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Neuroscience

रीयल-टाइम Iontophoresis Tetramethylammonium के साथ मात्रा मात्रा और ब्रेन एक्स्ट्रासेल्यूलर स्पेस के Tortuosity मात्रा

Published: July 24, 2017 doi: 10.3791/55755
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल वास्तविक समय आयनोपोथरेसिस का वर्णन करता है, एक ऐसा तरीका जो जीवित दिमाग के बाहरी स्थान (ईसीएस) के भौतिक मापदंडों को मापता है। ईसीएस में जारी एक निष्क्रिय अणु का प्रसार ईसीएस मात्रा अंश और कर्कत्व की गणना करने के लिए किया जाता है। मस्तिष्क ईसीएस में तीव्र प्रतिवर्ती परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए यह आदर्श है

Abstract

यह समीक्षा वास्तविक अवधारणाओं और प्रोटोकॉल का वास्तविक समय आयनोपोथोरिसिस (आरटीआई) पद्धति का प्रदर्शन करने का वर्णन करता है, जीने के मस्तिष्क के बाह्य स्थान (ईसीएस) का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए सोने का मानक। ईसीएस सभी मस्तिष्क कोशिकाओं को घेरता है और इसमें अंतरीय द्रव और बाह्य मैट्रिक्स शामिल हैं। मस्तिष्क गतिविधि के लिए आवश्यक कई पदार्थों के परिवहन, जिनमें न्यूरोट्रांसमीटर, हार्मोन और पोषक तत्व शामिल हैं, ईसीएस के माध्यम से फैलता है। इस स्थान की मात्रा और ज्यामिति में परिवर्तन सामान्य मस्तिष्क प्रक्रियाओं के दौरान होते हैं, जैसे नींद और रोग संबंधी स्थितियों, जैसे आइस्केमिया। हालांकि, मस्तिष्क ईसीएस की संरचना और विनियमन, विशेष रूप से रोगग्रस्त राज्यों में, बड़े पैमाने पर बेरोज़गार बनी हुई है। आरटीआई विधि जीवित मस्तिष्क के दो भौतिक मापदंडों को मापता है: मात्रा अंश और कर्कत्व। वॉल्यूम अंश ईसीएस द्वारा नियंत्रित ऊतक मात्रा का अनुपात है। टर्टुओसिटी एक मस्तिष्क के माध्यम से फैलते समय रिश्तेदार बाधा का एक उपाय होती हैकोई अवरोध के साथ एक माध्यम की तुलना में Gion। आरटीआई में, एक निष्क्रिय अणु एक स्रोत माइक्रोइलेक्ट्रोड से मस्तिष्क ईसीएस में स्पंदित होता है। चूंकि अणु इस स्रोत से दूर होते हैं, आयन की बदलती एकाग्रता लगभग 100 माइक्रोन दूर स्थित एक आयन-चयनात्मक माइक्रोइलेक्ट्रोड का उपयोग करके समय से मापा जाता है। परिणामस्वरूप प्रसार वक्र से, दोनों मात्रा अंश और कर्कत्व की गणना की जा सकती है। इस तकनीक का उपयोग मस्तिष्क स्लाइस में कई प्रजातियों (इंसानों सहित) और विवो में ईसीएस में तीव्र और पुरानी परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए किया गया है। अन्य तरीकों के विपरीत, आरटीआई का प्रयोग वास्तविक समय में मस्तिष्क ईसीएस में दोनों पलटवापसी और अपरिवर्तनीय परिवर्तनों की जांच के लिए किया जा सकता है।

Introduction

बाह्य अंतरिक्ष (ईसीएस) सभी मस्तिष्क कोशिकाओं के लिए बाहरी कनेक्शंस का नेटवर्क है और इसमें अंतरीय द्रव और बाह्य मैट्रिक्स ( चित्रा 1 ए और चित्रा 1 बी ) शामिल हैं। मस्तिष्क सेल फ़ंक्शन के लिए जरूरी कई पदार्थों का वितरण, जिसमें पोषक तत्व, हार्मोन और न्यूरोट्रांसमीटर शामिल हैं, ईसीएस के माध्यम से फैलता है। वॉल्यूम, ज्यामिति और बाह्य मैट्रिक्स सहित इस अंतरिक्ष के भौतिक मापदंडों में परिवर्तन, ईसीएस और मस्तिष्क कोशिकाओं को स्नान करने वाले स्थानीय आयन सांद्रता के माध्यम से प्रसार को काफी प्रभावित कर सकते हैं, जिनका मस्तिष्क कोशिका समारोह 1 , 2 पर गहरा असर है।

मस्तिष्क क्षेत्र की दो संरचनात्मक विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए रीयल-टाइम आयनोपोरेसिस (आरटीआई) का उपयोग किया जाता है: मात्रा अंश और कर्कत्व 3 , 4 ,"Xref"> 5 वॉल्यूम अंश ( α ), कुल ऊतक मात्रा ( वी टिशू ) के सापेक्ष ईसीएस ( वी ईसीएस ) द्वारा एक प्रतिनिधि प्राथमिक मात्रा में पेश ऊतक मात्रा का अनुपात है;

समीकरण

Tortuosity ( λ ) रिश्तेदार बाधा है कि एक पदार्थ एक मस्तिष्क क्षेत्र के माध्यम से diffusing जब कोई अवरोधों के साथ एक माध्यम की तुलना में मुठभेड़;

समीकरण

जहां डी * (सेमी 2 एस -1 ) मस्तिष्क में पदार्थ का प्रभावी प्रसार गुणांक है और डी (सेमी 2 एस -1 ) एक नि: शुल्क माध्यम में निशुल्क प्रसार अंश है, जैसे पतला एगरोज़ जेल।

आज, आर के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला जांच पदार्थटीआई विधि छोटी सीेशन टेट्रामिथाइलमोनियम (टीएमए) है। टीएमए में 74 जी / एमओएल का एक आणविक वजन है, समाधान में पूरी तरह से पृथक होता है, और एक सकारात्मक चार्ज होता है। इस आयन के साथ आरटीआई के अध्ययन ने यह दर्शाया है कि α समीकरण 0.2 और λ समीकरण 1.6 1 , 2 इसका मतलब यह है कि ईसीएस कुल मस्तिष्क की मात्रा का लगभग 20% है और यह कि एक छोटे, जड़ अणु का प्रसार ईसीएस में लगभग 2.5 गुना धीमी गति से होता है, कोई अवरोध नहीं 3 के माध्यम से। हालांकि, दोनों α और λ मस्तिष्क आयु, क्षेत्र और राज्य के साथ और रोग की स्थिति 1 में भिन्नता है। इन मापदंडों के परिवर्तन मस्तिष्क के विकास, बुढ़ापे, नींद, मिर्गी, और कई अन्य मौलिक प्रक्रियाओं और मस्तिष्क के रोगों से जुड़े हुए हैं 1, 6 जबकि अन्य तकनीकों का माप α और λ , आरटीआई, वास्तविक समय में रहने वाले ऊतकों के स्थानीय क्षेत्रों में दोनों को माप सकता है। इस कारण से, आरटीआई तीव्र और प्रतिवर्ती चुनौतियों के दौरान α और λ में बदलाव की जांच के लिए एक अपरिहार्य उपकरण बन गया है।

आरटीआई का समर्थन करने वाले सिद्धांत को मूल रूप से निकोलसॉन और फिलिप्स द्वारा मान्यता दी गई थी, और इस तकनीक का उपयोग उस समय 4 , 7 से बड़े पैमाने पर किया गया है। आरटीआई का प्रयोग करने वाले प्रयोगों से आयनटोस्कोरोसिस द्वारा सोर्स माइक्रोइलेक्ट्रोड से टीएमए की एक नाड़ी को सोडियम एग्रोस जेल में रिलीज करने से शुरू होता है। एक बार बाहर निकल जाने पर, आयन स्वतंत्र रूप से यादृच्छिक पथों की संभावित अनंत संख्या ( चित्रा 1 डी ) से चुनकर, बिंदु स्रोत से दूर फैल जाते हैं। आयन की बदलती एकाग्रता समय-समय पर एक आयन-चयनात्मक माइक्रोइलेक्ट्रोड (आईएसएम) का उपयोग करके मापा जाता है100 माइक्रोन दूर ( चित्रा 1 सी ) टीएमए एकाग्रता में बदलाव गहरा रहे हैं और वक्र के लिए लगाए गए हैं जो डी के दोनों गणना और आयनोपोरेसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड के प्रोटोकॉल (प्रोटोकाल में चर्चा पैरामीटर) की संख्या के लिए अनुमति देता है। इन मूल्यों के साथ, डी * प्राप्त करने के लिए और α और λ दोनों की गणना करने के लिए ब्याज की एक मस्तिष्क क्षेत्र में प्रक्रिया को दोहराया जाता है। आयनोपोरेसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड, डेटा संग्रह, रेखांकन और टीएमए एकाग्रता वक्र की फिटिंग का नियंत्रण और प्रयोगात्मक मापदंडों की गणना आम तौर पर वांडा और वाल्टर कार्यक्रमों द्वारा किया जाता है, जो कि इस उद्देश्य के लिए विशेष रूप से डिजाइन किए गए हैं (सॉफ्टवेयर और उनके मैनुअल अनुरोध पर लेखकों से स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है)।

इस समीक्षा के प्रोटोकॉल अनुभाग में सीआरटेंट मस्तिष्क स्लाइस में आरटीआई के डिजाइन और प्रदर्शन के लिए आवश्यक बुनियादी प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है। तकनीक का उपयोग गैर-छड़ी में भी किया गया हैईएनटी मॉडल, मानव मस्तिष्क स्लाइस और विवो ब्रेन तैयारी 1, 4, 6, 8, 9 सहित। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग डेटा व्याख्या में बारीकियों को उजागर करने के लिए आदर्श और गैर-आदर्श परिणाम प्रदान करता है। अंत में, चर्चा अनुभाग संक्षेप में समस्या निवारण तकनीक, आरटीआई की सीमाएं, ईसीएस का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली वैकल्पिक तकनीक और आरटीआई के भविष्य के अनुप्रयोगों को शामिल करता है।

आकृति 1
चित्रा 1: ईसीएस के माध्यम से फैलाव के आरेख ( ) ईसीएस का आरेख: एक विशिष्ट मस्तिष्क खंड में ईसीएस का आकार और स्थान दर्शाता है। ग्रे मस्तिष्क सेल प्रक्रियाओं के बीच ईसीएस के निशान। ईसीएस का मात्रा कुल ऊतक मात्रा का लगभग 20% है ( यानी, मात्रा अंश = 02) शारीरिक शर्तों के तहत ( बी ) ईसीएस के बढ़ते आरेख: मस्तिष्क कोशिका ज्यामिति (ग्रे) और बाह्य मैट्रिक्स (बहुरंगी ग्लाइकोसमैनोग्लाइक्सेन और प्रोटियोग्लिककैन्स के जाल के रूप में चित्रित) सहित कठोरता के लिए योगदान देने वाले भौतिक मापदंडों को हाइलाइट करता है। ( सी ) बिन्दु स्रोत से प्रसार का 3 डी आरेख: एक आयनोपोरेरिक स्रोत से एक आईएसएम को निष्क्रिय अणुओं के शुद्ध आंदोलन को दर्शाता है। प्रसार बाधाओं और सेलुलर तेज को छोड़कर, अणु एक गोलाकार एकाग्रता मोर्चे के उत्पादन के सभी दिशाओं में बाहर फैल जाती है। आईएसएम आयनटॉपहायरेक्टिक स्रोत से जारी जड़ अणुओं की स्थानीय एकाग्रता को मात्रा देता है। ( डी ) मस्तिष्क के ईसीएस में प्रसार के कंप्यूटर सिमुलेशन: [फारसी बाईं] मोंटे कार्लो सिमुलेशन के लिए सेटअप; हरे रंग का क्षेत्र मस्तिष्क कोशिका प्रक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं और लाल क्रॉस एक बिंदु स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है। यह सेटअप मॉडल 1 ए चित्रा में मस्तिष्क के ऊतकों को चित्रित करता है। [मध्य चित्र] 3 और6 अणु यादृच्छिक आंदोलनों का प्रदर्शन करते हैं क्योंकि वे मस्तिष्क के बाह्य अंतरिक्ष के माध्यम से फैल जाते हैं, जो 2 आयाम में दिखाया गया है। [दूर सही] बिंदु स्रोत से कई अणुओं के यादृच्छिक चलता है। बिंदु स्रोत से सभी अणुओं का शुद्ध आंदोलन आकृति 1 सी में दर्शाया गया है। संचयी यादृच्छिक चलता कोशिकाओं के बीच के स्थान की रूपरेखा ( यानी, ईसीएस; आगे के स्पष्टीकरण के लिए संदर्भ 5 देखें) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Protocol

ऊतक के नमूनों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले सभी पशु प्रक्रियाओं को एसयूएनई डाउनटाटे मेडिकल सेंटर में पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदन किया गया था।

