Real-time Iontophoresis med tetrametylammonium for å kvantifisere volumfraksjon og tortuositet i hjernens ekstracellulære rom

Summary

Denne protokollen beskriver sanntids-iontoforese, en metode som måler fysiske parametere for det ekstracellulære rommet (ECS) av levende hjerner. Spredningen av et inert molekyl som slippes i ECS, brukes til å beregne ECS volumfraksjonen og tortuositeten. Det er ideelt for å studere akut reversible endringer i hjerne ECS.

Abstract

Denne anmeldelsen beskriver de grunnleggende konseptene og protokollen for å utføre realtids iontoforese-metoden (GI), gullstandarden for å undersøke og kvantifisere det ekstracellulære rommet (ECS) av levende hjerne. ECS omgir alle hjerneceller og inneholder både interstitiell væske og ekstracellulær matrise. Transport av mange stoffer som kreves for hjernens aktivitet, inkludert nevrotransmittere, hormoner og næringsstoffer, skjer ved diffusjon gjennom ECS. Endringer i volum og geometri i dette rommet forekommer under normale hjerneprosesser, som søvn og patologiske forhold, som iskemi. Men strukturen og reguleringen av hjernen ECS, særlig i sykdommer, forblir stort sett uutforsket. RTI-metoden måler to fysiske parametere av levende hjerne: volumfraksjon og tortuositet. Volumfraksjon er andelen av vevvolumet okkupert av ECS. Tortuosity er et mål på den relative hindringen et stoff møter når det diffunderes gjennom hjernenGion i forhold til et medium uten hindringer. I RTI pulses et inert molekyl fra en kilde-mikroelektrode til hjernen ECS. Som molekyler diffunderer vekk fra denne kilden, måles den skiftende konsentrasjonen av ionet over tid ved å bruke en ion-selektiv mikroelektrode plassert omtrent 100 μm unna. Fra den resulterende diffusjonskurven kan både volumfraksjon og tortuositet beregnes. Denne teknikken har blitt brukt i hjerneskiver fra flere arter (inkludert mennesker) og in vivo for å studere akutte og kroniske endringer i ECS. I motsetning til andre metoder kan RTI brukes til å undersøke både reversible og irreversible endringer i hjernens ECS i sanntid.

Introduction

Det ekstracellulære rommet (ECS) er nettverket av sammenkoblede kanaler utvendig til alle hjerneceller og inneholder både interstitialvæske og ekstracellulær matrise ( figur 1a og figur 1b ). Fordelingen av mange stoffer som kreves for hjernecellens funksjon, inkludert næringsstoffer, hormoner og nevrotransmittere, oppstår ved diffusjon gjennom ECS. Endringer i de fysiske parametrene til dette rommet, inkludert volum, geometri og ekstracellulær matrise, kan drastisk påvirke diffusjon gjennom ECS og de lokale ionkonsentrasjonsbadinghjerneceller, som har en dyp innvirkning på hjernecellens funksjon ^{1 , 2} .

Real-time iontophorese (RTI) brukes til å bestemme to strukturelle egenskaper i en hjerneområde: volumfraksjon og tortuosity ^{3 , 4 ,}"Xref"> 5. Volumfraksjon ( α ) er andelen av vevvolum okkupert av ECS ( V _ECS ) i forhold til totalvevvolumet ( V- _vev ) i et representativt elementært volum;

Tortuosity ( λ ) er den relative hindringen som et stoff møter når det diffunderer gjennom en hjerneområde i forhold til et medium uten hindringer;

Hvor D ^* (cm ² s ^-1 ) er den effektive diffusjonskoeffisienten av stoffet i hjernen og D (cm ² s ^-1 ) er den frie diffusjonskoeffisienten av stoffet i et fritt medium, slik som fortynnet agarosegel.

I dag er den mest brukte probesubstansen for RTI-metoden er den lille kationtetrametylammonium (TMA). TMA har en molekylvekt på 74 g / mol, dissocieres fullstendig i oppløsning, og har en positiv ladning. RTI studier med dette ionet har vist at α 0,2 og λ 1,6 ^{1 , 2} . Dette betyr at ECS er omtrent 20% av total hjernevolum, og at diffusjonen av et lite inert molekyl forekommer omtrent 2,5 ganger langsommere i ECS enn i et medium uten hindringer ³ . Imidlertid varierer både a og λ med hjernealder, region og tilstand og i patologiske forhold ¹ . Endringer av disse parametrene har vært knyttet til hjernens utvikling, aldring, søvn, epilepsi og mange andre grunnleggende prosesser og sykdommer i hjernen ^{1, 6} . Mens andre teknikker måler α og λ , kan RTI måle både i lokaliserte områder av levende vev i sanntid. Av denne grunn har RTI blitt et uunnværlig verktøy for å undersøke endringer i a og λ under akutte og reversible utfordringer.

Teorien som støttet RTI ble opprinnelig godkjent av Nicholson og Phillips, og teknikken har blitt brukt mye siden den tiden ^{4 , 7} . Eksperimenter som benytter RTI begynner med frigjøring av en puls av TMA fra en kilde-mikroelektrode ved iontoforese inn i en fortynnet agarosegel. Når de er utkastet, diffunger ioner fritt fra punktkilden, og velger fra et potensielt uendelig antall tilfeldige veier ( figur 1d ). Den endrede konsentrasjonen av ionet måles over tid ved å bruke en jon-selektiv mikroelektrode (ISM) plassert grovt100 μm unna ( figur 1c ). Endringene i TMA-konsentrasjonen er grafet og montert på en kurve som gjør det mulig å beregne både D og transportnummeret til iontoforese mikroelektroden (parametere diskutert i protokollen). Med disse verdiene gjentas prosedyren i en hjerneområde av interesse for å oppnå D ^* og å beregne både a og λ . Kontroll av iontophorese mikroelektroden, datainnsamling, grafing og montering av TMA-konsentrasjonskurven og beregning av eksperimentelle parametere gjøres vanligvis av programmene Wanda and Walter, som er spesielt designet for dette formålet (programvaren og deres håndbøker er Fritt tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel).

Protokolldelen i denne anmeldelsen beskriver de grunnleggende prosedyrene som trengs for å designe og utføre RTI i hjerneskjær av gnagere. Teknikken har også blitt brukt i ikke-stangEnt modeller, inkludert humane hjerne skiver og in vivo hjernen preparater ^{1 , 4 , 6 , 8 , 9} . Den Representative Results-delen inneholder både ideelle og ikke-ideelle resultater for å markere nyanser i datatolkning. Endelig dekker diskusjonsseksjonen feilsøkingsteknikker, begrensninger av RTI, alternative teknikker som brukes til å studere ECS, og fremtidige applikasjoner av RTI.

Figur 1: Diagrammer av diffusjon gjennom ECS. ( A ) Diagram over ECS: Demonstrer størrelsen og plasseringen av ECS i en typisk hjerneseksjon. Gul markerer ECS mellom de grå hjernecelleprosessene. Volumet av ECS er omtrent 20% av det totale vevvolumet ( dvs. volumfraksjon = 0.2) under fysiologiske forhold. ( B ) Forstørret diagram av ECS: Fremhever fysiske parametre som bidrar til tortuositet, inkludert hjernecellet geometri (grå) og ekstracellulær matrise (diagrammet som et maske av flerfarget glykosaminoglykaner og proteoglycaner). ( C ) 3D-diagram av diffusjon fra en punktkilde: Demonstrerer netto bevegelse av inerte molekyler fra en iontoforetisk kilde til en ISM. Uten diffusjonsbarrierer og opptak av cellene diffunderer molekylene utover i alle retninger, og produserer en sfærisk konsentrasjonsfront. ISM kvantifiserer den lokale konsentrasjonen av de inerte molekylene frigjort fra den iontoforetiske kilden. ( D ) Datasimulering av diffusjon i hjernens ECS: [Langt til venstre] Oppsett for Monte Carlo-simulering; Grønne sfærer representerer hjernecelleprosesser og det røde kors representerer en punktkilde. Dette oppsettet modellerer hjernevævet diagrammet i figur 1a . [Midtbilder] 3 og6 molekyler utfører tilfeldige bevegelser som de diffunderer gjennom hjernens ekstracellulære rom, vist i 2 dimensjoner. [Langst til høyre] Tilfeldige turer av mange molekyler utgitt fra punktkilden. Netto bevegelse av alle molekyler fra punktkilden er utover som vist i figur 1c . De kumulative tilfeldige turene skisserer mellomromene mellom cellene ( dvs. ECS, se referanse ⁵ for videre forklaring). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Alle dyreprosedyrer, som brukes til å oppnå vevsprøver, ble godkjent av dyreetikkutvalget ved SUNY Downstate Medical Center.

