Detecção de ligantes estrogênicos em produtos de cuidados pessoais, usando uma tela de estrogênio de levedura otimizado para o laboratório de ensino de graduação

Summary

Este artigo apresenta uma tela de estrogênio fermento otimizado para quantificação dos ligands em produtos de cuidados pessoais (PCP) que ligam alfa de receptores de estrógeno (ERα) e/ou beta (ERβ). O método incorpora duas opções de substrato colorimétrico, uma seis dias incubação refrigerada para uso em cursos de graduação e ferramentas estatísticas para análise de dados.

Abstract

A tela de estrogênio de levedura (Sim) é usado para detectar ligantes estrogênicos em amostras ambientais e tem sido amplamente aplicada em estudos de disrupção endócrina. Estrogênicos ligantes incluem tanto natural como artificial "ambiental estrógenos" (EEs) encontrado em muitos bens de consumo, incluindo alimentos, plásticos, pesticidas e produtos de cuidados pessoais (PCP). EEE perturbar hormônio sinalização em seres humanos e outros animais, potencialmente reduzindo a fertilidade e aumentar o risco de doença. Apesar da importância da EEs e outros endócrino perturbar químicos (CDE) para a saúde pública, endócrina não está normalmente incluída em currículos de graduação. Esta lacuna é em parte devido à falta de atividades de laboratório pertinente que ilustram os princípios envolvida estando também acessível para estudantes de graduação. Este artigo apresenta um otimizado Sim para quantificação dos ligands em produtos de cuidados pessoais que ligam alfa de receptores de estrógeno (ERα) e/ou beta (ERβ). O método incorpora um dos dois substratos colorimétricos (orto- nitrofenil-β-D-galactopyranoside (ONPG) ou clorofenol vermelho-β-D-galactopyranoside (CPRG)) que são clivados por β-galactosidase, uma incubação refrigerada 6 dias passo para facilita a utilização em cursos de graduação do laboratório, uma aplicação automatizada para cálculos de LacZ e código R para a análise de regressão logística de 4 parâmetros associados. O protocolo foi projetado para permitir que os alunos de graduação, desenvolver e conduzir experimentos nos quais eles tela produtos de sua escolha para estrogênio imita. No processo, eles aprendem sobre endócrina, cultura celular, ligação ao receptor, atividade enzimática, engenharia genética, estatística e delineamento experimental. Simultaneamente, também praticam as habilidades fundamentais e amplamente aplicável de laboratório, tais como: cálculo de concentração; fazendo soluções; demonstrando a técnica estéril; diluição em série normas; construir e interpolação curvas padrão; identificação de variáveis e controles; coletar, organizar e analisar dados; construção e interpretação de gráficos; e utilizando equipamentos comuns de laboratório tais como micropipettors e espectrofotômetros. Assim, implementar este ensaio incentiva os alunos a se envolver em aprendizagem baseada em inquérito enquanto explora questões emergentes em ciências ambientais e saúde.

Introduction

A tela de estrogênio de levedura (Sim) é amplamente utilizado para quantificar ligantes que imitam o estradiol (E2 ou 17 β-estradiol) em uma variedade de matrizes, incluindo água, tecidos vegetais, produtos de consumo e alimentos^{1,2,3, 4}. Coletivamente, esses ligantes são denominados "Estrogênios ambientais (EEs)." O sim foi originalmente desenvolvido como um baixo custo, em vitro alternativa para testes in vivo como o roedor uterotrophic ensaio^5,6 e a truta de arco-íris alimentação ensaio⁷. O objectivo destes testes é para determinar se um produto contém substâncias químicas que estimulam ou bloqueiam os mecanismos dependentes de estrogênio. Detecção de EEs é crítica, porque eles podem interferir com o normal estrógeno endógeno, sinalização, particularmente durante o desenvolvimento fetal. Esta interferência compromete a saúde, aumentando o risco de obesidade, infertilidade, câncer e perda cognitiva⁸.

Apesar da importância da EEE e outras CDE para a saúde pública, endócrina não é comumente incluída nos currículos de graduação. Essa deficiência é em parte devido a uma escassez de actividades que ilustram os princípios envolvida estando também acessível para estudantes de graduação. Além disso, diversas variações do protocolo Sim existem^{9,10,11,12,13}, e essa diversidade faz ensaio otimização demorado para coordenadores de laboratório não especificamente treinados nas técnicas relevantes. Finalmente, sim ensaios são geralmente completou mais de 1 dia ou 2 dias consecutivos, com uma incubação O/N. Neste momento não é compatível com o formato dos cursos de graduação do laboratório, que normalmente satisfazem uma vez / semana por várias horas.

Em resposta a essas necessidades, este manuscrito relata um protocolo otimizado de Sim 96 poços que inclui métodos de extração de etanol para produtos de higiene pessoal (PCP)³ e uma etapa de refrigeração de 6 dias para acomodar reuniões semanais de laboratório. Etanol absoluto é um solvente orgânico versátil que pode dissolver uma variedade de solutos polares e apolares. Além disso, é apropriado para cursos de graduação, porque é prontamente disponível, relativamente não tóxico, acessível e miscível com a água; também evapora facilmente sem equipamentos especiais. No entanto, o etanol não é ideal para extrair fortemente hidrofóbicos desreguladores endócrinos ou muitos óleos e ceras, os dois últimos sendo ingredientes comuns em PCP. eficiência de extração pobre aumenta o risco de resultados negativos falsos. Com essa restrição em mente, investigadores devem escolher procedimentos de extração (por exemplo, extração etanólica ou extração de fase sólida) esse endereço amostra características e objetivos do estudo (pesquisa contra graduação instrução).

O Sim depende recombinante Saccharomyces cerevisiae , originalmente criado por Dr. Charles Miller, na Universidade de Tulane. Por favor veja Miller et al (2010) para um mapa completo do plasmídeo engenharia¹⁴. Fermento transformado com estes plasmídeos constitutivamente expressa humana ERα nuclear ou ERβ (também chamado ESR1 e ESR2, respectivamente) quando cultivadas em meios contendo galactose (para ERα) ou glicose ou galactose (para ERβ). Se produtos químicos estrogênicos estão presentes na mídia, eles se ligam aos receptores, criando complexos ligante-receptor que ativam a expressão de β-galactosidase (lacZ) a um nível proporcional à concentração de químicos estrogênicos. Células de levedura lysed então para liberar a β-galactosidase acumulada. A Lise contém ONPG ou CPRG, que são clivados por β-galactosidase para produzir produtos de amarelos ou vermelhos, respectivamente. Produtos colorimétricos podem ser quantificados, medindo a absorbância usando um Espectrofotômetro de placa de micropoços. O grau de mudança de cor é proporcional à concentração de ligantes estrogênicos, aos quais o fermento foi exposto.