1. समाधान और उपकरण की तैयारी

  1. आईएसएम की संदर्भ बैरल के लिए एक 150 मिमी NaCl बैकफिल समाधान तैयार करें। इसे 0.2 एम.एम. फिल्टर (बैक्टीरिया या कणों को हटाने के लिए) से जुड़ी 10 मिलीलीटर सिरिंज में रखें।
  2. माइक्रोइलेक्ट्रोड के लिए 150 एमएम टीएमए क्लोराइड (टीएमए-सीएल) बैकफ़िल समाधान तैयार करें। इसे 0.2 एम.एम. फिल्टर से जुड़ी 10 मिलीलीटर सिरिंज में रखें। सही एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए 5 एम निर्माता स्टॉक समाधान से TMA-Cl समाधान (इस प्रोटोकॉल में) तैयार करें।
  3. कम से कम 2 घंटे के लिए ब्लीच (सोडियम हाइपोक्लोराइट) के तारों को डुबकी करके माइक्रोइलेक्ट्रोड के निर्माण के लिए कम से कम चार रजत तारों को क्लोरिडाइज़ करें। इथेनॉल के साथ अतिरिक्त ब्लीच निकालें और तारों को सुखा दें।
  4. 150 एमएम नाओकल में 50 एमएल का 0.3% एगरोज़ और बीकर में 0.5 एमएम टीएमए-सीएल तैयार करेंऔर इसे कवर। अच्छा प्रसार मापन सुनिश्चित करने के लिए एगरोस का उपयोग करें जो पाउडर और काफी ताज़ा है।
  5. गर्मी और इसे हल करने के लिए एक हलचल बार के साथ agarose समाधान मिश्रण। समाधान को कमरे के तापमान पर ठंडा करने दें यह 4 डिग्री सेल्सियस तक 1 सप्ताह तक स्टोर करें।
  6. एक उदासीन (जमीन) इलेक्ट्रोड तैयार करें जो 4% agarose में 1 एम केएलएल (पूरक ए में निर्देश)
  7. प्रयोगात्मक कक्ष में फिट हो सकता है एक छोटा सा, छिद्रपूर्ण कप तैयार करें और इससे इसकी सामग्री और बाहरी वातावरण ( चित्रा 2 ए ) के बीच बिजली निरंतरता की अनुमति मिलती है। इस कप के निचले भाग में एक धातु की अंगूठी रखो जिससे पानी में आंशिक रूप से डूबने से इसे फ्लोटिंग से रोका जा सके।
  8. आईएसएम के अंशांकन के लिए पांच 100 एमएल टीएमए-सीएल समाधान बनाने के लिए 5 एम टीएमए-सीएल स्टॉक के धारावाहिक कमजोर पड़ने का उपयोग करें। समाधानों में 0.5, 1, 2, 4, और 8 मिमी टीएमए-सीएल की अंतिम सांद्रता होनी चाहिए, सभी 150 मिमी NaCl में होनी चाहिए। वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक सील कप में अंशांकन समाधान स्टोर करें/ Li>

2. इलेक्ट्रॉनिक सेटअप

  1. चित्रा 2 बी में ब्लॉक आरेख के अनुसार आरटीआई प्रायोगिक सेटअप के घटकों से कनेक्ट करें; दो इनपुट चैनलों के साथ एक एम्पलीफायर शामिल करें (जिनमें से एक को आईएसएम के आयन-चयनात्मक बैरल के लिए बहुत ही उच्च-प्रतिबाधा होना चाहिए), 10 हर्ट्ज पर एक कम-पास फिल्टर सेट, एक चार्ट रिकॉर्डर, ए / डी + डी / ए कनवर्टर, एक iontophoretic इकाई (या लगातार-मौजूदा दालों की आपूर्ति करने में सक्षम एक प्रवर्धक), और एक कंप्यूटर (पीसी) वांडा और वाल्टर कार्यक्रम चल रहा है। यह सुनिश्चित करने के लिए इलेक्ट्रॉनिक सेटअप का निरीक्षण करें कि सभी कनेक्शन जगह में हैं
  2. आईएसएम के पास एक उच्च प्रतिरोध है और आस-पास के आंदोलन द्वारा बनाए गए कलाकृतियों के प्रति संवेदनशील है, क्योंकि यदि आवश्यक हो तो जमीन आधारित बाड़े में (जैसे फैराडे पिंजरे) प्रयोगात्मक सेटअप को सुरक्षित रखें।
  3. एक समर्पित आईएसएम अंशांकन स्टेशन बनाएं जिसमें एक दोहरी इनपुट एम्पलीफायर, एक चार्ट रिकॉर्डर, एक उपयुक्त आईएसएम धारक और एक उदासीन जमीन इलेक्ट्रोड शामिल है। अगर संभव हो तो,बाड़े का ढाल इस चरण को छोड़ें यदि आईएसएम प्रयोगात्मक सेटअप (चरण 3.2 9) में कैलिब्रेट किया गया है

चित्र 2
चित्रा 2: झरझरा प्रायोगिक कप और इलेक्ट्रॉनिक सेटअप। ( ) छिद्रपूर्ण प्रयोगात्मक कप: एक झरझरा मेष का प्रयोग प्रायोगिक कप बनाने के लिए किया जाता है जो कि अग्नाशय (अंदर) और प्रायोगिक स्नान द्रव (बाहर) के बीच विद्युतीय निरंतरता की अनुमति देता है। एक धातु की अंगूठी कप के निचले हिस्से से जुड़ी हुई है जिससे कप को स्नान के समाधान में तैरने से बचाया जा सकता है। ( बी ) आरटीआई सेटअप (2.1 और 2.2 कदम) के ब्लॉक आरेख: एक आईएसएम एक एम्पलीफायर (एपीपी) से जुड़ा है। आईएसएम में दो बैरल हैं। एक में टिप में तरल आयन एक्सचेंजर (एलआईसीए) होता है और स्थानीय परिवेश वोल्टेज के साथ टिप पर टीएमए एकाग्रता के लघुगणक के लिए आनुपातिक वोल्टेज उत्पन्न करता है; वेंई सिग्नल पथ एक लाल रेखा से प्रदर्शित होता है आईएसएम की दूसरी बैरल संदर्भ बैरल के रूप में जाना जाता है और आईएसएम की नोक पर परिवेश वोल्टेज को मापता है; यह एक नीला संकेत पथ से जुड़ा हुआ है एम्पलीफायर के दो तथाकथित प्रमुख चरण हैं जो आईएसएम से जुड़ते हैं; इन इकाइयों को 1 (एक्स 1) का लाभ मिलता है और बाकी एम्पलीफायर सर्किटरी के कम प्रतिबाधा के लिए माइक्रोइलेक्ट्रोड के उच्च प्रतिबाधा का मिलान करता है। आयन-चयनात्मक बैरल से जुड़ा मुख्य चरण 1,000 मेगावाट की आवक प्रतिरोध का सामना करने में सक्षम होना चाहिए, जबकि संदर्भ बैरल का प्रतिरोध आम तौर पर लगभग 10 मे। है। सिर के चरण को छोड़ने के बाद, संदर्भ बैरल से वोल्टेज शुद्ध औयन सिग्नल वोल्टेज प्राप्त करने के लिए एक संक्षेपण एम्पलीफायर (Σ) का उपयोग करके आयन-चयन बैरल पर वोल्टेज से उल्टे और घटाया जाता है। एम्पलीफायर का आउटपुट सिग्नल कंडीशनिंग यूनिट को देता है जो अतिरिक्त प्रवर्धन और एक मल्टीपोल लो-पास फिल्टर प्रदान करता है (≤10 हर्ट्ज; आमतौर पर एक बेस्सेल फाईलिटर), जो शोर को हटाता है और एनालॉग-टू-डिजिटल कनवर्टर (ए / डी) में संकेत अलियासिंग को रोकता है। फिल्टर के आउटपुट को एक स्ट्रिप चार्ट रिकॉर्डर पर भी प्रदर्शित किया जाता है। ए / डी कनवर्टर संकेतों को डिजिटाइज़ करता है और उन्हें एक पर्सनल कंप्यूटर (पीसी) भेजता है। पीसी एक डिजिटल सिग्नल भी उत्पन्न करता है जो एक डिजिटल-एनालॉग कनवर्टर (डी / ए) द्वारा एक एनालॉग वोल्टेज पल्स के लिए परिवर्तित किया जाता है जो आयनोपोशोरिस यूनिट को खिलाया जाता है, जो वोल्टेज को निरंतर आयाम की वर्तमान पल्स में कनवर्ट करता है और इसे भेजता है Iontophoresis माइक्रोइलेक्ट्रोड के लिए Iontophoresis संकेत पथ एक हरे रंग की रेखा से प्रतिनिधित्व किया है डाटा अधिग्रहण और iontophoresis संकेत वांडा कार्यक्रम के नियंत्रण में हैं, जो प्रयोग को परिभाषित करने वाले सभी पैरामीटर के साथ-साथ, प्रत्येक समय के रिकॉर्डिंग की तुलना में वोल्टेज के रूप में प्रत्येक प्रसार रिकॉर्ड के लिए एक आउटपुट फाइल उत्पन्न करता है। एक दूसरा कार्यक्रम, वाल्टर, आउटलुक फाइल पढ़ता है और आईजीएम अंशांकन डेटा का इस्तेमाल करता है ताकि डिजिटाइज्ड वोल्ट्स को सांद्रता में परिवर्तित किया जा सके। एकाग्रता veफिर समय के वक्र को तब वाल्टर में प्रसार समीकरण के उपयुक्त समाधान में लगाया जाता है। डी और एन टी निकाले जाते हैं यदि माध्यम agarose है, और λ और α निकाला जाता है अगर माध्यम मस्तिष्क है। एनालॉग सिग्नल ठोस लाइन हैं; डिजिटल सिग्नल बिंदीदार रेखाएं हैं एक उदासीन जमीन इलेक्ट्रोड (न दिखाया गया है) जिसमें स्नान में स्नान शामिल है। लाल रेखाएं = आयन सिग्नल, ब्लू लाइन = संदर्भ संकेत, ग्रीन लाइन = आयनोप्टोसिस कमांड, सॉलिड लाइन = एनालॉग, डॉट्स लाइन = डिजिटल। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