1. Fremstilling av løsninger og utstyr

1. Klargjør en 150 mM NaCl-fyllingsløsning for referansekranen til ISM. Oppbevar den i en 10 ml sprøyte festet til et 0,22 μm filter (for å fjerne bakterier eller partikler).
2. Forbered en 150 mM TMA klorid (TMA-Cl) påfyllingsløsning for mikroelektroder. Oppbevar den i en 10 ml sprøyte festet til et 0,22 μm filter. Klargjør TMA-Cl-løsningene (i denne protokollen) fra en 5 M produsent lagerløsning for å sikre riktig konsentrasjon.
3. Kloridisere minst fire sølvtråd for fremstilling av mikroelektroder ved å senke ledningene i blekemiddel (natriumhypokloritt) i minst 2 timer. Fjern overflødig blekemiddel med etanol og la ledningene tørke.
4. Tilbered 50 ml 0,3% agarose i 150 mM NaCl og 0,5 mM TMA-Cl i et begerOg dekke det. Bruk agarose som er pulverisert og rimelig frisk for å sikre god diffusjonsmåling.
5. Varm og bland agaroseoppløsningen med en omrøringsbjelke for å oppløse den. La løsningen avkjøles til romtemperatur. Oppbevar dette ved 4 ° C i opptil 1 uke.
6. Forbered en likegyldig (jord) elektrode laget av 4% agarose i 1 M KCl (retninger i tillegg A)
7. Fremstil en liten, porøs kopp som passer inn i forsøkskammeret og som muliggjør elektrisk kontinuitet mellom innholdet og omgivelsene ( figur 2a ). Legg en metallring på bunnen av denne koppen for å forhindre at den flyter når den er delvis nedsenket i vann.
8. Bruk seriell fortynning av en 5 M TMA-Cl lager for å lage fem 100 mL TMA-Cl løsninger for kalibrering av ISMene. Løsninger bør ha endelige konsentrasjoner på 0,5, 1, 2, 4 og 8 mM TMA-Cl, alt i 150 mM NaCl. Oppbevar kalibreringsløsningene i en forseglingsbar kopp for å forhindre fordampning. </ Li>

2. Elektronisk oppsett

1. Koble komponentene til RTI eksperimentelle oppsett i henhold til blokkdiagrammet i figur 2b ; Inkludere en forsterker med to inngangskanaler (hvorav den ene skal være veldig høyimpedans for ISONs ion-selektive fat), et lavpassfilter satt til 10 Hz, en diagramopptaker, en A / D + D / A Omformer, en iontoforetisk enhet (eller en forsterker som er i stand til å levere konstantstrømspulser) og en datamaskin (PC) som kjører Wanda og Walter-programmene. Kontroller det elektroniske oppsettet for å bekrefte at alle tilkoblinger er på plass.
2. Skjerm eksperimentell oppsett i et jordet kabinett (for eksempel Faraday-bur), om nødvendig, ettersom ISM har høy motstand og er følsomme for gjenstander som er opprettet av nærliggende bevegelser.
3. Opprett en dedikert ISM-kalibreringsstasjon som består av en dobbel inngangsforsterker, en diagramopptaker, en passende ISM-holder og en likegyldig jordelektrode. Hvis mulig,Skjerm innkapslingen. Hopp over dette trinnet hvis ISMene er kalibrert i forsøksoppsettet (trinn 3.29)

Figur 2: Porøs eksperimentell kopp og elektronisk oppsett. ( A ) Porøs eksperimentell kopp: Et porøst nett brukes til å lage en eksperimentell kopp som muliggjør elektrisk kontinuitet mellom agarosen (innsiden) og den eksperimentelle badevæsken (utvendig). En metallring er festet til bunnen av koppen for å hindre at koppen flyter i badeoppløsningen. ( B ) Blokkdiagram over RTI-oppsettet (trinn 2.1 og 2.2): En ISM er koblet til en forsterker (amp.). ISM har to fat. En inneholder flytende ionbytter (LIX) i spissen og genererer en spenning proporsjonal med logaritmen til TMA-konsentrasjonen ved spissen sammen med den lokale omgivelsespenningen. thE signalvei er representert av en rød linje. Den andre fatningen av ISM kalles referanse fatet og måler omgivelsespenningen ved spissen av ISM; Den er koblet til med en blå signalbane. Forsterkeren har to såkalte hodetrinn som kobler til ISM; Disse enhetene har en forsterkning på 1 (x1) og samsvarer med mikroelektrodens høyimpedans til den lave impedansen til resten av forsterkerkretsene. Hodetrinnet som er koblet til det ion-selektive fatet, må kunne samsvare med en innkommende motstand på ca. 1000 MΩ, mens motstanden til referansekartet typisk er ca. 10 MΩ. Etter å ha forlatt hodetrinnet, blir spenningen fra referansekanelen omvendt og subtraheret fra spenningen på det ion-selektive fatet ved hjelp av en summeringsforsterker (Σ) for å oppnå den rene ion-signalspenning. Utgangene fra forsterkeren går til en signalkondisjoneringsenhet som gir ytterligere forsterkning og et multipole lavpassfilter (≤ 10 Hz, vanligvis en Bessel fiLter), som fjerner støy og forhindrer signal aliasing ved analog-til-digital-omformeren (A / D). Utgangene til filteret vises også på en strip-diagramopptaker. A / D-konverteren digitaliserer signalene og sender dem til en personlig datamaskin (PC). PCen genererer også et digitalt signal som konverteres av en digital-til-analog-omformer (D / A) til en analog spenningspuls som tilføres til iontoforeseenheten, som omdanner spenningen til en strømpuls med konstant amplitude og sender den Til iontoforese mikroelektroden. Jontoforese signalveien er representert av en grønn linje. Datainsamlings- og iontoforese-signalet er under kontroll av Wanda-programmet, som genererer en utdatafil for hver diffusjonspost i form av en spennings-mot-tidspilling, sammen med alle parametrene som definerer eksperimentet. Et annet program, Walter, leser utdatafilen og bruker ISM-kalibreringsdata for å konvertere de digitaliserte spenningene til konsentrasjoner. Konsentrasjonen veRsus tidskurver monteres deretter i Walter til riktig løsning til diffusjonsligningen. D og n _t ekstraheres hvis mediet er agarose, og A og a ekstraheres dersom mediet er hjerne. Analoge signaler er faste linjer; Digitale signaler er stiplede linjer. Det er også en likegyldig jordelektrode (ikke vist) i badekaret som inneholder skiven. Røde linjer = ion signal, Blå linjer = referansesignal, Grønne linjer = iontophorese kommando, Solid linjer = analog, Stiplede linjer = digital. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Fremstilling og kalibrering av ion-selektive mikroelektroder