A escolha do substrato (CPRG ou ONPG) varia de acordo com o potencial de absorvância fundo decorrentes as amostras sendo testadas. Por exemplo, extratos de plantas muitas vezes irão adicionar uma tonalidade amarela para a mídia que infla artificialmente medidas estrogenicity se ONPG (quantificado em 405 nm) é usado como substrato para a β-galactosidase. Com extractos vegetais, CPRG (quantificado em 574 nm) pode ser um substrato colorimétrico mais apropriado. CPRG é mais caro que ONPG mas é usado em um décimo a molaridade. Este artigo apresenta estrogenicities de PCP extratos quantificados usando ONPG e CPRG.

Quantificar estrogenicity de amostras ambientais usando ERα e ERβ é uma abordagem mais abrangente do que usando apenas um destes receptores. Em animais, estes receptores apresentam distribuição tecidual diferencial, actividades regulamentares e afinidades de ligação por ligantes estrogênicas e anti-estrogênicas¹⁵. Por exemplo, fitoestrogênios à base de plantas tipicamente bind ERβ mais fortemente², Considerando que os produtos químicos sintéticos podem mostrar preferência por ERα ou ERβ ou podem ligar os dois receptores igualmente bem¹⁵. Por conseguinte, ligação ao receptor de estrogênio de uma não necessariamente prever vinculação ao outro.

Embora EEs são encontrados em muitos produtos de consumo (por exemplo, pesticidas, detergentes, adesivos, lubrificantes, plásticos, alimentos e produtos farmacêuticos), assim como as plantas, os dados apresentados foram obtidos usando uma seleção de PCP. PCP é convincentes, prontamente disponível, orçamento-friendly e ambientalmente relevantes para alunos de graduação. Os alunos podem ser convidados a trazer seus favoritos PCP de casa para testar no laboratório. Eles também podem procurar o banco de dados Skin Deep desenvolvido pelo grupo de trabalho ambiental¹⁶ para gerar comparações orientado a hipótese de PCP com alta e baixa partituras de toxicidade. Desta forma, os alunos podem simultaneamente desenvolver habilidades de laboratório avançado; envolver-se na aprendizagem auto-dirigida, baseada em inquérito; e explorar questões emergentes em ciências ambientais e saúde.

Protocol

1 fazer reagentes

1. Preparar a mídia de glicose e galactose pela mistura de nitrogênio de levedura 6,7 g base de dextrose 20g ou galactose, sulfato de adenina 20 mg (adicionado como 10 mL de uma solução aquosa de 200 mg/100 mL), uracil 20 mg (adicionado como 10 mL de uma solução aquosa de 200 mg/100 mL) , leucina 60 mg (adicionado como 6 mL da solução aquosa a 1 g/100 mL) e histidina 20 mg (adicionado como 2 mL da solução aquosa a 1 g/100 mL) em água destilada até um volume final de 1 L. Esterilize por filtração (filtro de 0,2 µm). Meios de comunicação podem ser armazenados a 4 ° C durante várias semanas.
2. Preparar o estradiol (E2) padrões por dissolução em pó E2 em etanol anidro e diluir para as concentrações adequadas de trabalho (227.5 nM & 9.75 nM) em etanol a 50%.
   Nota: Se o estradiol é comprado como um frasco de 1 mg, adicione 1 mL de etanol diretamente para o frasco para dissolver o pó de estradiol. Isso resulta em um estoque de 3,67 mM #1.  Dilua 10 μL de estoque #1 em 990 etanol μL tornar-se 1 mL de caldo μM 36.71 #2.  Em seguida, dilua 10 μL de stock #2 em etanol a 50% 990 μL tornar-se 1 mL de caldo de nM 367.13 #3.  Para tornar o trabalho de estoques, dilua 619.7 estoque μL #3 em etanol a 50% μL 380.3 tornar-se 1 mL de 227.5 nM trabalho estoque usados para criar curvas padrão com fermento expressando ERα.  Dilua o estoque μL 26.56 #3, em etanol a 50% 973.44 μL tornar-se 1 mL de 9,75 nM trabalho estoque usados para criar curvas padrão com fermento expressando ERβ. Selo padrões com parafilm e loja -20-70 ° c.
   Cuidado: E2 é um suspeito cancerígeno e toxicidade reprodutiva. É prejudicial se inalado, ingerido ou absorvido pela pele. E2 pode causar danos para amamentar crianças e fetos. E2 é muito tóxico para a vida aquática. Usar proteção pessoal apropriada (luvas, coifa, máscara de pó) e evitar a exposição durante a gravidez e lactação. Descarte-E2 como resíduos perigosos e não liberam no meio ambiente.
3. Prepare o buffer de LacZ misturando 8,52 g Na₂HPO₄, 5,52 g NaH₂PO₄•H₂O, 95,21 mg MgCl₂, mg 745,5 KCl, sal de sódio de 2 g N-lauroylsarcosine e ONPG (400 mg) ou CPRG (77,7 mg) em água desionizada para um final volume de 1 L. loja LacZ tampão em alíquotas de 20 mL a-20 ° C.
   Nota: Uma alíquota de 20 mL é suficiente para uma placa de 96 poços.
4. Prepare o carbonato de sódio misturando 105,9 g de carbonato de sódio em água desionizada até um volume final de 1 L. loja no RT
5. Prepare 1 M ditiotreitol (DTT) em água. Congelar 25 alíquotas µ l de TDT a-20 ° C.
   Cuidado: TDT é uma pele agudo e irritante para os olhos. Use equipamento de proteção pessoal apropriado (luvas, coifa, máscara de pó) para evitar a pele e olhos, inalação e ingestão.
   Nota: Cada alíquota é suficiente para uma placa de 96 poços.

2. preparar as amostras e controles de extração

1. Selecione as amostras para testar.
   Nota: Este artigo apresenta dados para quinze PCP, incluindo sabonete, creme de cabelo, champô, protetor solar, protetor labial, Fundação, creme de barbear, unha polonês e loção.
2. Combine 1 g da amostra com 10 mL de etanol anidro em um tubo cônico de 15 mL. Prepare um controle negativo extração consistindo de 11 mL de etanol em um tubo cônico de 15 mL. Prepare-se repetições conforme necessário.
   Nota: Para o projeto experimental apresentado, foram preparadas três alíquotas de todos os 15 PCP e soluções de controle de extração triplicado, rendendo um total de 48 amostras, cada uma delas foi analisada em triplicata, utilizando o protocolo na seção 4. Um prato único pode acomodar até 23 amostras em triplica. Etanol anidro é usado nesta etapa porque evapora facilmente. Use controles de extração negativo para verificar que os estrogênios não são lixiviação em amostras dos tubos cónicos.
3. Homogeneizar o conteúdo do tubo por 30 min por uma combinação de agitação manual e num Vortex ou agitando os tubos em um tubo multi reaccional.
4. Tubos de centrifuga cónicos na velocidade máxima permitida em uma centrífuga de balde de 10 min. decantar o sobrenadante de cada tubo através de um filtro de célula de 40 µm para um tubo cónico de 50 mL. Conteúdo vazio de cada tubo de 50 mL em um frasco de cintilação.
5. Deixe os frascos abrir em um capuz ventilado por uma semana permitir que o álcool evapore completamente. Alternativamente, seca as amostras em uma campânula ventilada em atmosfera de azoto ou com um evaporador rotativo. Para evitar a degradação dos componentes sensíveis luz, protege amostras de secagem de luz (por exemplo, lugar de tecido opaco sobre porta de campânula ventilada).
6. Reconstitua as amostras em 1,0 mL de etanol a 50% e o vórtice para homogeneizar.