3. आयन-चयनात्मक माइक्रोइलेक्ट्रोड्स की तैयारी और अंशांकन

  1. प्रयोग से एक दिन पहले प्रोटोकॉल का उपयोग करके आईएसएम तैयार करें। प्रयोग के दिन कम से कम दो कार्य सुनिश्चित करने के लिए बैचों में आईएसएम बनाएं।
    नोट: ज्यादातर आईएसएम एक दिन के लिए स्थिर हैं यादो। आईएसएम निर्माण आर्द्रता और वायुमंडलीय स्थितियों के प्रति संवेदनशील है। प्रत्येक माइक्रोइलेक्ट्रोड को सफलतापूर्वक जांचना नहीं होगा
  2. एक पुरानी जोड़ी संदंश का उपयोग करके डबल बैरल बोरोसिलेट ग्लास केशिका के बैरल में से एक के अंत में लगभग 0.5 सेंटीमीटर ग्लास चिप।
  3. केशिका के विपरीत छोर पर एक बैरल चिप ( चित्रा 3 ए )। सुनिश्चित करें कि पट से क्षतिग्रस्त नहीं है (गंभीर)। सावधानी: फेंकने वाली ग्लास के कारण चोट रोकने के लिए चश्मे पहनें
  4. संदूषक को हटाने के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए एसीटोन की एक बोतल में केशिका रखें।
  5. किसी भी अतिरिक्त एसीटोन को निकालने के लिए एसीटोन और पल्स साफ, सूखी, संपीड़ित नाइट्रोजन गैस या हवा से केशिका हटा दें। केशिका में सभी एसीटोन निकालें, क्योंकि अवशिष्ट एसीटोन सिलनाकरण (महत्वपूर्ण) के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं।
  6. किसी ऊर्ध्वाधर या क्षैतिज खींचने पर माइक्रोप्रिपेट की टिप तैयार करें एक लंबे सूट के साथ एक विंदुक खींचने के लिए पैरामीटर दर्जी औरतेज टिप, लगभग 1 माइक्रोन या व्यास में कम। इस चरण के अंत में, एक केशिका को दो pipettes ( चित्रा 3 ए ) में बनाया जाएगा।
  7. एक 10X उद्देश्य के साथ एक यौगिक, ईमानदार माइक्रोस्कोप के तहत एक एकल माइक्रोप्रिपेट को विज़ुअलाइज़ करें। एक गिलास सूक्ष्मदर्शी स्लाइड का उपयोग करके टिप को काट दें ताकि टिप का अंतिम व्यास ( यानी, दोनों बैरल) 2 और 5 माइक्रोन ( चित्रा 3 बी ) के बीच हो। इस विंदुक को अब से आईएसएम के रूप में संदर्भित किया जाएगा।
  8. एक 0.2 एमबी फिल्टर और एक 28 जी, 97 मिमी सुई ( चित्रा 3 बी ) से जुड़ी एक 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके चिप्स वाले हिस्से पर खोलने के माध्यम से आईएसएम के चीप बैरल को 150 मिमी NaCl संदर्भ समाधान में भरें। बैरल की ऊंचाई तीन-चौथाई बैरल भर मत करो
  9. 150 एमएम टीएमए-सीएल बैकफ़िल समाधान के साथ आईएसएम के गैर-चिपक बैरल को भरें। समाधान से बाहर किसी भी हवाई बुलबुले दस्तक करने के लिए आईएसएम को धीरे से टैप करें। Mic के नीचे बुलबुले की जांच करेंटोप छूने के लिए इस्तेमाल की गई रोस्कोप
  10. आईएसएम के पीछे एक बन्सन बर्नर का उपयोग करने के लिए ज्वाला, यह सुनिश्चित करने के लिए कि आईएसएम के पीछे के पट में पूरे बैकफ़िल समाधान का कोई संचार नहीं होता है। सुनिश्चित करें कि ज्वलंत होने के बाद आईएसएम के शीर्ष एक चौथाई सूखा है।
  11. आईएसएम के संदर्भ समाधान में क्लोरिडित चांदी के तार को सम्मिलित करें और संदर्भ बैरल ( चित्रा 3 सी ) के रूप में चिह्नित करने के लिए केशिका से फैला हुआ तार मोड़ो। सुनिश्चित करें कि तार बैकफिल समाधान में जलमग्न है और प्रयोग की अवधि के लिए समाधान में रहता है।
  12. एक 25 जी सिरिंज सुई की नोक पर एक छोटी लंबाई polytetrafluoroethylene टयूबिंग (लगभग 20 सेमी लंबा) स्लाइड करें। आयन-चयनात्मक बैरल के पीछे टयूबिंग के दूसरे छोर को रखें। सुनिश्चित करें कि टयूबिंग बैरल में है लेकिन बैकफ़िल समाधान ( चित्रा 3 सी ) से ऊपर है।
  13. एक बेंसन बर्नर के साथ दांत के मोम की छड़ी को गरम करें और टयूबिंग और सिल्व दोनों को मुहरेंएर तार अपने संबंधित बैरल ( चित्रा 3 सी ) में। सुनिश्चित करें कि आयन-चयनात्मक बैरल (गंभीर) में प्लास्टिक टयूबिंग के आसपास एक पूर्ण हवा की सील का उत्पादन किया गया है।
  14. Xylene में 4% क्लोरोटीमैथाइलसिलिन की एक छोटी, पारदर्शी ग्लास कंटेनर (5 एमएल या उससे कम) तैयार करें। सावधानी: ज़ेलेनेस और सिलेन्स स्वास्थ्य के लिए बहुत खतरनाक हैं; एक धूआं हुड के अंदर दोनों रसायनों को संभाल लें और उचित रूप से त्याग दें
  15. एक स्टीरियो विच्छेदन माइक्रोस्कोप के सामने कंटेनर की स्थिति में एक धूआं हुड में क्षैतिज रूप से घुड़सवार। एक माइक्रोमैनिपुलेटर ( चित्रा 3 डी ) का उपयोग कर कंटेनर पर खड़ी आईएसएम को सुरक्षित रखें।
  16. क्लोरोटीमैथाइलसिलिन समाधान में माइक्रोइलेक्ट्रोड के टिप को डुबकी।
  17. आईएसएम के लिए अग्रणी 25-गेज सुई के लिए एक खाली 10-एमएल सिरिंज संलग्न करें। सिरिंज से सकारात्मक हवा का दबाव लागू होने तक टीएमए-सीएल समाधान का एक बुलबुला बन जाता है; यह कदम माइक्रोस्कोप के माध्यम से प्रत्यक्ष दृश्य के तहत किया जाना चाहिए।
  18. आईएसएम धारक को धीरे से टैप के बुलबुले को बंद करने के लिए टैप करें।
  19. 10 एमएल सिरिंज पर नकारात्मक दबाव का उपयोग करके आईएसएम की नोक में करीब 1,500 माइक्रोन की ऊंचाई पर क्लोरोटीमैथाइलसिलिन समाधान खींचना।
  20. टॉम ( चित्रा 3 डी ) पर टीएमए-सीएल समाधान का एक बुलबुला बनने तक आईएसएम की नोक से क्लोरोटीमैथाइलसिलिन समाधान पूरी तरह से निष्कासित करें।
  21. चरणों 3.19 और 3.20 पांच बार दोहराएं। सुनिश्चित करें कि तरल पदार्थ का एक भी, निर्बाध स्तंभ प्रत्येक बार टिप में खींचा जाता है। यदि कोई उपाय टिप में नहीं खींचा जा सकता है, तो जांच लें कि टयूबिंग अवरुद्ध है या नहीं, हवा की मुहर अधूरी है या आईएसएम की नोक अवरुद्ध है।
  22. जब तक टीएमए-सीएल समाधान का एक बुलबुना तैयार नहीं हो जाता है, तब तक टिप के सभी क्लोरोटीमैथाइलसिलिन समाधान को फ्लश करें।
  23. सिरिंज पर सकारात्मक दबाव बनाए रखते हुए, xylene समाधान से आईएसएम हटा दें। यह सुनिश्चित करें कि सभी xylene समाधान को आईएसएम टिप से निष्कासित कर दिया गया है, क्योंकि अधिक xylene exc को बर्बाद कर देगापिछड़ चरणों में बनाया पिछलग्गू स्तंभ
  24. टीएमए के लिए तरल आयन एक्सचेंजर (एलआईसीएक्स) धारण करने वाले एक छोटे, पारदर्शी कंटेनर (या तो एक्सचेंजर एक छोटे या क्यूवेट में आया) में आईएसएम की टिप रखें। क्षैतिज खुर्दबीन सेटअप का उपयोग करके प्रत्यक्ष दृश्य के तहत यह चरण निष्पादित करें।
  25. टिप में कम से कम एलएक्स आकर्षित करने के लिए एक छोटी मात्रा में नकारात्मक दबाव डालें ( यानी, जैसे ही एलआईक्स टिप में प्रवेश किया जाता है, नकारात्मक दबाव लगाने से रोकें)।
  26. टयूबिंग से 10 एमएल सिरिंज को डिस्कनेक्ट करें और आईएसएम को 5 मिनट तक बैठने दें। उस समय के दौरान, एलएक्स सिलीनाइज्ड टिप में प्रवेश करेगी जब तक यह संतुलन की स्थिति तक नहीं पहुंच जाएगा।
  27. एलएक्स से आईएसएम निकालें टयूबिंग एक्सचेंजर बैरल के बाहर खींचो (जबकि संभव के रूप में छोटे मोम को हटाने) आईएसएम के पीछे के अंत में बनाए गए छोटे खुलने में क्लोरिडित चांदी के तार को रखें। पिघला हुआ मोम के साथ एक्सचेंजर बैरल की बैकफिल में तार सील करें।
  28. आईएसएम बैठने की अनुमति देंकम से कम 30 मिनट के लिए बीकर के अंदर रिम को किसी भी लचीला, अस्थायी चिपकने वाला पूरा आईएसएम लगाएं।
  29. चरण 1.8 में बनाए गए प्रत्येक अंशांकन समाधान में आईएसएम द्वारा मापा वोल्टेज को रिकॉर्ड करके आईएसएम को जांचें।
    नोट: अंशांकन एक अंशांकन स्टेशन में किया जा सकता है (चरण 2.3 देखें) या प्रयोगात्मक सेटअप में। इस प्रक्रिया को पूरक बी में और हाक एट अल 10 में रेखांकित किया गया है।
  30. यदि आईएसएम अंशांकन कई आईएसएम के लिए सफल रहा, तो इरादा उपयोग के दिन तक यहां रोकें। यदि नहीं, तो अधिक आईएसएम बनाना।
  31. प्रयोग के दिन, फिर माइक्रोइलेक्ट्रोड को जांचना (चरण 3.2 9 देखें)।

चित्र तीन
चित्रा 3: आयन-चयनात्मक माइक्रोएलेक्ट्रोड की तैयारी। ( ) केशिका के छोर को वापस करने और खींचने के बाद आईएसएम (चरण 3.2-3.6): दोनों छोर पर एक एकल बैरलफा का कांच केशिका छिद्रित है। एक आईएसएम को एक डबल-बैरल ग्लास केशिका खींचकर तैयार किया जाता है ताकि दो सूक्ष्मदर्शी युक्तियां ठीक हो सकें। ( बी ) बैरल बैकफिलिंग के बाद आईएसएम (चरण 3.7-3.9): एक आईएसएम की नोक 2-5 सुक्ष्ममापी व्यास के लिए छिद्रित होती है। आयन-चयनात्मक बैरल को टीएमए-सीएल के साथ बैकफिल किया गया है, और संदर्भ बैरल NaCl से बैकफ़िल किया गया है। ( सी ) क्लोरोटेरिमेयथिलसिलेन (चरण 3.11-3.13) के साथ कोटिंग से पहले आईएसएम: एक क्लोरिडित चांदी का तार संदर्भ बैरल में डाला जाता है। पॉलीटेट्राफ्लूरोइथेलेन (पीटीएफई) टयूबिंग एक 25 जी सुई से जुड़ा हुआ है और आयन-चयनात्मक बैरल में डाला जाता है। दोनों बैरल के शीर्ष पर एक हवा-तंग सील दंत मोम का उपयोग कर बनाई गई है। ( डी ) क्लोरोटीमर्थाइलसिलाइन (चरण 3.15-3.26) के साथ एक माइक्रोप्रिपेट कोटिंग: [कम बढ़ाई] क्षैतिज रूप से घुड़सवार स्टिरिओमोरिकोस्कोप के साथ क्लोरोटीमैथाइलसिलिन में निलंबित आईएसएम। [उच्च आवर्धन] क्षैतिज रूप से घुड़सवार स्टिरिओमिक्रोसेक के माध्यम से दृश्यक्लोरोटीमियेथिलिसिलन समाधान में आईएसएम टिप का ओप माइक्रोस्कोप के माध्यम से टिप की विज़ुअलाइज़ेशन के बाद, टीएमए-सीएल समाधान की छोटी मात्रा को आयन-चयन बैरल (पर्याप्त टीएमए-सीएल समाधान का एक छोटा सा बुलबुला उत्पन्न करने के लिए) से निष्कासित कर दिया गया है। आईएसएम धारक को टीएमए-सीएल समाधान बबल जारी करने के लिए टैप किया जाता है और फिर क्लोरोटीमैथाइलसिलिन को टिप में तैयार किया जाता है। यह चक्र कई बार दोहराया जाता है। आईएसएम से सभी क्लोरोटाईमेथाइलसीलान निकल जाने के बाद, आईएसएम को टीएमए के लिए तरल आयन एक्सचेंजर (एलआईसीए) में रखा गया है और एलिक्स आयन-चयनात्मक बैरल की नोक में खींचा गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

4. Iontophoresis माइक्रोएलेक्ट्रोड की तैयारी

नोट: Iontophoresis microelectrodes प्रयोग के दिन गढ़े होना चाहिए।

  1. एक ऊर्ध्वाधर या हो पर एक डबल बैरल बोरोसिलेट ग्लास केशिका खींचेंरेजांटिकल पुलर चरण 3.6 ( चित्रा 4 ए ) में खींचा माइक्रोप्रोपेट्स के समान विंदुक खींचने के लिए पैरामीटर को दर्जी करें।
  2. चरण 3.7 में उपयोग किए गए मिश्रित माइक्रोस्कोप के नीचे माइक्रोप्रिपेस रखें और एक गिलास सूक्ष्मदर्शी स्लाइड का उपयोग करके टिप काट दें ताकि परिणामस्वरूप व्यास 2 और 5 माइक्रोन ( चित्रा 4 ए ) के बीच हो।
  3. एक 0.2 एमबी फिल्टर और एक 28 जी, 97 मिमी सुई ( चित्रा 4 ए ) से जुड़ी 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके 150 एमएम टीएमए-सीएल बैकफिल समाधान के साथ बैरल भरें।
  4. यह सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे माइक्रोपिपेट को टैप करें कि कोई भी बुलबुले बैरल के दोनों बगल में नहीं छोड़े।
  5. क्लोरिडेड चांदी के तारों को माइक्रोप्रोपेट के दोनों बैरल में रखें। यह सुनिश्चित करें कि तारों के बैकफ़िल समाधान में काफी गहराई है ताकि वे प्रयोग की अवधि के समाधान के संपर्क में बने रहें।
  6. तारों को गर्म दांत के मोम का उपयोग करके बैरल में सील करें। धीरे से इंटरलाक टी वह एक दूसरे के चारों ओर घुमाते हुए तारों ( चित्रा 4 बी में दिखाए गए माइक्रोइलेक्ट्रोड को पूरा)।

चित्रा 4
चित्रा 4: एक Iontophoresis माइक्रोएलेक्ट्रोड की तैयारी। ( ) बैरल्स दोहराए जाने के बाद Iontophoresis microelectrode (चरण 4.1-4.3): एक आयनोस्थोरेसिस माइक्रोइलेक्ट्रोड को केशिका ट्यूब से खींचा जाता है। माइक्रोएलेक्ट्रोड की टिप 2-5 माइक्रोन के व्यास के लिए छिड़ गई है। Iontophoresis माइक्रोएलेक्ट्रोड के दोनों बैरल टीएमए-सीएल समाधान से भरे हुए हैं। ( बी ) पूर्ण आयनटोस्कोरोसिस माइक्रोएक्लेक्ट्रोड (चरण 4.5-4.6): बैरल में डाले गए दो क्लोराइज्ड चांदी के तारों के साथ एक आयनोप्टोसिसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड। माइक्रोइलेक्ट्रोड के बैरल मोम के साथ सील कर दिए जाते हैं, और चांदी के तारों को माइक्रोएलेक्ट्रोड के पीछे मुड़ते हैं।/files/ftp_upload/55755/55755fig4large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. कृत्रिम सेरेब्रोस्पिनल द्रव और कृंतक मस्तिष्क टिशू स्लाइस की तैयारी