1. Fremstil ISMer ved hjelp av protokollen under en dag før eksperimentet. Lag ISM i grupper for å sikre at minst to jobber på eksperimentets dag.
   MERK: De fleste ISM er stabile for en dag ellerto. ISM-fabrikasjon er følsom for fuktighet og atmosfæriske forhold. Ikke alle mikroelektroder vil kalibrere med hell.
2. Klipp bort omtrent 0,5 cm glass på enden av en av fatene i en dobbeltborrelert borosilikatglasskapillær ved å bruke et gammelt par tang.
3. Chip en enkelt fat i motsatt ende av kapillæren ( Figur 3a ). Sørg for at septum ikke er skadet (kritisk). Forsiktig: Bruk vernebriller for å unngå skade på grunn av prosjektilglass.
4. Plasser kapillæren i en flaske aceton i minst 1 time for å fjerne forurensninger.
5. Fjern kapillæren fra acetonen og puls ren, tørr, komprimert nitrogengass eller luft gjennom den for å fjerne eventuell overskytende aceton. Fjern alt aceton i kapillæren, da resterende aceton kan forstyrre silanisering (avgjørende).
6. Fremstille spissen av mikropipetten på enten en vertikal eller horisontal trekker. Skreddersy parametrene for å trekke en pipette med lang taper ogSkarp spiss, ca 1 μm eller mindre i diameter. På slutten av dette trinnet vil en kapillær bli laget i to pipetter ( figur 3a ).
7. Visualiser en enkelt mikropipett under et sammensatt, opprettholdt mikroskop med et 10X objektiv. Klipp spissen av ved hjelp av et glassmikroskop, slik at den endelige diameteren av spissen ( dvs. begge fatene) er mellom 2 og 5 μm ( figur 3b ). Denne pipetten blir fra nå av referert til som et ISM.
8. Fyll den flisete fatet av ISM med 150 mM NaCl-referanseløsning gjennom åpningen på den flisete siden ved hjelp av en 10 ml sprøyte festet til et 0,22 μm filter og en 28 G, 97 mm nål ( Figur 3b ). Ikke fyll fatet forbi tre fjerdedeler høyden på fatet.
9. Fyll den ikke-flisete fatet av ISM med 150 mM TMA-Cl fyllfylling. Pek på ISM forsiktig for å banke noen luftbobler ut av løsningen. Sjekk etter bobler under mikrofonenRoscope brukes til å chippe spissen.
10. Flamme på baksiden av ISM-en ved hjelp av en Bunsen-brenner for å sikre at det ikke kommer kommunikasjon av backfill-løsningen over septumet på baksiden av ISM. Sørg for at den øverste en fjerdedel av ISM er tørr etter flamming.
11. Sett inn en klorisert sølvtråd i referanseløsningen til ISM og bøy ledningen som stikker ut fra kapillæren for å markere dette som referansekartet ( figur 3c ). Kontroller at ledningen er nedsenket i fyllfyllingen og forblir i oppløsning i løpet av forsøket.
12. Skyv en kort lengde polytetrafluoroetylenrør (ca. 20 cm lang) over toppen av en 25 G sprøytenål. Plasser den andre enden av slangen på baksiden av det ion-selektive fatet. Sørg for at slangen er i tønnen, men over fyllingsløsningen ( figur 3c ).
13. Varm en tannpinne med en Bunsen-brenner og tett både slangen og silvenEr ledning i sine respektive fat ( figur 3c ). Kontroller at en komplett lufttetning er produsert rundt plastrøret i det ion-selektive fatet (kritisk).
14. Forbered en liten, gjennomsiktig glassbeholder (5 ml eller mindre) på 4% klortrimetylsilan i xylen. Forsiktig: Xylener og silaner er svært helsefarlige; Behandle begge kjemikaliene inne i en avtrekksdeksel og kast dem på riktig måte.
15. Plasser beholderen foran et stereo-disseksjonsmikroskop montert horisontalt i en avtrekksdeksel. Fest ISM'en vertikalt over beholderen ved hjelp av en mikromanipulator ( Figur 3d ).
16. Dip spissen av mikroelektroden i klortrimetylsilanløsningen.
17. Fest en tom 10 ml sprøyte til 25-gauge nålen som fører til ISM. Påfør et positivt lufttrykk fra sprøyten inntil en boble av TMA-Cl-oppløsning dannes; Dette trinnet skal utføres under direkte visualisering gjennom mikroskopet.
18. Pek på ISM-holderen forsiktig for å banke boblen av spissen.
19. Tegn klorotrimetylsilanløsningen til en høyde på omtrent 1.500 μm i spissen av ISM ved å bruke negativt trykk på 10 ml sprøyten.
20. Fullstendig klor klorotrimetylsilanløsningen fra spissen av ISM til en boble av TMA-Cl-oppløsning er skapt på spissen ( Figur 3d ).
21. Gjenta trinn 3.19 og 3,20 fem ganger. Forsikre deg om at en jevn, uavbrutt kolonne av væske trekkes inn i spissen hver gang. Hvis ingen løsning kan trekkes inn i spissen, kontroller om slangen er blokkert, lufttetningen er ufullstendig eller spissen av ISM er blokkert.
22. Skyll hele klorotrimetylsilanløsningen ut av spissen til en boble av TMA-Cl-oppløsning er opprettet.
23. Mens du opprettholder et positivt trykk på sprøyten, fjern ISM fra xylenløsningen. Sørg for at all xylen-løsningen utvises fra ISM-spissen, da overskytende xylen vil ødelegge excHanger kolonne opprettet i etterfølgende trinn.
24. Plasser spissen av ISM-en i en liten gjennomsiktig beholder (enten den ene veksleren kom inn eller en liten kyvett) inneholdende flytende ionbytter (LIX) for TMA. Utfør dette trinnet under direkte visualisering ved hjelp av det horisontale mikroskopoppsettet.
25. Påfør en liten mengde negativt trykk for å tegne en minimal mengde LIX i spissen ( dvs. så snart LIX er sett inn i spissen, slutte å bruke negativt trykk).
26. Koble 10 ml sprøyten fra slangen og la ISM sitte i 5 minutter. I løpet av den tiden vil LIX komme inn i den silaniserte spissen til den når en tilstand av likevekt.
27. Fjern ISM fra LIX. Trekk slangen ut av varmeveksleren (mens du fjerner så lite voks som mulig). Plasser en klorisert sølvtråd inn i den lille åpningen som er opprettet på baksiden av ISM. Tapp tråden i påfyllingsbatteriet med smeltet voks.
28. Tillat at ISM sitterI minst 30 min. Fest fullførte ISMer til innsiden av et beger ved hjelp av et hvilket som helst bøyelig, midlertidig lim.
29. Kalibrere ISM ved å registrere spenningen målt av ISM i hver kalibreringsløsning laget i trinn 1.8.
    MERK: Kalibrering kan utføres i en kalibreringsstasjon (se trinn 2.3) eller i forsøksoppsettet. Denne prosedyren er beskrevet i tillegg B og i Haack et al. ¹⁰ .
30. Hvis ISM-kalibreringen var vellykket for flere ISM-er, pause her til dagen for den tiltenkte bruk. Hvis ikke, fremstill flere ISMer.
31. På eksperimentets dag kalibrerer du mikroelektroden igjen (se trinn 3.29).

Figur 3: Fremstilling av en ion-selektiv mikroelektrode. ( A ) ISM etter chipping bak enden av en kapillær og trekking (trinn 3.2-3.6): En enkelt fat i begge ender oFa glass kapillær er chipped. En ISM genereres ved å trekke en dobbelt-barreled glasskapillær for å generere to mikropipetter med fine tips. ( B ) ISM etter påfylling av begge fatene (trinn 3.7-3.9): Spissen av en enkelt ISM er fliset til en diameter på 2-5 μm. Det ion-selektive fatet fylles på nytt med TMA-Cl, og referansekartet fylles på nytt med NaCl. ( C ) ISM før belegging med klortrimetylsilan (trinn 3.11-3.13): En klorisert sølvtråd settes inn i referansekartet. Polytetrafluoretylenrør (PTFE) er koblet til en 25 G nål og satt inn i det ion-selektive fatet. En lufttett forsegling på toppen av begge fatene er opprettet ved bruk av dental voks. ( D ) Coating en mikropipett med klortrimetylsilan (trinn 3.15-3.26): [Lav forstørrelse] En ISM suspendert i klortrimetylsilan i tråd med et horisontalt montert stereomikroskop. [Høy forstørrelse] Utsikten gjennom en horisontalt montert stereomicroscÅpning av et ISM-tips i klortrimetylsilanløsning. Etter visualisering av spissen gjennom et mikroskop, blir liten mengde TMA-Cl-løsning utvist fra det ion-selektive fatet (nok til å generere en liten boble av TMA-Cl-oppløsning). ISM-holderen er tappet for å frigjøre en TMA-Cl løsning boble og deretter klortrimethylsilan er trukket opp i spissen. Denne syklusen gjentas flere ganger. Etter at klorotrimetylsilan er utslettet fra ISM, blir ISM plassert i væsken-ionbytteren (LIX) for TMA, og LIX er trukket inn i spissen av det ion-selektive fatet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Fremstilling av Iontopesis Microelectrodes

MERK: Iontopesis mikroelektroder skal fremstilles på eksperimentets dag.

1. Trekk en dobbeltboret borosilikatglasskapillær på en vertikal eller hoVannrett trekk. Tilpass parametrene for å trekke en pipette som ligner mikropipettene trukket i trinn 3.6 ( figur 4a ).
2. Plasser mikropipetten under det sammensatte mikroskopet som ble brukt i trinn 3.7, og kutt spissen av ved hjelp av et glassmikroskoprør slik at den resulterende diameteren er mellom 2 og 5 μm ( figur 4a ).
3. Fyll begge fatene med 150 mM TMA-Cl gjenfyllingsløsning ved hjelp av en 10 ml sprøyte festet til et 0,22 μm filter og en 28 G, 97 mm nål ( Figur 4a ).
4. Tapp mikropipetten forsiktig for å sikre at ingen luftbobler blir igjen i løsningen av begge fatene.
5. Plasser kloridiserte sølvtråd i begge fatene på mikropipetten. Forsikre deg om at ledningene er dyp nok i fyllingsløsningen slik at de forblir i kontakt med løsningene for eksperimentets varighet.
6. Tett ledningene i fatene ved å bruke varm tannvoks. Forsikre forsiktig t Han kabler ved å vri dem rundt hverandre (fullført mikroelektrode vist på figur 4b ).

Figur 4: Fremstilling av en Iontopesis Microelectrode. ( A ) Iontophores mikroelektrod etter gjenfylling av begge fatene (trinn 4.1-4.3): En iontoforese mikroelektrode trekkes fra et kapillærrør. Spissen av mikroelektroden er fliset til en diameter på 2-5 μm. Begge tønner av iontophores mikroelektroden er fylt med TMA-Cl løsning. ( B ) Fullført iontoforese mikroelektrode (trinn 4.5-4.6): En iontoforese mikroelektrode med to kloridiserte sølvtråder satt inn i fatene. Tappene av mikroelektroden er forseglet med voks, og sølvtrådene vrides sammen på baksiden av mikroelektroden./files/ftp_upload/55755/55755fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5. Fremstilling av kunstig cerebrospinalvæske og gnagere i hjernevevssnitt

1. Forbered 1 liter kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) med en sammensetning som er passende for forsøket og tilsatt 0,5 mM TMA-Cl til den.
   MERK: TMA-Cl er nødvendig for å etablere en bakgrunnskonsentrasjon av TMA under forsøket.
2. Klargjør gnagere hjernesnitt med en tykkelse på 400 μm i henhold til standardprotokollene ^{11 , 12} . Bruk ACSF forberedt i trinn 5.1 for disseksjon og vedlikehold av hjerneskiver.