3. cultivo e repicagem fermento¹⁴

1. Manter as culturas de levedura ativa (estirpe recombinante W303a de S. cerevisiae¹⁴) incubando fermento em mídia de filtro-esterilizados glicose a 30 ° C. Fermento de subcultura semanalmente na mídia fresco glicose filtro esterilizado.
2. Duas noites (cerca de 42 h) antes de preparar as placas Sim, subcultura levedura adicionando 0,1 mL de culturas de levedura ativa a 10 mL de mídia de filtro-esterilizados glicose utilizando uma técnica estéril.  Incube a 30 ° C por duas noites.  Tremendo não é necessário se levedura é crescida como culturas superficiais em estéril 250 mL Erlenmeyer frascos.
   Nota: Levedura também pode ser armazenado em placas de ágar refrigerado por vários meses. Para armazenamento a longo prazo (anos), aliam-se culturas O/N 15-50% de glicerol estéril, vórtice e congelar a-70 ° C. Para preparar o glicerol estéril, use uma seringa para transferir 300 glicerol µ l para uma cryovial e autoclave com a tampa soltada. Em seguida, adicione 1.200 cultura de levedura do / N µ l utilizando uma técnica estéril.

4. preparar placas Sim (dia 1 do ensaio)

1. Em um recipiente estéril e utilizando uma técnica estéril, diluir o fermento da etapa 3.2 para uma densidade óptica de 0,065 ±0.005 em 610 nm (OD₆₁₀) em mídia de filtro-esterilizados galactose.
   1. Confirmar a densidade óptica por pipetagem 120 μL de cada amostra de levedura em triplicado juntamente com espaços em branco de galactose triplicado em uma placa de poliestireno clara (placa não precisa ser estéril).  Use um espectrofotómetro de placa para verificar se a cultura do fermento diluído tem um líquido OD₆₁₀ de 0,065 ±0.005 OD610 subtrair leituras de espaços em branco de galactose de leituras de₆₁₀ OD fermento para determinar líquido OD₆₁₀ da levedura. Prepare um volume final de pelo menos 30 levedura mL diluido para cada placa de 96 poços.
      Nota: Filtros de espectrofotômetro medir a absorvância entre 595 e 610 nm podem ser usados para esta medição.

Uma aproximada rácio de 1:6 v: v de levedura: mídia normalmente produz uma OD₆₁₀ perto 0.065, então comece adicionando fermento 4,5 mL para mídia de 30 mL e adicionar mais fermento ou mídia conforme apropriado para alcançar um netOD₆₁₀ entre 0.060 e 0.070.

Utilizando uma técnica estéril, adicione esta suspensão de fermento diluído aos poços de uma estéril, polipropileno, microplacas de 96 poços, de acordo com o layout da placa (Figura 1). Durante a pipetagem, manter a fonte fermento suspendido por continuamente agitando o recipiente ou mistura com a pipeta. Para esta etapa, é útil usar uma pipeta de repetição com uma ponta de seringa estéril.
Nota: As placas de polipropileno são esterilizadas por duas placas empilhadas autoclave embrulhadas em papel alumínio.  A placa superior serve como uma tampa para a placa da amostra pode ser re-esterilizado, lavados e reutilizados.

Adicione mídia de filtro-esterilizados galactose 120 µ l 3 poços adicionais (H10 - 12) de acordo com o layout da placa (Figura 1). Esses poços servem como controles de mídia para contabilizar absorvância contribuída pela mídia sozinha.

Construir uma curva padrão em cada placa diluindo serialmente triplica de padrões a E2 (227.5 nM para ERα, 9.75 nM para ERβ) em poços contendo a suspensão de levedura (A1 - G3), de acordo com o layout da placa (Figura 1).  Comece adicionando 5 µ l de E2 padrões para poços A1 a A3. Misturar o conteúdo de microplacas pipetando e em seguida serialmente diluir esta suspensão movendo µ l 205 de poços A1 - 3 para poços B1 - 3. Repetir a mistura e a transferência de 205 µ l por meio de linha G.
Nota: Depois de concluída a diluição serial, descarte 205 μL de poços G1 - 3. No final desta etapa, todos os poços padrão devem conter 120 μL. A diluição serial renderá as concentrações finais de E2 listadas na tabela 1. Para as etapas de diluição serial, é útil usar uma pipeta multicanal com dicas estéril.

Adicione 5 µ l de veículo (50% de etanol) para poços de controle do veículo que contém a suspensão de levedura (H1 - 3) de acordo com o layout da placa (Figura 1).
Nota: Poços de controle do veículo são usados para quantificar a absorvância de fundo associada com mídia e células de levedura. Além disso, citotoxicidade ou crescimento promovendo efeitos de teste, as amostras podem ser detectadas, comparando os valores de₆₁₀ OD de testar poços com aqueles dos poços de controle do veículo.

Adicione 5 µ l triplica de amostras e controles negativos extração poços contendo a suspensão de levedura de acordo com o layout da placa (Figura 1).
Nota: Tome nota de que amostras ou extração negativo controles são adicionados a cada poço.  Para controlar quais poços têm amostras e que não, começar com uma caixa de dicas e usar dicas dos mesmos locais na caixa como as localizações dos poços correspondentes na placa. Uma placa de 96 poços pode acomodar até 23 amostras em triplicata.

Misture o conteúdo de amostra, controle de extração e poços de controle do veículo por pipetagem. Ajuste os volumes desses poços a 120 µ l removendo 205 µ l de cada um, conforme descrito na legenda para Figura 1.