  1. प्रयोग के लिए उपयुक्त संरचना के साथ 1 एल कृत्रिम मस्तिष्कशोथ द्रव (एसीएसएफ) तैयार करें और इसमें 0.5 एमएम टीएमए-सीएल जोड़ें।
    नोट: प्रयोग के दौरान टीएमए की पृष्ठभूमि की एकाग्रता स्थापित करने के लिए टीएमए-सीएल आवश्यक है।
  2. मानक प्रोटोकॉल 11 , 12 के अनुसार 400 सुक्ष्ममापी की मोटाई के साथ कृंतक मस्तिष्क स्लाइस तैयार करें। मस्तिष्क स्लाइस के विच्छेदन और रखरखाव के लिए 5.1 चरण में तैयार एसीएसएफ का उपयोग करें।

6. एगारोस में रीयल-टाइम इयोन्टोफोरेसिस

  1. वाल्टर और वांडा कार्यक्रम चलाने वाले कंप्यूटर को चालू करें
    नोट: अनुरोध पर ये कार्यक्रम स्वतंत्र रूप से उपलब्ध हैं। हालांकि यह सॉफ़्टवेयर जरूरी नहीं है, वही प्रोग्रामिंग समान हैसॉफ्टवेयर या हाथ से विश्लेषण प्रदर्शन अन्यथा आवश्यक होगा।
  2. एसीएसएफ को एक उचित दर पर डुबकी कक्ष के माध्यम से चलाएं ( जैसे, 2 एमएल / मिनट)। प्रयोग की अवधि के लिए तापमान नियंत्रक को वांछित तापमान और बबल एसीएसएफ के साथ 95% हे 2 /5% सीओ 2 (या अन्य उपयुक्त गैस मिश्रण) निर्धारित करें।
  3. एक उपयुक्त धारक में एक उदासीन (जमीन) इलेक्ट्रोड को माउंट करें और डुबकी एसीएसएफ में डुबकी डालने के लिए डुबकी कक्ष के माध्यम से चल रहा है। तार को रिकॉर्डिंग सेटअप के आधार पर कनेक्ट करें
  4. पहले से तैयार 0.3% agarose के साथ छिद्रपूर्ण कप (चरण 1.7 में बनाया) भरें और इसे डुबकी कक्ष में रखें। सुनिश्चित करें कि समाधान कप के शीर्ष पर नहीं चलता है।
  5. एक कैलिब्रेटेड आईएसएम को एक माइक्रोमैनिपुलेटर के पिपेट धारक और दूसरे को आयनोस्टोरेसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड सुरक्षित रखें। धारकों को सेटअप के लिए उपयुक्त कोण को सेट करें ( चित्रा 5 ए )।
  6. जुडियेआईएसएम और iontophoresis माइक्रोइलेक्ट्रोड के तार उनके रिकॉर्डिंग एम्पलीफायर के प्रमुख चरणों में हैं। वैकल्पिक रूप से, सीधे एम्पलीफायर से कनेक्ट करें (सेटअप के आधार पर)
  7. सुनिश्चित करें कि कनेक्टिंग वायर्स या क्लिप के वजन / पोजीशनिंग से माइक्रोएलेक्ट्रोड की कोई भी गति नहीं होती है, क्योंकि स्थिति में छोटे उतार-चढ़ाव परिणामों को प्रभावित कर सकता है।
  8. इलेक्ट्रॉनिक सेटअप चालू करें (चरण 2 से) अलग उदाहरणों में वाल्टर और वांडा को प्रारंभ करें
  9. वांडा जीयूआई में, "कैलिब्रेट करें" ( चित्रा 6 ए ) पर क्लिक करें। अंशांकन बॉक्स ( चित्रा 6 बी ) में, आईएसएम अंशांकन (चरण 3.2 9) के दौरान मापा गया वोल्टों को भरें और "फ़िट डेटा" पर क्लिक करें।
    नोट: यह निकोलस्की समीकरण (वैकल्पिक रूप से एम और कश्मीर प्राप्त करने के लिए दूसरे तरीकों से समीकरण को फिट) के निम्न प्रतिनिधित्व के लिए उपयुक्त बनाता है:
    समीकरण
    उसकेई, वी मापा वोल्टेज (एमवी) है, एम निकोलस्की ढलान (एमवी) है, सी आयन (एमएम) की एकाग्रता है, कश्मीर हस्तक्षेप (एमएम) है, और वी 0 ऑफसेट वोल्टेज (एमवी) 3 है
  10. मुख्य जीयूआई में चरण 6.9 में उत्पन्न ढलान ( एम ) और हस्तक्षेप ( के ) को स्वचालित रूप से स्थानांतरित करने के लिए कैलिब्रेट बॉक्स में "स्वीकार करें" पर क्लिक करें।
    नोट: यहाँ, कश्मीर ना हस्तक्षेप, जो आमतौर पर नगण्य है प्रतिनिधित्व करता है।
  11. GUI के बाईं ओर, यह सुनिश्चित करें कि सभी प्रयोगात्मक पैरामीटर संबंधित प्रविष्टियों ( चित्रा 6 ए ) में सेट हैं।
    1. स्रोत मेथड बॉक्स में, स्रोत को iontophoretic स्रोत (डिफ़ॉल्ट), "रिकॉर्ड की अवधि" को "200 s" (डिफ़ॉल्ट), "पल्स आरंभ" से "10 s" (डिफ़ॉल्ट), "पल्स एंड" "60 एस" (डिफ़ॉल्ट), "पूर्वाग्रह वर्तमान" से "20 एनए" (डिफ़ॉल्ट) तक,"मुख्य वर्तमान" से "100 एनए" (डिफ़ॉल्ट), और "रूपांतरण फैक्टर" को एक उचित मान पर।
    2. मापने इलेक्ट्रोड बॉक्स में, स्नान समाधान (एमएम में व्यक्त) के भीतर निहित टीएमए की एकाग्रता के लिए "स्नान सी" सेट करें उपयोग में डेटा अधिग्रहण प्रणाली के उचित मूल्यों के लिए "कुल लाभ," "आउटपुट चैनल," "आईएसएम चैनल," और "रेफरी चैनल" सेट करें।
      नोट: "रूपांतरण फैक्टर" को उचित मूल्य पर सेट किया जाना चाहिए (प्रयोग में iontophoretic इकाई के लिए विशिष्ट)। यह मान डी / ए कनवर्टर (एनए / एमवी) से दिए गए लागू वोल्टेज के लिए दिया गया वर्तमान की राशि को निर्दिष्ट करता है।
  12. अगर कप में एक तापमान जांच रखें जीयूआई के "मेजरिंग इलेक्ट्रोड" बॉक्स में "तापमान" प्रविष्टि में मापा तापमान दर्ज करें ( चित्रा 6 ए )।
  13. उप-स्तरीय प्रकाशक चालू करें। यदि आवश्यक हो, तो कैमरे को mic से संलग्न करेंरोस्कोप और कैमरा मॉनिटर
  14. अंडोरा में कम से कम 1000 माइक्रोन माइक्रोइलेक्ट्रोड को कम करें और उन्हें कप में रखें ( चित्रा 5 बी )। 10X उद्देश्य (लंबे समय तक काम करने वाले दूरी के साथ जल-विसर्जन उद्देश्य) का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के तहत उन्हें कल्पना करो।
  15. एम्पोरिफायर पर वोल्टेज को 0 एमवीएफ़ को संदर्भ और आईएसएम चैनल दोनों के लिए ऑफसेट करने के लिए बेसलाइन वोल्टेज के रूप में एगरोज़ में दर्ज वोल्टेज की स्थापना के लिए।
  16. दो-चैनल एम्पलीफायर पर, आईएसएम चैनल कनेक्टर को मैन्युअल रूप से संदर्भ और आईएसएम चैनलों के बीच घटाव 'ऑन' सेट करने के लिए वोल्टेज घटाव आउटपुट में ले जाएँ।
    नोट: घटाव यह सुनिश्चित करता है कि आईएसएम चैनल में वोल्टेज परिवर्तन अकेले टीएमए एकाग्रता में बदलाव को दर्शाता है।
  17. आईएसएम को स्थानांतरित करें ताकि यह आयनोस्टोरेसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड के टिप को छू सके। सभी तीन दिशात्मक अक्षों में एक-दूसरे पर युक्तियाँ केन्द्रित करें
  18. शून्य पर माइक्रोइलेक्ट्रोडोड दोनों की रिश्तेदार स्थितिमाइक्रोमैनेप्युलेटर नियंत्रण बक्से सुनिश्चित करें कि माइक्रोइलेक्ट्रोडस सही और सटीक (गंभीर) केंद्रित हैं।
  19. एक अक्ष में आयनटोस्कोरोसिस माइक्रोइलेक्ट्रोड से आईएसएम 120 माइक्रोन दूर ले जाएं (बायां-दायां अक्ष, चित्रा 5 बी )। जीयूआई के "माप इलेक्ट्रोड" बॉक्स में इस दूरी को इनपुट करें ( चित्रा 6 ए )।
  20. जीयूआई ( चित्रा 6 ए ) में "अधिग्रहण" पर क्लिक करके एक रिकॉर्डिंग शुरू करें; प्रोग्राम को एक पूर्ण रिकॉर्डिंग रिकॉर्ड करने की अनुमति दें।
    नोट: iontophoresis microelectrode एक निरंतर पूर्वाग्रह वर्तमान प्राप्त करता है "अधिग्रहण" पर क्लिक करने के बाद, एक सीमित अवधि के लिए मुख्य चालू होने से पहले एक छोटी देरी है।
  21. दो से तीन बार चरण 6.20 दोहराएं। नए रिकॉर्ड प्राप्त करने से पहले टीएमए संकेत बेसलाइन पर वापस आने तक प्रतीक्षा करें; कार्यक्रम बाद के विश्लेषण के लिए प्रत्येक रिकॉर्ड को बचाएगा।
  22. आईएसएम वापस टी चलकर दो माइक्रोएलेक्ट्रोड की रिक्ति की जांच करेंओ नियंत्रण बॉक्स द्वारा निर्दिष्ट शून्य स्थिति। यदि माइक्रोइलेक्ट्रोड्स अब केन्द्रित नहीं हैं, तो चरण 6.17 के रूप में एक ही रणनीति का उपयोग करके उन्हें फिर से केन्द्रित करें। इलेक्ट्रोड की स्थिति में कोई भी बदलाव रिकॉर्ड करें।
    नोट: यदि अंतर लगभग 2% से अधिक है, तो चरण 6.1 9 में प्राप्त रिकॉर्ड सटीक नहीं समझा जा सकता है और नए को लिया जाना चाहिए।

चित्रा 5
चित्रा 5: अग्र में प्रयोगों के लिए सेटअप। ( ) पतला अगर में प्रयोग के लिए सेटअप (चरण 6.1-6.5): चलना छिड़काव कक्ष में पतले अगर से भरा एक छोटा झरझरा कंटेनर। एक आयनोपोरेसिस माइक्रोएक्लेक्ट्रोड (बायीं तरफ) और एक आईएसएम (दायां तरफ) माइक्रोएक्लेक्ट्रोड धारकों द्वारा आयोजित किया जाता है; माइक्रोइलेक्ट्रोइड धारक रोबोट micromanipulators की बाहों में फिट हैं। एगर जेल में एक तापमान जांच की जाती है, और एक उदासीन जमीन इलेक्ट्रोड पीएल हैपनडुब्बी चैम्बर के भीतर कसौटी ( बी ) अगर एगर में माइक्रोइलेक्ट्रोड के बढ़ते दृश्य: एक आयनोस्टोरेसिस माइक्रोएक्लेक्ट्रोड (बायीं तरफ) और आईएसएम (दाहिनी ओर) को 10 दिनों में पानी के विसर्जन उद्देश्य (150 एमएम NaCl में डूबे हुए उद्देश्य) का उपयोग करते हुए देखा जाता है। माइक्रोइलेक्ट्रोडोड्स माइक्रोनिपुलेटर्स द्वारा 1,000 सुक्ष्ममापी की गहराई तक तैनात किए जाते हैं; माइक्रोइलेक्ट्रोड के बीच की दूरी 120 माइक्रोन है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्र 6: वांडा कंप्यूटर सॉफ्टवेयर इंटरफेस ( ) वांडा ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) नेविगेट करना: वांडा सॉफ्टवेयर खोलने के बाद दिखाई देने वाली स्क्रीन बॉक्स (1) में, उपयुक्त माध्यम, आयनोपोटोसिस अणु, और तकनीक का चयन किया जाता है। (2) "कैलिब्रेट" को खोलने के लिए क्लिक किया जाता हैवांडा कैलिब्रेशन बॉक्स आईएसएम को कैलिब्रेट करने के बाद ( चित्रा 6 बी और सप्लीमेंट बी देखें), आईएसएम प्रोटोकॉल के चरण 6 और 8 में वर्णित अनुसार, अगर या मस्तिष्क में स्थित है। बॉक्स (6) में, प्रयोग किए जाने वाले सभी उपयुक्त मान दर्ज किए जाते हैं। (7) "अधिग्रहण" को रिकॉर्डिंग लेने के लिए क्लिक किया जाता है; वांडा जीयूआई के शीर्ष-सही हिस्से में वोल्टेज बनाम का एक ग्राफ का समय होता है। ( बी ) वांडा में आईएसएम कैलिब्रेट करना : वांडा जीयूआई में "कैलिब्रेट" (2) पर क्लिक करने के बाद खुलने वाली विंडो चरण 3.2 9 से मान बॉक्स (3) में दर्ज किए गए हैं, और (4) "फ़िट डेटा" का चयन किया गया है। अंशांकन वक्र रैखिक होने की पुष्टि की गई है। (5) "स्वीकार करें" को वांडा जीयूआई पर वापस लौटने के लिए क्लिक किया गया है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