6. Real-time Iontophoresis i Agarose

1. Slå på datamaskinen som kjører Walter og Wanda-programmene.
   MERK: Disse programmene er fritt tilgjengelige på forespørsel. Mens denne programvaren ikke er nødvendig, programmerer tilsvarendeProgramvare eller utførelse av analysen for hånd ellers ville være nødvendig.
2. Kjør ACSF gjennom nedsenkningskammeret med en passende hastighet ( f.eks. 2 ml / min). Still temperaturregulatoren til ønsket temperatur og boble ACSF med 95% O ₂ /5% CO ₂ (eller en annen egnet gassblanding) i løpet av forsøket.
3. Monter en likegyldig (jord) elektrode i en passende holder og senk spissen inn i ACSF som går gjennom nedsenkningskammeret. Koble ledningen til bakken av opptaksoppsettet.
4. Fyll den porøse koppen (laget i trinn 1.7) med den 0,3% agarose som er tilberedt tidligere, og plasser den i nedsenkningskammeret. Pass på at løsningen ikke løper over toppen av koppen.
5. Sikre en kalibrert ISM til pipettholderen til en mikromanipulator og en iontoforese mikroelektrode til den andre. Sett holderen til en vinkel som passer for oppsettet ( Figur 5a ).
6. KobleISM- og iontoforese-mikroelektroden ledes til de respektive hodetrinnene til opptaksforsterkeren. Alternativt kan du koble direkte til forsterkeren (avhengig av oppsettet).
7. Forsikre deg om at vekten / plasseringen av tilkoblingstrådene eller -klippene ikke forårsaker bevegelse av mikroelektroder, da små svingninger i posisjonering kan påvirke resultatene.
8. Slå på det elektroniske oppsettet (fra trinn 2). Start Walter og Wanda i separate tilfeller.
9. I Wanda GUI klikker du på "Kalibrere" ( Figur 6a ). I kalibreringsboksen ( figur 6b ) fyller du inn spenningene målt under ISM-kalibreringen (trinn 3.29) og klikker "Tilpass data".
   MERK: Dette muliggjør montering til følgende representasjon av Nicolsky-ligningen (alternativt plasser ligningen på annen måte for å oppnå M og K ):
   
   Hennee, V er den målte spenning (MV), M er den Nicolsky skråning (mV), C er konsentrasjonen av ionet (mM), er K interferensen (mM), og V ₀ er nullspenningen (mV) ^3.
10. Klikk på "Godta" i kalibreringsboksen for å automatisk overføre hellingen ( M ) og interferens ( K ) generert i trinn 6.9 til hovedgiren.
    MERK: Her representerer K Na-forstyrrelsen, som vanligvis er ubetydelig.
11. På venstre side av GUI, sørg for at alle eksperimentelle parametere er angitt i tilsvarende oppføringer ( figur 6a ).
    1. I kildemetoden-boksen, sett kilden til den iontoforetiske kilden (standard), "Record Duration" til "200 s" (standard), "Pulse Start" til "10 s" (standard), "Pulse End" Til "60 s" (standard), "Bias Current" til "20 nA" (standard),"Hovedstrøm" til "100 nA" (standard) og "Konverteringsfaktor" til en passende verdi.
    2. I Måleelektrode-boksen, sett "Bath C" til konsentrasjonen av TMA inneholdt i badoppløsningen (uttrykt i mM). Sett "Total Gain", "Output Channel", "ISM Channel" og "Ref. Channel" til passende verdier for datainnsamlingssystemet som brukes.
       MERK: "Konverteringsfaktoren" må settes til en passende verdi (spesifikk for den iontoforetiske enheten som brukes). Denne verdien spesifiserer mengden strøm som er bestått for en gitt påført spenning fra D / A-omformeren (nA / mV).
12. Plasser en temperatursonde i agarkoppen. Ta opp den målte temperaturen i "Temperatur" -inngangen i "Måleelektrode" -boksen i GUI-en ( Figur 6a ).
13. Slå på underfasebelysningen. Om nødvendig, slå på kameraet som er koblet til mikrofonenRoscope og kameraskjermer.
14. Senk mikroelektrodene minst 1000 μm dypt inn i agarosen og senter dem i koppen ( Figur 5b ). Visualiser dem under mikroskopet ved hjelp av et 10X-objektiv (vanndypingsmål med lang arbeidsavstand).
15. Forskjellig spenningen på forsterkeren til 0 mV for både referanse- og ISM-kanaler for å etablere spenningen som er registrert i agarosen som grunnlinjespenning.
16. På tokanalsforsterkeren, flytt ISM-kanalkontakten manuelt til spenningsuttrekkutgangen for å sette subtraksjonen 'på' mellom referanse- og ISM-kanalene.
    MERK: Subtraksjon sikrer at spenningen endres i ISM-kanalen, reflekterer endringene i TMA-konsentrasjonen alene.
17. Flytt ISM slik at det berører spissen av iontophores mikroelektroden. Senter tipsene på hverandre i alle tre retningsakser.
18. Null de relative posisjonene til begge mikroelektroder påMikromanipulator kontroll bokser. Sørg for at mikroelektroder er sentrert nøyaktig og nøyaktig (kritisk).
19. Flytt ISM 120 μm vekk fra iontophores mikroelektroden i en akse (venstre høyre akse, figur 5b ). Skriv inn denne avstanden i boksen "Måleelektrode" i GUI ( Figur 6a ).
20. Start et opptak ved å klikke "Acquire" i GUI ( Figur 6a ); La programmet ta opp et fullt opptak.
    MERK: Jonotfores mikroelektroden mottar en konstant biasstrøm. Etter å ha klikket på "Acquire," er det en kort forsinkelse før hovedstrømmen brukes i en begrenset periode.
21. Gjenta trinn 6.20 to til tre ganger. Vent til TMA-signalet returnerer til baseline før du kjøper nye poster; Programmet lagrer hver post for senere analyse.
22. Kontroller avstanden mellom de to mikroelektroder ved å flytte ISM tilbake tO nullstilling som er angitt av kontrollboksen. Hvis mikroelektrodene ikke lenger er sentrert, senter dem igjen ved hjelp av samme strategi som i trinn 6.17. Ta opp eventuelle endringer i elektrodens posisjon.
    MERK: Hvis avstanden endres med mer enn ca 2%, kan de rekorder som er oppnådd i trinn 6.19 ikke betraktes som nøyaktige, og nye må tas.

Figur 5: Oppsett for eksperimenter i agar. ( A ) Oppsett for eksperiment i fortynnet agar (trinn 6.1-6.5): En liten porøs beholder fylt med fortynnet agar plassert i et løpende perfusjonskammer. En mikroforelektrode (venstre side) og en ISM (høyre side) holdes av mikroelektrodeholdere; Mikroelektrodeholdere er montert i armene til robotmikromanipulatorer. En temperaturprobe plasseres i agargel, og en likegyldig jordelektrode er plAced i nedsenkningskammeret. ( B ) Forstørret visning av mikroelektroder i agar: En iontoforese mikroelektrode (venstre side) og en ISM (høyre side) visualiseres i agar ved hjelp av et 10x vanndypningsmål (objektiv nedsenket her i 150 mM NaCl). Mikroelektroder plasseres ved hjelp av mikromanipulatorer til en dybde på 1000 μm; Avstanden mellom mikroelektroder er 120 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Wanda Computer Software Interface. ( A ) Navigere Wanda grafisk brukergrensesnitt (GUI): Skjermbildet som vises etter å ha åpnet Wanda-programvaren. I boks (1) velges det passende medium, iontoforesemolekylet og teknikken. (2) "Kalibrere" klikkes for å åpneWanda Calibration-boksen. Etter kalibrering av ISM (se figur 6b og tillegg B) er ISM posisjonert i agar eller hjerne, som beskrevet i trinn 6 og 8 i protokollen. I boks (6) blir alle passende verdier for eksperimentet utført. (7) "Acquire" klikkes for å ta et opptak; En graf av spenning mot tid vises i øverste høyre del av Wanda GUI. ( B ) Kalibrere ISM i Wanda : Vinduet som åpnes etter å ha klikket på (2) "Kalibrere" i Wanda GUI. Verdiene fra trinn 3.29 er oppgitt i boks (3), og (4) "Tilpass data" er valgt. Kalibreringskurven er bekreftet å være lineær. (5) "Godta" klikkes for å gå tilbake til Wanda GUI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

