Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Ионтофорез в реальном времени с тетраметиламмонием для количественного определения объемной доли и торможности внеклеточного пространства мозга

Published: July 24, 2017 doi: 10.3791/55755
Automatic Translation
*1, *2,3, 4, 5, 5, 2
1Department of Medicine, University of Virginia, 2Department of Cell Biology, SUNY Downstate Medical Center, 3Neural and Behavioral Science Graduate Program, SUNY Downstate Medical Center, 4Division of Neonatology, University of Virginia, 5Department of Neuroscience and Physiology, New York University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол описывает ионтофорез в реальном времени, метод измерения физических параметров внеклеточного пространства (ECS) живых мозгов. Диффузия инертной молекулы, высвобождаемой в ECS, используется для расчета объемной доли ECS и извилистости. Он идеально подходит для изучения острых обратимых изменений в ECS мозга.

Abstract

В этом обзоре описаны основные концепции и протокол для выполнения метода ионтофореза в реальном времени (RTI), золотой стандарт для исследования и количественной оценки внеклеточного пространства (ECS) живого мозга. ECS окружает все клетки мозга и содержит как интерстициальную жидкость, так и внеклеточный матрикс. Транспортировка многих веществ, необходимых для активности мозга, включая нейротрансмиттеры, гормоны и питательные вещества, происходит путем диффузии через ECS. Изменения объема и геометрии этого пространства происходят при нормальных мозговых процессах, таких как сон и патологические состояния, такие как ишемия. Однако структура и регуляция ECS головного мозга, особенно в больных государствах, по-прежнему в значительной степени не изучены. Метод RTI измеряет два физических параметра живого мозга: объемную долю и извилистость. Объемная доля - это доля объема ткани, занимаемого ECS. Тортютность - это мера относительного препятствия, с которым сталкивается вещество при рассеивании через мозгПо сравнению со средой без препятствий. В RTI, инертная молекула пульсирует от исходного микроэлектрода в мозг ECS. Когда молекулы диффундируют от этого источника, изменяющаяся концентрация ионов измеряется во времени с использованием ион-селективного микроэлектрода, расположенного примерно на расстоянии 100 мкм. Из полученной диффузионной кривой можно рассчитать как объемную долю, так и извилистость. Этот метод использовался в срезах мозга у нескольких видов (включая людей) и in vivo для изучения острых и хронических изменений в ECS. В отличие от других методов, RTI может использоваться для изучения как обратимых, так и необратимых изменений в ECS мозга в реальном времени.

Introduction

Внеклеточное пространство (ECS) представляет собой сеть взаимосвязанных каналов, внешних по отношению ко всем клеткам мозга, и содержит как интерстициальную жидкость, так и внеклеточный матрикс ( рис. 1а и рис. 1b ). Распределение многих веществ, необходимых для функционирования мозговых клеток, включая питательные вещества, гормоны и нейротрансмиттеры, происходит путем диффузии через ECS. Изменения физических параметров этого пространства, включая объем, геометрию и внеклеточную матрицу, могут существенно повлиять на диффузию через ECS и локальные концентрации ионов, которые купают клетки головного мозга, которые оказывают глубокое влияние на функцию клеток мозга 1 , 2 .

В настоящее время ионтофорез (RTI) используется для определения двух структурных характеристик области мозга: объемная доля и извилистость 3 , 4 ,"Xref"> 5. Объемная доля ( α ) представляет собой долю объема ткани, занимаемого ECS ( V ECS ) относительно общего объема ткани ( V- ткань ) в типичном элементарном объеме;

Уравнение

Tortuosity ( λ ) является относительным препятствием, которое вещество встречает при рассеивании через область мозга по сравнению со средой без препятствий;

Уравнение

Где D * (см 2 с -1 ) - эффективный коэффициент диффузии вещества в головном мозге, а D (см 2 с -1 ) - коэффициент свободной диффузии вещества в свободной среде, такой как разбавленный агарозный гель.

Сегодня наиболее часто используемое зондирующее вещество для RМетод ТИ представляет собой небольшой катион тетраметиламмоний (ТМА). TMA имеет молекулярную массу 74 г / моль, полностью диссоциирует в растворе и имеет один положительный заряд. RTI с этим ионом показали, что α Уравнение 0,2 и λ Уравнение 1.6 1 , 2 . Это означает, что ECS составляет примерно 20% от общего объема мозга и что диффузия небольшой инертной молекулы в ECS происходит примерно в 2,5 раза медленнее, чем в среде без препятствий 3 . Однако как α, так и λ изменяются в зависимости от возраста, региона и состояния мозга, а также в патологических условиях 1 . Изменения этих параметров были связаны с развитием мозга, старением, сном, эпилепсией и многими другими фундаментальными процессами и заболеваниями мозга 1, 6 . В то время как другие методы измеряют α и λ , RTI может измерять как в локализованных областях живой ткани в реальном времени. По этой причине RTI стала незаменимым инструментом для исследования изменений α и λ во время острых и обратимых проблем.

Теория, поддерживающая RTI, была первоначально подтверждена Николсоном и Филлипсом, и этот метод был широко использован с того времени 4 , 7 . Эксперименты с использованием RTI начинаются с высвобождения импульса ТМА из исходного микроэлектрода путем ионтофореза в разбавленный агарозный гель. После выталкивания ионы свободно диффундируют от точечного источника, выбирая из потенциально бесконечного числа случайных путей ( рис. 1d ). Меняющаяся концентрация ионов измеряется во времени с использованием ион-селективного микроэлектрода (ISM), расположенного примерно100 мкм ( рис. 1в ). Изменения концентрации ТМА рисуются и привязаны к кривой, которая позволяет рассчитывать как D, так и транспортный номер микроэлектрода ионофореза (параметры, обсуждаемые в Протоколе). С этими значениями процедура повторяется в интересующей области мозга для получения D * и для вычисления как α, так и λ . Управление микроэлектроном ионтофореза, сбор данных, графическое отображение и подгонка кривой концентрации ТМА, а также расчет экспериментальных параметров обычно выполняются программами Wanda и Walter, которые были специально разработаны для этой цели (программное обеспечение и их руководства Свободно предоставляется авторам по запросу).

В разделе «Протокол» настоящего обзора описаны основные процедуры, необходимые для проектирования и проведения РТИ в мозговых срезах грызунов. Этот метод также использовался в не-стержнеЛОР - модели, в том числе срезов головного мозга человека и в естественных препаратов мозга 1, 4, 6, 8, 9. В разделе «Репрезентативные результаты» представлены как идеальные, так и неидеальные результаты для выявления нюансов в интерпретации данных. Наконец, в разделе «Обсуждение» вкратце рассматриваются методы устранения неполадок, ограничения RTI, альтернативные методы, используемые для изучения ECS, и будущие приложения RTI.

Рисунок 1
Рисунок 1: Диаграммы диффузии через ECS. (А) Схема ECS: Демонстрирует размер и расположение ECS в типичной секции мозга. Желтый обозначает ECS между процессами серой клетки головного мозга. Объем ECS составляет примерно 20% от общего объема ткани ( т. Е. Объемная доля = 0.2) в физиологических условиях. ( B ) Увеличенная диаграмма ECS: показывает физические параметры, способствующие извилистости, включая геометрию мозга (серый) и внеклеточный матрикс (схематично как сетка разноцветных гликозаминогликанов и протеогликанов). ( C ) Трехмерная диаграмма диффузии из точечного источника: Демонстрирует чистое движение инертных молекул от ионтофоретического источника до ISM. Исключая диффузионные барьеры и поглощение клеток, молекулы диффундируют наружу во всех направлениях, создавая сферический фронт концентрации. МСМ количественно определяет локальную концентрацию инертных молекул, высвобождаемых из ионтофоретического источника. ( D ) Компьютерное моделирование диффузии в ECS головного мозга: [Далеко слева] Настройка для моделирования методом Монте-Карло; Зеленые сферы представляют собой процессы в мозговых ячейках, а красный крест - точечный источник. Эта установка моделирует мозговую ткань, показанную на рисунке 1a . [Средние изображения] 3 и6, выполняющие случайные движения, когда они диффундируют через внеклеточное пространство головного мозга, показано в двух измерениях. [Крайний правый] Случайные блуждания многих молекул, выпущенных из точечного источника. Чистое движение всех молекул от точечного источника наружу, как показано на рисунке 1в . Кумулятивные случайные блуждания описывают пространства между ячейками ( т. Е. ECS, см. Ссылку 5 для дальнейшего объяснения). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры для животных, используемые для получения образцов тканей, были одобрены комитетом по этике животных в Медицинском центре SUNY Downstate.