7. Agarose डेटा विश्लेषण

  1. को खोलोकंप्यूटर पर वाल्टर कार्यक्रम (पीसी) "0 से रिकॉर्ड्स:" मेनू में, वांडा ( चित्रा 7 ए ) द्वारा उत्पन्न रिकॉर्ड को पढ़ने के लिए "वांडा / वोल्टो" बटन पर क्लिक करें। उस स्प्रैडशीट में आउटपुट की आवश्यकता होने के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर खोलना आवश्यक है। "1. एक्सेल लिखें" में "शीट 1,3" पर क्लिक करें? मेनू ( चित्रा 7 बी )
  2. अगली पॉप-अप विंडो में, पढ़ने के लिए रिकॉर्ड्स का चयन करें और "ओपन" पर क्लिक करें ( चित्रा 7 बी ); ध्यान दें कि अभिलेख स्वचालित रूप से गढ़े होंगे उपयुक्त प्रक्रिया शुरू करने के लिए, निम्न चरणों का पालन करें
    1. "2. विकल्प" मेनू में, "रिक रिक" बटन पर क्लिक करें। " चित्रा 2 " पॉप-अप विंडो में, संसाधित करने वाले पहले रिकॉर्ड पर क्रॉसहेयर को स्थानांतरित करने के लिए माउस का उपयोग करें ( चित्रा 7c ); रिकॉर्ड चुनने के लिए माउस बटन दबाएं।
    2. ओ क्लिक करेंमेनू में n "फिट वक्र" फिटिंग के पुनरावृत्तियों की वांछित संख्या का चयन करें; डेटा के सटीक फिट प्राप्त करने के लिए फिटिंग के कम से कम 20 पुनरावृत्तियों का उपयोग करें।
    3. मेनू में, सभी डेटा बिंदुओं को फिट करने के लिए "सभी" चुनें और "जारी रखें" चुनें; कार्यक्रम प्रदर्शित वक्र फिट होगा उचित प्रक्रिया को देखें और प्रायोगिक रिकार्ड की तुलना करें, जो सबसे अच्छी फिट वक्र प्राप्त की गई है।
  3. "एक्सेल" पर "7. परिणाम" मेनू ( चित्रा 7 डी ) में क्लिक करके उपयुक्त स्प्रैडशीट प्रोग्राम को परिणाम लिखने के लिए विकल्प चुनें। नोट (और रिकॉर्ड) निम्न महत्वपूर्ण डेटा का उपयोग आयनोस्टोरेसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड की कार्यक्षमता निर्धारित करने के लिए किया जाएगा: ' डी (ई 5) ', ' संदर्भ डी (ई 5) ', ' आर_एप ', परिवहन संख्या ' एन टी ', ' स्पष्ट एन टी '
    नोट: " डी (ई 5) ": मापित मुक्त प्रसार coefficienटीएक्स 10 5 (सेमी 2 / एस); " संदर्भ डी (ई 5) ": सैद्धांतिक मुक्त प्रसार गुणांक x 10 5 (सेमी 2 / एस) यह मान आयन, माध्यम, और तापमान इनपुट के आधार पर वाल्टर के भीतर एक डेटाबेस से निकाला जाता है। " R_app ": मापित और संदर्भ डी (ई 5) के आधार पर गणना की गई माइक्रोइलेक्ट्रोल्ड स्पेसिंग ( सीएम ) स्पष्ट है। " N t ": परिवहन संख्या (आयाम रहित) यह संख्या आयनटोस्कोरोसिस वर्तमान का अंश निर्धारित करती है जो कि टीएमए 4 रिलीज करने के लिए इस्तेमाल की जा रही है। " स्पष्ट n t ": स्पष्ट परिवहन संख्या (आयाम रहित) यह r_app से गणना की जाने वाली परिवहन संख्या है यह संख्या मापा n टी के करीब होना चाहिए
  4. माइक्रोएलेक्ट्रोड की एक चुनी गई जोड़ी के लिए प्रत्येक रिकॉर्ड के लिए 7.1-7.3 चरण दोहराएं।
  5. निर्धारित करें कि क्या आयनटॉस्कोरोसिस माइक्रोइलेक्ट्रोड निम्नलिखित कार्य करके उपयोग करने योग्य है।
    1. वास्तविक आर ( यानी, 120 माइक्रोन) के साथ " आर_एप" की तुलना करें; यह मानदंड पूरा हो गया है अगर सभी परीक्षणों के औसत मूल्य एक-दूसरे के 4% के भीतर हैं
    2. संदर्भ डी (ई 5) के साथ " डी (ई 5)" की तुलना करें; यह मानदंड पूरा हो गया है कि सभी परीक्षणों से औसत मूल्य एक-दूसरे के 8% के भीतर हैं।
    3. एक ही microelectrode के साथ परीक्षण के बीच "n t" की तुलना करें; यह मानदंड पूरा हो गया है कि अगर सभी परीक्षणों से औसत मूल्य एक-दूसरे के 10% के भीतर हैं
  6. यदि कदम 7.5 से मानदंड में से कोई भी पूरा नहीं हुआ, तो आयनोस्टोरेसिस माइक्रोइलेक्ट्रोड को समस्या निवारण करें या दूसरा परीक्षण शुरू करें।
  7. यदि iontophoresis microelectrode प्रयोग के लिए उपयुक्त समझा जाता है, तो वांडा जीयूआई ( चित्रा 6 ए ) में "परिवहन संख्या N" क्षेत्र में सभी परीक्षणों से औसत परिवहन संख्या रिकॉर्ड करें।

jove_content "> चित्रा 7
चित्रा 7: वाल्टर कंप्यूटर सॉफ्टवेयर इंटरफेस ( ) वॉल्टर में डेटा संग्रह कार्यक्रम चुनना: वाल्टर सॉफ्टवेयर शुरू करने के बाद "0. रिकॉर्ड्स ऑफ़:" मेन्यू खुलता है। "वांडा / वोल्टोरो" बटन पर क्लिक करके वांडा द्वारा सहेजे गए रिकॉर्ड को लोड करने का विकल्प चुना गया है ( बी ) वाल्टर में डेटा और डेटा विश्लेषण आउटपुट स्थान चुनना: [वाम] उचित स्प्रैडशीट प्रोग्राम खोलने के बाद, "शीट्स 1,3" को पहले खोले गए स्प्रैडशीट प्रोग्राम के लिए सभी वाल्टर डेटा विश्लेषण का उत्पादन करने के लिए चुना जाता है। [दाएं] डेटा विश्लेषण के बाद आउटपुट स्थान चुना जाता है, एक पॉप-अप विंडो खुलती है, जिससे उपयोगकर्ता वाल्टर द्वारा पढ़े जाने वाले पहले और अंतिम रिकॉर्डिंग को चुनने देता है। ( सी ) वाल्टर में विश्लेषण करने के लिए रिकॉर्डिंग का चयन करना: [दाएं] पढ़ने के लिए फाइल को चुने जाने के बाद, एक पॉप-अप विंडो सभी चयनित रिकॉर्डों के साथ खुल जाएगीएक ग्राफ के रूप में खेला (" चित्रा 2 ")। [वाम] "2. विकल्प" मेनू में, "आरईसी का चयन करें" क्लिक किया जाता है, और माउस को विश्लेषण के लिए पहली रिकॉर्डिंग की पहचान करने के लिए क्रॉसहेयर ले जाने के लिए उपयोग किया जाता है; या तो माउस बटन को रिकॉर्डिंग चुनने के लिए दबाया जाता है। ( डी ) वाल्टर से स्प्रैडशीट में डेटा विश्लेषण निर्यात करना: डेटा को फिटिंग करने के बाद, एक पॉप-अप विंडो और "7 परिणाम" मेनू दिखाई दे। वाल्टर (लाल) द्वारा तैयार फैल प्रसार वक्र के साथ चयनित रिकॉर्डिंग (नीला) का [वाम] ग्राफ। [दाएं] "7 परिणाम" मेनू उपयोगकर्ता को "एक्सेल" बटन पर क्लिक करके स्प्रेडशीट प्रोग्राम को डेटा से विश्लेषण लिखने की अनुमति देता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

8. मस्तिष्क स्लाइसें में वास्तविक समय Iontophoresis

  1. एक 400 सुक्ष्ममापी मोटी मस्तिष्क रखेंरिकॉर्डिंग कक्ष में जूँ, यह सुनिश्चित करना कि यह बहते हुए एसीएसएफ में पूरी तरह से जलमग्न है। एक वॉटरकलर पेंटब्रश का उपयोग करके टुकड़ा रखें और धीरे से ग्रिड के साथ सुरक्षित करें।
  2. मस्तिष्क टुकड़े पर ब्याज के क्षेत्र के ऊपर आयनटोस्कोरोसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड और आईएसएम दोनों को स्थानांतरित करें। बहते हुए एसीएसएफ में, लेकिन स्लाइस के ऊपर दोनों तरबूज।
  3. "0" एमवी के संदर्भ और आयन-संवेदन चैनल दोनों के लिए वोल्टेज ऑफसेट। स्थिर करने के लिए दोनों चैनलों में वोल्टेज की प्रतीक्षा करें चार्ट रिकॉर्डर पर, आईएसएम के आयन संवेदन चैनल पर मापा वोल्टेज को चिह्नित करें। वांडा में बेसलाइन वी पैरामीटर की गणना के लिए इसका उपयोग करें।
  4. आईएसएम और iontophoresis माइक्रोइलेक्ट्रोड 200 एमएल टुकड़ा में गहरा और एक दूसरे से 120 माइक्रोन दूर रखें। मस्तिष्क टुकड़ा में माइक्रोइलेक्ट्रोड को ले जाने के बाद संकेत के स्थिरीकरण के लिए रुको।
    नोट: iontophoresis microelectrode के लिए लागू पूर्वाग्रह वर्तमान टीएमए के एक छोटे से संचय का कारण बनता है। यह एक सामान्य गलती है जो कि ए.आर.बहुत जल्दी ecording और संकेत buildup को कम।
  5. चार्ट रिकॉर्डर पर, आईएसएम के आयन-संवेदन चैनल पर मस्तिष्क स्लाइस में मापा स्थिर वोल्टेज को चिह्नित करें। चरण 8.3 और चरण 8.4 में मापा टीएमए संकेत के बीच वोल्टेज अंतर की गणना करें और वांडा जीयूआई के माप इलेक्ट्रोड बॉक्स ( चित्रा 6 ए ) में "बेसलाइन वी (एमवी)" फ़ील्ड में यह मान इनपुट करें।
  6. जीयूआई के बाईं ओर, यह सुनिश्चित करें कि सभी प्रायोगिक पैरामीटर सही ढंग से दर्ज / दर्ज किए गए हैं। "मस्तिष्क", "ट्रांसपोर्ट संख्या" को चरण 7.4 में आयनटोस्कोरोसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड के लिए गणना की गई औसत मूल्य और "स्लाइस" वाले स्नान के तापमान पर "तापमान" के लिए "मध्यम" सेट करें।
    नोट: माप के प्रत्येक सेट के लिए वी दर्ज की जानी चाहिए। बेसलाइन वी को वांडा द्वारा मूलभूत सी (एमएम) पैरामीटर ( यानी, मस्तिष्क के ऊतकों में टीएमए की एकाग्रता) में परिवर्तित कर दिया जाएगा।
  7. "अधिग्रहण" पर क्लिक करके रिकॉर्डिंग शुरू करें और इसे पूर्ण रिकॉर्डिंग ले सकें। एक नई रिकॉर्डिंग प्राप्त करने से पहले टीएमए संकेत बेसलाइन पर वापस आने तक प्रतीक्षा करें।
  8. चुने गए मस्तिष्क स्थान से माइक्रोइलेक्ट्रोड को हटाने से पहले दो से तीन लगातार रिकॉर्डिंग लें। इनपुट प्रत्येक रिकॉर्डिंग के तुरंत बाद वांडा सॉफ्टवेयर में मापा जाता है।
  9. चक्कर की सतह पर तिरछे दोनों सूक्ष्म अल्ट्राट्रॉड्स को ले जाएं। स्लाइस से कम से कम 50 माइक्रोन तक दोनों उठाएं। चार्ट रिकॉर्डर का उपयोग करके, अब वी मापा और चरण 8.3 से इसकी माप के बीच कोई भी परिवर्तन निर्धारित करें।
  10. आईएसएम और iontophoretic microelectrodes के सुझाव एक्स-, वाई-, और जेड-एक्स में एक दूसरे के रिश्तेदार केंद्र हैं। Micromanipulator नियंत्रण बॉक्स के प्रदर्शन से अंतर परिवर्तन, यदि कोई हो, प्राप्त करें।

9. मस्तिष्क डेटा विश्लेषण

  1. विश्लेषण आउटपुट के लिए एक नई स्प्रैडशीट खोलें।
  2. विश्लेषण करने के लिए वाल्टर में चरणों 7.1-7.4 दोहराएंई मस्तिष्क से ली गई रिकॉर्डिंग
  3. वाल्टर मेनू में "Excel" पर क्लिक करके स्प्रेडशीट प्रोग्राम पर डेटा लिखें मस्तिष्क ईसीएस की α , मात्रा अंश रिकॉर्ड करें; Λ , मस्तिष्क ईसीएस की कष्टप्रदता; और कश्मीर (एस -1 ), गैर-विशिष्ट मंजूरी।