7. Agarose Data Analysis

1. ÅpneWalter program på datamaskinen (PC). I menyen "0. Records From:" klikker du på "Wanda / VOLTORO" -knappen for å lese registret som er generert av Wanda ( Figur 7a ). Hvis du vil at utdata til et regneark er nødvendig, åpner du den riktige programvaren. Klikk "Ark 1,3" i "1. Skriv Excel?" Meny ( figur 7b ).
2. I det neste popup-vinduet velger du posten som skal leses og klikker på "Åpne" ( Figur 7b ); Legg merke til at postene automatisk skal graferes. For å starte monteringsprosedyre, utfør følgende trinn.
   1. I "2. Alternativer" -menyen, klikk på "velg rec" -knappen. I popup-vinduet " Figur 2 " bruker du musen til å flytte krysshårene over den første posten som skal behandles ( figur 7c ); Trykk på enten museknappen for å velge posten.
   2. Klikk på oN "passe kurve" i menyen. Velg ønsket antall iterasjoner av montering; Bruk minst 20 iterasjoner av montering for å oppnå en nøyaktig passform av dataene.
   3. I menyen, velg "alle" for å passe alle datapunkter og velg "fortsett;" Programmet passer til den viste kurven. Følg monteringsprosedyren og sammenlign eksperimentet med den beste monterte kurven som er oppnådd.
3. Velg alternativet for å skrive resultatet til riktig regnearksprogram ved å klikke på "Excel" i menyen "7. Resultat" ( Figur 7d ). Merk (og skriv inn) følgende kritiske data som skal brukes til å bestemme funksjonaliteten til iontophorese mikroelektroden: ' D (E5) ', ' Referanse D (E5) ', ' r_app ', transportnummer ' n _t ', ' Tilsynelatende N _t '.
   MERK: " D (E5) ": Målt fri diffusjonskoeffisientTx 10 ⁵ (cm ² / s); " Referanse D (E5) ": Teoretisk fri diffusjonskoeffisient x 10 ⁵ (cm ² / s). Denne verdien er hentet fra en database innen Walter basert på ion, medium og temperaturinngang. " R_app ": Tilsynelatende mikroelektrodeavstand (cm), beregnet ut fra målt og referanse D (E5) . " N _t ": Transportnummer (dimensjonsløs). Dette tallet bestemmer brøkdelen av iontophoresestrømmen som brukes til å frigjøre TMA ⁴ . "Tilsynelatende n _t": Tilsynelatende transport nummer (dimensjonsløs). Dette er et transportnummer beregnet fra r_app . Dette tallet skal være nær den målte n _t .
4. Gjenta trinn 7.1-7.3 for hver av postene for et valgt par mikroelektroder.
5. Bestem om iontophores mikroelektroden kan brukes ved å gjøre følgende.
   1. Sammenlign " r_app" med den faktiske r ( dvs. 120 μm); Dette kriteriet er oppfylt dersom gjennomsnittsverdiene fra alle forsøk er innenfor 4% av hverandre.
   2. Sammenlign " D (E5)" med referansen D (E5) ; Dette kriteriet er oppfylt hvis gjennomsnittsverdiene fra alle forsøkene ligger innenfor 8% av hverandre.
   3. Sammenlign " n _t " mellom forsøk med samme mikroelektrode; Dette kriteriet er oppfylt dersom gjennomsnittsverdier fra alle forsøk er innenfor 10% av hverandre.
6. Hvis et av kriteriene fra trinn 7.5 ikke var oppfylt, feilsøk iontophores mikroelektroden eller begynn å teste en annen.
7. Hvis iontophores mikroelektroden anses egnet for forsøket, må du registrere det gjennomsnittlige transportnummeret fra alle forsøkene i feltet Transportnummer N i Wanda GUI ( Figur 6a ).

jove_content ">
Figur 7: Walter Computer Software Interface. ( A ) Velge datainnsamlingsprogrammet i Walter: Menyen "0. Records From:" åpnes etter at Walter-programvaren er startet. Alternativet for å laste opp postene som er lagret av Wanda, er valgt ved å klikke på "Wanda / Voltoro" -knappen. ( B ) Velge data- og dataanalyseplasseringsstedet i Walter: [Venstre] Etter at riktig regnearkprogram er åpnet, er "Ark 1,3" valgt for å utføre all Walter-dataanalyse til det tidligere åpnede regnearkprogrammet. [Høyre] Etter at dataanalysutgangsstedet er valgt, åpnes et popup-vindu som lar brukeren velge de første og siste opptakene som skal leses av Walter. ( C ) Velge opptaket for å analysere i Walter: [Høyre] Etter at filene som skal leses er valgt, åpnes et popup-vindu med alle valgte plater disSpilt som en graf (" figur 2 "). [Venstre] I "2.Options" -menyen klikkes "select rec", og musen brukes til å flytte krysshårene for å identifisere den første innspillingen for analyse; Enten du trykker på museknappen for å velge innspillingen. ( D ) Eksportere dataanalysen fra Walter til et regneark: Etter å ha montert dataene, vises et popup-vindu og menyen "7. Resultat". [Venstre] Graf av det valgte innspillingen (blå) med den monterte diffusjonskurven generert av Walter (rød). [Høyre] Menyen "7. Resultat" lar brukeren skrive dataene fra analysen til et regnearksprogram ved å klikke på "Excel" -knappen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

8. Real-time Iontophoresis i hjerneskiver

1. Plasser en 400 μm tykk hjerne sLus i opptakskammeret, og sørger for at den er helt nedsenket i den flytende ACSF. Plasser skiven med en akvarell pensel og fest den forsiktig med et rutenett.
2. Flytt både iontophores mikroelektroden og ISM over interessepunktet på hjerneskiven. Dyp både i den flytende ACSF men over skiven.
3. Forskjellig spenningen for både referanse- og ion-sensingskanaler til "0" mV. Vent til spenningen i begge kanalene stabiliseres. På kartopptakeren merker du spenningen målt på ionensensjonskanalen på ISM. Bruk denne til å beregne baseline V-parameteren i Wanda.
4. Plasser ISM og iontophoresis mikroelektroden 200 μm dyp i skiven og 120 μm vekk fra hverandre. Vent til stabilisering av signalet etter at mikroelektroden er flyttet inn i hjerneskiven.
   MERK: Forspenningsstrømmen som brukes på iontophorese-mikroelektroden, forårsaker en liten opphopning av TMA. Det er en vanlig feil å ta arInnspillingen for tidlig og undervurderer signaloppbyggingen.
5. På kartopptakeren merker du den stabiliserte spenningen målt i hjerneskiven på ion-sensing-kanalen i ISM. Beregn spenningsforskjellen mellom TMA-signalet målt i trinn 8.3 og trinn 8.4 og skriv inn denne verdien i feltet "Baseline V (mV)" i Måleelektrode-boksen til Wanda GUI ( Figur 6a ).
6. På venstre side av GUI, sørg for at alle eksperimentelle parametere er riktig innspilt / angitt. Sett "Medium" til "Brain", "Transportnummer" til gjennomsnittsverdien beregnet for iontophores mikroelektroden i trinn 7.4, og "Temperatur" til temperaturen på badet som inneholder skiven.
   MERK: V må registreres for hvert sett med målinger. Grunnlinjen V vil bli konvertert av Wanda til baseline C (mM) parameteren ( dvs. konsentrasjonen av TMA i hjernevævet).
7. Start opptaket ved å klikke på "Acquire" og la det være fullt opptak. Vent til TMA-signalet går tilbake til baseline før du skaffer et nytt opptak.
8. Ta to til tre påfølgende innspillinger før du fjerner mikroelektroder fra valgt hjerneplassering. Skriv inn temperaturen målt i Wanda-programvaren umiddelbart før hvert opptak.
9. Flytt begge mikroelektroder diagonalt tilbake til overflaten av skiven. Løft begge til minst 50 μm over skiven. Ved hjelp av kartopptakeren bestemmer du hvilken som helst endring mellom V målt nå og målingen fra trinn 8.3.
10. Senter tipsene til ISM og de iontoforetiske mikroelektroder i forhold til hverandre i x-, y- og z-aksene. Få avstandsendringer, om noen, fra displayet til mikromanipulatorens kontrollboks.

9. Hjernedataanalyse

1. Åpne et nytt regneark for analyseutgangen.
2. Gjenta trinn 7.1-7.4 i Walter til analyserE opptakene tatt fra hjernen.
3. Skriv dataene på regnearkprogrammet ved å klikke "Excel" i Walter-menyen. Ta opp a , volumfraksjonen av hjernen ECS; Λ , tortuosity av hjernen ECS; Og k (s ^-1 ), ikke-spesifikk clearance.

10. Kontroller transportnummer og ISM-kalibrering

1. Mål ISM transport antall (n _t) ved slutten av forsøket ved anvendelse av protokollen nedenfor. Alternativt kan kontrollere n _t etter kritiske forsøk eller når målingene fremavvikende. Imidlertid kan sjekke n _t for mange ganger føre til traumer til hjernen skive.
2. Ta nye innspillinger i agarose. Se trinn 6.4, 6.11, 6.12, 6.14, 6.15 og 6.17-6.22.
3. Gjenta trinn 7.1-7.4 i Walter for å få n _t fra de nye agaroseopptakene. Kontroller regnearket: hvis n _t har endret seg med merEnn 10% fra n _t oppnådd før hjernemålingene, er dataene som er oppnådd med denne iontoforetiske mikroelektroden, ikke pålitelige.
4. Utfør en ny kalibrering (se trinn 3.29) for ISM etter at alle hjernedata er samlet. Bruk nyoppnådde ISM-kalibreringsdata som inngang i Wanda Calibrate-boksen (se trinn 6.9 og 6.10) og kontroller at skråningsverdien varierer med mindre enn 10% fra forrige kalibrering.
   MERK: Dataene som er oppnådd med denne ISM, er ikke pålitelige dersom hellingsverdien varierer med mer enn 10% fra forrige kalibrering.