1. Подготовка решений и оборудования

  1. Подготовьте 150 мМ раствор засыпки NaCl для эталонного ствола ISM. Храните его в 10 мл шприце, прикрепленном к фильтру 0,22 мкм (для удаления бактерий или частиц).
  2. Приготовить 150 мМ раствор TMA хлорида (TMA-Cl) для микроэлектродов. Храните его в 10 мл шприце, прикрепленном к фильтру 0,22 мкм. Подготовьте решения TMA-Cl (в этом протоколе) из 5 м запатентованного раствора производителя, чтобы обеспечить правильную концентрацию.
  3. Хлоридируйте по меньшей мере четыре серебряных провода для изготовления микроэлектродов, погружая провода в отбеливатель (гипохлорит натрия) в течение не менее 2 часов. Удалите излишки отбеливателя с этанолом и дайте проводам высохнуть.
  4. Подготовьте 50 мл 0,3% агарозы в 150 мМ NaCl и 0,5 мМ TMA-Cl в стаканеИ покрыть его. Используйте агарозу, которая является порошкообразной и достаточно свежей, чтобы обеспечить хорошие измерения диффузии.
  5. Разогрейте и смешайте раствор агарозы с мешалкой, чтобы растворить его. Дайте раствору остыть до комнатной температуры. Хранить при температуре 4 ° C в течение 1 недели.
  6. Подготовьте безразличный (заземленный) электрод, изготовленный из 4% агарозы в 1 М KCl (указания в Приложении A)
  7. Создайте небольшую пористую чашу, которая может помещаться в экспериментальную камеру и которая обеспечивает электрическую непрерывность между ее содержимым и внешней средой ( рис. 2а ). Поместите металлическое кольцо на дно этой чашки, чтобы предотвратить его плавание при частичном погружении в воду.
  8. Используйте серийное разведение 5 M TMA-Cl, чтобы сделать пять 100 мл TMA-Cl растворов для калибровки ISM. Растворы должны иметь конечные концентрации 0,5, 1, 2, 4 и 8 мМ TMA-Cl, все в 150 мМ NaCl. Храните калибровочные растворы в герметичной чашке для предотвращения испарения. </ Li>

2. Электронная настройка

  1. Подключите компоненты экспериментальной установки RTI в соответствии с блок-схемой на рис. 2b ; Включают в себя усилитель с двумя входными каналами (один из которых должен быть очень высоким импедансом для ион-селективного цилиндра ISM), фильтр нижних частот, установленный на 10 Гц, блок-рекордер, A / D + D / A Конвертер, ионтофоретический блок (или усилитель, способный подавать импульсы постоянного тока), и компьютер (ПК), на котором запущены программы Wanda и Walter. Проверьте электронную установку, чтобы убедиться, что все соединения установлены.
  2. Защитите экспериментальную установку в заземленной оболочке (например, клетке Фарадея), если это необходимо, поскольку ISM имеют высокое сопротивление и чувствительны к артефактам, созданным близлежащим движением.
  3. Создайте специализированную калибровочную станцию ​​ISM, состоящую из двух входного усилителя, устройства для записи диаграмм, соответствующего держателя ISM и равномерного заземляющего электрода. Если возможно,Экранируйте корпус. Пропустите этот шаг, если ISM откалиброваны в экспериментальной установке (шаг 3.29)

фигура 2
Рисунок 2: Пористая экспериментальная чашка и электронная настройка. (А) Пористая экспериментальная чашка: Пористый сетка используется для создания экспериментальной чашки , которая позволяет электрическую непрерывность между агарозами (внутри) и экспериментальной купальной жидкостью (снаружи). Металлическое кольцо прикреплено к нижней части чашки, чтобы чашка не плавала в купальном растворе. ( B ) Блок-схема установки RTI (шаги 2.1 и 2.2): ISM подключен к усилителю (amp.). У ИСМ есть два ствола. Один содержит жидкий ионообменник (LIX) в наконечнике и генерирует напряжение, пропорциональное логарифму концентрации ТМА на наконечнике вместе с локальным внешним напряжением; гоE сигнальный путь представлен красной линией. Другой цилиндр ИСМ известен как опорный цилиндр и измеряет напряжение окружающей среды на кончике ИСМ; Он связан синим сигнальным трактом. Усилитель имеет две так называемые головные ступени, которые подключаются к ISM; Эти единицы имеют коэффициент усиления 1 (x1) и соответствуют высокому импедансу микроэлектрода до низкого импеданса остальных схем усилителя. Стадии головку, соединенную с ионоселективным стволом должен иметь возможность соответствовать входящее сопротивление около 1000 МОм, а сопротивление эталонного ствола, как правило, около 10 МОм. После выхода на сцене головки, напряжение от опорного ствола инвертируется и вычитается из напряжения на ион-селективного ствол с помощью суммирующего усилителя (a), чтобы получить чистое напряжение ионного сигнала. Выходы усилителя переходят в блок формирования сигнала, который обеспечивает дополнительное усиление и мультипольный фильтр нижних частот (≤10 Гц, как правило, Bessel fiLter), который удаляет шум и предотвращает наложение сигналов на аналого-цифровой преобразователь (A / D). Выходы фильтра также отображаются на магнитофоне. АЦП преобразует в цифровую форму сигналы и отправляет их на персональный компьютер (ПК). ПК также генерирует цифровой сигнал, который преобразуется цифро-аналоговым преобразователем (D / A) в аналоговый импульс напряжения, который подается в блок ионтофореза, который преобразует напряжение в импульс тока постоянной амплитуды и отправляет его К микроэлектроду ионофореза. Канал сигнала ионтофореза представлен зеленой линией. Сигнал сбора данных и ионтофореза находится под контролем программы Wanda, которая генерирует выходной файл для каждой записи диффузии в виде записи напряжения и времени вместе со всеми параметрами, которые определяют эксперимент. Вторая программа, Walter, считывает выходной файл и использует данные калибровки ISM для преобразования оцифрованных напряжений в концентрации. Концентрация veКривые времени rsus затем устанавливаются в Уолтере для соответствующего решения уравнения диффузии. D и n t извлекаются, если среда является агарозной, а λ и α экстрагируются, если средой является мозг. Аналоговые сигналы - сплошные линии; Цифровые сигналы - пунктирные линии. В ванне, содержащей срез, имеется также равномерный заземляющий электрод (не показан). Красные линии = ионный сигнал, синие линии = опорный сигнал, зеленые линии = команда ионтофореза, сплошные линии = аналоговые, пунктирные линии = цифровые. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Подготовка и калибровка ион-селективных микроэлектродов