10. परिवहन संख्या और आईएसएम अंशांकन की जांच करना

  1. उपाय प्रयोग के अंत में भारतीय चिकित्सा पद्धति परिवहन संख्या (एन टी) नीचे प्रोटोकॉल का उपयोग। वैकल्पिक रूप से, महत्वपूर्ण परीक्षणों या जब माप विषम दिखाई के बाद n t की जाँच करें। हालांकि, जाँच n t कई बार मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए आघात हो सकता है।
  2. Agarose में नई रिकॉर्डिंग ले लो चरण 6.4, 6.11, 6.12, 6.14, 6.15 और 6.17-6.22 देखें।
  3. नए agarose रिकॉर्डिंग से n टी प्राप्त करने के लिए वाल्टर में चरण 7.1-7.4 दोहराएं। स्प्रैडशीट का निरीक्षण करें: यदि एनटी ने अधिक से बदल दिया हैकी तुलना में मस्तिष्क माप से पहले प्राप्त n t से 10%, डेटा इस iontophoretic microelectrode के साथ प्राप्त विश्वसनीय नहीं हैं।
  4. सभी मस्तिष्क डेटा एकत्र किए जाने के बाद आईएसएम के लिए एक नया अंशांकन (चरण 3.2 9 देखें) करें वांडा कैलिब्रेट बॉक्स में इनपुट के रूप में नए प्राप्त आईएसएम अंशांकन डेटा का उपयोग करें (चरण 6.9 और 6.10 देखें) और जांच लें कि ढलान मूल्य पिछले अंशांकन से 10% से कम है।
    नोट: इस आईएसएम से प्राप्त आंकड़े विश्वसनीय नहीं हैं यदि ढलान मूल्य पिछले अंशांकन से 10% से अधिक के बराबर है।

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Representative Results

आरटीआई तकनीक की उपयोगिता को α में परिवर्तन और एक हाइपोइस्मोलालर चुनौती ( चित्रा 8 और 9 चित्रा ) के दौरान मापने के लिए डिज़ाइन किए गए एक प्रयोग में प्रदर्शित किया गया है। यह पहले से दिखाया गया है कि हाईपोटोनिक एसीएसएफ पर धोने से ईसीएस के ऑस्मोलरायटी को कम करने से α में कमी आती है और λ 13 में वृद्धि होगी।

इस प्रयोग में, आरटीआई दोनों नियंत्रण शर्तों के तहत चूहे मस्तिष्क स्लाइस पर और हाइपोटोनिक एसीएसएफ के धोने के दौरान किया गया था। एक आईएसएम गढ़ा गया था, और इसके अंशांकन पैरामीटर निकोलस्की समीकरण के लिए फिटिंग के लिए वांडा में इनपुट थे, जिसने 58.21 एमवी के ढलान ( एम ) की गणना की थी। आईएसएम और iontophoresis माइक्रोइलेक्ट्रोड को एगर में रखा गया था और परिवहन न्यू को मापने के लिए 120 μ मीटर को एक-दूसरे से अलग रखा गया थाmber। प्रोटोकॉल के चरण 6 में ( चित्रा 8 ए ) प्रक्रिया के अनुसार तीन रिकॉर्डिंग ली गईं, और वक्र ठीक किये गए और उनका विश्लेषण किया गया। कच्चे वक्र ( चित्रा 8 ए ) के साथ ओवरलैप किए गए प्रत्येक मुकदमे की फिट वक्र मापा प्रसार गुणांक ( डी एक्स 1 ई 5 ), परिवहन संख्या ( एन टी ), और माइक्रोएलेक्ट्रोड ( आर_एप ) और उनके वास्तविक अंतर ( आर ) के स्पष्ट अंतर के बीच का अंतर तीन रिकॉर्डिंग ( चित्रा 8 बी , रिकॉर्डिंग ए 1-3) इन मानदंडों के आधार पर, प्रयोग के साथ जारी रखने के लिए यह आयनटोस्कोरोसिस माइक्रोइलेक्ट्रोड को स्वीकार्य माना गया था।

एक बार स्थिर आयनोप्टोसिसिस माइक्रोइलेक्ट्रोड को चुना गया, चूंकि इन मापदंडों के लिए एक आधार रेखा स्थापित करने के लिए चूहे मस्तिष्क टुकड़े में α और λ के लिए नियंत्रण मान लिया गया था। पूर्वखतरनाक अध्ययनों में चूहे नियोर्टेक्स के नियंत्रण मूल्यों को α = 0.18-0.22 और λ = 1.54-1.65 1 होना चाहिए । इस प्रयोग में इन मूल्यों को दोहराने के लिए, आईएसएम और iontophoresis microelectrode को चूहे neocortex में 200 माइक्रोन गहरा और एक दूसरे के अलावा 120 माइक्रोन रखा गया था। चित्रा 8 बी में आंकड़ों की गणना की गई औसत एन टी , α और λ की गणना में उपयोग के लिए वांडा कार्यक्रम में दर्ज किया गया था। मस्तिष्क में 200 माइक्रोन के गहराई से दो माइक्रोइलेक्ट्रोड के प्लेसमेंट से बेसलाइन वी में एक बदलाव दर्ज किया गया था, और बेसलाइन टीएमए ( यानी बेसलाइन सी पैरामीटर) एकाग्रता को ठीक करने के लिए वोल्न्डा में प्रवेश किया गया था। तीन रिकॉर्डिंग लिए गए, और उनके घटता लगाए गए थे ( चित्रा 9 ए , चित्रा 9 डी और चित्रा 9 एफ )। फिट बैठता है एक औसत का पता चलाΑ = 0.192 और λ = 1.6 9 ( चित्रा 9 ई )। रिकॉर्डिंग के बाद बेसलाइन वी में रिक्तियां और पाली की जांच की गई, और आंकड़ों को पुन: विश्लेषण करने के लिए वांडा में सही मूल्य दर्ज किए गए (जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण 8 में बताया गया है)। पुनर्गणना के मूल्यों में काफी भिन्नता नहीं थी, और चित्र 9 डी में रिपोर्ट किए गए मूल्यों को स्वीकार किया गया था।

एसीएसएफ की सामान्य ओएसएमएफ 300 एमओएसएम है Α और चूहे somatosensory नियोकॉर्टेक्स में λ पर hypotonic ACSF के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, 150 mOsm की एक परासारिता साथ ACSF NaCl एकाग्रता को कम करके बनाया गया था। यह hypothesized था कि इस हाइपोटोनिक ACSF मस्तिष्क कोशिकाओं की सूजन का कारण होगा, जिससे कम α और संभावित उच्च λ 13 । लगभग 30 मिनट के लिए हाइपोटोनिक एसीएसएफ के साथ मस्तिष्क टुकड़ा सुपरफ़ाज़ हुआ था, जिससे उसे अनुमति मिलती हैमस्तिष्क के साथ संतुलित करना इस समय के दौरान, माइक्रोएलेक्ट्रोड नेओरॉर्टेक्स में एक ही स्थान पर बने रहे क्योंकि वे नियंत्रण परिस्थितियों के पिछले माप के दौरान थे। पांच रिकॉर्डिंग हाइपोटोनिक स्थितियों ( चित्रा 9 बी और एफ ) के तहत किए गए थे। इससे एक औसत α = 0.13 और λ = 1.84 ( चित्रा 9 ई ) उत्पन्न हुआ। इन मूल्यों की धारणा के अनुरूप थे कि hypoosmolarity कम हो जाती है α और बढ़ जाती है λ बेसलाइन वी में अंतर और परिवर्तन मापा गया और विश्लेषण और फिटिंग प्रक्रिया के दौरान खाते में लिया गया।

रिकवरी मापदंडों को नियमित एसीएसएफ (300 एमओएसएम) पर धोने और नेकोटेक्स्ट में एक ही जगह में नई रिकॉर्डिंग लेने से मापा जाता था। क्योंकि सूजन प्रभाव प्रतिवर्ती होना चाहिए, यह उम्मीद थी कि α और λ स्तर को नियंत्रित करने के लिए ठीक हो जाएगा। मूल्यों avनियमित ACSF धोने पर 30 मिनट के बाद चार रिकॉर्ड किए गए थे जो α = 0.37 और λ = 1.61 ( चित्रा 9 सी , चित्रा 9 ई और चित्रा 9 एफ ) थे। यह दर्शाता है कि इन स्थितियों ( चित्रा 9 ई और 9 चित्रा 9 ) के तहत α की वसूली के दौरान एक अप्रत्याशित ओवरहाट था। इसके बाद, माइक्रोइलेक्ट्रोड को आगर में लौटा दिया गया था ताकि यह पुष्टि हो सके कि आयनोपॉस्फोरस माइक्रोइलेक्ट्रोड का परिवहन संख्या अपरिवर्तित नहीं था ( चित्रा 8 सी )। आईएसएम को फिर से पुन: पुस्तकालय किया गया था, और निकोलस्की समीकरण के लिए नया फिट ने ढलान को 58.21 एमवी तक बताया।

यह प्रयोग आदर्श परिस्थितियों में आरटीआई की तरह दिखने का एक स्पष्ट उदाहरण है। प्रयोग के निम्न तत्व अपनी सफलता की कुंजी थे। सबसे पहले, में एकत्रित प्रायोगिक डेटाAgarose और दिमाग वांडा ( चित्रा 8 ए और 9 ए चित्रा 9 सी ) द्वारा उत्पन्न सैद्धांतिक घटता के साथ पर्याप्त ओवरलैप का प्रदर्शन किया। ढलान, शिखर में समानता और समान आधार रेखा पर वापस लौटने के कारण मैच की ताकत का निर्धारण करने में सभी महत्वपूर्ण हैं। एग्रोस में रिकॉर्डिंग करते समय वक्र के ये अंश अक्सर समस्याग्रस्त होते हैं, और यह सामान्य बात है कि ऐसी परिस्थितियों को खोजने से पहले कई रिकॉर्डिंग को लेना चाहिए जो अच्छी तरह से मिलान किए गए curves ( यानी, अच्छा माइक्रोइलेक्ट्रोड) का उत्पादन करते हैं। दूसरा, प्रयोग के पहले और बाद में औसत परिवहन संख्या एक दूसरे के 10% ( चित्रा 8 बी और चित्रा 8 सी ) के भीतर थी। अगर ऐसा नहीं हुआ होता, तो मस्तिष्क में दर्ज मूल्यों पर भरोसा नहीं किया जा सकता था। आरटीआई प्रयोगों में यह सबसे आम समस्या है तीसरा, मानकीकृत टीएमए समाधानों में आईएसएम कैलिब्रेशन और इससे पहलेप्रयोग का मिलान (डेटा नहीं दिखाया गया) आमतौर पर, कार्यरत आईएसएम की कैलिब्रेशन 10% के भीतर है, जिससे यह प्रयोग असफलता का एक असामान्य स्रोत बना।

आंकड़ा 8
8 चित्रा: मस्तिष्क में प्रयोग करने से पहले और बाद में आग में आदर्श वक्र फिटिंग डाटा। ( ) अगर एक परीक्षण में प्रतिनिधि डेटा: [दूर छोड़ दिया] टीएमए की एकाग्रता वक्र का प्रदर्शन करते हुए अगर में प्राप्त एकल परीक्षण से प्रतिनिधि डेटा। प्रसार मापन से पहले, +20 एनए का एक निरंतर पूर्वाग्रह वर्तमान आयनटोस्कोरोसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड के माध्यम से लागू किया गया था। समय = 10 एस, टीएमए 50 एस के लिए एक +60 एनए मुख्य चालू आवेदन करके आयनटोस्कोरोसिस माइक्रोएक्लेक्ट्रोड से अगरस में स्पंदित किया गया था। स्रोत से 120 माइक्रोन के एक आईएसएम की स्थिति का इस्तेमाल करते हुए [टीएमए] को मापने के द्वारा एक प्रसार वक्र उत्पन्न हुआ। [मध्य] डेटा से प्राप्त एक फिट वक्र डेटा पीवाल्टर में दौड़ना [दाएं] आंकड़ों के ओवरलैप और फिट वक्र दर्शाता है कि वाल्टर द्वारा वक्र फिटिंग द्वारा इस परीक्षण में मॉडल प्रसार को सही रूप से ठीक किया गया है। ( बी ) मस्तिष्क में प्रयोग करने से पहले अगर माप की तालिका: हाइपोटोनिक तनाव प्रयोगों ( चित्रा 9 ) से पहले तीन परीक्षणों (ए 1, ऊपर ऊपर की ओर) से प्राप्त डेटा। सभी परीक्षणों का आयोजन आयनोपोटोसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड और आईएसएम के साथ किया गया था जिसका उपयोग हाइपोयोस्मोोटिक तनाव परीक्षणों के लिए किया गया था। डेटा ने मस्तिष्क स्लाइस में प्रयोग के साथ आगे बढ़ने के लिए आवश्यक मानदंडों को पूरा किया। इन मापदंडों में डेटा और फिट वक्र (ऊपर के रूप में) और परिवहन संख्या में 10% से कम अंतर के बीच पर्याप्त ओवरलैप शामिल है। अतिरिक्त मानदंड चरण 7.6 में दिए गए हैं। ( सी ) मस्तिष्क में प्रयोग के बाद अगर माप की तालिका: hypoosmotic तनाव प्रयोगों ( चित्रा 9 ) के बाद अगर में तीन परीक्षणों से प्राप्त डेटा। शामिल हैं एसीसी 1-3 और ए 4-6 परीक्षणों के बीच दृढ़ता से सुझाव दिया गया कि मस्तिष्क परीक्षणों में आईएसएम और iontophoresis microelectrodes स्थिर थे। आरईसी = रिकॉर्डिंग या परीक्षण; आईएसएम और iontophoresis माइक्रोइलेक्ट्रोड के बीच की दूरी = आर ; सीबी = बेसलाइन एकाग्रता; रेफरी डी एक्स 1 ई 5 = सैद्धांतिक मुक्त प्रसार गुणांक x 10 5 (सेमी 2 एस -1 ) पूर्व-परिकलित मानक के आधार पर; एन टी = परिवहन संख्या (आयाम रहित); डी (ई 5) = मापा मुक्त प्रसार गुणांक x 10 5 (सेमी 2 एस -1 ); मापा और संदर्भ डी (ई 5) के आधार पर r_app = स्पष्ट माइक्रोएलेक्ट्रोड अंतर (सेमी); N टी स्पष्ट = स्पष्ट परिवहन संख्या r_app पर आधारित इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

