611
13	Solkrem	ERΑ	ONPG	14.069	11.494	10.189	11.917
13	Solkrem	ERΑ	CPRG	4.773	5.790	5.850	5.471
13	Solkrem	ERΒ	ONPG	Overskrider området	2.580	Overskrider området	> 2.580
13	Solkrem	ERΒ	CPRG	0.292	0.240	ND	< 0.266
15	Leppepomade	ERΑ	ONPG	ND	ND	0.431	< 0.431
15	Leppepomade	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
15	Leppepomade	ERΒ	ONPG	1.202	1.060	0.887	1.050
15	Leppepomade	ERΒ	CPRG	0.820	0.871	0.851	0.847

Tabell 2. EEQs av PCPs med null EEQs. Tre dele 15 PCPs og tre utvinning kontrollene ble homogenisert i vannfri etanol, fordampet og rekonstituert i 50% etanol for totalt 48 prøver, hver ble analysert i tre eksemplarer bruker Ja analysen. Åtte PCPs hadde minst 1 null EEQ, mens 7 PCPs ikke ble funnet for å være estrogenic på testet konsentrasjonen. EEQ 1, EEQ 2 og EEQ 3 refererer til de tre dele hver PCP, hver testet i tre eksemplarer på en separat plate. Verdier for EEQ 1, EEQ 2 og EEQ 3 er av triplicates for hver aliquot. Gjær som brukes i analysen uttrykt 1 av 2 isoformene av menneskelig østrogen-reseptorer (ERα eller ERβ). To kolorimetrisk underlag, ONPG og CPRG, ble testet ved hjelp av ikke-kjøling protokollen. EEQs var fast bestemt på å bruke fire-parameteren logistiske regresjoner (med R² verdier ≥ 0.98) LacZ verdier i hver av 7 konsentrasjoner av E2. ND = under gjenkjenning grensen til analysen.--= tapte replikere.

Analysen forhold			Modell parametere
Reseptor	Substrat	Arrest på 4 ° C for 6 d	Modell R2	Vekstrate (LacZ enheter/ng/ml)	Vendepunkt (ng/mL)	Lavere asymptoten (LacZ enheter)	Øvre asymptoten (LacZ enheter)
ERΑ	ONPG	nei	> 0,99	8.548 ±1.633	-0.512 ±0.025	-1.623 ±4.408	128.11 ±6.31
ERΑ	ONPG	ja	> 0,99	7.618 ±0.758	-0.587 ±0.014	-8.378 ±2.223	99.53 ±2.528
ERΑ	CPRG	nei	> 0,99	8.256 ±2.182	-0.610 ±0.033	0.853 ±3.333	62.52 ±3.473
ERΑ	CPRG	ja	> 0,99	5.068 ±0.616	-0.523 ±0.022	-3.147 ±1.946	68.06 ±3.069
ERΒ	ONPG	nei	> 0,99	1.041 ±2.004	-0.898 ±4.410	-32.98 ±86.62	248.6 ±778.9
ERΒ	ONPG	ja	> 0,99	4.327 ±1.289	-1.736 ±0.087	4.654 ±3.087	66.37 ±10.75
ERΒ	CPRG	nei	= 0,99	5.673 ±1.764	-1.914 ±0.052	3.925 ±1.679	28.05 ±2.334
ERΒ	CPRG	ja	> 0,99	4.412 ±1.142	-1.894 ±0.051	2.052 ±1.303	22.64 ±2.047

Tabell 3. Modell parameterne for 4-parameteren logistiske regresjoner for Standard kurvene i figur 2. To underlag, ONPG og CPRG, ble testet med gjær uttrykke 1 av 2 menneskelige østrogen-reseptorer (ERα eller ERβ) både uten og med en seks dagers kjøling periode etter 17 h inkubasjon. Parameterne er rapportert som beregner ±standard feil.

Vedlegg 1. Programmet beregner LacZ verdier.  Programmet, først laste ned gratis Java-programvare (som nevnt i Tabellen for materiale). Deretter åpne programmet LacZ. Oppsettet plate med programmet må være identiske på plate oppsettet i figur 1. Hvis enkelte eksempel brønner ikke ble brukt, beholde absorbansen målinger fra Tom brønnene som plassholdere i absorbansen datasettet limes inn i LacZ.  Dette bevarer romlige oppsettet av platen i programmet og sikrer at media kontroll brønner i deres påkrevd lokasjon.  I tillegg vil programmet ikke kjøre hvis det finnes tomme celler. Lim inn OD₄₀₅ målinger (for ONPG) eller OD₅₇₄ målinger (for CPRG) av alle bruke tastaturkommandoer "kontroll (ctrl) + v" eller "kommando + v," avhengig av Datamaskinplattform brukes. Angi inkubasjonstiden i timer for analysen å produsere farge (fra trinn 5.4, for eksempel 0.66667 h for 40 min). Klikk Neste. Lim inn i OD₆₁₀ målinger fra trinn 5.3. Klikk Send. LacZ resultater vises, og kan kopieres ved å trykke "kontroll (ctrl) + c" eller "kommando + c," avhengig av datamaskinen plattformen brukes. Klikk her for å laste ned denne filen.