Sele as placas com um filme estéril, adesivo, porosa. Rotular as placas e incubar durante 17 h a 30 ° C. A placa não precisa ser sacudido durante a incubação

5. processamento Sim placas (dia 2 do ensaio)

1. Após a incubação h 17 a 30 ° C, retire as placas da incubadora. Se placas serão processadas imediatamente, prossiga para a etapa 5.1.1. Se placas serão processadas em uma data posterior, prossiga para o passo 5.1.2.
   1. Usar uma pipeta multicanal para misturar o conteúdo de cada linha de poços e depois transferir 50 µ l de suspensão de levedura de cada poço para o correspondente bem de uma microplaca clara, poliestireno, 96 poços.
      Nota: Placas de poliestireno não precisa ser estéril, mas devem ter uma tampa. Use novas pontas de pipeta para cada linha de poços para evitar Cruz-contaminando poços, embora se pipetagem através de triplica com uma pipeta multicanal 8-ponta, dicas, só precisam ser alterado entre conjuntos de três vias.
      1. Rotule a nova chapa. Siga para o passo 5.2.
   2. Para armazenar as placas antes do processamento, embrulhe em filme plástico. Leve à geladeira embrulhadas placas a 4 ° C por 6 m. depois disso, retire as placas da geladeira, desembrulhá-los e transferir o conteúdo de todos os poços pipetando etapa 5.1.1. Siga para o passo 5.2.
2. Adicione 20 µ l de 1m TDT para 20 mL de tampão de LacZ de temperatura descongelada, para uma concentração final de 1 mM DTT. Buffer de LacZ mistura bem. Se usando uma pipeta multicanal, dispensá-los em um reservatório de reagente.
   Cuidado: Use luvas e trabalhar com TDT em uma capa, se possível
3. Usando qualquer uma pipeta multicanal ou repetindo a pipeta, adicione 200 µ l de tampão de LacZ contendo DTT e ONPG ou CPRG a todas as cavidades da placa de poliestireno e imediatamente medir e gravar o OD₆₁₀ de todos os poços utilizando um Espectrofotômetro de placa. Repita conforme necessário para placas adicionais.
   Nota: As leituras de₆₁₀ OD são usadas no denominador do cálculo LacZ (etapa 6.1). Por este motivo, obter as leituras imediatamente depois de pipetagem e antes de resolver as células ou lysed por buffer LacZ. Se valores de₆₁₀ OD para poços de amostra são visivelmente superior ou inferior valores de₆₁₀ OD para poços de controle do veículo, os extratos de amostra são promover o crescimento ou citotóxicos para levedura, respectivamente. O LacZ cálculo irá corrigir pequenas diferenças de densidades de célula através de poços, mas se exceder 30% em qualquer direção, então diluir a amostra de leite reconstituído (da etapa 2.6) em etanol a 50% adicionais e teste novamente a amostra, retornando para a etapa 3.2 ¹².
4. Cobrir as placas com uma tampa. Incube as placas contendo levedura que ERα expresso¹⁴ a 30 ° C por 40 min (para ONPG) ou 3h (para CPRG). Incube as placas contendo levedura que expressa ERβ¹⁴ a 30 ° C para 70 min (ONPG) ou 4h (para CPRG).
   Nota: Quando se trabalha com CPRG, tempos de incubação são flexíveis; incubação de 2-4 h produz resultados adequados com ambos os receptores, com incubação do mais tempo, aumentando a sensibilidade do ensaio.
5. Depois incubar as placas, use uma pipeta multicanal ou pipeta de repetição para adicionar 100 µ l de carbonato de sódio a cada poço. Carbonato de sódio eleva o pH e interrompe a reação de β-galactosidase.
6. Medir e registar a OD₄₀₅ (para ONPG) ou OD₅₇₄ (para CPRG) de todos os poços utilizando um Espectrofotômetro de placa.

6.Cálculo dos valores LacZ

Nota: Valores de LacZ quantificar o grau de mudança de cor para cada amostra e oferecem um método normalizado de comparar valores entre ensaios separados pela contabilidade para diversas variáveis (por exemplo, densidade óptica de levedura, densidade óptica de mídia e incubação tempo se Isto difere entre poços no mesmo prato)¹².

1. Calcular significa dos valores de₆₁₀ OD triplicadas para poços de controle de mídia (galactose) (H10-12) e calcular o meio de três vias OD₄₀₅ ou valores de₅₇₄ OD para veículo (50% de etanol) controles (H1-3). Usar esses meios e o tempo de incubação (t) em horas para a placa para alterar cor (passo 5.5) para calcular valores de LacZ (correspondente ao grau de mudança de cor em cada poço) para todos os padrões e amostra de poços utilizando as seguintes equações:
   
   
   1. Como alternativa, use o aplicativo automatizado no Apêndice 1 para calcular valores de LacZ para padrões e amostras.
      Nota: O layout da placa usado com o aplicativo deve ser idêntico para o layout da placa apresentado na Figura 1. Se alguns poços da amostra não foram usados, reter as leituras de absorvância dos poços vazios como detentores de lugar no dataset absorvância sendo colado no Apêndice 1 aplicativo LacZ.  Isso preserva o layout espacial da placa no aplicativo e garante que os poços de controle de mídia estão em seu local necessário.  Além disso, o aplicativo não será executado se houver células vazias.
2. Calcule o meio de três vias LacZ valores para cada padrão de E2 e cada amostra. Relatório de valores médios de LacZ como µ l^-1h^-1. Log-transformar as concentrações de cada padrão de E2 e gerar um documento de planilha formatado como no arquivo template.csv (Apêndice 2).

7. interpolação amostra Estradiol equivalentes (EEQs) usando 4-parâmetro regressão logística

Nota: EEQs relacionar valores de LacZ de amostra (mudança de cor) para os valores de LacZ da curva padrão criado com E2. EEQs assim determinar quanto amostra é necessária para eliciar a mesma resposta de mudança de cor como uma concentração conhecida de E2.

1. Para calcular EEQs para amostras de teste, primeiro traça a curva padrão. Ajuste os valores médios LacZ para padrões de E2 (eixo y) e log-transformadas E2 concentrações correspondentes (eixo x) para um modelo de regressão logística quatro-parâmetro.
2. Use o modelo para interpolar EEQs para valores de LacZ de amostra de teste. Realizar cálculos de regressão logística de EEQs usando o software estatístico, conforme descrito no Apêndice 2.

8. padronização EEQs (ng/mL), a massa de amostra de PCP

1. Para relacionar a quantidade de amostra de PCP adicionada ao EEQs cada um bem na etapa 4.5, multiplicar EEQ (ng/mL) pelo volume total chapeado em poços da amostra (325 µ l) e depois dividir pelo volume de amostra coletada adicionado a cada poço (5 µ l).
   Nota: Estes valores representam EEQ / mL da amostra coletada. Se as amostras foram preparadas usando 1 g de PCP, esses valores representam também EEQ por grama de PCP (ng/g). Expressa-se desta forma, valores EEQ (ng/g) podem ser comparados em diferentes valores de PCP. EEQ (ng/g) para os produtos de cuidados pessoais testados neste estudo são mostrados na tabela 2, e coletados em todo o protocolo inteiro de dados de exemplo estão incluídos no Apêndice 3.