"> 9 चित्र
9 चित्रा: Hypoosmotic तनाव अल्फा और लेम्बडा बढ़ता है
एसी। ( ) नियंत्रण, ( बी ) hypoosmotic, और ( सी ) वसूली की स्थिति के तहत मस्तिष्क में परीक्षणों से प्रतिनिधि डेटा: ठोस लाइनों डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं और धराशायी काले लाइनें ठीक वक्र हैं। तीन स्थितियों में अलग-अलग ढलानों, आयाम और चौड़ाई सहित स्पष्ट रूप से विभिन्न प्रसार घटता प्रदर्शित होते हैं। ( डी ) नियंत्रण परीक्षणों से डेटा तालिका: तीन नियंत्रण परीक्षणों की डेटा सारणी (बी 1, ऊपर ग्रेफर्ड); Α और λ सभी परीक्षणों में समान हैं और चूहे neocortex के लिए प्रकाशित डेटा के अनुरूप हैं। मस्तिष्क, पूर्व और बाद के प्रयोग अगर माप (चित्रा 8b और 8C) मस्तिष्क n t के लिए इस्तेमाल किया गया था से औसत एन टी में सभी परीक्षणों के लिए डी रेफरी 1.25 × 10 -5 सेंटीमीटर 2 एस -1 पर प्रसारित हुई थी, जो प्रसार गुणांक (वाल्टर में) के डाटाबेस के आधार पर थी, जो चूहे मस्तिष्क में प्राप्त हुई थी जब टी = 34.5 [डिग्री सेल्सियस]। प्रसार माप के दौरान ईसीएस से छोटी राशि TMA के लिए पैरामीटर कश्मीर [एस -1 ] खाते हैं I हालांकि कश्मीर आमतौर पर बहुत छोटा है, वक्र फिटिंग में पैरामीटर सहित आरटीआई पद्धति की सटीकता में सुधार होता है। हानि पैरामीटर k ' शायद सेलुलर तेज या टीसीए का नुकसान ACSF को दर्शाता है। ( ) नियंत्रण, hypoosmotic, और वसूली की शर्तों की तुलना: नियंत्रण, hypoosmotic, और वसूली की स्थिति के तहत मस्तिष्क में सभी परीक्षणों से औसत। डेटा दर्शाता है कि hypoosmotic तनाव α घट जाती है और बढ़ जाती है λ हाइपोयोमसटिक स्थितियों के बाद वसूली अवधि के दौरान, α ओवरसूट बेसलाइन (नियंत्रण), जबकि λआधार रेखा पर लौटता है परिणाम बताते हैं कि हिमस्मुटिक चुनौतियों के दौरान ईसीएस में परिवर्तन आंशिक रूप से प्रतिवर्ती हैं I आरटीआई विधि इस प्रकार की तीव्र प्रतिवर्ती प्रभाव के अध्ययन के लिए आदर्श है। ( ) ग्राफ़ डेटा क्लस्टरिंग का प्रदर्शन: प्रत्येक परीक्षण से मात्रा अंश (एक्स-अक्ष) और कर्कथता (वाई-अक्ष) एक बिंदु के रूप में प्लॉट किया जाता है ग्राफ प्रत्येक समूह ( यानी, नियंत्रण, हाइपोओस्मिथर और रिकवरी) के भीतर डेटा के क्लस्टरिंग को दर्शाता है, यह सुझाव देता है कि आरटीआई में मस्तिष्क ईसीएस में हाइपोइस्मोलार्वर चुनौती के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रभाव का पता लगाने की संवेदनशीलता है। आरईसी = रिकॉर्डिंग या परीक्षण; आईएसएम और iontophoresis माइक्रोइलेक्ट्रोड के बीच दूरी = आर =; सीबी = बेसलाइन एकाग्रता; अल्फा = मात्रा अंश; लैम्ब्डा = कर्कत्व; K ' = जांच की गैर-विशिष्ट मंजूरी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

चित्रा 10
चित्रा 10: गैर-आदर्श डेटा आम तकनीकी समस्याओं का प्रदर्शन ( ) iontophoresis माइक्रोएलेक्ट्रोड के साथ सामान्य तकनीकी मुद्दों के आरेख: तकनीकी मुद्दों का प्रदर्शन करने वाले तीन स्रोतों के साथ कार्यप्रणाली iontophoresis microelectrode से टीएमए की सामान्य रिलीज़ की तुलना। [उच्च बढ़ाई, ए 1] वर्तमान में एक आदर्श आयनटॉपहायरेटिक स्रोत में टीएमए रिलीज और क्लोराइड तेज गति से किया जाता है। [उच्च आवर्धन, a2] कम n t विज्ञप्ति कम TMA के साथ एक योणोगिनेसिस microelectrode और सामान्य से अधिक क्लोराइड लेता है। [उच्च आवर्धन, ए 3] टीओए, क्लोराइड और विलायक को रिलीज करने वाले इलेक्ट्रोसोमोसिस का प्रदर्शन करने वाला आयनोपोरेसिस माइक्रोइलेक्ट्रोड। [उच्च बढ़ाई, ए 4] समय के साथ बढ़ती रिलीज प्रदर्शित करते हुए आयनोस्टोरेसिस माइक्रोइलेक्ट्रोड ( यानी, "वार्मिंग अप")। ( बी ) गैर आदर्श डेटा का ग्राफ ओअगर में बाँध दिया: वाल्टर द्वारा लगाए गए वक्र द्वारा डेटा को पर्याप्त रूप से तैयार नहीं किया गया है और इसलिए इसे सही ढंग से व्याख्या नहीं किया जा सकता है; विसंगति का सही कारण स्पष्ट नहीं है। ( सी ) अगर में प्राप्त गैर-आदर्श डेटा की तालिका: दूसरी पंक्ति ( चित्रा 10 बी में छपी ) में गैर-आदर्श डेटा की तुलना के लिए सामान्य या अपेक्षित परिणाम अगर अगर में शीर्ष पंक्ति ( चित्रा 8 ए में छपी ) में प्रदर्शित होते हैं। आंकड़े और चित्रा 10 बी में फिट वक्र के बीच गरीब ओवरलैप का मतलब है कि फिट वक्र सही डेटा प्रसार डेटा नहीं करता है; इसलिए, गणना मूल्य (* के साथ चिह्नित) व्याख्या नहीं की जा सकती। यह आयनटोस्कोरोसिस माइक्रोइलेक्ट्रोड ( उदाहरण के लिए, वार्मिंग अप) या आईएसएम ( जैसे, धीमी प्रतिक्रिया) के साथ समस्याओं के कारण हो सकता था। समस्या निवारण: एक्सचेंज माइक्रोएलेक्ट्रोड्स एक समय में, आयनटोस्कोरोसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड से शुरू होता है। आरईसी = रिकॉर्डिंग या परीक्षण; आरआईएसएम और iontophoresis माइक्रोइलेक्ट्रोड के बीच = दूरी; सीबी = बेसलाइन एकाग्रता; रेफरी डी एक्स 1 ई 5 = सैद्धांतिक मुक्त प्रसार गुणांक x 10 5 (सेमी 2 एस -1 ) पूर्व-परिकलित मानक के आधार पर; एन टी = परिवहन संख्या (आयाम रहित); डी (ई 5) = मापा मुक्त प्रसार गुणांक x 10 5 (सेमी 2 एस -1 ); मापा और संदर्भ डी (ई 5) के आधार पर r_app = स्पष्ट माइक्रोएलेक्ट्रोड अंतर (सेमी); N टी स्पष्ट = स्पष्ट परिवहन संख्या r_app पर आधारित इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

जबकि चित्रा 8 और चित्रा 9 में दिखाया गया प्रयोग एक स्थिर और काम कर रहे आयनटोस्कोरोसिस माइक्रोइलेक्ट्रोड और आईएसएम था, वहां कई प्रयोग हैं जिनमें या तो बोवें माइक्रोइलेक्ट्रोड्स से समझौता किया जाता है और आदर्श परिणाम नहीं मिलता। एक "सामान्य" टीएमए iontophoresis microelectrode में n टी का एक मूल्य है समीकरण 0.3। चित्रा 10 ए आरओआई प्रयोगों के दौरान सामना किया जा सकता आयनोस्टोरेसिस माइक्रोइलेक्ट्रोड के साथ तीन आम मुद्दों को दर्शाता है।

कम रिलीज योणोगिनेसिस microelectrode विज्ञप्ति बहुत कम TMA जब पूर्वाग्रह वर्तमान या मुख्य वर्तमान लागू किया जाता है, एन टी <0.1 में जिसके परिणामस्वरूप। वर्तमान अभी भी टिप के माध्यम से गुजर रहा है, लेकिन इनमें से अधिकांश एसएल एयनॉन द्वारा टिप में प्रवेश कर लेते हैं और टिप छोड़कर टीएमए द्वारा बहुत कम होता है। यदि n टी कई लगातार परीक्षण में स्थिर है, इन योणोगिनेसिस microelectrodes इस्तेमाल किया जा सकता। हालांकि, यह अनुशंसित नहीं है, क्योंकि वे बेहतर ढंग से कार्य नहीं कर रहे हैं, जिसका अर्थ है कि आगे के मुद्दे विकसित हो सकते हैं। एक भी बड़ा चरमतब होता है जब iontophoretic microelectrode की नोक अवरुद्ध है और कोई आयन छोडने या टिप में प्रवेश नहीं करता है। इस मामले में, कोई वक्र का उत्पादन नहीं किया जाएगा। ऐसे मामलों में, यह जाँचने के बाद कि सभी विद्युत कनेक्शन उचित और सुरक्षित हैं, आयनोस्टोरेसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड को खारिज किया जाना चाहिए।

उच्च रिहाई (इलेक्ट्रोसोमोसिस) TMA के अलावा, योणोगिनेसिस microelectrode भी पानी विज्ञप्ति, एन टी> 0.5 में जिसके परिणामस्वरूप। यदि n टी कई परीक्षणों से अधिक स्थिर है, इन योणोगिनेसिस microelectrodes इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह अनुशंसित नहीं है, के रूप में आगे मुद्दों का विकास हो सकता। लेने के लिए एकमात्र समस्या निवारण चरण मुख्य वर्तमान को कम करना है। इससे कभी-कभी पानी रिलीज निकल जाते हैं और 0.5 नीचे कम करने के लिए n t कारण बनता है।

बढ़ती रिलीज ("वार्मिंग अप") इस मामले में, समय के साथ टीएमए रिलीज बढ़ जाती है। जब "वार्मिंग अप" तेजी से होता है,प्रसार वक्र का आकार आकृति 10b में दिखाया गया है, और यह मज़बूती से फिट नहीं किया जा सकता है। इस मामले में, प्रसार वक्र मुख्य वर्तमान के प्रारंभिक चरण के दौरान टीएमए एकाग्रता में धीमी गति को दर्शाता है, और टीएमए एकाग्रता पठार नहीं करता है। एक अविश्वसनीय फिट एक गलत मापा डी बनाता है, जो मापा परिवहन संख्या और r_app मूल्यों की स्थिरता को प्रभावित करता है। जब "को गर्म करना" अधिक क्रमिक है, यह अलग-अलग प्रसार घटता के आकार पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं है, लेकिन यह एक n t कि लगातार परीक्षणों से अधिक बढ़ जाती है में प्रकट होता है। एक "वार्मिंग अप" स्थिति को कभी-कभी समय की अवधि (लगभग 30 मिनट) के लिए आयनोस्टोरेसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड के "स्पंदन" के द्वारा remedied किया जा सकता है यह एक पूर्वाग्रह वर्तमान और एक उच्च मुख्य वर्तमान (+200 एनए) के बीच एक समय में कुछ सेकंड के लिए बारी से किया जाता है। अगर एक आयनोस्टोरेसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड अभी भी एक स्टाबल नहीं देता हैई ट्रांसपोर्ट नंबर, बस एक नया परीक्षण करने के लिए सबसे अच्छा है