  1. Создайте ISM, используя протокол за один день до эксперимента. Внесите ISM в партии, чтобы обеспечить как минимум две работы в день эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Большинство ISM стабильны в течение дня илидва. Изготовление ISM чувствительно к влажности и атмосферным условиям. Не каждый микроэлектрод успешно откалибрует.
  2. Отрежьте примерно 0,5 см стекла в конце одного из бочек двухствольного боросиликатного капилляра, используя старую пару щипцов.
  3. Чип одного ствола на противоположном конце капилляра ( рис. 3а ). Убедитесь, что перегородка не повреждена (критическая). Осторожно: надевайте защитные очки, чтобы предотвратить травмы из-за снарше.
  4. Поместите капилляр в бутылку ацетона в течение не менее 1 часа для удаления загрязняющих веществ.
  5. Удалите капилляр из ацетона и пульсируйте чистый, сухой, сжатый газообразный азот или воздух через него, чтобы удалить лишний ацетон. Удалите весь ацетон в капилляр, так как остаточный ацетон может мешать силанизации (критический).
  6. Выполните наконечник микропипетки на вертикальном или горизонтальном съемнике. Определите параметры, чтобы вытащить пипетку с длинным конусом иОстрый наконечник диаметром около 1 мкм или менее. В конце этого шага один капилляр будет превращен в две пипетки ( рис. 3а ).
  7. Визуализируйте одну микропипетку под микроскопом, вертикальным микроскопом с объективом 10X. Отрежьте наконечник с помощью стеклянного слайда микроскопа, чтобы конечный диаметр наконечника ( то есть, оба ствола) составлял от 2 до 5 мкм ( рисунок 3b ). С этого момента эта пипетка будет называться ISM.
  8. Заполните скошенный барабан ISM 150 мМ эталонным раствором NaCl через отверстие на скошенной стороне, используя шприц объемом 10 мл, прикрепленный к фильтру 0,22 мкм и игле 28 G, 97 мм ( рисунок 3b ). Не заполняйте ствол, превышающий три четверти высоты ствола.
  9. Заполните необработанную ствол ISM 150 мМ раствором TMA-Cl для обратной засыпки. Коснитесь ISM осторожно, чтобы выбить пузырьки воздуха из раствора. Проверьте наличие пузырьков под микрофономRoscope используется для обрезки наконечника.
  10. Пламя задней части ISM с помощью горелки Bunsen, чтобы гарантировать, что сообщение об обратной засыпке не встречается на перегородке в задней части ISM. Убедитесь, что верхняя четверть ISM сухая после пламени.
  11. Вставьте хлорированную серебряную проволоку в эталонный раствор ISM и согните провод, выступающий из капилляра, чтобы отметить это как опорный цилиндр ( рис. 3c ). Убедитесь, что провод погружен в раствор обратной засыпки и остается в растворе в течение всего эксперимента.
  12. Нанесите небольшую длину политетрафторэтиленовой трубки (длиной около 20 см) поверх наконечника иглы шприца 25 G. Поместите другой конец трубки в задней части ионоселективного ствола. Убедитесь, что труба находится в стволе, но выше раствора обратной засыпки ( рис. 3c ).
  13. Нагрейте палочку зубного воска с помощью горелки Бунзена и запечатайте как трубу, так и silvПровод в их соответствующие бочки ( рис. 3в ). Убедитесь, что вокруг пластиковой трубки в ионоселективном цилиндре (критический) создается сплошное воздушное уплотнение.
  14. Подготовьте небольшой прозрачный стеклянный контейнер (5 мл или менее) 4% хлортриметилсилана в ксилоле. Осторожно: ксилолы и силаны очень опасны для здоровья; Обрабатывайте оба химических вещества внутри вытяжного шкафа и выбрасывайте их соответствующим образом.
  15. Расположите контейнер перед стереоскопическим рассекающим микроскопом, установленным горизонтально в вытяжном шкафу. Закрепите ISM вертикально над контейнером с помощью микроманипулятора ( рис. 3d ).
  16. Окуните кончик микроэлектрода в раствор хлортриметилсилана.
  17. Прикрепите пустой шприц объемом 10 мл к игле с 25 калибрами, ведущей к ISM. Наносить положительное давление воздуха из шприца до образования пузырька раствора TMA-Cl; Этот шаг должен выполняться под прямой визуализацией через микроскоп.
  18. Коснитесь держателя ISM осторожно, чтобы выбить пузырек из наконечника.
  19. Нанесите раствор хлортриметилсилана на высоту примерно 1500 мкм в кончик ISM, используя отрицательное давление на 10 мл шприц.
  20. Полностью изгоните раствор хлортриметилсилана с кончика ISM до тех пор, пока на кончике не появится пузырь раствора TMA-Cl ( рисунок 3d ).
  21. Повторите шаги 3.19 и 3.20 пять раз. Убедитесь, что ровный, непрерывный столбец жидкости втягивается в наконечник каждый раз. Если в наконечник нельзя вставить раствор, проверьте, заблокирована ли трубка, воздушное уплотнение является неполным или кончик ISM заблокирован.
  22. Вымыть весь раствор хлортриметилсилана из наконечника до тех пор, пока не будет образован пузырь раствора TMA-Cl.
  23. Поддерживая положительное давление на шприц, удалите ISM из раствора ксилола. Убедитесь, что весь раствор ксилола вытеснен из наконечника ISM, так как избыток ксилола разрушит экстрактКолонка вешалки, созданная на последующих этапах.
  24. Поместите наконечник ISM в маленький прозрачный контейнер (или тот, в который входит теплообменник, или небольшая кювета), удерживая жидкий ионообменник (LIX) для TMA. Выполните этот шаг под прямой визуализацией, используя настройку горизонтального микроскопа.
  25. Нанесите небольшое количество отрицательного давления, чтобы нарисовать минимальное количество LIX в наконечник ( т. Е. Как только LIX увидит вход в наконечник, прекратите применение отрицательного давления).
  26. Отсоедините 10-мл шприц от трубки и позвольте ISM сидеть в течение 5 мин. В течение этого времени LIX войдет в силанизированный наконечник, пока не достигнет состояния равновесия.
  27. Удалите ISM из LIX. Вытащите трубу из ствола теплообменника (удаляя как можно меньше воска). Поместите хлоридированную серебряную проволоку в небольшое отверстие, созданное на заднем конце ISM. Уплотните проволоку в засыпку ствола теплообменника расплавленным воском.
  28. Разрешить ISM сидетьВ течение не менее 30 мин. Прикрепите завершенные ISM к внутреннему краю стакана с использованием любого гибкого временного клея.
  29. Откалибруйте ISM, записав напряжение, измеренное ISM в каждом калибровочном растворе, сделанном на шаге 1.8.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Калибровку можно выполнить на калибровочной станции (см. Шаг 2.3) или в экспериментальной установке. Эта процедура описана в Приложении B и в Haack et al. 10 .
  30. Если калибровка ISM прошла успешно для нескольких ISM, остановитесь здесь до дня предполагаемого использования. Если нет, создайте больше ISM.
  31. В день эксперимента снова откалибруйте микроэлектрод (см. Шаг 3.29).

Рисунок 3
Рисунок 3: Получение ион-селективного микроэлектрода. (А) после того, как ISM зазубрин назад концы капилляра и вытягивать (шаги 3.2-3.6): Один баррель на обоих концах OFa стеклянный капилляр. ISM генерируется путем вытягивания одного двухствольного стеклянного капилляра для создания двух микропипеток с точными наконечниками. ( Б ) ISM после засыпки обоих бочек (шаги 3.7-3.9): Кончик одного ISM отколовается до диаметра 2-5 мкм. Ионоселективный цилиндр засыпается TMA-Cl, а эталонный цилиндр засыпан NaCl. ( C ) ISM перед нанесением хлортриметилсилана (этапы 3.11-3.13): В эталонный цилиндр вставлена ​​прорезь из хлорированного серебра. Трубка из политетрафторэтилена (ПТФЭ) соединена с иглой 25 G и вставлена ​​в ион-селективный цилиндр. С помощью зубного воска создается герметичное уплотнение поверх обоих бочек. ( D ) Покрытие микропипетки хлортриметилсиланом (этапы 3.15-3.26): [Низкое увеличение] ISM суспендировали в хлортриметилсилане в соответствии с горизонтально установленным стереомикроскопом. [Высокое увеличение] Вид через горизонтально установленный стереомикроскопOpe кончика ISM в растворе хлортриметилсилана. После визуализации наконечника через микроскоп небольшое количество раствора TMA-Cl вытесняется из ион-селективного ствола (достаточно для создания небольшого пузырька раствора TMA-Cl). Держатель ISM защелкивается для выпуска пузырька раствора TMA-Cl, а затем хлортриметилсилан вытягивается в наконечник. Этот цикл повторяется несколько раз. После того, как хлортриметилсилан выбрасывается из ISM, ISM помещают в жидкий ионообменник (LIX) для TMA, а LIX втягивают в кончик ионно-селективного цилиндра. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Подготовка микроэлектродов Iontophoresis

ПРИМЕЧАНИЕ: Микроэлектроды Iontophoresis должны быть изготовлены в день эксперимента.

  1. Потяните двухствольный капилляр из боросиликатного стекла по вертикали или hoГоризонтальный съемник. Определите параметры, чтобы вытащить пипетку, подобную микропипеткам, вытащенные на шаге 3.6 ( рисунок 4a ).
  2. Поместите микропипетку под сложный микроскоп, использованный на этапе 3.7, и разрежьте наконечник с помощью стеклянного слайда микроскопа, чтобы полученный диаметр был между 2 и 5 мкм ( рис. 4а ).
  3. Заполните обе бочки раствором 150 мМ TMA-Cl с обратной промывкой, используя 10 мл шприц, прикрепленный к фильтру 0,22 мкм и игле 28 G, 97 мм ( рис. 4a ).
  4. Аккуратно коснитесь микропипетки, чтобы не осталось пузырьков воздуха в растворе обоих бочек.
  5. Поместите пробирки из хлорированного серебра в оба ствола микропипетки. Убедитесь, что провода достаточно глубоки в растворах обратной засыпки, чтобы они оставались в контакте с растворами в течение всего эксперимента.
  6. Уплотните провода в бочки, используя горячий зубной воск. Аккуратно заблокируйте t Он прокручивает их друг вокруг друга (завершенный микроэлектрод, показанный на рисунке 4b ).

Рисунок 4
Рисунок 4: Приготовление микроэлектрода Iontophoresis. (А) Электрофорез микроэлектрода после засыпки обоих стволов (шаги 4.1-4.3): ионофорез микроэлектрода вытягивается из капиллярной трубки. Кончик микроэлектрода отщепляется до диаметра 2-5 мкм. Оба бочка ионтофореза микроэлектрода заполнены раствором ТМА-С1. ( Б ) Завершенный микрофонный электрофон с ионофорезом (шаги 4.5-4.6): микроэлектрод с ионтофорезом с двумя прорезями из хлорированного серебра, вставленными в бочки. Бочки микроэлектрода запечатываются воском, а серебряные провода скручены вместе на задней части микроэлектрода./files/ftp_upload/55755/55755fig4large.jpg "target =" _ blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Приготовление искусственной жидкости из целлюлозной жидкости и грызунов

  1. Подготовьте 1 л искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) с композицией, подходящей для эксперимента, и добавьте к ней 0,5 мМ TMA-Cl.
    ПРИМЕЧАНИЕ. TMA-Cl необходим для установления фоновой концентрации TMA во время эксперимента.
  2. Подготовьте срезы мозга грызунов толщиной 400 мкм согласно стандартным протоколам 11 , 12 . Используйте ACSF, подготовленный на этапе 5.1, для рассечения и поддержания срезов мозга.