Representative Results

Os estrogenicities de três vias amostras de 15 PCP foram avaliados usando este protocolo Sim. Como observado por Miller et al . (2010), ensaios com fermento expressando ERβ eram mais que uma ordem de magnitude mais sensível do que ensaios com fermento expressando ERα (Figura 2)¹⁴. Portanto, a atividade estrogênica mais frequentemente foi detectada com fermento ERβ-expressando (tabela 2). Oito PCP exibiu atividade estrogênica com ERβ e 5 PCP exibiu atividade estrogênica com ERα. Amostras de bálsamo labial, protetor solar, loção e creme de cabelo foram estrogênicas com ambos os receptores, enquanto Fundação, creme de barbear e esmaltes eram apenas estrogênicos com ERβ nas concentrações testadas. Sete outros PCP (4 xampus, 2 sabonetes e 1 batom) não eram estrogênicos com qualquer receptor nas concentrações testadas.

Além de diferenças de sensibilidade do receptor, EEQs para cada amostra diferem dependendo do substrato colorimétrico (ONPG ou CPRG) utilizado no ensaio (tabela 2). Em todos, mas uma amostra, EEQs determinados usando ONPG eram superiores aos determinados usando CPRG. Além disso, a variação entre as repetições de extração foi menor para EEQs medidos com ERβ e CPRG e determinado mais alto para EEQs com ERα e ONPG (tabela 2).

Além de comparar substratos colorimétricos, 1 objectivo do presente estudo era testar a incubação vezes duração compatíveis com a programação de um curso de graduação de laboratório. O ensaio é típico requer que uma incubação de 17 h seguido imediatamente por incubação no buffer de LacZ para 40 min - 4 h, um programa que é impossível implementar em um laboratório de ensino restringido por uma única sessão semanal. Para facilitar o uso deste teste no ensino, o ensaio foi modificado através da introdução de um período de refrigeração d 6 (passo 5.1.2) após a incubação de 17 h. Curvas padrão de placas refrigeradas foram comparáveis das placas não refrigerado (figuras 2 & 3), exceto que todos os erros-padrão dos parâmetros estimados usando modelos de regressão logística quatro-parâmetro menor para placas refrigeradas do que para placas nonrefrigerated (tabela 3). Assim, placas para 6 d de refrigeração reduz o erro e melhora a precisão das estimativas EEQ.

Figura 1. Layout da placa de micropoços e diluição padrão curva de preparação para o ensaio Sim. Padrões de E2 (luz cinzento poços), amostras e negativo de controles de extração (poços brancos) e veículo (H1 - 3) e mídia de galactose (H10 - 12) controles (poços cinzento escuros) foram todos testados em triplicado. Uma curva padrão de E2 (luz cinza poços) foi construída pelo chapeamento 320 µ l de levedura em poços A1, A3 e 120 µ l de levedura em poços B1 através do G3. Então, 5 µ l de E2 (227.5 nM para o fermento que expressam ERα; 9,75 nM para o fermento que expressam ERβ) foram adicionados para a levedura em poços A1 a A3. O fermento + E2 suspensão foi serialmente diluída Transferindo 205 µ l de cada poço para o poço abaixo, rendendo as concentrações finais de E2 listadas na tabela 1. Observe que, no final do processo de diluição serial, 205 µ l devem ser descartadas de poços G1 através de G3 para alcançar um volume final de 120 µ l em cada poço. Amostra e poços de controle negativo extração foram preparados pela adição de 5 µ l de cada extrato (dissolvido em etanol a 50%) para 320 µ l de levedura. Poços de controle do veículo (H1 - 3) foram preparados pela adição de 5 µ l de etanol a 50% a 320 µ l de levedura. Todos os poços da amostra e controle foram misturados por pipetagem, e 205 µ l foram removidos e descartados para ajustar volumes bem a 120 µ l. Por último, os controles de mídia foram preparadas pelo chapeamento 120 µ l de mídia de galactose em poços H10 - 12.  Para usar a calculadora de LacZ no Apêndice 1 e o aplicativo descrito no Apêndice 2, o E2 R devem ser banhados a curva padrão e controles de mídia do veículo e a galactose, como mostrado.  Amostras e controles negativos extração podem ser chapeados em qualquer um dos poços de brancos, enquanto a ordem do chapeamento é notável.  Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Curva-padrão para as placas Sim geradas através de regressão logística 4 parâmetros. Dois substratos (ONPG & CPRG) foram testados usando fermento expressando um dos dois humanos receptores de estrogênio (ERα ou ERβ) ambos sem (A) e (B) uma refrigeração d 6 período após a incubação de 17 h com 17 β-estradiol e exemplo de extratos. Todas as normas de E2 e controles de mídia e veículo foram testados em triplicado. Pontos representam meios de três vias valores de LacZ, onde valores de LacZ refletem o grau de mudança de cor induzida por β-galactosidase. Parâmetros do modelo de regressão logística estão listados na tabela 3. ONPG = orto- nitrofenil-β-D-galactopyranoside; CPRG = vermelho de clorofenol-β-D-galactopyranoside. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Exemplos de pratos desenvolvidos Sim. Dois substratos (ONPG & CPRG) foram testados usando fermento expressando receptores de estrogênio humano (ERα ou ERβ), sem (esquerda) ou com o período (direita) uma refrigeração de seis dias após a incubação de 17 h com 17 β-estradiol ou amostra extrai. Todas as normas E2, mídia e veículo controles foram testados em triplica. As placas foram organizadas com a maior concentração de E2 na linha superior de cada placa e controles (50% etanol + fermento na mídia de esquerda e galactose à direita) na linha inferior de cada placa de acordo com a Figura 1. ONPG = orto- nitrofenil-β-D-galactopyranoside; CPRG = vermelho de clorofenol-β-D-galactopyranoside.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Número padrão	[E2] para levedura ERα (pM)	[E2] para levedura ERβ (pM)
1	3500	150
2	2208	94,6
3	1393	59,7
4	878	37,6
5	554	23,7
6	349	15
7	220	9.45

Tabela 1. Final concentrações de E2 padrões utilizados no sim.
E2 em pó foi dissolvido em etanol anidro e então diluído para trabalhar ações concentrações de 227.5 nM (para o fermento que expressam ERα) e 9,75 nM (para o fermento que expressam ERβ) em etanol a 50%.Estoques de trabalho foram então adicionados aos poços de microplacas contendo levedura na mídia de galactose e serialmente diluídas para as concentrações que constam do quadro.