पूरे प्रयोग के दौरान परिवहन संख्या और स्थिरता का सटीक माप आवश्यक है ताकि α के लिए सही मूल्य सुनिश्चित किया जा सके। माइक्रोएलेक्ट्रोड के बीच की रिक्ति को बनाए रखना, दोनों α और λ के निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण है। यदि माप एक माप के बाद बदलता है, तो agarose या मस्तिष्क में, माइक्रोइलेक्ट्रोड के सुझावों के बीच की सीधी रेखा की दूरी आउटपुट स्प्रैडशीट में डाली जा सकती है और वाल्टर द्वारा पुन: विश्लेषण किया जा सकता है। यदि मूल्यों में बहुत अधिक अंतर है, तो माप को त्याग दिया जाना चाहिए। तापमान में उतार-चढ़ाव अशुद्धि के लिए एक योगदानकारी कारक भी हो सकता है, इसलिए सटीक तापमान जांच का उपयोग करना और एक विश्वसनीय कक्ष हीटिंग तत्व महत्वपूर्ण है।

आयनटोस्कोरोसिस माइक्रोएलेक्ट्रोड आरटीआई तकनीक में समस्याओं का सबसे अधिक स्रोत है; अच्छा डाटा प्राप्त करने के लिए स्थिर आईएसएम बनाने और उसका उपयोग करना महत्वपूर्ण है। हेआईएसएम के साथ संभावित समस्या एक सुस्त प्रतिक्रिया हो सकती है, जो टिप में बहुत उच्च प्रतिबाधा के कारण हो सकती है। धीमे-से प्रतिक्रिया वाले आईएसएम के साथ, सभी आयनोस्टोरेसिस माइक्रोइलेक्ट्रोडों में "वार्मिंग अप" असर ( चित्रा 10 बी ) दिखाई देगा, लेकिन वक्र केवल आईएसएम की अक्षमता की वजह से तेजी से बदलते टीएमए सांद्रता का पता लगा सकते हैं। माइक्रोइलेक्ट्रोड्स (150 माइक्रोन तक) के बीच की दूरी बढ़ाना आईएसएम का जवाब देने के लिए अधिक समय की अनुमति दे सकता है और वक्र फिटिंग को सुधार सकता है। एक सुस्त प्रतिक्रिया यह संकेत दे सकती है कि आयन एक्सचेंजर टिप के अंदर पीछे हट गया है। यह एक मिश्रित माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है और, यदि मौजूद है, तो इसका मतलब है कि शहरीकरण खराब था और आईएसएम को खारिज किया जाना चाहिए। इसके अलावा, आईएसएम सिग्नल में बहाव से डेटा के गलत फिट हो सकते हैं। यह प्रयोगकर्ता पर निर्भर करता है कि यह निर्धारित करने के लिए कि क्या बहाव सहिष्णुता से परे डेटा को प्रभावित कर रहा है या नहीं।

आरटीआई की सीमाएं

टीडेटा विश्लेषण में अंतर्निहित धारणाओं के कारण यहां आरटीआई विधि के लिए कई सीमाएं हैं इन मान्यताओं में रुचि के मस्तिष्क क्षेत्र में ऊतक एकरूपता और ऊतक आइसोप्रोपी के लिए एक आवश्यकता शामिल है और इस क्षेत्र के आस-पास की गोलाकार मात्रा। आरटीआई के संदर्भ में, ऊतक एकरूपता के लिए ब्याज के क्षेत्र में प्रसार के मापदंड स्थिर हैं। ऊतक आइसोट्रॉपी का मतलब है कि डी * का एक भी मान सभी तीन स्थानिक अक्षों पर लागू होता है। एक स्रोत माइक्रोइलेक्ट्रोड से मुक्त प्रत्येक अणु, रिकॉर्डिंग आईएसएम की स्थिति पर पहुंचने से पहले एक यादृच्छिक पथ लेता है। आईएसएम पर वोल्टेज, एक ही समय में दर्ज अणुओं ( यानी एकाग्रता) की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें अणुओं के सभी तीन अलग-अलग अक्षों में यात्रा की गई है, साथ ही साथ कुछ अणु जो आईएसएम से परे यात्रा कर चुके हैं और मापने के लिए वापस आ चुके हैं बिंदु ( चित्रा 1 सी ) आरटीआई डेटा विश्लेषण के दौरान, वाल्टर कार्यक्रम जनकएएएस औसत α और λ , जिसमें एक बिंदु स्रोत से आईएसएम तक सभी अक्षों में यात्रा करने वाले सभी अणुओं का प्रसार शामिल है। यदि प्रसार की दर तीन स्थानिक अक्षों (एनिसोट्रॉपी) में से किसी एक में काफी भिन्न है या यदि ऊतक गैर-सजातीय है, तो अतिरिक्त डेटा संग्रह और डेटा विश्लेषण को α और λ 8 , 14 की गणना के लिए आवश्यक है।

उपरोक्त ऊतक के लिए आवश्यक शर्तें आरटीआई विधि के अनुसार एक बिंदु स्रोत और आईएसएम के बीच अंतर, जिसे आर के रूप में जाना जाता है, लगभग 80 - 130 माइक्रोन है। जब आर 50 माइक्रोन से कम हो जाता है, आईएसएम प्रतिक्रिया जांच अणु की एकाग्रता में प्रसार-निर्भर परिवर्तन रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकती है। यह तेजी से प्रतिक्रिया समय 10 , 15 के साथ समकक्ष आईएसएम का उपयोग करके भविष्य में remedied किया जा सकता है। बड़ा आरअंतराल भी आईएसएम प्लेसमेंट के दौरान ईसीएस परिवेश, आईएसएम टिप आकार और मस्तिष्क के ऊतकों के नुकसान में मस्तिष्क क्षेत्र-स्वतंत्र अंतर को कम करता है। इसके विपरीत, जब आर 150 माइक्रोन से अधिक बढ़ गया है, iontophoretic बिंदु स्रोत से अणुओं के प्रसार को गैर-एसोट्रोपिक, व्याकरण के मस्तिष्क क्षेत्र या ऊतक-सुगंधित सीमा 14 के आसपास के गैर-इंपोट्रोपिक, असहिष्णु तत्वों से प्रभावित करने के लिए अतिसंवेदनशील है।

ईसीएस को तलाशने के लिए आरटीआई और वैकल्पिक तकनीक शामिल करना

आरटीआई विधि ईसीएस के अध्ययन के लिए एक आणविक जांच का उपयोग करने वाली तकनीकों का एक बड़ा समूह है; प्रत्येक विधि का अपना फायदे और कमियां हैं हालांकि आरटीआई वास्तविक समय में दोनों α और λ के सटीक गणना की अनुमति देता है, इस विधि को एक आरोप वाले आणविक जांच की आवश्यकता होती है जिसे आयन एक्सचेंजर द्वारा पता लगाया जा सकता है। ऐसे प्रयोगों में जहां iontophoresis उपयुक्त नहीं है, जैसे कि एक अनचार्जित जांच का अध्ययन, iपरोक्षोरेसीस को प्रतिबाधा निकालना द्वारा बदला जा सकता है दुर्भाग्य से, वर्तमान तकनीकों दबाव इंजेक्शन के साथ α की गणना के लिए अनुमति नहीं देते, क्योंकि मात्रा जारी किया इंजेक्शन मध्यम 16 के गुणों पर निर्भर करता है। एक जांच का उपयोग करने के लिए जिसके लिए कोई एक्सचेंजर मौजूद नहीं है, जांच फ्लोरोसेंटली टैग की जा सकती है और एपिफ्लोरेसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा ईसीएस के माध्यम से इसका प्रसार। एकीकृत तकनीक ऑप्टिकल इमेजिंग (आईओआई) के रूप में जाना जाने वाला यह तकनीक, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले अणुओं के आकार और उपलब्धता से सीमित है और सेलुलर अपटैक 17 , 18 के लिए संभावित है। आईओआई तकनीक का फायदा यह है कि अणुओं को जांच के तौर पर इस्तेमाल किया जा सकता है, और यह पता चला है कि आणविक आकार के साथ λ बढ़ जाती है। अंत में, प्रसार विधियों का एक महत्वपूर्ण वर्ग ने रेडियोट्रॉसर को नियोजित किया है, लेकिन अब वे आम उपयोग में नहीं हैं 2

आरटीआई के भविष्य के आवेदन

विवो में इस तकनीक को मज़बूती से लागू करना संभव है, इसकी संभावित 1 , 4 , 6 का विस्तार करना। इसका उपयोग मस्तिष्क फिजियोलॉजी में विविध प्रकार के परिवर्तनों के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि रासायनिक पर्यावरण, औषध विज्ञान, आघात या आनुवंशिक नॉकआउट 1 में परिवर्तन से प्रेरित। जब तक ईसीएस में बदलाव के बारे में 2 मिनट या उससे अधिक की अवधि के लिए रहता है, आरटीआई ईसीएस वॉल्यूम अंश और कर्कत्व की सटीक मात्रा का ठहराव प्रदान कर सकता है।

जबकि पिछले 50 सालों में मस्तिष्क ईसीएस की संरचना और कार्य में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि उत्पन्न हुई हैकई अनुत्तरित प्रश्न रहें उदाहरण के लिए, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि कैसे और कैसे होमोस्टेटिक तंत्र α को विनियमित करते हैं और कैसे α में परिवर्तन मस्तिष्क समारोह को प्रभावित करता है। कंप्यूटर मॉडल ने सेल ज्यामिति और अन्य कारकों के रिश्तेदार योगदान का अनुमान लगाने में मदद की है जो λ को प्रभावित करते हैं, लेकिन अधिक काम करने की आवश्यकता है 1 अंत में, स्नायविक रोग (और इसके विपरीत) के रोगजनन में ईसीएस की भूमिका काफी हद तक बेरोज़गार है। निकट भविष्य में, आरटीआई माप विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों से 19 लक्षित दवा वितरण में सुधार हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

काम एनआईएच एनआईएनएनएस अनुदान R01 NS047557 द्वारा समर्थित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A/D and D/A converter National Instruments Corporation NI USB-6221 DAQ The NI USB-6221 is still sold as a 'Legacy' device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available.
agarose Lonza NuSieve GTG Agarose #50081 to prepare dilute agarose gel for RTI measurements
amplifier for ISM Dagan Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages
biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective) for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope
borosilicate theta capillary glass tubing Harvard Apparatus Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811 double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm
brush Winsor & Newton University Series 233, size 0 round shoft handle brush, available from Amazon
bunsen burner Fisher
camera for visualizing micropipettes Olympus OLY-150 requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional
chart recorder to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished
chlorotrimethylsilane, puriss., > 99% Sigma-Aldrich catalog # 92360 for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
Commercial Software The MathWorks MATLAB, Data acquisition toolbox for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available.
eye protective goggles Fisher
fixed-stage compound microscope Olympus BX51WI can use other compound microscopes with fixed stages
forceps Fine Science Tools #11251-10 to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work
fume hood for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab
glass microscope slide Fisher #12-550A to chip microelectrode tips
heater/stirrer Fisher Corning PC-420D to prepare dilute agarose gel and stir solutions
iontophoretic unit Dagan ION-100 and PS-100 ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites)
liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium World Precision Instruments IE190 Potassium Ion Exchanger Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate - do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight.
microelectrode holder WPI M3301EH to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH.
micromanipulator Narishige MM-3 to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition
micropipette puller Sutter Instruments Model P-97 to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing
microprobe thermometer Physiotemp Model BAT-12R fine probe of this thermometer is placed close to recording site
needle BD Syringes and Needles # 305122 (25 gauge) for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5 mm x 16 mm)
objective 5X dry Olympus MPlan N
objective 10X water immersion Olympus UMPlan FL N 10X objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm
plastic containers (with lids) Fisher #14-375-148 to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes
platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope EXFO Gibraltar Burleigh platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability
porous minicup for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade
reusable adhesive Bostik Blu-Tack for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon
robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning Sutter Instruments MP-285 two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text).
signal conditioning unit with low-pass filter Axon Instruments CyberAmp 320 or 380 no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed.
silver wire A-M Systems #7830 diameter 0.015", bare (no coating)
slice chamber Harvard Apparatus Warner Model RC-27L this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber
stereomicroscope for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers
syringe, 10 mL BD Syringes and Needles #309604 to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip
syringe filter 0.22 µm pore Whatman #6780-1302 to filter backfill solutions; available from Fisher
syringe needle, 28 gauge, 97mm World Precision Instruments MicroFil MF28G-5 to backfill microelectrodes
Teflon (=PTFE) tubing Component Supply STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge) for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax.
temperature control system Harvard Apparatus Warner Models TC-344B and SH-27A TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers
tetramethyammonium (TMA) chloride Sigma-Aldrich T-3411 5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
vibrating blade microtome Leica VT1000S to cut brain slices
xylenes Fisher X5-1 for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 125 मस्तिष्क प्रसार बाह्य स्थान वास्तविक समय आयनोस्थोरेसिस आयन-चयनात्मक माइक्रोएलेक्ट्रोड कर्कथता मात्रा अंश
रीयल-टाइम Iontophoresis Tetramethylammonium के साथ मात्रा मात्रा और ब्रेन एक्स्ट्रासेल्यूलर स्पेस के Tortuosity मात्रा
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Odackal, J., Colbourn, R., Odackal,More

Odackal, J., Colbourn, R., Odackal, N. J., Tao, L., Nicholson, C., Hrabetova, S. Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space. J. Vis. Exp. (125), e55755, doi:10.3791/55755 (2017).

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