6. Ионтофорез в реальном времени в агарозе

  1. Включите компьютер с программами Уолтера и Ванды.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Эти программы доступны по запросу. Хотя это программное обеспечение не является существенным, программирование аналогичныхПрограммного обеспечения или выполнения анализа вручную.
  2. Пропустите ACSF через камеру погружения с соответствующей скоростью ( например, 2 мл / мин). Установите регулятор температуры на желаемую температуру и пузырь ACSF с 95% O 2 /5% CO 2 (или другой подходящей газовой смесью) в течение всего эксперимента.
  3. Установите равномерный (заземляющий) электрод в подходящий держатель и погрузите наконечник в ACSF, проходящий через камеру погружения. Подключите провод к основанию настройки записи.
  4. Заполните пористую чашку (сделанную на этапе 1,7) с помощью 0,3% агарозы, приготовленной ранее, и поместите ее в камеру для погружения. Убедитесь, что решение не работает над верхней частью чашки.
  5. Закрепите калиброванный ISM на держателе пипетки одного микроманипулятора и микроэлектрода с ионтофорезом до второго. Установите держатели под углом, соответствующим настройке ( рис. 5а ).
  6. соединятьПроводов микропровода ISM и ионтофореза к их соответствующим ступеням головки усилителя записи. В качестве альтернативы, подключайтесь непосредственно к усилителю (в зависимости от настройки).
  7. Убедитесь, что вес / расположение соединительных проводов или зажимов не вызывает никакого движения микроэлектродов, так как небольшие изменения в позиционировании могут влиять на результаты.
  8. Включите электронную настройку (с шага 2). Начните Уолтера и Ванду в отдельных случаях.
  9. В графическом интерфейсе Wanda нажмите «Откалибровать» ( рис. 6a ). В поле «Калибровка» ( рис. 6b ) заполните напряжения, измеренные во время калибровки ISM (шаг 3.29), и нажмите «Установить данные».
    ПРИМЕЧАНИЕ. Это позволяет подобрать следующее представление уравнения Никольского (альтернативно подставить уравнение другим способом для получения M и K ):
    Уравнение
    ЕеE, V - измеренное напряжение (mV), M - никольский наклон (mV), C - концентрация иона (mM), K - интерференция (mM), а V 0 - напряжение смещения (mV) 3 .
  10. Нажмите «Принять» в поле «Калибровка», чтобы автоматически передать наклон ( M ) и помехи ( K ), сгенерированные на шаге 6.9, в главный графический интерфейс.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь K представляет собой интерференцию Na, которая обычно незначительна.
  11. В левой части графического интерфейса убедитесь, что все экспериментальные параметры заданы в соответствующих записях ( рис. 6а ).
    1. В поле «Метод источника» установите источник в ионтофоретический источник (по умолчанию), «Длительность записи» на «200 с» (по умолчанию), «Пульс начинается» до «10 с» (по умолчанию), «Импульсный конец», До «60 с» (по умолчанию), «Bias Current» - «20 nA» (по умолчанию),«Основной ток» - «100 нА» (по умолчанию), а «Коэффициент конверсии» - соответствующее значение.
    2. В коробке измерительных электродов установите «Bath C» в концентрацию TMA, содержащуюся в растворе ванны (выраженная в мМ). Установите «Total Gain», «Output Channel», «ISM Channel» и «Ref Channel» на соответствующие значения для используемой системы сбора данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ. «Коэффициент конверсии» должен быть установлен на соответствующее значение (определенное для используемого ионтофоретического блока). Это значение определяет величину тока, который передается для данного приложенного напряжения от цифрового преобразователя (nA / mV).
  12. Поместите датчик температуры в чашку агара. Запишите измеренную температуру в позиции «Температура» в поле «Измерительный электрод» в графическом интерфейсе ( рис. 6а ).
  13. Включите подсветку подэтапа. Если необходимо, включите камеру, прикрепленную к микрофонуRoscope и монитор камеры.
  14. Опустите микроэлектроды глубиной не менее 1000 мкм в агарозу и центрируйте их в чашке ( рис. 5b ). Визуализируйте их под микроскопом с помощью объектива 10X (цель погружения с водой с большим рабочим расстоянием).
  15. Сдвиньте напряжение на усилителе до 0 мВ для обоих опорных и ISM-каналов, чтобы установить напряжение, зарегистрированное в агарозе, в качестве базового напряжения.
  16. На двухканальном усилителе вручную переместите разъем канала ISM на выход вычитания напряжения, чтобы установить вычитание «включено» между опорным и ISM-каналами.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Вычитание гарантирует, что изменения напряжения в канале ISM отражают изменения концентрации только TMA.
  17. Переместите ISM так, чтобы он касался наконечника микроэлектрода с ионтофорезом. Центрируйте наконечники друг на друга во всех трех направленных направлениях.
  18. Обнулить относительные положения обоих микроэлектродов наМикроманипулятор. Убедитесь, что микроэлектроды центрированы точно и точно (критически).
  19. Переместите ИСМ на расстоянии 120 мкм от микроэлектрода ионофореза на одной оси (левая-правая ось, рис. 5b ). Введите это расстояние в поле «Измерительный электрод» в графическом интерфейсе ( рисунок 6a ).
  20. Начните запись, нажав «Приобрести» в графическом интерфейсе ( рисунок 6a ); Позволяют программе записывать полную запись.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Микроэлектрод ионофореза получает постоянный ток смещения. После нажатия кнопки «Приобретение» происходит небольшая задержка до того, как основной ток будет применен в течение ограниченной продолжительности.
  21. Повторите шаг 6.20 два-три раза. Подождите, пока сигнал TMA не вернется к исходному уровню, прежде чем приобретать новые записи; Программа сохранит каждую запись для последующего анализа.
  22. Проверьте расстояние между двумя микроэлектродами, перемещая ISM назад tO нулевая позиция, заданная блоком управления. Если микроэлектроды больше не центрированы, снова центрируйте их, используя ту же стратегию, что и на этапе 6.17. Запишите любые изменения положения электродов.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Если интервал изменяется более чем на 2%, записи, полученные на этапе 6.19, не могут считаться точными и должны приниматься новые.

Рисунок 5
Рисунок 5: Настройка для экспериментов в агаре. (А) установка для эксперимента в разбавленном агаре (шаги 6.1-6.5): небольшой контейнер , заполненный пористыма разбавленного агара , помещенном в работающей перфузионной камере. Микроэлектрод ионофореза (левая сторона) и ISM (правая сторона) удерживаются держателями микроэлектрода; Держатели микроэлектрода вставляются в плечи роботизированных микроманипуляторов. Температурный зонд помещают в агаровый гель, а равномерный заземляющий электрод равен plВ камере погружения. ( B ) Увеличенный вид микроэлектродов в агаре: микроэлектрод ионофореза (левая сторона) и ISM (правая сторона) визуализируются в агаре с использованием объектива 10X для погружения в воду (объектив погружен здесь в 150 мМ NaCl). Микроэлектроды позиционируются с использованием микроманипуляторов на глубину 1000 мкм; Расстояние между микроэлектродами составляет 120 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6
Рисунок 6: Интерфейс программного обеспечения для компьютеров Wanda. (А) Навигационное Ванда графический пользовательский интерфейс (GUI) , : экран , который появляется после открытия программного обеспечения Ванда. В коробке (1) выбирают подходящую среду, молекулу ионтофореза и метод. (2) Нажмите «Калибровать», чтобы открытьШкала калибровки Ванда. После калибровки ISM (см. Рис. 6b и дополнение B) ISM помещается в агар или головной мозг, как описано в шагах 6 и 8 протокола. В поле (6) вводятся все соответствующие значения для выполняемого эксперимента. (7) Нажмите «Приобретение», чтобы сделать запись; В верхней правой части графического интерфейса Wanda отображается график напряжения и времени. ( B ) Калибровка ISM в Wanda : окно, которое открывается после нажатия (2) «Калибровка» в GUI Wanda. Значения с шага 3.29 вводятся в поле (3), и (4) выбирается «Fit Data». Утверждается, что калибровочная кривая является линейной. (5) Нажмите «Принять», чтобы вернуться в GUID Wanda. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