Amostras testadas		Condições de ensaio		Estrogênicas equivalentes (EEQs) de PCP
PCP #	Tipo de amostra	Receptor	Substrato	1 EEQ (ng/g)	2 EEQ (ng/g)	3 EEQ (ng/g)	Quer dizer EEQ (ng/g)
1	Creme de cabelo	ERΑ	ONPG	ND	0.379	ND	< 0.379
1	Creme de cabelo	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
1	Creme de cabelo	ERΒ	ONPG	0.528	0,338	0.363	0.410
1	Creme de cabelo	ERΒ	CPRG	ND	0.215	ND	< 0.215
4	Protetor solar	ERΑ	ONPG	6.803	1.390	ND	< 4.097
4	Protetor solar	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
4	Protetor solar	ERΒ	ONPG	1,321	0.838	0.818	0.992
4	Protetor solar	ERΒ	CPRG	0.651	0.591	0.725	0.656
7	Fundação	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
7	Fundação	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
7	Fundação	ERΒ	ONPG	ND	0.158	ND	< 0,158
7	Fundação	ERΒ	CPRG	ND	ND	ND	ND
9	Creme de barbear	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
9	Creme de barbear	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
9	Creme de barbear	ERΒ	ONPG	ND	0.256	0,295	< 0,276
9	Creme de barbear	ERΒ	CPRG	0.507	0.392	0,560	0.486
10	Lustrador de prego	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
10	Lustrador de prego	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
10	Lustrador de prego	ERΒ	ONPG	0.916	0.503	0,554	0.658
10	Lustrador de prego	ERΒ	CPRG	0.532	0.628	0.594	0.585
11	Loção	ERΑ	ONPG	ND	ND	2.327	< 2.327
11	Loção	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
11	Loção	ERΒ	ONPG	Excede o intervalo	2.599	1.845	> 2.222
11	Loção	ERΒ	CPRG	--	1,986	1,236	1.611
13	Protetor solar	ERΑ	ONPG	14.069	11.494	10.189	11.917
13	Protetor solar	ERΑ	CPRG	4.773	5.790	5.850	5.471
13	Protetor solar	ERΒ	ONPG	Excede o intervalo	2.580	Excede o intervalo	> 2.580
13	Protetor solar	ERΒ	CPRG	0.292	0,240	ND	< 0.266
15	Protetor labial	ERΑ	ONPG	ND	ND	0.431	< 0.431
15	Protetor labial	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
15	Protetor labial	ERΒ	ONPG	1.202	1.060	0.887	1.050
15	Protetor labial	ERΒ	CPRG	0.820	0.871	0.851	0.847

Tabela 2. EEQs de PCP com EEQs diferente de zero. Três alíquotas de 15 PCP e três controles de extração foram homogeneizadas em etanol anidro, evaporadas e reconstituídas em etanol a 50% para um total de 48 amostras, cada uma delas foi analisada em triplicata, utilizando o ensaio de Sim. Oito PCP tinha pelo menos 1 EEQ diferente de zero, enquanto 7 PCP não foram encontrados para ser estrogênica nas concentrações testadas. 1 EEQ, EEQ 2 e 3 EEQ referem-se a três alíquotas de cada PCP, cada testada em triplicado em uma placa separada. Valores para 1 EEQ, EEQ 2 e 3 EEQ são os meios do triplica para cada alíquota. Fermento utilizado no ensaio de expresso 1 dos 2 isoformas dos receptores de estrogênio humano (ERα ou ERβ). Dois substratos colorimétricos, ONPG e CPRG, foram testados usando o protocolo não refrigerado. EEQs foram determinados utilizando quatro-parâmetro regressões logísticas (com R² valores ≥ 0,98) de LacZ valores em cada uma das 7 concentrações de E2. ND = abaixo do limite de deteção do ensaio.... = replicar perdido.

Condições de ensaio			Parâmetros do modelo
Receptor	Substrato	Prender a 4 ° C por 6 d	Modelo R2	Taxa de crescimento (LacZ unidades/ng/ml)	Ponto de inflexão (ng/mL)	Assíntota inferior (unidades de LacZ)	Assíntota superior (unidades de LacZ)
ERΑ	ONPG	Não	> 0,99	±1.633 8.548	-0.512 ±0.025	-1.623 ±4.408	128.11 ±6.31
ERΑ	ONPG	SIM	> 0,99	±0.758 7.618	-0.587 ±0.014	-8.378 ±2.223	99.53 ±2.528
ERΑ	CPRG	Não	> 0,99	±2.182 8.256	-0.610 ±0.033	±3.333 0.853	62.52 ±3.473
ERΑ	CPRG	SIM	> 0,99	±0.616 5.068	-0.523 ±0.022	-3.147 ±1.946	68.06 ±3.069
ERΒ	ONPG	Não	> 0,99	1.041 ±2.004	-0.898 ±4.410	-32.98 ±86.62	248.6 ±778.9
ERΒ	ONPG	SIM	> 0,99	±1.289 4.327	-1.736 ±0.087	4.654 ±3.087	66.37 ±10.75
ERΒ	CPRG	Não	= 0,99	5.673 ±1.764	-1.914 ±0.052	±1.679 3.925	28.05-±2.334
ERΒ	CPRG	SIM	> 0,99	±1.142 4.412	-1.894 ±0.051	±1.303 2.052	±2.047 22.64

Tabela 3. Modelo de parâmetros de 4 parâmetros regressões logísticas para as curvas padrão em Figura 2. Dois substratos, ONPG e CPRG, foram testados usando fermento expressando 1 dos 2 receptores de estrogênio humano (ERα ou ERβ) sem e com um período de seis dias de refrigeração após a incubação de 17 h. Parâmetros são relatados como estima ±standard erros.

Apêndice 1. Aplicativo para calcular os valores de LacZ.  Para usar o aplicativo, primeiro Baixe o software livre de Java (conforme indicado na Tabela de materiais). Em seguida, abra o aplicativo de LacZ. O layout da placa usado com o aplicativo deve ser idêntico para o layout da placa apresentado na Figura 1. Se alguns poços da amostra não foram usados, reter as leituras de absorvância dos poços vazios como detentores de lugar no dataset absorvância sendo colado em aplicativo do LacZ.  Isso preserva o layout espacial da placa no aplicativo e garante que os poços de controle de mídia estão em seu local necessário.  Além disso, o aplicativo não será executado se houver células vazias. Colar em leituras de OD₄₀₅ (para ONPG) ou leituras de₅₇₄ OD (para CPRG) de todos os poços, usando o comando de teclado "control (ctrl) + v" ou "command + v," dependendo da plataforma do computador sendo usada. Digite a quantidade de tempo de incubação em horas para o ensaio produzir a cor (da etapa 5.4; por exemplo, 0,66667 h para 40 min). Clique em Avançar. Colar em leituras de₆₁₀ OD da etapa 5.3. Clique em enviar. Resultados de LacZ serão exibidos e podem ser copiados pressionando "control (ctrl) + c" ou "command + c," dependendo da plataforma do computador sendo usada. Clique aqui para baixar este arquivo.