Representative Results

Utnyttelsen av RTI-teknikken er demonstrert i et eksperiment designet for å måle endringene i a og under en hypoosmolær utfordring ( figur 8 og figur 9 ). Det har tidligere blitt vist at redusering av osmolariteten til ECS ved vask på hypotonisk ACSF vil gi en reduksjon i α og en økning i λ ¹³ .

I dette forsøket ble RTI utført på rottehjerne skiver under både kontrollbetingelser og under vasking av hypotonisk ACSF. En ISM ble fabrikkert, og kalibreringsparametrene ble innført i Wanda for montering til Nicolsky-ligningen, som beregnet en helling ( M ) på 58,21 mV. ISM- og iontofores mikroelektroder ble plassert i agar og plassert 120 μm fra hverandre for å måle transporten nåmber. Tre opptak ble tatt, og kurvene ble montert og analysert i henhold til prosedyren i trinn 6 i protokollen ( figur 8a ). Den tilpassede kurven til hvert forsøk overlappes med råkurven ( figur 8a ). Den målte diffusjonskoeffisienten ( D x 1E5 ), transportnummeret ( n _t ) og forskjellen mellom den tilsynelatende avstanden mellom mikroelektrodene ( r_app ) og deres faktiske avstand ( r ) var ikke vesentlig forskjellig mellom de tre innspillingene ( figur 8b , Opptak a1-3). Basert på disse kriteriene ble denne iontoforese-mikroelektroden ansett som akseptabel for å fortsette med forsøket.

Når den stabile iontoforese-mikroelektroden ble valgt, ble kontrollverdier for a og λ i rottehjernsnittet tatt for å etablere en basislinje for disse parametrene. preVious studier fant kontrollverdier for rotte neocortex å være a = 0,18-0,22 og λ = 1,54-1,65 ¹ . For å replikere disse verdiene i dette eksperimentet ble ISM- og iontoforese-mikroelektroden plassert 200 μm dypt i rotte-neocortex og 120 μm fra hverandre. Gjennomsnittet n _t , beregnet ut fra dataene i figur 8b , ble inngått i Wanda-programmet for bruk i beregningene av a og λ . Et skifte i baseline V fra plasseringen av de to mikroelektroder om 200 μm dypt i hjernen ble registrert, og spenningshoppet ble inngått i Wanda for å korrigere baseline TMA ( dvs. baseline C parameter) konsentrasjonen. Tre opptak ble tatt, og deres kurver ble montert ( figur 9a , figur 9d og figur 9f ). Passene avslørte et gjennomsnittA = 0,192 og λ = 1,69 ( figur 9e ). Spacing og shift i baseline V ble kontrollert etter at opptakene ble tatt, og de korrigerte verdiene ble angitt i Wanda for å reanalysere dataene (som beskrevet i trinn 8 i protokollen). De omberegnede verdiene varierte ikke signifikant, og verdiene som ble rapportert i figur 9d ble akseptert.

Den normale osmolariteten til ACSF er 300 mOsm. For å teste effekten av hypotonisk ACSF på α og λ i rotte somatosensorisk neocortex ble ACSF med en osmolaritet på 150 mOsm gjort ved å redusere NaCl-konsentrasjonen. Det ble antatt at denne hypotoniske ACSF ville føre til hevelse av hjerneceller, noe som forårsaket en lavere a og en potensielt høyere λ ¹³ . Hjernen skive ble superfused med hypotonisk ACSF i ca 30 minutter, slik at detÅ balansere med hjernen. I løpet av denne tiden forblir mikroelektrodene på samme sted i neocortex som de var under tidligere målinger av kontrollbetingelser. Fem opptak ble tatt under hypotoniske forhold ( figur 9b og f ). Dette ga et gjennomsnitt a = 0,13 og A = 1,84 ( Figur 9e ). Disse verdiene var i overensstemmelse med hypotesen om at hypoosmolaritet reduserer a og øker λ . Mellomrom og endringer i basislinje V ble målt og tatt i betraktning under analysen og monteringsprosedyren.

Utvinningsparametere ble også målt ved å vaske på vanlig ACSF (300 mOsm) og ta nye innspillinger på samme sted i neocortex. Fordi hevelseeffekter bør reverseres, var det forventet at a og λ ville komme seg til kontrollnivåer. Verdiene avBerørt over fire poster tatt etter 30 minutter med vanlig ACSF-vask var α = 0,37 og λ = 1,61 ( figur 9c , figur 9e og figur 9f ). Dette viste at det var en uventet overskudd under utvinning av α under disse forholdene ( Figur 9e og Figur 9f ). Etterpå ble mikroelektrodene returnert til agar for å bekrefte at transportnummeret til iontofores mikroelektroden var uendret ( figur 8c ). ISM ble deretter rekalibrert, og den nye passformen til Nicolsky-ligningen avslørte hellingen til å være 58,21 mV.

Dette eksperimentet er et klart eksempel på hva RTI ser ut under ideelle forhold. Følgende elementer i forsøket var nøkkelen til suksess. Først forsøksdata samlet inn iAgarose og hjernen demonstrerte tilstrekkelig overlapping med de teoretiske kurver generert av Wanda ( figur 8a og figur 9a og figur 9c ). Likheten i skråning, topp og tilbake til en lignende grunnlinje er alle viktige for å bestemme styrken til kampen. Disse delene av kurven er ofte problematiske ved opptak i agarose, og det er vanlig at flere opptak må tas før man finner forholdene som produserer godt tilpassede kurver ( dvs. gode mikroelektroder). For det andre var de gjennomsnittlige transportnumrene før og etter forsøket innen 10% av hverandre ( figur 8b og figur 8c ). Hvis dette ikke hadde skjedd, kunne verdiene som ble registrert i hjernen ikke stole på. Dette er langt det vanligste problemet som oppstår i RTI-eksperimenter. For det tredje, ISM-kalibreringer i standardiserte TMA-løsninger før og etterFor eksperimentet matchet (data ikke vist). Kalibreringene av et fungerende ISM er vanligvis innenfor 10%, noe som gjør dette til en uvanlig kilde til eksperimentfeil.

Figur 8: Ideelle kurvepassdata i agar før og etter eksperimentering i hjernen. ( A ) Representative data fra en forsøk i agar: [Langt til venstre] Representative data fra en enkelt prøve oppnådd i agar som demonstrerte konsentrasjonskurven for TMA. Før diffusjonsmålinger ble en konstant biasstrøm på +20 nA påført gjennom iontophores mikroelektroden. På tidspunktet = 10 s ble TMA pulset fra iontofores mikroelektroden inn i agaret ved å påføre en +60 nA hovedstrøm i 50 s. En diffusjonskurve ble generert ved å måle [TMA] over tid ved å bruke en ISM plassert 120 μm fra kilden. [Midt] En tilpasset kurve hentet fra data sRocessing i Walter. [Høyre] Overlapningen av dataene og den tilpassede kurven demonstrerer at kurvmontering gjort av Walter nøyaktig modellerer diffusjon i denne forsøket. ( B ) Tabell med agarmålinger før eksperimentering i hjernen: Data oppnådd fra tre forsøk (a1, graftet ovenfor) før hypotoniske stresseksperimenter ( Figur 9 ). Alle forsøk ble utført med iontophores mikroelektroden og ISM brukt til hypoosmotiske stressforsøk. Dataene oppfylte kriteriene som trengs for å fortsette med forsøket i hjerneskiver. Disse kriteriene inkluderer tilstrekkelig overlapping mellom dataene og den tilpassede kurven (som ovenfor) og mindre enn 10% variasjon i transportnummer. Ytterligere kriterier er skissert i trinn 7.6. ( C ) Tabell med agarmålinger etter eksperimentering i hjernen: Data oppnådd fra tre forsøk utført i agar etter hypoosmotiske stresseksperimenter ( Figur 9 ). Den består Ency demonstrert mellom forsøkene a1-3 og a4-6 tyder sterkt på at ISM og iontophoresis mikroelektroder var stabile gjennom hjernen forsøk. Rec = opptak eller prøveversjon; R = avstand mellom ISM og iontoforese mikroelektrode; Cb = baseline konsentrasjon; Ref D x1E5 = teoretisk fri diffusjonskoeffisient x 10 ⁵ (cm ² s ^-1 ) basert på en forhåndsbestemt standard; N _t = transportnummer (dimensjonsløs); D (E5) = målt fri diffusjonskoeffisient x 10 ⁵ (cm ² s ^-1 ); R_app = tilsynelatende mikroelektrodeavstand (cm) basert på målt og referanse D (E5); N _t tilsynelatende = tilsynelatende transportnummer basert på r_app . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