Vedlegg 2. Statistisk programvarealternativer for å beregne EEQs. EEQs kan beregnes ved hjelp av én av tre presentert alternativer.  Instruksjonene for bruk av 1. JMP programvare eller 2. R-kode finnes i vedlegg 2.  R koden har også byttet til 3. et program-format er tilgjengelig på https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tillegg 3. Prøve Data samlet inn av gjær som Express ERα og CPRG underlaget. Målinger av OD₆₁₀ og OD₅₇₄ for hver av syv E2 standarder, kjøretøy og media kontrollene, og et enkelt representativt PCP utvalg er inkludert, sammen med beregnede LacZ verdier. LacZ verdier av standarder som ble brukt til å konstruere en fire-parameteren logistisk regresjonsmodell av standardkurven som beskrevet i trinn 7A & B ovenfor. Modellen ble brukt til interpolere tre eksemplarer anslag over EEQs av det representativt utvalget i ng/mL i microplate brønnene. Disse verdiene ble deretter konvertert til EEQs uttrykt som ng/g av prøven (trinn 8.1). Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Ja er en rimelig metode som brukes til å oppdage estrogenic ligander i miljøprøver, som vann, mat, plante vev og personlig pleieprodukter. Dataene presenteres her sammenligne 2 østrogen-reseptorer (ERα og ERβ), 2 underlag (ONPG og CPRG) og 2 tidslinjer (2 d protokollen uten kjøling) og syv dagers protokollen med kjøling for å måle estrogenicity i personlig pleieprodukter via Ja analysen. 7 d, nedkjølt protokoll CPRG og gjær uttrykke ERα og/eller ERβ best kvantifiserer EEQs mens også kompatibel med tidspress pålagt av undervisning laboratorium kurs som oppfyller én gang / uke for flere h. Faktisk var sammenlignet med 2 d analysen uten kjøling, sju dagers nedkjølt analysen assosiert med redusert avvik over platen gjentak. I tillegg ble den lineære delen av standardkurve litt utvidet data samles inn med nedkjølt analysen. Den lineære delen av standardkurve definerer den analysen rekkevidden og er den eneste delen av som kan brukes til interpolere prøve EEQs.

I alle unntatt én av prøvene testet var EEQs målt ved hjelp av CPRG lavere enn kvantifisert med ONPG. Med en høyere utryddelse koeffisient og lavere K_m og V-_maxer CPRG ti ganger mer følsom enn ONPG¹⁷. Dermed CPRG kan brukes i lave konsentrasjoner, og kan brukes til å oppdage lavere mengder av β-galactosidase. For disse grunner er CPRG generelt foretrukket over ONPG^18,19. Imidlertid forklarer større substrat følsomhet ikke lavere EEQ verdier oppdaget med CPRG. Høyere EEQ verdiene oppdaget med ONPG kan skyldes matrix interferens med analysen, som bemerket av andre forfattere^2,18. Gul pigmenter fra personlig pleie produktet ekstrakter kan blåse EEQ verdier oppdaget med ONPG. Andre har omgås problemet ved å inkludere pigment kontroller i deres eksperimentell design², en tilnærming som dobler antall plater i et eksperiment. Når matrix forstyrrelser kan være problematisk, være CPRG en å foretrekke substrat for Ja analysen, selv om det er dyrere og krever lengre inkubasjon ganger enn ONPG. Videre er fargeendring indusert av spalting av substrat av β-galactosidase mer dramatisk med CPRG, gjør det enklere for studenter å visualisere resultatene.

Miller et al. (2010), som utviklet gjæren som brukes i denne protokollen, bemerket at gjær uttrykke ERβ var 30 x mer følsomme for 17β-østradiol enn gjær uttrykke ERα, et funn som underbygges av våre data¹⁴. Bortsett fra potensielle nyansene i plasmider konstruksjon, Miller et al. (2010) kunne ikke forklare denne forskjellen i følsomhet¹⁴. Én forskjell mellom de to plasmider konstruksjoner er at ERα uttrykk er regulert av galaktose, mens ERβ uttrykk er regulert av enten glukose eller galaktose. Gjær brukes i Ja analysen er kultivert i glukose media og bare gitt galaktose når de er utvannet i starten av analysen. Derfor kan gjær uttrykke ERβ samle høyere kopi antall reseptor proteiner før starten av analysen, og dermed overdragelse høyere følsomhet estrogenic ligander.