7. Анализ данных агарозы

  1. ОткройУолтер на компьютере (ПК). В меню «0. Records From:» нажмите кнопку «Wanda / VOLTORO», чтобы прочитать записи, созданные Wanda ( рисунок 7a ). Если требуется, чтобы выход в электронную таблицу был необходим, откройте соответствующее программное обеспечение. Нажмите «Лист 1,3» в «1. Создать Excel?». Меню ( рисунок 7b ).
  2. В следующем всплывающем окне выберите запись (записи) для чтения и нажмите «Открыть» ( рисунок 7b ); Обратите внимание, что записи будут автоматически распечатываться. Чтобы начать процедуру подгонки, выполните следующие действия.
    1. В меню «2. Параметры» нажмите кнопку «выбрать rec». В всплывающем окне « Рисунок 2 » используйте мышь, чтобы переместить перекрестие над первой обработанной записью ( рисунок 7c ); Нажмите кнопку мыши, чтобы выбрать запись.
    2. Нажмите oN "fit curve" в меню. Выберите желаемое количество итераций фитинга; Используйте по крайней мере 20 итераций фитинга для получения точной подгонки данных.
    3. В меню выберите «все» для соответствия всем точкам данных и выберите «продолжить»; Программа будет соответствовать отображаемой кривой. Соблюдайте порядок подгонки и сравните экспериментальную запись с наилучшей полученной кривой.
  3. Выберите вариант, чтобы записать результат в соответствующую электронную таблицу, нажав «Excel» в меню «7. Результаты» ( рисунок 7d ). Запишите (и запишите) следующие критические данные, которые будут использоваться для определения функциональности микроэлектрода ионофореза: « D (E5) », « Ссылка D (E5) », « r_app », номер транспортного средства « n t », « Явная N t '.
    ПРИМЕЧАНИЕ: « D (E5) »: коэффициент свободной диффузииTx 10 5 (см 2 / с); « Ссылка D (E5) »: теоретический коэффициент свободной диффузии x 10 5 (см 2 / с). Это значение извлекается из базы данных в Walter на основе иона, среды и входа температуры. « R_app »: явный интервал микроэлектродов (см), рассчитанный на основе измеренного и эталонного D (E5) . « N t »: номер транспортного средства (безразмерный). Это число определяет долю тока ионтофореза, который используется для высвобождения TMA 4 . « Явный n t »: Явный номер транспорта (безразмерный). Это транспортное число, рассчитанное из r_app . Это число должно быть близко к измеренному n t .
  4. Повторите шаги 7.1-7.3 для каждой из записей для выбранной пары микроэлектродов.
  5. Определите, можно ли использовать микроэлектрод ионофореза, выполняя следующее.
    1. Сравните « r_app» с фактическим r ( т. Е. 120 мкм); Этот критерий выполняется, если средние значения от всех испытаний находятся в пределах 4% друг от друга.
    2. Сравните « D (E5)» со ссылкой D (E5) ; Этот критерий выполняется, если средние значения от всех испытаний находятся в пределах 8% друг от друга.
    3. Сравните « n t » между испытаниями с одним и тем же микроэлектродом; Этот критерий выполняется, если средние значения от всех испытаний находятся в пределах 10% друг от друга.
  6. Если один из критериев, описанных в шаге 7.5, не был выполнен, устраните неисправность микроэлектрода с ионтофорезом или начните тестирование другого.
  7. Если микроэлектрод ионофореза считается подходящим для эксперимента, запишите средний транспортный номер из всех испытаний в поле «Транспортное число N» в графическом интерфейсе Wanda ( рисунок 6a ).

jove_content "> Рисунок 7
Рисунок 7: Интерфейс программного обеспечения Walter Computer. (А) Выбор программы сбора данных в Уолтере: В «0. Записи из:» открывает меню после запуска программы Вальтера. Выбор загрузки записей, сохраненных Wanda, выбирается нажатием кнопки «Wanda / Voltoro». ( B ) Выбор местоположения вывода данных и данных в Уолтере: [Влево] После открытия соответствующей программы электронных таблиц «Листы 1,3» выбраны для вывода всех данных анализа данных Уолтера на ранее открытую программу электронных таблиц. [Вправо] После выбора местоположения вывода анализа данных открывается всплывающее окно, позволяющее пользователю выбрать первую и последнюю записи, которые будут читать Уолтер. ( C ) Выбор записи для анализа в Уолтере: [Вправо] После выбора файлов для чтения открывается всплывающее окно со всеми выбранными записямиИграл как график (« Рисунок 2 »). [Влево] В меню «2.Options» нажимается «select rec», и мышь используется для перемещения перекрестия для идентификации первой записи для анализа; Либо нажата кнопка мыши, чтобы выбрать запись. ( D ) Экспорт анализа данных из Уолтера в электронную таблицу: после установки данных появится всплывающее окно и меню «7. Результаты». [Слева] График выбранной записи (синий) с установленной кривой диффузии, генерируемой Уолтером (красный). [Вправо] Меню «7. Результаты» позволяет пользователю записывать данные из анализа в программу для работы с электронными таблицами, нажав кнопку «Excel». Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

8. Ионтофорез в реальном времени в срезах мозга

  1. Поместите мозг толщиной 400 мкмВшей в записывающей камере, гарантируя, что он полностью погружен в поток ACSF. Поместите срез, используя акварельную кисть и аккуратно закрепите его сеткой.
  2. Переместите как микрофон электрона иона, так и ИСМ над полем интереса на срез мозга. Погрузитесь как в текущем ACSF, так и над срезом.
  3. Смещение напряжения как для опорного и ионно-зондирования каналов в «0» мВ. Подождите, пока напряжение в обоих каналах стабилизируется. На магнитофоне отметьте напряжение, измеренное на канале ионного зондирования ISM. Используйте это для вычисления базового параметра V в Wanda.
  4. Поместите ИСМ и ионтофорезный микроэлектрод глубиной 200 мкм в срез и 120 мкм друг от друга. Дождитесь стабилизации сигнала после перемещения микроэлектрода в срез мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Ток смещения, применяемый к микроэлектрону с ионтофорезом, вызывает небольшое накопление ТМА. Это распространенная ошибкаСлишком рано записывать и недооценивать нарастание сигнала.
  5. На регистраторе диаграммы отметьте стабилизированное напряжение, измеренное в срезе мозга на канале ионного зондирования ISM. Рассчитайте разность напряжений между сигналом TMA, измеренным на шаге 8.3 и шаге 8.4, и введите это значение в поле «Baseline V (mV)» в поле Measureing Electrode в графическом интерфейсе Wanda ( рисунок 6a ).
  6. В левой части графического интерфейса убедитесь, что все экспериментальные параметры правильно записаны / введены. Установите «Средний» на «Мозг», «Транспортный номер» до среднего значения, рассчитанного для микроэлектрода с ионтофорезом на этапе 7.4, и «Температура» до температуры ванны, содержащей срез.
    ПРИМЕЧАНИЕ: V должен быть записан для каждого набора измерений. Базовая линия V будет преобразована Вандой в исходный параметр C (мМ) ( т. Е. Концентрация ТМА в ткани головного мозга).
  7. Начните запись, нажав «Приобрести» и позвольте ей выполнить полную запись. Подождите, пока сигнал TMA не вернется к исходному уровню, прежде чем приобретать новую запись.
  8. Возьмите две-три последовательные записи перед удалением микроэлектродов из выбранного места расположения мозга. Введите температуру, измеренную в программное обеспечение Wanda, непосредственно перед каждой записью.
  9. Переместите оба микроэлектрода по диагонали обратно на поверхность среза. Поднимите оба по меньшей мере на 50 мкм над срезом. Используя устройство записи диаграммы, определите любое изменение между измеренным сейчас V и его измерением с шага 8.3.
  10. Центрируйте концы ISM и ионтофоретических микроэлектродов относительно друг друга в х-, y- и z-осях. Получите изменения расстояния, если таковые имеются, с дисплея блока управления микроманипулятора.

9. Анализ данных мозга

  1. Откройте новую таблицу для вывода анализа.
  2. Повторите шаги 7.1-7.4 в Уолтере, чтобы проанализироватьЗаписи, взятые из мозга.
  3. Запишите данные в программу электронных таблиц, нажав «Excel» в меню Walter. Запишите α , объемную долю мозговой ЭКС; Λ , извилистость ECS головного мозга; И k (s -1 ), неспецифический клиренс.

10. Проверка транспортного номера и калибровки ISM

  1. Измерьте транспортный номер ISM ( n t ) в конце эксперимента, используя приведенный ниже протокол. Альтернативно, проверьте n t после критических испытаний или когда измерения окажутся аномальными. Тем не менее, проверка n t слишком много раз может привести к травме среза мозга.
  2. Возьмите новые записи в агарозе. См. Шаги 6.4, 6.11, 6.12, 6.14, 6.15 и 6.17-6.22.
  3. Повторите шаги 7.1-7.4 в Уолтере, чтобы получить n t из новых записей агарозы. Проверьте таблицу: если n t изменилось большеЧем 10% от n t, полученного до измерений в мозге, данные, полученные с этим ионтофоретическим микроэлектродом, не являются надежными.
  4. Выполните новую калибровку (см. Шаг 3.29) для ISM после сбора данных о мозге. Используйте вновь полученные данные калибровки ISM в качестве входных данных в окне калибровки Wanda (см. Шаги 6.9 и 6.10) и убедитесь, что значение наклона отличается от предыдущей калибровки менее чем на 10%.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Данные, полученные с помощью этого ISM, не являются надежными, если значение наклона отличается более чем на 10% от предыдущей калибровки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Полезность метода RTI показана в эксперименте, предназначенном для измерения изменений α и во время гипоосмолярной задачи ( рис. 8 и рис. 9 ). Ранее было показано, что уменьшение осмолярности ECS путем промывки на гипотоническом ACSF приведет к уменьшению α и увеличению λ 13 .