">
Figur 9: Hypoosmotisk stress reduserer alfa og øker Lambda
ac. Representative data fra forsøk i hjernen under ( a ) kontroll, ( b ) hypoosmotiske og ( c ) gjenopprettelsesforhold: Solide linjer representerer data og stiplede svarte linjer er tilpassede kurver. De tre forholdene viser markant forskjellige diffusjonskurver, inkludert forskjellige bakker, amplituder og bredder. ( D ) Datatabell fra kontrollforsøk: Datatabell av tre kontrollforsøk (b1, grafisk over); Α og λ er lik i alle forsøk og stemmer overens med publiserte data for rotte neocortex. For alle forsøk i hjernen ble gjennomsnittlig n _t fra pre- og post-eksperiment-agarmålinger ( Figur 8b og 8c ) brukt til hjernen n _t D _ref ble satt til 1,25 × 10 ^-5 cm ² s ^-1 , basert på en database med diffusjonskoeffisienter (i Walter) som ble oppnådd i rottehjernen når T = 34,5 [° C]. Parameteren k ' [s ^-1 ] står for den lille mengden TMA som er tapt fra ECS under diffusjonsmålingene. Selv om k ' vanligvis er veldig liten, inkludert parameteren i kurvepassing, forbedrer nøyaktigheten av RTI-metoden. Tap-parameteren k ' representerer sannsynligvis opptak av cellene eller tapet av TMA til ACSF. ( E ) Sammenligning av kontroll-, hypoosmotiske og gjenopprettelsesforhold: Gjennomsnitt av alle forsøk i hjernen under kontroll, hypoosmotiske og gjenopprettelsesforhold. Dataene viser at hyposmotisk stress reduserer a og øker λ . Under en gjenopprettingsperiode etter hypoosmotiske forhold, a overshoots baseline (kontroll), mens λReturnerer til baseline. Resultatene tyder på at endringer i ECS under hypoosmotiske utfordringer er delvis reversible. RTI-metoden er ideell for å studere denne typen akutt reversibel effekt. ( F ) Graf demonstrerer dataklynging: Volumfraksjonen (x-akse) og tortuositet (y-akse) fra hvert forsøk er plottet som et enkeltpunkt. Grafen demonstrerer klustring av data i hver gruppe ( dvs. kontroll, hypoosmolar og gjenoppretting), noe som tyder på at RTI har følsomheten for å detektere de reproducerbare effektene av en hypoosmolar utfordring i hjernen ECS. Rec = opptak eller prøveversjon; R = avstand mellom ISM og iontoforesis mikroelektrode; Cb = baseline konsentrasjon; Alfa = volumfraksjon; Lambda = tortuosity; K ' = ikke-spesifikk klaring av sonde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende filer: Vennligst klikk her for å laste ned filene.

Discussion

Figur 10: Ikke-ideelle data som demonstrerer vanlige tekniske problemer. ( A ) Diagrammer av vanlige tekniske problemer med iontophores mikroelektroder: Sammenligning av normal frigivelse av TMA fra en fungerende iontoforese mikroelektrode med tre kilder som viser tekniske problemer. [Høy forstørrelse, a1] Strømmen i en ideell iontoforetisk kilde bæres like ved TMA-frigivelse og kloridopptak. [Høy forstørrelse, a2] En iontoforese mikroelektrode med lav n _t frigjør mindre TMA og tar opp mer klorid enn normalt. [Høy forstørrelse, a3] En iontoforese mikroelektrode som viser elektroosmos, frigir TMA, klorid og løsningsmiddel. [Høy forstørrelse, a4] En iontoforese mikroelektrode som viser voksende utgivelse over tid ( dvs. "oppvarming"). ( B ) Graf over ikke-ideelle data oOppnådd i agar: Dataene er ikke tilstrekkelig modellert av kurven tilpasset Walter og kan derfor ikke tolkes nøyaktig; Den eksakte årsaken til uoverensstemmelsen er uklar. ( C ) Tabell over ikke-ideelle data oppnådd i agar: Normale eller forventede resultater i agar vises i toppraden (vist i figur 8a ) for sammenligning med de ikke-ideelle dataene i andre rad (vist i figur 10b ). Den dårlige overlapping mellom dataene og den tilpassede kurven i figur 10b betyr at den tilpassede kurven ikke nøyaktig modellerer diffusjonsdataene; Derfor kan de beregnede verdiene (merket med *) ikke tolkes. Dette kan ha vært forårsaket av problemer med iontophorese mikroelektroden ( f.eks. Oppvarming) eller ISM ( f.eks. Langsom respons). Feilsøking: bytt mikroelektroder en om gangen, starter med iontophores mikroelektroden. Rec = opptak eller prøveversjon; r= Avstand mellom ISM og iontoforese mikroelektrode; Cb = baseline konsentrasjon; Ref D x1E5 = teoretisk fri diffusjonskoeffisient x 10 ⁵ (cm ² s ^-1 ) basert på en forhåndsbestemt standard; N _t = transportnummer (dimensjonsløs); D (E5) = målt fri diffusjonskoeffisient x 10 ⁵ (cm ² s ^-1 ); R_app = tilsynelatende mikroelektrodeavstand (cm) basert på målt og referanse D (E5); N _t tilsynelatende = tilsynelatende transportnummer basert på r_app . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Mens forsøket vist i figur 8 og figur 9 hadde en stabil og fungerende iontoforese mikroelektrode og ISM, er det mange forsøk hvor enten eller boTh mikroelektroder er kompromittert og gir ikke ideelle resultater. En "normal" TMA iontoforese mikroelektrode har en verdi på n _t 0,3. Figur 10a demonstrerer tre vanlige problemer med iontophorese-mikroelektroden som kan oppstå under RTI-eksperimenter.

Lav utgivelse. Jónforfores mikroelektroden frigjør meget lite TMA når bias strøm eller hovedstrøm er påført, noe som resulterer i n _t <0,1. Strømmen går fremdeles gjennom spissen, men det meste bæres av Cl anionen som kommer inn i spissen og svært lite ved TMA-kationen som forlater spissen. Hvis n _t er stabil i flere påfølgende studier, kan disse iontofores mikroelektroder brukes. Dette anbefales imidlertid ikke, da de ikke fungerer optimalt, noe som betyr at flere problemer kan utvikle seg. En enda større ekstremeOppstår når spissen av den iontoforetiske mikroelektroden er blokkert og ingen ioner forlater eller går inn i spissen. I dette tilfellet vil ingen kurve bli produsert. I slike tilfeller, etter å ha kontrollert at alle elektriske tilkoblinger er ordentlige og sikre, skal iontophores mikroelektroden kastes.

Høy frigjøring (elektroosmos). I tillegg til TMA frigjør iontopfores mikroelektroden også vann, noe som resulterer i n _t > 0,5. Hvis n _t er stabil over flere forsøk, kan disse iontofores mikroelektroder brukes, men dette anbefales ikke, da ytterligere problemer kan utvikle seg. Det eneste feilsøkingssteget å ta er å redusere strømmen. Dette eliminerer noen ganger vannutslipp og forårsaker at n _t faller under 0,5.

Voksende utgivelse ("oppvarming"). I dette tilfellet øker TMA-utgivelsen over tid. Når "oppvarming" er rask,Diffusjonskurven har en form som ligner den som er vist på figur 10b , og den kan ikke pålides pålitelig. I dette tilfellet demonstrerer diffusjonskurven en langsom stigning i TMA-konsentrasjonen i den innledende fase av hovedstrømmen, og TMA-konsentrasjonen er ikke plateau. En upålitelig passform skaper en unøyaktig målt D , som påvirker konsistensen til det målte transportnummeret og r_app- verdiene. Når "oppvarming" er mer gradvis, har det ingen signifikant innvirkning på formen til individuelle diffusjonskurver, men det manifesterer seg i en n _t som øker over suksessive forsøk. En "oppvarming" tilstand kan noen ganger løses ved å "pulsere" iontofores mikroelektroden i en tidsperiode (ca. 30 min). Dette gjøres ved å skifte mellom en biasstrøm og en høy hovedstrøm (+200 nA) i noen sekunder om gangen. Hvis en iontoforese mikroelektrode fortsatt ikke gir en stablE transportnummer, er det best å bare teste en ny.

Nøyaktig måling av transportnummer og stabilitet under hele forsøket er viktig for å sikre en nøyaktig verdi for α . Opprettholde avstanden mellom mikroelektroder er kritisk for bestemmelsen av både a og λ . Hvis avstanden endrer seg etter en måling, enten i agarose eller i hjernen, kan den lineære avstanden mellom mikroelektrodene spisses inn i utgangssegmentet og reanalyseres av Walter. Hvis verdiene er for store, må målingen kasseres. Temperatur svingning kan også være en medvirkende faktor til unøyaktighet, så det er viktig å bruke en nøyaktig temperaturføler og et pålitelig kammervarmeelement.