Lavere følsomheten til ERα-uttrykke gjær kan forklare høyere priser av ikke-deteksjon av estrogenicity i prøver målt med ERα sammenlignet med ERβ. For å øke sannsynligheten for vil at prøven EEQs bli oppdaget, brukere kan benytte forskjellige utvinning løsemidler og metoder eller legge til større mengder eksempel gjær. Hvis høyere eksempel volumer, bør konsentrasjonen av E2 standarder justeres slik at det samme volumet av standarder og prøver kan bli brukt i analysen. En begrensning å legge mer prøven er at gjær tåler bare 6-10% etanol, med bedre toleranse ved inkubasjon temperaturer på 30 vs 35 ° C²⁰. Bestemme for effekter av etanol på gjær, bør etterforskere legge til tre eksemplarer "gjær bare" brønner på den platen og bekrefte at OD₆₁₀ disse "gjær bare" brønner er sammenlignbare med OD₆₁₀ kjøretøy kontroll brønner umiddelbart etter tillegg av LacZ buffer. Prøver oppløst i etanol kan eventuelt legges til tørr microwell plater og etanol fordampet av før gjær er lagt. Dimethylsulfoxide (DMSO) brukes også som et eksempel løsemiddel i Ja søk, men den siste arbeider konsentrasjonen av DMSO med gjær bør være begrenset til 1%¹².

Ja analysen er et kraftig screening verktøyet for å oppdage estrogenicity i miljøprøver. Spesielt oppdager Ja ligander som binder kjernefysiske østrogen-reseptorer som samhandler med østrogen respons elementene til direkte gene expression¹⁴. Ja har imidlertid også viktige begrensninger. Ja oppdager ikke EØS som fungerer gjennom ikke-nukleære mekanismer som membran østrogen reseptorer eller mekanismer som involverer flere elementer som aktivator Protein 1 (AP-1) transkripsjonsfaktorer. Videre, fordi gjær ikke har samme metabolske kapasitet som pattedyrceller, ja kan ikke oppdage ligander som krever metabolske aktivere estrogenic.

I tillegg ikke kan Ja analysen lett skille mellom estrogenic og anti-estrogenic ligander i komplekse prøver. I stedet, den måler netto estrogenicity, som er en sum av estrogenic og anti-estrogenic ligander. Å kvantifisere konsentrasjonen av ER antagonister eller vurdere hemmende aktiviteten blandinger, kan analysen endres av rugende gjær med både den standard Agonistiske (17β-østradiol) og en rekke test prøve konsentrasjoner¹². Denne prosessen avgjør om antagonister i utvalgene kan minske agonist-indusert reporter aktivitet og gir en nyttig skjerm for å identifisere tilstedeværelsen av ER antagonister i prøvene.

Protokollen presenteres her rommer eksempel datatyper, selv om noen eksempler kan kreve endringer i forberedelsene utvinning og utvalg. For eksempel EEQs store variasjoner blant gjentak av noen personlig pleieprodukter. Mer variabel prøvene tendens til å inneholde olje dråper eller ellers var ikke helt homogen, indikerer at et mer lipofile løsemiddel som diethyl Eter ville være nyttig. Alternativt kan oljer og voks i personlig pleieprodukter ekskluderes ved å trekke ut prøver med 50% etanol i stedet for 100% etanol.En 50% etanol utvinning vil også ta flere vannløselige estrogenic ligander (f.eks, noen pigmenter). Men 50% etanol fordamper saktere enn 100% etanol, og dermed forlenge utvinning tid. I tillegg var eksempler (for eksempel såper) cytotoksiske til gjær, noe som resulterer i redusert celle tetthet målinger (OD₆₁₀). Fox et al. (2008) foreslår at slike eksempler bør fortynnet og testes om cellen tetthet forskjeller overstige 30% i forhold til kjøretøy kontroll brønner¹².

Hvis ja analysen brukes for analytisk forskningsformål, kan fortynning kurver av prøven bassenger testes for å avgjøre riktige mengder ekstrakt legges til gjær i trinn 4.5 preemptively. Alternativt ekstrakter kan testes samtidig på flere volumer (f.eks, 5 µL og 20 µL ekstrakt lagt til gjær i trinn 4.5) eller fortynninger som dekker størrelsesordener (f.eks0,2 µL, 2 µL og 20 µL). "Hensiktsmessig" mengder ekstrakt er de som identifiserer estrogenicity ved å sammenligne LacZ verdier langs den lineære delen av standardkurven. Optimalisering forhindrer problemer forårsaket ved å legge for mye eller for lite utvalg gjær, som cytotoksisitet, feilaktige negativer eller estrogenicity som overskrider standardkurven. Som nevnt ovenfor, bør volum av prøver og E2 standarder justeres når ulike mengder ligand brukes slik at gjær er utsatt for en konsistent volum og konsentrasjon av etanol eller andre kjøretøy over platen.