В этом эксперименте RTI проводили на срезах мозга крысы как в контрольных условиях, так и во время мытья гипотонического ACSF. Был изготовлен ISM, и его параметры калибровки были введены в Ванду для подгонки к уравнению Никольского, которое рассчитало наклон ( M ) 58,21 мВ. Микроэлектроды ISM и ионтофореза помещали в агар и размещали на расстоянии 120 мкм друг от друга, чтобы измерить транспортировку number. Были взяты три записи, и кривые были установлены и проанализированы в соответствии с процедурой на этапе 6 протокола ( рисунок 8а ). Построенная кривая каждого испытания накладывалась на необработанную кривую ( рис. 8а ). Измеренный коэффициент диффузии ( D x 1E5 ), транспортный номер ( n t ) и разница между кажущимся интервалом микроэлектродов ( r_app ) и их фактическим расстоянием ( r ) существенно не отличались между тремя записями ( рис. 8b , Записи a1-3). Основываясь на этих критериях, этот микроэлектрод ионофореза считался приемлемым для продолжения эксперимента.

После того, как был выбран стабильный ионный микрофосфон, контрольные значения для α и λ в срединном мозге крысы были взяты, чтобы установить базовый уровень для этих параметров. доВ исследованиях было обнаружено, что контрольные значения для неокортекса крыс составляют α = 0,18-0,22 и λ = 1,54-1,65 1 . Чтобы воспроизвести эти значения в этом эксперименте, МСМ и ионтофорезный микроэлектрод были помещены на глубину 200 мкм в неокортексе крысы и на расстоянии 120 мкм друг от друга. Среднее значение n t , рассчитанное по данным на рисунке 8b , было введено в программу Wanda для использования при расчетах α и λ . Был зарегистрирован сдвиг базовой линии V от размещения двух микроэлектродов глубиной около 200 мкм в головном мозге, и скачок напряжения был введен в Ванду для коррекции базовой линии TMA ( т.е. базовой линии C ). Были сделаны три записи, и их кривые были установлены ( рис. 9а , рис. 9d и рис. 9f ). Приступы показали среднийΑ = 0,192 и λ = 1,69 ( фиг. 9e ). Интервалы и сдвиги в базовой линии V проверялись после того, как были сделаны записи, и скорректированные значения были введены в Ванду для повторной анализа данных (как подробно описано в шаге 8 протокола). Пересчитанные значения существенно не различались, и значения, представленные на рисунке 9d, были приняты.

Нормальная осмолярность ACSF составляет 300 мОсм. Чтобы проверить влияние гипотонического ACSF на α и λ в соматосенсорной неокортексе крысы, ACSF с осмолярностью 150 мОсм был сделан путем снижения концентрации NaCl. Было высказано предположение, что этот гипотонический ACSF приведет к набуханию клеток головного мозга, вызывая более низкое α и потенциально более высокое λ 13 . Мозговой срез был переполнен гипотоническим ACSF в течение примерно 30 мин, что позволяло емуДля уравновешивания мозга. За это время микроэлектроды остались в том же месте в неокортеке, как и во время предыдущих измерений условий контроля. Пять записей были взяты в гипотонических условиях ( рис. 9b и f ). Это порождает среднее значение α = 0,13 и λ = 1,84 ( рис. 9e ). Эти значения согласуются с гипотезой о снижении гипоосмолярности α и увеличении λ . Интервал и изменения базовой линии V были измерены и учтены во время анализа и процедуры подгонки.

Параметры восстановления также измерялись путем промывки на обычном ACSF (300 мОсм) и записи новых записей в том же месте в неокортексе. Поскольку эффекты набухания должны быть обратимыми, ожидалось, что α и λ восстановятся до контрольных уровней. Значения avПосле четырех минут, проведенных через 30 минут обычной промывки ACSF, были α = 0,37 и λ = 1,61 ( рис. 9c , рис. 9e и рис. 9f ). Это показало, что во время восстановления α в этих условиях произошел неожиданный перерегулирование ( рис. 9е и рис. 9f ). Затем микроэлектроды возвращали в агар, чтобы подтвердить, что транспортный номер микроэлектрода с ионтофорезом не изменился ( рис. 8в ). Затем ИСМ была перекалибрована, а новая поправка к уравнению Никольского показала, что наклон составляет 58,21 мВ.

Этот эксперимент является ярким примером того, как выглядит RTI в идеальных условиях. Следующие элементы эксперимента были ключом к его успеху. Во-первых, экспериментальные данные, собранные вАгароза и мозг продемонстрировали адекватное совпадение с теоретическими кривыми, создаваемыми Вандой ( рис. 8а и рис. 9а и рис. 9в ). Сходство в наклоне, пике и возврате к аналогичной базовой линии имеют важное значение для определения силы матча. Эти участки кривой часто проблематичны при записи в агарозе, и обычно бывает необходимо сделать несколько записей, прежде чем находить условия, которые создают хорошо подобранные кривые ( т. Е. Хорошие микроэлектроды). Во-вторых, средние транспортные числа до и после эксперимента находились в пределах 10% друг от друга ( рис. 8b и рис. 8в ). Если этого не произошло, нельзя было бы доверять значениям, записанным в мозге. Это, безусловно, самая распространенная проблема, которая возникает в экспериментах RTI. В-третьих, калибровки ISM в стандартизированных решениях TMA до и после(Сопоставленный эксперимент (данные не показаны). Как правило, калибровки рабочего ISM составляют не более 10%, что делает его необычным источником отказа эксперимента.

Рисунок 8
Рисунок 8: данные о идеальной кривой для агара до и после экспериментов в мозге. ( A ) Репрезентативные данные исследования в агаре: [Крайние левые] Репрезентативные данные из одного исследования, полученного в агаре, демонстрирующего кривую концентрации ТМА. Перед измерением диффузии через ионтофорезный микроэлектрод применялся постоянный ток смещения +20 нА. В момент времени = 10 с ТМА пульсировала от микроэлектрода ионофореза в агар путем применения основного тока +60 нА в течение 50 с. Кривая диффузии генерировалась путем измерения [TMA] с течением времени с использованием ISM, расположенного на расстоянии 120 мкм от источника. [Ближний] Построенная кривая, полученная из данных pОбработка в Уолтере. [Вправо] Наложение данных и построенная кривая демонстрируют, что уступка кривой, сделанная Уолтером, точно моделирует диффузию в этом испытании. ( Б ) Таблица измерений агара перед экспериментированием в головном мозге: данные, полученные из трех исследований (a1, приведенных выше) до экспериментов по гипотоническим стрессам ( рис. 9 ). Все испытания проводились с использованием микроэлектрода с ионтофорезом и ISM, используемого для исследований гипоосмотического стресса. Данные выполнили критерии, необходимые для продолжения эксперимента в срезах мозга. Эти критерии включают в себя адекватное перекрытие данных и установленной кривой (как указано выше) и менее 10% изменения транспортного номера. Дополнительные критерии описаны на шаге 7.6. ( C ) Таблица измерений агара после экспериментов в головном мозге: данные, полученные из трех исследований, проведенных в агаре после экспериментов с гипоосмотическим стрессом ( рис. 9 ). Составление Показанная между испытаниями a1-3 и a4-6, настоятельно указывает на то, что микроэлектроды ISM и ионтофореза стабильны во время испытаний мозга. Rec = запись или пробная версия; R = расстояние между ISM и ионофорезом микроэлектрода; Cb = базовая концентрация; Ref D x1E5 = теоретический коэффициент свободной диффузии x 10 5 (см 2 с -1 ) на основе предварительно рассчитанного стандарта; N t = номер транспортного средства (безразмерный); D (E5) = измеренный коэффициент свободной диффузии x 10 5 (см 2 с -1 ); R_app = кажущееся расстояние между микроэлектродами (см) на основе измеренного и эталонного D (E5); N t visible = очевидный транспортный номер, основанный на r_app . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