Apêndice 2. Opções de Software de estatística para calcular EEQs. EEQs podem ser calculadas usando uma das três opções apresentadas.  Instruções de uso 1. JMP software ou 2. Código R são fornecidos no apêndice 2.  O código de R também foi convertido para 3. um formato de aplicativo disponível em https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/. Clique aqui para baixar este arquivo.

Apêndice 3. Amostra de dados coletados usando o fermento que ERα Express e CPRG como substrato. Medições de OD₆₁₀ e OD₅₇₄ para cada um dos sete controles padrões, veículos e meios de comunicação de E2, e uma única amostra representativa de PCP são incluídas, juntamente com os valores calculados do LacZ. Valores de LacZ de padrões foram usados para construir um modelo de regressão logística quatro parâmetros da curva padrão, conforme descrito em etapas 7A & B acima. O modelo foi usado para interpolar triplicadas estimativas de EEQs da amostra representativa em ng/mL em poços da microplaca. Estes valores foram então convertidos para EEQs expressados em ng/g de amostra (passo 8.1). Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O sim é um método de baixo custo usado para detectar ligantes estrogênicos em amostras ambientais, tais como água, comida, tecidos vegetais ou produtos de cuidados pessoais. Dados apresentados aqui comparar 2 receptores de estrógeno (ERα e ERβ), 2 substratos (ONPG e CPRG) e 2 cronogramas (2 d protocolo sem refrigeração) e protocolo de sete dias com refrigeração para medir estrogenicity em produtos de cuidados pessoais através do ensaio de Sim. A 7D, protocolo refrigerado usando CPRG e levedura expressando ERα e/ou ERβ melhor quantifica EEQs enquanto também compatível com as restrições de tempo impostas pelos cursos de graduação do laboratório que atendem apenas uma vez / semana por várias horas. Na verdade, comparado com o ensaio 2 d sem refrigeração, o ensaio de sete dias refrigerado foi associado com variância reduzida através de repetições de placa. Além disso, a parte linear da curva padrão foi ligeiramente ampliada para dados coletados usando o ensaio de refrigerados. A porção linear da curva padrão define a escala da deteção do ensaio e é a única parte da curva padrão que pode ser usada para interpolar EEQs amostra.

Em todos, mas uma das amostras testadas, EEQs medidos usando CPRG eram inferiores aos quantificado com ONPG. Com um maior coeficiente de extinção e baixa K_m e V_max, CPRG é dez vezes mais sensível que ONPG¹⁷. Assim, CPRG pode ser usado em concentrações inferiores e pode ser usado para detectar a menor quantidade de β-galactosidase. Por estas razões, CPRG é geralmente preferível ONPG^18,19. No entanto, maior sensibilidade de substrato não explica os valores mais baixos de EEQ detectado com CPRG. Os valores mais elevados de EEQ detectados com ONPG poderiam ser devido à interferência de matriz com o ensaio, como foi observado por outros autores^2,18. Pigmentos amarelos de extratos de produtos de cuidados pessoais podem inflar valores EEQ detectados com ONPG. Outros têm contornado esse problema, incluindo controles de pigmento em seu projeto experimental², uma abordagem que dobra o número de placas em um experimento. Quando a interferência de matriz pode ser problemática, CPRG pode ser um substrato preferível para o ensaio de Sim, porém é mais caro e exige tempos de incubação mais do que de ONPG. Além disso, a mudança de cor induzida pela clivagem de substrato por β-galactosidase é mais dramática com CPRG, tornando mais fácil para os alunos a Visualizar resultados.

Miller et al . (2010), quem projetou o fermento utilizado no presente protocolo, observou aquele fermento expressando ERβ foram 30 x mais sensíveis ao 17 β-estradiol que fermento expressando ERα, uma conclusão fundamentada por nossos dados¹⁴. Além de nuances possíveis na construção do plasmídeo, Miller et al . (2010) não poderia explicar essa diferença de sensibilidade¹⁴. Uma diferença entre as duas construções de plasmídeo é que a expressão ERα é regulada pela galactose, enquanto expressão de ERβ é regulada por glicose ou galactose. O fermento utilizado no ensaio de Sim são cultivadas em meios de glicose e só dado galactose, quando eles são diluídos no início do ensaio. Portanto, levedura expressando ERβ pode acumular maior número de cópias das proteínas do receptor antes do início do ensaio, conferindo assim maior sensibilidade para ligantes estrogênicos.

A baixa sensibilidade de levedura ERα-expressando pode explicar as maiores taxas de não-detecção de estrogenicity em amostras medidos com ERα comparado com ERβ. Para aumentar a probabilidade de que a amostra EEQs será detectado, usuários poderiam empregar métodos e solventes de extracção diferentes ou adicionar mais elevados volumes de amostra para o fermento. Se maiores volumes de amostra são usados, as concentrações dos padrões E2 devem ser ajustadas de tal que o mesmo volume de amostras e padrões pode ser usado no ensaio. Uma limitação da adição de amostra mais é que o fermento pode tolerar apenas 6-10% de etanol, com melhor tolerância a temperaturas de incubação de 30 vs 35 ° C²⁰. Para controlar para os efeitos do álcool na levedura, os investigadores devem adicionar triplicado "fermento apenas" poços para o layout da placa e confirmar que o OD₆₁₀ desses poços "fermento apenas" é comparável do OD₆₁₀ dos poços de controle do veículo imediatamente após a adição de buffer de LacZ. Alternativamente, as amostras em etanol podem ser adicionadas a placas de micropoços seco e o etanol evaporado fora antes de levedura são adicionados. Dimetilsulfóxido (DMSO) é também usado como um solvente da amostra em Sim ensaios, mas a concentração de trabalho final de DMSO com fermento deve ser limitada a 1%¹².

O ensaio de Sim é uma ferramenta poderosa de triagem para detecção de estrogenicity em amostras ambientais. Especificamente, o Sim detecta ligandos que se ligam a receptores de estrogênio nuclear que interagir com elementos de resposta de estrogênio para direcionar a expressão de gene¹⁴. No entanto, o sim também tem limitações importantes. O sim não detecta EEs que funcionam através de mecanismos não-nucleares, tais como receptores de estrogênio de membrana ou mecanismos que envolvem elementos adicionais tais como fatores de transcrição de ativador da proteína 1 (AP-1). Além disso, porque o fermento não têm a mesma capacidade metabólica como células de mamíferos, o sim não consegue detectar ligantes que requerem ativação metabólica para ser estrogênicos.

Além disso, o ensaio é prontamente não pode diferenciar entre estrogênicas e anti-estrogênicas ligantes em amostras complexas. Em vez disso, mede estrogenicity líquido , que é o efeito de soma de ligantes estrogênicas e anti-estrogênicas. Para quantificar a concentração dos antagonistas de ER ou avaliar a atividade inibitória de misturas, o ensaio pode ser modificado por incubando a levedura com o agonista padrão (17 β-estradiol) e um intervalo de teste de amostra concentrações¹². Este processo determina se antagonistas nas amostras podem diminuir a atividade de repórter induzida pelo agonista e fornece uma tela útil para identificar a presença de antagonistas de ER em amostras.

O protocolo apresentado aqui pode acomodar uma variedade de tipos de amostra, embora algumas amostras podem exigir modificações para as etapas de preparação de extração e amostra. Por exemplo, EEQs variadas amplamente entre repetições de alguns produtos de cuidados pessoais. As amostras mais variáveis tendem a conter gotículas de óleo, ou caso contrário não eram inteiramente homogêneas, indicando que um solvente mais lipofílico como éter dietílico seria útil. Alternativamente, óleos e cera em produtos de cuidados pessoais podem ser excluídas por extrair amostras com 50% de etanol em vez de 100% de etanol.Uma extração de etanol 50% também irá capturar mais ligantes estrogênicos solúvel em água (por exemplo, alguns pigmentos). No entanto, 50% etanol evapora mais lentamente do que o etanol 100% e assim pode estender o tempo de extração. Além disso, algumas amostras (tais como sabões) foram citotóxicas para levedura, resultando em medições de densidade celular reduzida (OD₆₁₀). Fox et al . (2008) sugerem que tais amostras devem ser diluídas e retestadas se as diferenças de densidade celular excederem 30% em relação ao veículo controle poços¹².

Se o ensaio de Sim é usado para fins de investigação analítica, curvas de diluição das piscinas de amostra podem ser testadas para determinar preventivamente volumes adequados de extrato para ser adicionado a levedura na etapa 4.5. Alternativamente, extractos podem ser testados simultaneamente em vários volumes (por exemplo, 5 µ l e 20 µ l extrato adicionado ao fermento na etapa 4.5) ou diluições que abrangem ordens de magnitude (por exemplo, 0,2 µ l, 2 µ l e 20 µ l). "Apropriados" volumes do extrato são aquelas que identificam estrogenicity combinando LacZ valores ao longo da parte linear da curva padrão. Otimização evita problemas causados pela adição de amostra demasiado ou demasiado pouco para o fermento, como citotoxicidade, falso-negativos ou estrogenicity que excede a curva padrão. Como mencionado acima, os volumes de amostras e padrões de E2 devem ser ajustados quando diferentes quantidades de ligante são utilizadas tal que fermento estão expostos a um volume consistente e concentração de etanol ou outro veículo através da placa.

Apesar do potencial para falsos negativos, o ensaio de Sim foi identificado como uma ferramenta de teste de nível 3 para os desreguladores endócrinos por Schug et al (2013), que desenvolveu um abrangente protocolo hierárquico para disrupção endócrina (TiPED)²¹. Para o ensino de graduação, o ensaio é valioso para o ensino de conceitos relacionados à disrupção endócrina, cultura celular, ligação ao receptor, atividade enzimática, engenharia genética, estatística e delineamento experimental. Os alunos que usam o ensaio também praticam habilidades fundamentais e amplamente aplicável laboratório tais como diluir serialmente padrões; extração de amostras; fazendo soluções; construir e interpolação curvas padrão; cálculo de concentração; fazendo soluções; demonstrando a técnica estéril; cultivo de células; identificação de variáveis e controles; coletar, organizar e analisar dados; construção e interpretação de gráficos; e utilizando equipamentos comuns de laboratório tais como micropipettors e espectrofotômetros.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Vortex Mixer (for single or multiple tubes)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-215-365	Any mixer will suffice.
Bucket centrifuge	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	75-063-839	Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.
Bunsen burner	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	17-012-823	Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.
Incubator	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	50125590H	Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C.
Microplate reader	BioTek (www.biotek.com)	EPOCH2	A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.
Gen5 microplate reader and imager software	BioTek (www.biotek.com)	GEN5	Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.
Refrigerator	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	05LREEFSA	Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C.
Pipettor or PipetAid compatible with 1 - 10 mL serological pipets	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-681-15E	Any pipettors will suffice if they are compatible with 1 & 10 mL serological pipets.
P10 micropipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F144562G	Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl.
P200 micropipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F144565G	Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl.
P300 multichannel pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FBE1200300	Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 - 205 µl.
Repeating pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F164001G	Must be able to deliver 100 - 320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Sterile 15 mL conical tubes with caps	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	05-539-801
Glass scintillation vials	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	03-337-4
Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (nonsterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	12565501
Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid	Cole-Parmer (www.coleparmer.com)	EW-01728-81
100 mL glass beakers	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-539H	Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.
250 mL glass Erlenmeyer flasks	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FB500250	Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.
Sterile, adhesive, porous film	VWR (www.vwr.com)	60941-086
Metal forceps	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	12-000-157	Any metal forceps will suffice.
Reagent reservoir	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	07-200-127
Filtration units (0.2 µm)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	09-761-52
Squirt bottle (for ethanol)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-897-10	Any laboratory squirt bottles will suffice.
Autoclavable storage bottles	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	06-414-1D	Any autoclavable glass storage bottles will suffice.
10 mL glass serological pipets (sterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-678-27F	Any glass serological pipets will suffice.
1 mL glass serological pipets (sterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-678-27C	Any glass serological pipets will suffice.
P10 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-3810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P200 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-8810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P300 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-9810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
Syringe tips for repeating pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F164150G	Only required if a repeating pipettor is used.
Sterile petri dishes	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FB0875712	Any sterile petri dishes will suffice.
Parafilm	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	S37440
Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast
Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g., W303a)	American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)	MYA-151	Recombinant yeast are also available upon request from the authors.
Receptor/reporter plasmid for ERα	Addgene (www.addgene.org)	pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061)
Receptor/reporter plasmid for ERβ	Addgene (www.addgene.org)	pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Difco agar	BD (www.bd.com)	214530
Dithiothreitol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	D0632	CAUTION:  Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.  Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	N1127
Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	10884308001
Yeast nitrogen base	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	Y0626
Glucose	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	G8270
Galactose	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	G5388
Adenine sulfate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	A9126
Uracil	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	U0750
Leucine	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	L8000
Histidine	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	H8000
17 β-Estradiol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)                     MP Biomedicals	E8875-250 mg     0219456401 - 1 mg	CAUTION:  Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.  It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.  Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.  Estradiol is very toxic to aquatic life.  Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.  Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.
100% ethanol	Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)	111000200
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S9638
Sodium phosphate dibasic (anhydrous)	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S0876
Magnesium chloride	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	M8266
Potassium chloride	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	P9333
Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt)	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	L5125
Sodium carbonate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S7795
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Excel spreadsheet software	Microsoft		Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.
Java software (required for Appendix 1 application)	Oracle Corporation		To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.  LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards.
JMP statistical software version 13.0.0	SAS Institute		Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.  The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.
R statistical computing and graphics software	R Foundation		Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.  Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.