Til tross for potensialet for feilaktige negativer, har ja analysen blitt identifisert som en Tier 3 testverktøy for endokrine disruptors av Schug et al. (2013), som utviklet en omfattende lagdelt protokoll for endokrine forstyrrelser (TiPED)²¹. For undergraduate utdanning er analysen verdifulle for undervisning begreper knyttet til hormonforstyrrende, cellekultur, reseptor bindende, enzym aktivitet, genetisk engineering, statistikk og eksperimentell design. Studenter som bruker analysen også praksis grunnleggende og bredt aktuelt laboratorium ferdigheter som å fortynne serier standarder; utdrager prøver; gjør løsninger; konstruere og interpolere standard kurver; beregne konsentrasjoner; gjør løsninger; demonstrere steril teknikk; dyrking celler. identifisere variabler og kontroller. samle, ordne og analysere data. konstruere og tolke grafer; og bruker vanlige laboratorieutstyr som micropipettors og Spektrofotometrene.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Vortex Mixer (for single or multiple tubes)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-215-365	Any mixer will suffice.
Bucket centrifuge	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	75-063-839	Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.
Bunsen burner	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	17-012-823	Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.
Incubator	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	50125590H	Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C.
Microplate reader	BioTek (www.biotek.com)	EPOCH2	A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.
Gen5 microplate reader and imager software	BioTek (www.biotek.com)	GEN5	Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.
Refrigerator	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	05LREEFSA	Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C.
Pipettor or PipetAid compatible with 1 - 10 mL serological pipets	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-681-15E	Any pipettors will suffice if they are compatible with 1 & 10 mL serological pipets.
P10 micropipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F144562G	Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl.
P200 micropipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F144565G	Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl.
P300 multichannel pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FBE1200300	Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 - 205 µl.
Repeating pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F164001G	Must be able to deliver 100 - 320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Sterile 15 mL conical tubes with caps	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	05-539-801
Glass scintillation vials	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	03-337-4
Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (nonsterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	12565501
Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid	Cole-Parmer (www.coleparmer.com)	EW-01728-81
100 mL glass beakers	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-539H	Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.
250 mL glass Erlenmeyer flasks	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FB500250	Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.
Sterile, adhesive, porous film	VWR (www.vwr.com)	60941-086
Metal forceps	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	12-000-157	Any metal forceps will suffice.
Reagent reservoir	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	07-200-127
Filtration units (0.2 µm)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	09-761-52
Squirt bottle (for ethanol)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-897-10	Any laboratory squirt bottles will suffice.
Autoclavable storage bottles	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	06-414-1D	Any autoclavable glass storage bottles will suffice.
10 mL glass serological pipets (sterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-678-27F	Any glass serological pipets will suffice.
1 mL glass serological pipets (sterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-678-27C	Any glass serological pipets will suffice.
P10 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-3810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P200 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-8810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P300 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-9810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
Syringe tips for repeating pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F164150G	Only required if a repeating pipettor is used.
Sterile petri dishes	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FB0875712	Any sterile petri dishes will suffice.
Parafilm	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	S37440
Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast
Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g., W303a)	American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)	MYA-151	Recombinant yeast are also available upon request from the authors.
Receptor/reporter plasmid for ERα	Addgene (www.addgene.org)	pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061)
Receptor/reporter plasmid for ERβ	Addgene (www.addgene.org)	pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Difco agar	BD (www.bd.com)	214530
Dithiothreitol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	D0632	CAUTION:  Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.  Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	N1127
Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	10884308001
Yeast nitrogen base	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	Y0626
Glucose	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	G8270
Galactose	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	G5388
Adenine sulfate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	A9126
Uracil	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	U0750
Leucine	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	L8000
Histidine	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	H8000
17 β-Estradiol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)                     MP Biomedicals	E8875-250 mg     0219456401 - 1 mg	CAUTION:  Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.  It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.  Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.  Estradiol is very toxic to aquatic life.  Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.  Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.
100% ethanol	Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)	111000200
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S9638
Sodium phosphate dibasic (anhydrous)	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S0876
Magnesium chloride	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	M8266
Potassium chloride	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	P9333
Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt)	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	L5125
Sodium carbonate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S7795
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Excel spreadsheet software	Microsoft		Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.
Java software (required for Appendix 1 application)	Oracle Corporation		To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.  LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards.
JMP statistical software version 13.0.0	SAS Institute		Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.  The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.
R statistical computing and graphics software	R Foundation		Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.  Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.