Jontoforese mikroelektroden er den hyppigste kilde til problemer i RTI teknikken; Å lage og bruke en stabil ISM er avgjørende for å skaffe gode data. ONe mulig problem med ISM kan være et svakt svar, som kan skyldes svært høy impedans i spissen. Med en treg respons-ISM vil alle iontophores mikroelektroder virke som en "oppvarming" -effekt ( figur 10b ), men kurven skyldes ganske enkelt at ISM ikke har evne til å oppdage de skiftende TMA-konsentrasjonene raskt nok. Øke avstanden mellom mikroelektroder (opptil 150 μm) kan gi mer tid til at ISM skal reagere og kan forbedre kurvepassingen. Et svakt svar kan indikere at ionbytteren har trukket seg opp inne i spissen. Dette kan ses under et sammensatt mikroskop, og hvis det foreligger, betyr silaniseringen dårlig og at ISM må kasseres. I tillegg kan drift i ISM-signalet forårsake unøyaktige passeringer av dataene. Det er opp til eksperimentøren å avgjøre om driften påvirker dataene utenfor toleransen.

Begrensninger av RTI

THer er det flere begrensninger på RTI-metoden på grunn av forutsetninger som ligger bak dataanalysen. Disse antagelsene inkluderer et krav til vev homogenitet og vev isotropi i både hjernen regionen av interesse og et sfærisk volum rundt denne regionen. I sammenheng med RTI krever vev homogenitet at diffusjonsparametrene er konstante innenfor interesseområdet. Vev isotropi betyr at en enkelt verdi på D ^* gjelder for alle tre romlige akser. Hvert molekyl som frigjøres fra en kilde-mikroelektrode, tar en tilfeldig bane før den kommer til stillingen til innspillings-ISM. Spenningen på ISM, som representerer antall molekyler ( dvs. konsentrasjon) registrert på en gang, inkluderer molekyler som har reist i alle tre romlige akser, samt noen molekyler som har reist utenfor ISM og har returnert til måling Punkt ( figur 1c ). Under RTI data analyse, Walter programmet generAtes gjennomsnitt a og λ , som inkluderer diffusjon av alle molekyler som reiser i alle akser fra en punktkilde til ISM. Hvis diffusjonsgraden er vesentlig forskjellig i en av de tre romlige aksene (anisotropi) eller hvis vevet er ikke-homogent, er det nødvendig med ytterligere datainnsamling og dataanalyse for å beregne a og λ ^{8 , 14} .

I tillegg til ovennevnte vevsforutsetninger krever RTI-metoden at avstanden mellom en punktkilde og ISM, som refereres til som r , er omtrent 80-130 um. Når r er redusert under 50 μm, kan ISM-responsen ikke være rask nok til å registrere diffusjonsavhengige endringer i konsentrasjonen av probemolekylet. Dette kan bli løst i fremtiden ved bruk av konsentriske ISMer med raskere responstider ^{10 , 15} . Større rAvstander reduserer også hjernen-uavhengige forskjeller i ECS-miljøet, ISM-tipstørrelsen og hjernevæskeskader under ISM-plassering. Omvendt, når r økes utover 150 μm, er diffusjonen av molekyler fra den iontoforetiske punktkilden mer utsatt for påvirkning av ikke-isotrope, inhomogene elementer som omgir hjerneområdet av interesse eller vev-perfusatgrensen ¹⁴ .

Inkluderer RTI og alternative teknikker for å utforske ECS

RTI-metoden tilhører en større gruppe teknikker som benytter en molekylær probe for å studere ECS; Hver metode har sine egne fordeler og mangler. Mens RTI muliggjør en nøyaktig beregning av både a og λ i sanntid, krever metoden en ladet molekylær probe som kan detekteres av en ionbytter. I eksperimenter der iontophorese ikke er egnet, for eksempel studiet av en uladet sonde, iOntophorese kan erstattes av trykkutkastning. Dessverre tillater nåværende teknikker ikke beregningen av α med trykkutkast, fordi volumet som frigjøres avhenger av egenskapene til det injiserte medium ¹⁶ . For å bruke en probe som ingen veksler eksisterer, kan proben være fluorescensmerket og dens diffusjon gjennom ECS målt ved epifluorescensmikroskopi. Denne teknikken, kjent som integrativ optisk avbildning (IOI), er begrenset av størrelsen og tilgjengeligheten av fluorescensmerkede molekyler og potensialet for cellulær opptak ^{17 , 18} . IOI-teknikken har fordelen at makromolekyler kan brukes som prober, og dette har vist at λ øker med molekylær størrelse. Endelig har en viktig klasse av diffusjonsmetoder benyttet radiotracere, men de er ikke lenger fellesbruk ² .

Fremtidige applikasjoner av RTI

på en pålitelig måte in vivo og utvide potensialet ^{1 , 4 , 6} . Det kan også brukes til å teste effektene av et bredt spekter av endringer i hjernens fysiologi, som de som fremkalles av endringer i det kjemiske miljøet, farmakologi, traumer eller genetisk knockout ¹ . Så lenge endringen indusert i ECS varer i en periode på ca. 2 minutter eller mer, kan RTI gi en presis kvantifisering av ECS volumfraksjon og tortuositet.

Mens betydelige innsikt i strukturen og funksjonen til hjernen ECS har blitt generert i de siste 50 årene derForbli mange ubesvarte spørsmål. For eksempel er det fortsatt uklart om og hvordan homeostatiske mekanismer regulerer α og hvordan endringer i α påvirker hjernens funksjon. Datamodeller har bidratt til å estimere de relative bidragene til cellegeometri og andre faktorer som påvirker λ , men mer arbeid er nødvendig ¹ . Endelig er rollen som ECS i patogenesen av nevrologisk sykdom (og omvendt) i stor grad uutforsket. I nær fremtid kan RTI-målinger forbedre målrettet legemiddellevering til bestemte hjernegrupper ¹⁹ .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A/D and D/A converter	National Instruments Corporation	NI USB-6221 DAQ	The NI USB-6221 is still sold as a 'Legacy' device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available.
agarose	Lonza	NuSieve GTG Agarose #50081	to prepare dilute agarose gel for RTI measurements
amplifier for ISM	Dagan	Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier	ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages
biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective)			for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope
borosilicate theta capillary glass tubing	Harvard Apparatus	Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811	double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm
brush	Winsor & Newton	University Series 233, size 0	round shoft handle brush, available from Amazon
bunsen burner	Fisher
camera for visualizing micropipettes	Olympus	OLY-150	requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional
chart recorder			to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished
chlorotrimethylsilane, puriss., > 99%	Sigma-Aldrich	catalog # 92360	for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
Commercial Software	The MathWorks	MATLAB, Data acquisition toolbox	for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available.
eye protective goggles	Fisher
fixed-stage compound microscope	Olympus	BX51WI	can use other compound microscopes with fixed stages
forceps	Fine Science Tools	#11251-10	to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work
fume hood			for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab
glass microscope slide	Fisher	#12-550A	to chip microelectrode tips
heater/stirrer	Fisher	Corning PC-420D	to prepare dilute agarose gel and stir solutions
iontophoretic unit	Dagan	ION-100 and PS-100	ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites)
liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium	World Precision Instruments	IE190 Potassium Ion Exchanger	Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate - do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight.
microelectrode holder	WPI	M3301EH	to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH.
micromanipulator	Narishige	MM-3	to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition
micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-97	to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing
microprobe thermometer	Physiotemp	Model BAT-12R	fine probe of this thermometer is placed close to recording site
needle	BD	Syringes and Needles # 305122 (25 gauge)	for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5 mm x 16 mm)
objective 5X dry	Olympus	MPlan N
objective 10X water immersion	Olympus	UMPlan FL N	10X objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm
plastic containers (with lids)	Fisher	#14-375-148	to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes
platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope	EXFO	Gibraltar Burleigh	platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability
porous minicup			for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade
reusable adhesive	Bostik	Blu-Tack	for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon
robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning	Sutter Instruments	MP-285	two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text).
signal conditioning unit with low-pass filter	Axon Instruments	CyberAmp 320 or 380	no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed.
silver wire	A-M Systems	#7830	diameter 0.015", bare (no coating)
slice chamber	Harvard Apparatus	Warner Model RC-27L	this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber
stereomicroscope			for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers
syringe, 10 mL	BD	Syringes and Needles #309604	to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip
syringe filter 0.22 µm pore	Whatman	#6780-1302	to filter backfill solutions; available from Fisher
syringe needle, 28 gauge, 97mm	World Precision Instruments	MicroFil MF28G-5	to backfill microelectrodes
Teflon (=PTFE) tubing	Component Supply	STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge)	for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax.
temperature control system	Harvard Apparatus	Warner Models TC-344B and SH-27A	TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers
tetramethyammonium (TMA) chloride	Sigma-Aldrich	T-3411	5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
vibrating blade microtome	Leica	VT1000S	to cut brain slices
xylenes	Fisher	X5-1	for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description