«> Рисунок 9
Рисунок 9: Гипоосмотический стресс уменьшает альфа и увеличивает лямбда
переменный ток. Репрезентативные данные испытаний в головном мозге при ( a ) контроле, ( b ) гипоосмотические и ( c ) условия восстановления: сплошные линии представляют данные, а штриховые черные линии - это кривые. Три условия демонстрируют заметно разные кривые диффузии, включая различные наклоны, амплитуды и ширины. ( D ) Таблица данных из контрольных испытаний: таблица данных трех контрольных испытаний (b1, приведенная выше); Α и λ одинаковы во всех испытаниях и согласуются с опубликованными данными для неокортекса крыс. Для всех испытаний в головном мозге, в среднем от N T до и после эксперимента измерений агара (рис 8b и 8с) был использован для мозга н т D ref был установлен на 1,25 × 10 -5 см 2 с -1 , основываясь на базе данных коэффициентов диффузии (в Уолтере), которая была получена в мозге крысы при Т = 34,5 ° С. Параметр k ' [s -1 ] учитывает небольшое количество TMA, потерянное из ECS во время диффузионных измерений. Хотя k ' обычно очень мало, в том числе параметр в подгонке кривой повышает точность метода RTI. Параметр потерь k ', вероятно, представляет собой поглощение клеток или потерю TMA в ACSF. ( E ) Сравнение контрольных, гипоосмотических и условий восстановления: Средние значения от всех испытаний в головном мозге под контролем, гипоосмотическими и восстановительными условиями. Данные показывают, что гипоосмотический стресс уменьшает α и увеличивает λ . В течение периода восстановления после гипоосмотических состояний α перерегулирует базовый уровень (контроль), а λВозвращается к исходному уровню. Результаты показывают, что изменения в ECS во время гипоосмотических проблем частично обратимы. Метод RTI идеально подходит для изучения этого типа острого обратимого эффекта. ( F ) График, демонстрирующий кластеризацию данных: объемная доля (ось x) и извилистость (ось y) от каждого испытания построены как одна точка. График демонстрирует кластеризацию данных внутри каждой группы ( т. Е. Контроль, гипоосмолярность и восстановление), что указывает на то, что у РТИ есть чувствительность для обнаружения воспроизводимых эффектов гипоосмолярной проблемы в ЭСС мозга. Rec = запись или пробная версия; R = расстояние между ISM и ионофорезом микроэлектрода; Cb = базовая концентрация; Alpha = объемная доля; Лямбда = извилистость; K ' = неспецифический клиренс зонда. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительные файлы: нажмите здесь, чтобы загрузить файлы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Рисунок 10
Рисунок 10: Неидеальные данные, демонстрирующие общие технические проблемы. (А) Диаграмма общих технических вопросов с ионофорезом микроэлектродами: Сравнение нормального высвобождения ТМА из функционирования ионофореза микроэлектрода с тремя источниками , демонстрирующих технические вопросами. [Высокое увеличение, a1] Ток в идеальном ионтофоретическом источнике переносится в равной степени высвобождением TMA и поглощением хлора. [Высокое увеличение, a2] Микроэлектрод с ионтофорезом с низким n t выделяет меньше TMA и занимает больше хлорида, чем обычно. [Высокое увеличение, a3] Микроэлектрод с ионофорезом, отображающий электроосмос, высвобождает TMA, хлорид и растворитель. [Высокое увеличение, a4] Микроэлектрод с ионофорезом, демонстрирующий растущий выброс с течением времени ( т. Е. «Разогрев»). ( B ) График неидеальных данных oВ агаре: данные не адекватно смоделированы кривой, установленной Уолтером, и поэтому не могут быть точно интерпретированы; Точная причина несоответствия неясна. ( C ) Таблица неидеальных данных, полученных в агаре. Нормальные или ожидаемые результаты в агаре отображаются в верхней строке (на рис. 8а ) для сравнения с неидеальными данными во второй строке (на рис. 10b ). Плохое перекрытие между данными и встроенной кривой на рис. 10b означает, что встроенная кривая не точно моделирует данные диффузии; Поэтому расчетные значения (помеченные знаком *) не могут быть истолкованы. Это могло быть вызвано проблемами с микроэлектроном ионтофореза ( например, разогреванием) или ISM ( например, медленным откликом). Устранение неисправностей: поочередно обменивайте микроэлектроды, начиная с микроэлектрода с ионтофорезом. Rec = запись или пробная версия; р= Расстояние между ISM и ионтофорезным микроэлектродом; Cb = базовая концентрация; Ref D x1E5 = теоретический коэффициент свободной диффузии x 10 5 (см 2 с -1 ) на основе предварительно рассчитанного стандарта; N t = номер транспортного средства (безразмерный); D (E5) = измеренный коэффициент свободной диффузии x 10 5 (см 2 с -1 ); R_app = кажущееся расстояние между микроэлектродами (см) на основе измеренного и эталонного D (E5); N t visible = очевидный транспортный номер, основанный на r_app . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В то время как эксперимент, показанный на рис. 8 и 9, имел стабильный и рабочий ионтофорезный микроэлектрод и ISM, существует множество экспериментов, в которых либоЙ микроэлектроды скомпрометированы и не дают идеальных результатов. «Нормальный» микроэлектродный ионтофорез TMA имеет значение n t Уравнение 0,3. На рис. 10а показаны три распространенные проблемы с микроэлектроном с ионтофорезом, который может быть встречен в экспериментах RTI.

Низкий выпуск. Микроэлектрод ионтофореза высвобождает очень мало ТМА при применении тока смещения или основного тока, в результате чего n t <0,1. Ток все еще проходит через наконечник, но большая его часть переносится анионом Cl, входящим в наконечник, и очень мало с помощью катиона TMA, оставляющего наконечник. Если n t является стабильным в нескольких последовательных испытаниях, эти микроэлектроды с ионтофорезом могут быть использованы. Однако это не рекомендуется, поскольку они не функционируют оптимально, а это значит, что могут возникнуть дополнительные проблемы. Еще больший крайнийПроисходит, когда кончик ионтофоретического микроэлектрода блокируется, и ни один из ионов не покидает или не входит в наконечник. В этом случае никакой кривой не будет. В таких случаях, после проверки правильности и надежности всех электрических соединений, микроэлектрод ионофореза следует отбросить.

Высокий выброс (электроосмос). В дополнение к TMA, микроэлектрод ионофореза также выделяет воду, что приводит к n t > 0,5. Если n t стабильно в течение нескольких испытаний, эти микроэлектроды с ионтофорезом могут быть использованы, но это не рекомендуется, так как могут возникнуть дополнительные проблемы. Единственный шаг по устранению неполадок - уменьшить основной ток. Это иногда исключает выделение воды и приводит к тому, что n t уменьшается ниже 0,5.

Растущий выпуск («разогрев»). В этом случае выпуск TMA со временем увеличивается. Когда «разогревание» происходит быстро,Кривая диффузии имеет форму, аналогичную форме, показанной на рисунке 10b , и не может быть надежно установлена. В этом случае диффузионная кривая демонстрирует медленное повышение концентрации ТМА во время начальной фазы основного тока, а концентрация ТМА не плато. Ненадежная подгонка создает неточное измерение D , которое влияет на согласованность измеренного транспортного номера и значений r_app . Когда «разогревание» более постепенное, оно не оказывает существенного влияния на форму отдельных кривых диффузии, но оно проявляется в n t, которое увеличивается при последовательных испытаниях. Состояние «разогрева» иногда может быть устранено «пульсированием» микроэлектрода ионофореза в течение периода времени (около 30 мин). Это делается путем чередования между током смещения и большим основным током (+200 нА) в течение нескольких секунд за раз. Если микроэлектрод ионофореза все еще не дает стабилизатораE транспортный номер, лучше всего просто протестировать новый.

Для обеспечения точного значения α необходимо точное измерение количества транспорта и стабильности в течение всего эксперимента. Поддержание расстояния между микроэлектродами имеет решающее значение для определения как α, так и λ . Если интервал изменяется после измерения, либо в агарозе, либо в мозге, прямое расстояние между наконечниками микроэлектродов может быть введено в электронную таблицу вывода и повторно проанализировано Уолтером. Если значения отличаются слишком сильно, измерение должно быть отброшено. Изменение температуры также может быть фактором, способствующим неточности, поэтому важно использовать точный датчик температуры и надежный нагревательный элемент камеры.

Микроэлектрод ионофореза является наиболее частым источником проблем в методе RTI; Создание и использование стабильной ISM имеет решающее значение для получения хороших данных. ОВозможная проблема с ISM может быть вялым ответом, который может быть вызван очень высоким сопротивлением в наконечнике. При медленном реагировании ISM все микроэлектроды с ионтофорезом, по-видимому, будут иметь эффект «разогрева» ( рис. 10b ), но кривая просто вызвана неспособностью ISM быстро обнаруживать изменения TMA-концентраций. Увеличение расстояния между микроэлектродами (до 150 мкм) может позволить больше времени для ISM реагировать и может улучшить установку кривой. Вялый ответ может указывать на то, что ионообменник отступил внутрь наконечника. Это можно увидеть под составным микроскопом и, если имеется, означает, что силанизация была плохая и что ISM необходимо отбросить. Кроме того, дрейфы в сигнале ISM могут приводить к неточным подборам данных. Экспериментатор должен определить, влияет ли дрейф на данные, выходящие за пределы допуска.

Ограничения RTI

TВот несколько ограничений для метода RTI из-за допущений, лежащих в основе анализа данных. Эти предположения включают требование однородности ткани и изотропии тканей как в интересующей области мозга, так и в сферическом объеме, окружающем эту область. В контексте RTI, однородность ткани требует, чтобы параметры диффузии были постоянными в интересующей области. Изотропия ткани означает, что одно значение D * применяется ко всем трем пространственным осям. Каждая молекула, высвобождаемая из исходного микроэлектрода, принимает случайный путь, прежде чем попасть в положение записи ISM. Напряжение на ISM, представляющее количество молекул ( т. Е. Концентрация), зарегистрированных за один раз, включает молекулы, которые путешествовали во всех трех пространственных осях, а также некоторые молекулы, которые вышли за пределы ISM и вернулись к измерению ( Рис. 1в ). При анализе данных RTI данные программы WalterСреднее значение α и λ , которые включают диффузию всех молекул, движущихся по всем осям от точечного источника до ISM. Если скорость диффузии существенно различается в любой из трех пространственных осей (анизотропия) или если ткань неоднородна, для расчета α и λ 8 , 14 требуются дополнительные сбор данных и анализ данных.

В дополнение к вышеуказанным предпосылкам ткани, метод RTI требует, чтобы расстояние между точечным источником и ISM, которое упоминается как r , составляет примерно 80-130 мкм. Когда r уменьшается ниже 50 мкм, ответ ISM может быть недостаточно быстрым для регистрации зависимых от диффузии изменений концентрации молекулы зонда. Это может быть исправлено в будущем с использованием концентрических ISM с более быстрым временем отклика 10 , 15 . Большее значение rРасстояния также минимизируют различия в области мозга в среде ECS, размер наконечника ISM и повреждение мозговой ткани во время размещения ISM. И наоборот, когда r увеличивается за пределами 150 мкм, диффузия молекул из ионтофоретического точечного источника более подвержена влиянию неизотропных, неоднородных элементов, окружающих интересующую область мозга или границу ткани-перфузата 14 .

Включение RTI и альтернативных методов для изучения ECS

Метод RTI относится к большей группе методов, которые используют молекулярный зонд для изучения ECS; Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Хотя RTI позволяет точно рассчитывать как α, так и λ в реальном времени, для этого метода требуется заряженный молекулярный зонд, который может быть обнаружен ионообменником. В экспериментах, когда ионтофорез не подходит, например, исследование незаряженного зонда, iОнтофорез может быть заменен выбросом давления. К сожалению, современные методы не позволяют вычислять α с выталкиванием под давлением, поскольку высвобождаемый объем зависит от свойств введенной среды 16 . Для использования зонда, для которого не существует теплообменника, зонд можно флуоресцентно маркировать и его диффузию через ECS, измеренную с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Этот метод, известный как интегративная оптическая визуализация (IOI), ограничен размером и доступностью флуоресцентно меченных молекул и потенциалом для клеточного поглощения 17 , 18 . Метод IOI имеет то преимущество, что макромолекулы могут использоваться в качестве зондов, и это показало, что λ увеличивается с молекулярным размером. Наконец, в важном классе методов диффузии использовались радиоизотопы, но они больше не используются 2 .

Будущие приложения RTI

in vivo , расширяя его потенциал 1 , 4 , 6 . Он также может быть использован для проверки влияния широкого спектра изменений в физиологии мозга, таких как вызванные изменениями в химической среде, фармакологии, травме или генетическом нокауте 1 . Пока изменение, индуцированное в ECS, длится в течение примерно 2 мин или более, RTI может обеспечить точное количественное определение объемной доли ECS и извилистости.

Хотя за последние 50 лет были получены значительные сведения о структуре и функционировании мозговой ЭКС,Остаются много вопросов без ответа. Например, пока неясно, как и как гомеостатические механизмы регулируют α и как изменения α влияют на функцию мозга. Компьютерные модели помогли оценить относительный вклад геометрии ячейки и других факторов, которые влияют на λ , но требуется больше работы 1 . Наконец, роль ECS в патогенезе неврологического заболевания (и наоборот) в значительной степени не изучена. В ближайшем будущем измерения RTI могут улучшить целевую доставку лекарств в определенные области мозга 19 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Работа была поддержана грантом NIH NINDS R01 NS047557.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A/D and D/A converter National Instruments Corporation NI USB-6221 DAQ The NI USB-6221 is still sold as a 'Legacy' device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available.
agarose Lonza NuSieve GTG Agarose #50081 to prepare dilute agarose gel for RTI measurements
amplifier for ISM Dagan Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages
biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective) for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope
borosilicate theta capillary glass tubing Harvard Apparatus Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811 double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm
brush Winsor & Newton University Series 233, size 0 round shoft handle brush, available from Amazon
bunsen burner Fisher
camera for visualizing micropipettes Olympus OLY-150 requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional
chart recorder to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished
chlorotrimethylsilane, puriss., > 99% Sigma-Aldrich catalog # 92360 for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
Commercial Software The MathWorks MATLAB, Data acquisition toolbox for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available.
eye protective goggles Fisher
fixed-stage compound microscope Olympus BX51WI can use other compound microscopes with fixed stages
forceps Fine Science Tools #11251-10 to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work
fume hood for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab
glass microscope slide Fisher #12-550A to chip microelectrode tips
heater/stirrer Fisher Corning PC-420D to prepare dilute agarose gel and stir solutions
iontophoretic unit Dagan ION-100 and PS-100 ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites)
liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium World Precision Instruments IE190 Potassium Ion Exchanger Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate - do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight.
microelectrode holder WPI M3301EH to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH.
micromanipulator Narishige MM-3 to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition
micropipette puller Sutter Instruments Model P-97 to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing
microprobe thermometer Physiotemp Model BAT-12R fine probe of this thermometer is placed close to recording site
needle BD Syringes and Needles # 305122 (25 gauge) for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5 mm x 16 mm)
objective 5X dry Olympus MPlan N
objective 10X water immersion Olympus UMPlan FL N 10X objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm
plastic containers (with lids) Fisher #14-375-148 to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes
platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope EXFO Gibraltar Burleigh platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability
porous minicup for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade
reusable adhesive Bostik Blu-Tack for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon
robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning Sutter Instruments MP-285 two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text).
signal conditioning unit with low-pass filter Axon Instruments CyberAmp 320 or 380 no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed.
silver wire A-M Systems #7830 diameter 0.015", bare (no coating)
slice chamber Harvard Apparatus Warner Model RC-27L this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber
stereomicroscope for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers
syringe, 10 mL BD Syringes and Needles #309604 to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip
syringe filter 0.22 µm pore Whatman #6780-1302 to filter backfill solutions; available from Fisher
syringe needle, 28 gauge, 97mm World Precision Instruments MicroFil MF28G-5 to backfill microelectrodes
Teflon (=PTFE) tubing Component Supply STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge) for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax.
temperature control system Harvard Apparatus Warner Models TC-344B and SH-27A TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers
tetramethyammonium (TMA) chloride Sigma-Aldrich T-3411 5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
vibrating blade microtome Leica VT1000S to cut brain slices
xylenes Fisher X5-1 for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sykova, E., Nicholson, C. Diffusion in brain extracellular space. Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).
  2. Nicholson, C. Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue. Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).
  3. Nicholson, C. Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment. J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).
  4. Nicholson, C., Phillips, J. M. Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum. J Physiol. 321, 225-257 (1981).
  5. Nicholson, C., Sykova, E. Extracellular space structure revealed by diffusion analysis. Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).
  6. Xie, L. L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
  7. Hrabetova, S., Nicholson, C. Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques. Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC press. 167-204 (2007).
  8. Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission. J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).
  9. Vargova, L., et al. Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas. Glia. 42 (1), 77-88 (2003).
  10. Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue. J Vis Exp. (103), (2015).
  11. Xiao, F., Hrabetova, S. Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers. Neuroscience. 161 (1), 39-45 (2009).
  12. Sherpa, A. D., Pvan de Nes,, Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains. Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).
  13. Kume-Kick, J., et al. Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex. J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).
  14. Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus. J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).
  15. Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording. J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).
  16. Nicholson, C. Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity. Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).
  17. Nicholson, C., Tao, L. Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging. Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).
  18. Thorne, R. G., Nicholson, C. In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).
  19. Wolak, D. J., Thorne, R. G. Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery. Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).

Tags

Neuroscience Brain диффузия внеклеточное пространство ионтофорез в реальном времени ион-селективные микроэлектроды извилистость объемная доля
Ионтофорез в реальном времени с тетраметиламмонием для количественного определения объемной доли и торможности внеклеточного пространства мозга
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Odackal, J., Colbourn, R., Odackal,… More

Odackal, J., Colbourn, R., Odackal, N. J., Tao, L., Nicholson, C., Hrabetova, S. Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space. J. Vis. Exp. (125), e55755, doi:10.3791/55755 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter