Realtidsanalytik med tetrametylammonium för att kvantifiera volymfraktioner och tortuositet i hjärnens extracellulära utrymme

Summary

I detta protokoll beskrivs realtids-jontofores, en metod som mäter fysiska parametrar för det extracellulära utrymmet (ECS) av levande hjärnor. Spridningen av en inert molekyl som släpps ut i ECS används för att beräkna ECS-volymfraktionen och tortuositeten. Den är idealisk för att studera akuta reversibla förändringar i hjärnans ECS.

Abstract

Denna översikt beskriver de grundläggande begreppen och protokollet för att utföra den realtids jontoforesmetoden (RTI), guldstandarden för att utforska och kvantifiera den extracellulära rymden (ECS) hos den levande hjärnan. ECS omger alla hjärnceller och innehåller både interstitiell vätska och extracellulär matris. Transporten av många ämnen som krävs för hjärnaktivitet, inklusive neurotransmittorer, hormoner och näringsämnen, sker genom diffusion genom ECS. Förändringar i volymen och geometrin för detta utrymme uppträder under normala hjärnprocesser, som sömn och patologiska tillstånd, som ischemi. Strukturen och reglering av hjärnans ECS, i synnerhet i sjuka stater, förblir emellertid i stort sett oförskriven. RTI-metoden mäter två fysiska parametrar av levande hjärna: volymfraktion och tortuositet. Volymfraktion är andelen vävnadsvolym upptagen av ECS. Tortuosity är ett mått på det relativa hindret som ett ämne möter när det diffunderar genom hjärnans reGion jämfört med ett medium utan hinder. I RTI pulseras en inert molekyl från en källa-mikroelektrod till hjärnans ECS. När molekyler diffunderar bort från denna källa mäts den förändrade koncentrationen av jonen över tiden med användning av en jonselektiv mikroelektrode placerad ungefär 100 | im bort. Från den resulterande diffusionskurvan kan både volymfraktion och tortuositet beräknas. Denna teknik har använts i hjärnskivor från flera arter (inklusive människor) och in vivo för att studera akuta och kroniska förändringar i ECS. Till skillnad från andra metoder kan RTI användas för att undersöka både reversibla och irreversibla förändringar i hjärnans ECS i realtid.

Introduction

Det extracellulära utrymmet (ECS) är nätet av sammankopplade kanaler yttre till alla hjärnceller och innehåller både interstitiell vätska och extracellulär matris ( Figur 1a och Figur 1b ). Fördelningen av många ämnen som krävs för hjärncellsfunktionen, inklusive näringsämnen, hormoner och neurotransmittorer, uppträder genom diffusion genom ECS. Förändringar i de fysiska parametrarna för detta utrymme, inklusive volymen, geometrin och extracellulär matris, kan drastiskt påverka diffusion genom ECS och de lokala jonkoncentrationerna i bada hjärnceller som har en djupgående inverkan på hjärncellsfunktionen ^{1 , 2} .

Realtidsjontofores (RTI) används för att bestämma två strukturella egenskaper hos en hjärnområde: volymfraktion och tortuositet ^{3 , 4 ,}"Xref"> 5. Volymfraktion ( a ) är andelen vävnadsvolym upptaget av ECS ( V _ECS ) i förhållande till den totala vävnadsvolymen ( V- _vävnad ) i en representativ elementär volym;

Tortuosity ( λ ) är det relativa hindret att ett ämne möter när det diffunderar genom en hjärnområde jämfört med ett medium utan hinder.

Där D ^* (cm ² s ^-1 ) är substansens effektiva diffusionskoefficient i hjärnan och D (cm ² s ^-1 ) är substansens fria diffusionskoefficient i ett fritt medium, såsom utspädd agarosgel.

Idag är det mest använda probprovet för RTI-metoden är det lilla katjontetrametylammoniumet (TMA). TMA har en molekylvikt av 74 g / mol, dissocieras fullständigt i lösning och har en positiv laddning. RTI-studier med denna jon har visat att a 0,2 och λ 1,6 ^{1 , 2} . Det betyder att ECS är ungefär 20% av den totala hjärnvolymen och att diffusionen av en liten inert molekyl uppträder ungefär 2,5 gånger långsammare i ECS än i ett medium utan hinder ³ . Både α och λ varierar emellertid med hjärnålder, region och tillstånd och i patologiska förhållanden ¹ . Ändringar av dessa parametrar har kopplats till hjärnans utveckling, åldrande, sömn, epilepsi och många andra grundläggande processer och hjärnans sjukdomar ^{1, 6} . Medan andra tekniker mäter α och λ kan RTI mäta både i lokaliserade områden av levande vävnad i realtid. Av denna anledning har RTI blivit ett oumbärligt verktyg för att undersöka förändringar i a och λ under akuta och reversibla utmaningar.

Teorin som stödjer RTI validerades ursprungligen av Nicholson och Phillips, och tekniken har använts i stor utsträckning sedan den tiden ^{4 , 7} . Experiment som använder RTI börjar med frisättningen av en puls av TMA från en källa-mikroelektrod genom jontofores till en utspädd agarosgel. Därefter diffusioneras joner fritt från punktkällan och väljer från ett potentiellt oändligt antal slumpmässiga vägar ( Figur 1d ). Den förändrade koncentrationen av jon mäts över tiden med användning av en jon-selektiv mikroelektrode (ISM) placerad grovt100 μm borta ( Figur 1c ). Förändringarna i TMA-koncentrationen grafiseras och monteras på en kurva som möjliggör beräkning av både D och transportnivån för jontofores mikroelektroden (parametrar som diskuteras i protokollet). Med dessa värden upprepas proceduren i en hjärnregion av intresse för att erhålla D ^* och att beräkna både a och λ . Kontroll av jontofores mikroelektroden, datainsamling, grafning och montering av TMA-koncentrationskurvan och beräkning av försöksparametrarna görs vanligtvis av programmen Wanda och Walter, som har utformats speciellt för detta ändamål (programvaran och deras manualer är Fritt tillgänglig från författarna på begäran).

Protokolldelen i denna översikt beskriver de grundläggande procedurer som behövs för att designa och utföra RTI i hjärnskivor av gnagare. Tekniken har också använts i non-rodEnt-modeller, inklusive humana hjärnskivor och hjärnpreparat in vivo ^{1 , 4 , 6 , 8 , 9} . Avsnittet Representativa resultat ger både ideala och ideala resultat för att markera nyanser i datatolkning. Slutligen behandlar diskussionsdelen kortfattat felsökningstekniker, begränsningar av RTI, alternativa tekniker som används för att studera ECS och framtida tillämpningar av RTI.

Figur 1: Diagram över diffusion genom ECS. (A) Diagram av ECS: Visar på storleken och placeringen av ECS i en typisk hjärnsektion. Gul markerar ECS mellan de grå hjärncellsprocesserna. Volymen av ECS är ungefär 20% av den totala vävnadsvolymen ( dvs. volymfraktionen = 0.2) under fysiologiska förhållanden. B ) Förstorat diagram över ECS: Uppmärksammar fysiska parametrar som bidrar till tortuositet, inklusive hjärncellsgeometri (grå) och extracellulär matris (diagrammatiserat som ett nät av mångfärgade glykosaminoglykaner och proteoglykaner). ( C ) 3D-diagram över diffusion från en punktkälla: Demonterar nätrörelsen av inerta molekyler från en jontoforetisk källa till en ISM. Exklusive diffusionsbarriärer och cellupptagning diffunderar molekylerna utåt i alla riktningar och producerar en sfärisk koncentrationsfront. ISM kvantifierar den lokala koncentrationen av de inerta molekylerna som frigörs från den jontoforetiska källan. ( D ) Datorsimulering av diffusion i hjärnans ECS: [Längst till vänster] Inställning för Monte Carlo-simulering; Gröna sfärer representerar hjärncellsprocesser och det röda korset representerar en punktkälla. Denna inställning modellerar hjärnvävnaden som visas i figur 1a . [Mellanbilder] 3 och6 molekyler som utför slumpmässiga rörelser som de diffunderar genom hjärnans extracellulära utrymme, visas i 2 dimensioner. [Farst till höger] Slumpmässiga promenader av många molekyler släppta från punktkällan. Nettoförflyttningen av alla molekyler från punktkällan är utåt såsom avbildas i figur 1c . De kumulativa slumpmässiga promenaderna skisserar mellanrummen mellan cellerna ( dvs. ECS, se referens ⁵ för ytterligare förklaring). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Protocol

Alla djurprocedurer, som användes för att erhålla vävnadsprover, var godkännande av djuretikutskottet vid SUNY Downstate Medical Center.

1. Framställning av lösningar och utrustning

1. Förbered en 150 mM NaCl-återfyllningslösning för ISM: s referensfat. Förvara den i en 10 ml spruta kopplad till ett 0,22 μm filter (för att avlägsna bakterier eller partiklar).
2. Förbered en 150 mM TMA klorid (TMA-Cl) återfyllningslösning för mikroelektroderna. Förvara den i en 10 ml spruta kopplad till ett 0,22 μm filter. Förbered TMA-Cl lösningarna (i detta protokoll) från en 5 M tillverkare stamlösning för att säkerställa rätt koncentration.
3. Kloridisera minst fyra silvertrådar för tillverkning av mikroelektroder genom att nedsänka ledningarna i blekmedel (natriumhypoklorit) under minst 2 timmar. Ta bort överskott av blekmedel med etanol och låt trådarna torka.
4. Framställ 50 ml 0,3% agaros i 150 mM NaCl och 0,5 mM TMA-Cl i en bägareOch täck den. Använd agaros som är pulveriserat och ganska friskt för att säkerställa goda diffusionsmätningar.
5. Värm och blanda agaroslösningen med en omrörningsstång för att lösa upp den. Låt lösningen svalna till rumstemperatur. Förvara detta vid 4 ° C i upp till 1 vecka.
6. Förbered en likgiltig (jord) elektrod gjord av 4% agaros i 1 M KCl (anvisningar i tillägg A)
7. Tillverka en liten, porös kopp som passar in i experimentkammaren och som möjliggör elektrisk kontinuitet mellan dess innehåll och omgivningen ( Figur 2a ). Placera en metallring på botten av denna kopp för att förhindra att den svävar när den delvis nedsänkts i vatten.
8. Använd serieutspädning av ett 5 M TMA-Cl lager för att göra fem 100 ml TMA-Cl lösningar för kalibreringen av ISM. Lösningar bör ha slutliga koncentrationer av 0,5, 1, 2, 4 och 8 mM TMA-Cl, allt i 150 mM NaCl. Förvara kalibreringslösningarna i en tätbar kopp för att förhindra förångning. </ Li>

2. Elektronisk inställning

1. Anslut komponenterna i RTI-experimentinställningen enligt blockdiagrammet i Figur 2b ; Inkludera en förstärkare med två ingångskanaler (varav en ska vara mycket högimpedans för ISM: s jon-selektiva fat), ett lågpassfilter satt till 10 Hz, en kartspelare, en A / D + D / A Omvandlare, en jontoforetisk enhet (eller en förstärkare som kan leverera konstantströmspulser) och en dator (PC) som kör Wanda och Walter-programmen. Kontrollera den elektroniska inställningen för att bekräfta att alla anslutningar är på plats.
2. Skydda den experimentella inställningen i en jordad kapsling (t.ex. en Faraday bur), om det behövs, eftersom ISM har ett högt motstånd och är känsliga för artefakter skapade av närliggande rörelse.
3. Skapa en dedikerad ISM-kalibreringsstation som består av en dubbel ingångsförstärkare, en kartspelare, en lämplig ISM-hållare och en likgiltig jordelektrod. Om möjligt,Skydda höljet. Hoppa över det här steget om ISM: erna kalibreras i experimentinställningen (steg 3.29)

Figur 2: Porös Experimental Cup och Electronic Setup. (A) Poröst experimentell kopp: Ett poröst nät används för att skapa en experimentell kopp som möjliggör elektrisk kontinuitet mellan agaros (inuti) och den experimentella badvätskan (utanför). En metallring är fäst på botten av koppen för att förhindra att koppen flyter i badlösningen. ( B ) Blockdiagram över RTI-inställningen (steg 2.1 och 2.2): En ISM är ansluten till en förstärkare (amp). ISM har två fat. En innehåller flytande jonbytare (LIX) i spetsen och genererar en spänning proportionell mot logaritmen för TMA-koncentrationen vid spetsen tillsammans med den lokala omgivande spänningen; thE-signalvägen representeras av en röd linje. Den andra trumman av ISM är känd som referensfat och mäter omgivningsspänningen vid ISM: s spets; Den är ansluten med en blå signalväg. Förstärkaren har två så kallade huvudsteg som ansluter till ISM; Dessa enheter har en förstärkning av 1 (x1) och matchar mikroelektrodens högimpedans till den låga impedansen hos resten av förstärkarkretsen. Huvudsteget som är anslutet till det jonselektiva fatet måste kunna matcha ett inkommande motstånd på ca 1000 MΩ, medan referenscylinderns motstånd är typiskt omkring 10 MΩ. Efter att ha lämnat huvudsteget inverteras spänningen från referenscylindern och subtraheras från spänningen på det jon-selektiva fatet med en summeringsförstärkare (Σ) för att erhålla ren jonsignalspänning. Utgångarna från förstärkaren passerar till en signalkonditioneringsenhet som ger ytterligare förstärkning och ett multipol lågpassfilter (≤ 10 Hz, vanligtvis en Bessel fiLter), som tar bort brus och förhindrar signal aliasing vid analog-digital-omvandlaren (A / D). Utsignalerna från filtret visas också på en remsorskiva. A / D-omvandlaren digitaliserar signalerna och skickar dem till en persondator (PC). PC: n alstrar också en digital signal som konverteras av en digital-analog-omvandlare (D / A) till en analog spänningspuls som matas till jontoforesenheten, vilken omvandlar spänningen till en strömpuls med konstant amplitud och skickar den Till jontofores mikroelektroden. Jontoforesignalvägen representeras av en grön linje. Datainsamlings- och jontoforesignalen är under kontroll av Wanda-programmet, vilket alstrar en utdatafil för varje diffusionspost i form av en spänning kontra tidsinspelning tillsammans med alla parametrar som definierar experimentet. Ett andra program, Walter, läser utdatafilen och använder ISM-kalibreringsdata för att omvandla de digitaliserade spänningarna till koncentrationer. Koncentrationen veRsus tidskurvor monteras sedan i Walter till lämplig lösning till diffusionsekvationen. D och n _t extraheras om mediet är agaros, och A och a extraheras om mediet är hjärna. Analoga signaler är fasta linjer; Digitala signaler är streckade linjer. Det finns också en likgilt jordelektrod (ej visad) i badet som innehåller skivan. Röda linjer = jonsignal, Blå linjer = referenssignal, gröna linjer = jontofores kommando, fasta linjer = analoga, prickade linjer = digitala. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

3. Framställning och kalibrering av jon-selektiva mikroelektroder

1. Skapa ISM med protokollet under en dag före experimentet. Gör ISM i satser för att säkerställa att minst två fungerar på experimentets dag.
   OBS! De flesta ISM är stabila för en dag ellertvå. ISM-tillverkning är känslig för luftfuktighet och atmosfäriska förhållanden. Inte alla mikroelektroder kommer att kalibrera framgångsrikt.
2. Spola bort ungefär 0,5 cm glas i slutet av en av faten i en dubbelborrad borosilikatglaskapillär med ett gammalt par tångar.
3. Chip en enda fat på den motsatta änden av kapillären ( Figur 3a ). Se till att septum inte är skadad (kritisk). Varning: Använd skyddsglasögon för att förhindra skada på grund av projektilglas.
4. Placera kapillären i en flaska aceton i minst 1 h för att avlägsna föroreningar.
5. Ta bort kapillären från acetonen och puls ren, torr, komprimerad kvävgas eller luft genom den för att avlägsna eventuellt överskott av aceton. Ta bort all aceton i kapillären, eftersom resterande aceton kan störa silanisering (avgörande).
6. Tillverka toppen av mikropipetten på antingen en vertikal eller horisontell dragare. Anpassa parametrarna för att dra en pipett med en lång avsmalning ochSkarp spets, ca 1 μm eller mindre i diameter. I slutet av detta steg tillverkas en kapillär i två pipetter ( figur 3a ).
7. Visualisera en enda mikropipett under ett sammansatt upprätt mikroskop med ett 10X objektiv. Skär av spetsen med hjälp av ett glasmikroskopglas så att spetsens slutdiameter ( dvs båda fat) är mellan 2 och 5 μm ( Figur 3b ). Denna pipett kommer från och med nu att kallas en ISM.
8. Fyll den flisade flaskan av ISM med 150 mM NaCl-referenslösning genom öppningen på den flisade sidan med en 10 ml spruta kopplad till ett 0,22 μm filter och en 28 G, 97 mm nål ( Figur 3b ). Fyll inte fatet över tre fjärdedelar hålen på tunnan.
9. Fyll den icke-flisade cylindern av ISM med 150 mM TMA-Cl-fyllningslösning. Tryck noggrant på ISM för att slå några luftbubblor ur lösningen. Kontrollera efter bubblor under mikrofonenRoscope som används för att chippa spetsen.
10. Flamma baksidan av ISM med en Bunsen-brännare för att säkerställa att ingen kommunikation av fyllnadslösningen sker över septumet bakom ISM. Se till att den översta fjärde delen av ISM är torr efter flammande.
11. Sätt in en kloriserad silvertråd i ISM: s referenslösning och böj ledningen som sticker ut från kapillären för att markera detta som referensfatet ( Figur 3c ). Se till att tråden är nedsänkt i återfyllningslösningen och förblir i lösning under försöksperioden.
12. Skjut en kort längd av polytetrafluoretylenrör (ca 20 cm lång) över toppen av en 25 g sprutnål. Placera den andra änden av röret på baksidan av det jon-selektiva fatet. Se till att röret är i fatet men ovanför fyllnadslösningen ( Figur 3c ).
13. Värm en tennvaxsticka med en Bunsen-brännare och täta både röret och silvanÄr tråd i sina respektive fat ( figur 3c ). Se till att en fullständig lufttätning produceras runt plaströret i det jon-selektiva fatet (kritiskt).
14. Förbered en liten, transparent glasbehållare (5 ml eller mindre) av 4% klortrimetylsilan i xylen. Varning: Xylener och silaner är mycket hälsofarliga. Hantera båda kemikalierna i en avloppsugn och kassera på lämpligt sätt.
15. Placera behållaren framför ett stereospridningsmikroskop monterat horisontellt i en avluftningsdosa. Säkra ISM vertikalt över behållaren med hjälp av en micromanipulator ( Figur 3d ).
16. Doppa på mikroelektrodens spets i klorotrimetylsilanlösningen.
17. Fäst en tom 10 ml spruta till 25-gauge nålen som leder till ISM. Applicera positivt lufttryck från sprutan tills en bubbla av TMA-Cl-lösning bildas; Detta steg bör utföras under direkt visualisering genom mikroskopet.
18. Peka på ISM-hållaren försiktigt för att slå bubblan av spetsen.
19. Dra klorotrimetylsilanlösningen till en höjd av ungefär 1 500 μm i spetsen av ISM med negativt tryck på 10 ml sprutan.
20. Helt klorotrimetylsilanlösningen helt från spetsen av ISM tills en bubbla av TMA-Cl-lösning skapas vid toppen ( Figur 3d ).
21. Upprepa steg 3.19 och 3.20 fem gånger. Se till att en jämn, oavbruten kolonn av vätska dras in i spetsen varje gång. Om ingen lösning kan dras in i spetsen, kontrollera om slangen är blockerad, lufttätningen är ofullständig eller spetsen på ISM är blockerad.
22. Spola all klorotrimetylsilanlösningen ur spetsen tills en bubbla av TMA-Cl-lösning är skapad.
23. Medan du håller ett positivt tryck på sprutan, ta bort ISM från xylenlösningen. Se till att all xylenlösningen utvisas från ISM-spetsen, eftersom överskott av xylen förstör excHängarkolonn skapad i följande steg.
24. Placera spetsen av ISM i en liten transparent behållare (antingen den som växlaren kom in eller en liten kyvett) som håller flytande jonbytaren (LIX) för TMA. Utför detta steg under direkt visualisering med hjälp av det horisontella mikroskopuppsättningen.
25. Applicera en liten mängd negativt tryck för att dra en minimal mängd av LIX i spetsen ( dvs så snart LIX ses i spetsen, sluta att applicera negativt tryck).
26. Koppla bort 10 ml sprutan från slangen och låt ISM sitta i 5 min. Under den tiden kommer LIX att komma in i den silaniserade spetsen tills den når ett jämviktsläge.
27. Ta bort ISM från LIX. Dra slangen ur växelkolven (medan du tar bort så lite vax som möjligt). Placera en kloriserad silvertråd i den lilla öppningen som skapas på baksidan av ISM. Tätning av tråden i återfyllningsfatets fyllning med smält vax.
28. Låt ISM sittaI minst 30 min. Fäst färdiga ISM-apparater på insidan av en bägare med hjälp av något smidigt, temporärt lim.
29. Kalibrera ISM genom att registrera spänningen mätt av ISM i varje kalibreringslösning gjord i steg 1.8.
    OBS: Kalibrering kan utföras i en kalibreringsstation (se steg 2.3) eller i experimentinställningen. Denna procedur beskrivs i tillägg B och i Haack et al ¹⁰ .
30. Om ISM-kalibreringen lyckades för flera ISM-enheter, pausa här tills den avsedda dagen. Om inte, tillverka fler ISM.
31. På experimentens dag kalibrerar du igen mikroelektroden (se steg 3.29).

Figur 3: Framställning av en jon-selektiv mikroelektrod. (A) ISM efter flisning tillbaka ändarna av en kapillär och dra (steg 3,2-3,6): En enda fat i båda ändar oFa glas kapillär är flisad. En ISM genereras genom att man drar en dubbeldopplad glaskapillär för att generera två mikropipetter med fina tips. ( B ) ISM efter återfyllning av båda faten (steg 3.7-3.9): Spetsen på en enda ISM är flisad till en diameter av 2-5 μm. Det jonselektiva fatet fylls på igen med TMA-Cl, och referensfatet fylls på igen med NaCl. C ) ISM före beläggning med klortrimetylsilan (steg 3.11-3.13): En kloriderad silvertråd införs i referensfatet. Polytetrafluoretylen (PTFE) slangen är ansluten till en 25 G nål och införd i det jon-selektiva fatet. En lufttät tätning ovanpå båda faten skapas med hjälp av tandvax. D ) Beläggning av en mikropipett med klortrimetylsilan (steg 3.15-3.26): [Låg förstoring] En ISM suspenderad i klortrimetylsilan i linje med ett horisontellt monterat stereomikroskop. [Hög förstoring] Utsikten genom en horisontellt monterad stereomikroskopÖppet av en ISM-spets i klorotrimetylsilanlösning. Efter visualisering av spetsen genom ett mikroskop utvisas liten mängd TMA-Cl-lösning från det jon-selektiva fatet (tillräckligt för att generera en liten bubbla av TMA-Cl-lösning). ISM-hållaren tappas för att släppa en TMA-Cl-lösningbubbla och därefter klorotrimetylsilan ritas upp i spetsen. Denna cykel upprepas flera gånger. När allt klorotrimetylsilan utsöndras från ISM, placeras ISM i flytande jonbytaren (LIX) för TMA och LIX dras in i spetsen av det jon-selektiva fatet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

4. Framställning av mikro-elektroder av jontofores

OBS: Iontopesis mikroelektroder ska tillverkas på experimentets dag.

1. Dra en dubbelhalsad borosilikatglaskapillär på en vertikal eller hoVågrät dragare. Anpassa parametrarna för att dra en pipett liknande mikropipetterna som dras i steg 3.6 ( Figur 4a ).
2. Placera mikropipetten under det föreningsmikroskop som användes i steg 3.7 och skär av spetsen med en glasmikroskopskiva så att den resulterande diametern är mellan 2 och 5 μm ( Figur 4a ).
3. Fyll båda faten med 150 mM TMA-Cl-återfyllningslösningen med en 10 ml spruta fäst vid ett 0,22 μm filter och en 28 G, 97 mm nål ( Figur 4a ).
4. Tryck försiktigt på mikropipetten för att se till att inga luftbubblor lämnas i lösningen av båda faten.
5. Placera kloridiserade silvertrådar i båda behållarna i mikropipetten. Se till att ledningarna är tillräckligt djupa i återfyllningslösningarna så att de kommer att hålla kontakten med lösningarna under försöksperioden.
6. Tät trådarna i tunnorna genom att använda hett tandvax. Lås upp försiktigt t Han sluter genom att vrida dem runt varandra (färdigställd mikroelektrod som visas i figur 4b ).

Figur 4: Framställning av en Iontopesis-mikroelektrod. (A) Jontofores mikroelektrod efter återfyllning båda piporna (steg 4,1-4,3): En jontofores-mikroelektrod dras från ett kapillärrör. Mikroelektroden spetsas till en diameter av 2-5 um. Båda faten av jontofores mikroelektroden fylls med TMA-Cl-lösning. ( B ) Fullföljd jontofores mikroelektrode (steg 4.5-4.6): En jontofores mikroelektrod med två klorerade silvertrådar införda i tunnorna. Mikroelektrodens tunnor förseglas med vax, och silvertrådarna vrids samman på baksidan av mikroelektroden./files/ftp_upload/55755/55755fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av den här siffran.

5. Framställning av artificiella cerebrospinalvätska och gnagare i hjärnvävnadssnitt

1. Förbered 1 liter artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) med en komposition som är lämplig för experimentet och tillsätt 0,5 mM TMA-Cl till den.
   OBS: TMA-Cl är nödvändig för att fastställa en bakgrundskoncentration av TMA under experimentet.
2. Förbered gnagarehjärnskivor med en tjocklek av 400 μm enligt standardprotokoll ^{11 , 12} . Använd ACSF beredd i steg 5.1 för dissektion och underhåll av hjärnskivor.

6. Real-time Iontophoresis in Agarose

1. Slå på datorn som kör Walter och Wanda-programmen.
   OBS: Dessa program är fritt tillgängliga på begäran. Medan denna programvara inte är nödvändig, programmerar liknandeProgramvara eller utför analysen för hand annars skulle behövas.
2. Kör ACSF genom nedsänkningskammaren med lämplig hastighet ( t.ex. 2 ml / min). Ställa temperaturstyrenheten till en önskad temperatur och bubbel ACSF med 95% O _2/5% CO ₂ (eller en annan lämplig gas-blandning) under hela experimentet.
3. Montera en likgiltig (jord) elektrod i en lämplig hållare och nedsänk spetsen i ACSF som löper genom nedsänkningskammaren. Anslut kabeln till marken för inspelningsinställningen.
4. Fyll den porösa koppen (gjord i steg 1.7) med den 0,3% agaros som framställts tidigare och placera den i nedsänkningskammaren. Se till att lösningen inte löper över toppen av koppen.
5. Säkra en kalibrerad ISM till pipetthållaren av en mikromekanipulator och en jontofores mikroelektrod till den andra. Ställ in hållarna i en vinkel som är lämplig för inställningen ( Figur 5a ).
6. AnslutaISM- och jontofores mikroelektroden trådar till sina respektive huvudsteg i inspelningsförstärkaren. Alternativt kan du ansluta direkt till förstärkaren (beroende på inställningen).
7. Se till att vikten / positioneringen av de anslutande ledningarna eller klippen inte orsakar någon rörelse för mikroelektroderna, eftersom små svängningar i positionering kan påverka resultaten.
8. Slå på den elektroniska inställningen (från steg 2). Starta Walter och Wanda i separata fall.
9. I Wanda GUI, klicka på "Kalibrera" ( Figur 6a ). I kalibreringsrutan ( Figur 6b ) fyller du in de spänningar som mäts under ISM-kalibreringen (steg 3.29) och klickar på "Anpassa data".
   OBS: Detta möjliggör anpassning till följande representation av Nicolsky-ekvationen (alternativt passa ekvationen med ett annat medel för att erhålla M och K ):
   
   Hennee, V är den uppmätta spänningen (mV), M är Nicolsky lutning (mV), C är koncentrationen av jon (mM), K är interferens (mM), och V ₀ är förskjutningsspänningen (mV) ^3.
10. Klicka på "Acceptera" i rutan Kalibrera för att automatiskt överföra höjden ( M ) och störningen ( K ) som genererades i steg 6.9 till huvudguiden.
    OBS: Här representerar K Na-störningen, som vanligtvis är försumbar.
11. På vänster sida av GUI, se till att alla experimentparametrar är inställda i motsvarande poster ( Figur 6a ).
    1. Ange källan till den jontoforetiska källan (standard), "Record Duration" till "200 s" (standard), "Pulse Start" till "10 s" (standard), "Pulse End" Till "60 s" (standard), "Bias Current" till "20 nA" (standard),"Huvudström" till "100 nA" (standard) och "Konverteringsfaktor" till ett lämpligt värde.
    2. I mätmätningsboxen sätts "Bath C" till koncentrationen av TMA i badlösningen (uttryckt i mM). Ange "Total Gain", "Output Channel", "ISM Channel" och "Ref Channel" till lämpliga värden för det dataupptagningssystem som används.
       OBS: "Konverteringsfaktorn" måste sättas till ett lämpligt värde (specifikt för den jontoforetiska enheten som används). Detta värde anger den mängd ström som passerar för en given tillämpad spänning från D / A-omvandlaren (nA / mV).
12. Placera en temperatursond i agarkoppen. Anteckna den uppmätta temperaturen i "Temperatur" -inmatningen i rutan "Mätelektrode" i GUI ( Figur 6a ).
13. Slå på underfasbelysningen. Om det behövs, slå på kameran som är ansluten till mikrofonenRoscope och kameraskärm.
14. Sänk mikroelektroderna minst 1000 μm djupt in i agarosen och centrera dem i koppen ( Figur 5b ). Visualisera dem under mikroskopet med hjälp av ett 10X-objekt (vatten-nedsänkningsmål med långt arbetsavstånd).
15. Förskjut spänningen på förstärkaren till 0 mV för både referens- och ISM-kanaler för att fastställa spänningen registrerad i agarosen som utgångsspänning.
16. På tvåkanalsförstärkaren flyttar man manuellt ISM-kanalanslutningen till spänningsuttragsutgången för att ställa in subtraktionen 'på' mellan referens- och ISM-kanalerna.
    OBS: Subtraktion säkerställer att spänningen ändras i ISM-kanalen återspeglar ändringarna i TMA-koncentrationen ensam.
17. Flytta ISM så att den röra vid toppen av jonofores mikroelektroden. Centrera spetsarna på varandra i alla tre riktningsaxlarna.
18. Noll de relativa positionerna för båda mikroelektroderna påMikromomanipulatorkontrollboxar. Kontrollera att mikroelektroderna centreras exakt och exakt (kritiskt).
19. Flytta ISM 120 μm bort från jontofores mikroelektroden i en axel (vänster-höger axel, figur 5b ). Ange detta avstånd i rutan "Mätelektrod" i GUI ( Figur 6a ).
20. Starta en inspelning genom att klicka på "Acquire" i GUI ( Figur 6a ); Låta programmet spela in en fullständig inspelning.
    OBS: Jonotfores mikroelektrod mottar en konstant biasström. Efter att ha klickat på "Acquire," finns det en kort fördröjning innan huvudströmmen tillämpas under en begränsad tid.
21. Upprepa steg 6.20 två till tre gånger. Vänta tills TMA-signalen återgår till baslinjen innan du hämtar nya poster. Programmet sparar varje post för senare analys.
22. Kontrollera avståndet mellan de två mikroelektroderna genom att flytta ISM tillbaka tO nollställningen som anges av kontrollboxen. Om mikroelektroderna inte längre är centrerade, centrera dem igen med samma strategi som i steg 6.17. Notera eventuella förändringar i elektrodens position.
    OBS! Om avståndet ändras med mer än ca 2%, kan de uppgifter som erhölls i steg 6.19 inte betraktas som exakta och nya måste tas.

Figur 5: Uppställning för experiment i agar. (A) Inställning för experiment i utspädd agar (steg 6,1-6,5): En liten porös behållare fylld med utspädd agar placerades i en löpande perfusionskammare. En mikro-elektrod (jonfores) mikroelektrod (vänster sida) och en ISM (höger sida) hålls av mikroelektroderhållare; Mikroelektroderhållare är monterade i armarna hos robotmikromanipulatorer. En temperatursond placeras i agargel och en likgilt jordelektrod är plAced i nedsänkningskammaren. ( B ) Förstorad vy av mikroelektroder i agar: En jontofores mikroelektrode (vänster sida) och en ISM (höger sida) visualiseras i agar med användning av ett 10x vatten nedsänkningsmål (objekt nedsänkt här i 150 mM NaCl). Mikroelektroder placeras med användning av mikromekanipulatorer till ett djup av 1000 μm; Avståndet mellan mikroelektroderna är 120 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Wanda Computer Software Interface. ( A ) Navigera Wanda grafiskt användargränssnitt (GUI): Skärmen som visas efter att Wanda-programmet öppnats. I lådan (1) väljes lämpligt medium, jontoforesmolekyl och teknik. (2) "Kalibrera" är klicka för att öppnaWanda kalibreringsrutan. Efter kalibrering av ISM (se figur 6b och tillägg B) placeras ISM i agar eller hjärna, såsom beskrivs i steg 6 och 8 i protokollet. I ruta (6) anges alla lämpliga värden för experimentet som utförs. (7) "Acquire" klickas för att ta en inspelning; En graf av spänning mot tid visas i den övre högra delen av Wanda GUI. ( B ) Kalibrera ISM i Wanda : Fönstret som öppnas efter att ha klickat på (2) "Kalibrera" i Wanda GUI. Värdena från steg 3.29 anges i fält (3) och (4) "Fit Data" är vald. Kalibreringskurvan bekräftas vara linjär. (5) "Accept" klickas för att återvända till Wanda GUI. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

7. Agarosdataanalys

1. ÖppnaWalter program på datorn (PC). I menyn "0. Records From:", klicka på "Wanda / VOLTORO" -knappen för att läsa de poster som genereras av Wanda ( Figur 7a ). Om du vill att utdata till ett kalkylblad krävs, öppna lämplig programvara. Klicka på "Sheet 1.3" i "1. Write Excel?" Meny ( Figur 7b ).
2. I nästa popup-fönster, välj den post som ska läsas och klicka på "Öppna" ( Figur 7b ); Notera att posterna automatiskt ska grafas. För att börja monteringsproceduren gör du följande steg.
   1. Klicka på "välj rec" -knappen i menyn "2. Alternativ". I popup-fönstret " Figur 2 " använder du musen för att flytta crosshairs över den första posten som ska bearbetas ( figur 7c ); Tryck på endera musknappen för att välja posten.
   2. Klicka på oN "passformkurva" i menyn. Välj önskat antal iterationer av montering; Använd minst 20 iterationer av montering för att få en korrekt passning av data.
   3. I menyn väljer du "alla" för att passa alla datapunkter och välj "fortsätt". Programmet passar den visade kurvan. Observera monteringsproceduren och jämföra försöksinspelningen med den bästa anpassade kurvan.
3. Välj alternativet att skriva resultatet till lämpligt kalkylarksprogram genom att klicka på "Excel" i menyn "7. Resultat" ( Figur 7d ). Notera (och spela in) följande kritiska data som ska användas för att bestämma jotfores mikroelektrodens funktion: ' D (E5) ', ' Referens D (E5) ', ' r_app ', transportnummer ' n _t ', ' Apparent N _t '.
   OBS: " D (E5) ": Mätt fri diffusionskoefficienttx 10 ⁵ (cm ² / s); " Referens D (E5) ": Teoretisk fri diffusionskoefficient x 10 ⁵ (cm ² / s). Detta värde extraheras från en databas inom Walter baserat på jon, mediet och temperaturingången. " R_app ": Tydlig mikroelektrodavstånd (cm), beräknad utifrån den uppmätta och referens D (E5) . " N _t ": Transportnummer (dimensionslös). Detta nummer bestämmer bråkdelen av jontoforesströmmen som används för att släppa TMA ⁴ . " Tydlig _nt ": Tydligt transportnummer (dimensionslös). Detta är ett transportnummer beräknat från r_app . Detta antal bör vara nära den uppmätta n _t.
4. Upprepa steg 7.1-7.3 för var och en av posterna för ett valt par av mikroelektroder.
5. Bestäm om mikro-elektrodens jontofores kan användas genom att göra följande.
   1. Jämför " r_app" med den faktiska r ( dvs 120 μm); Detta kriterium är uppfyllt om medelvärdena från alla försök ligger inom 4% av varandra.
   2. Jämför " D (E5)" med referens D (E5) ; Detta kriterium är uppfyllt om medelvärdena från alla försök ligger inom 8% av varandra.
   3. Jämföra den "n _t" mellan försök med samma mikroelektrod; Detta kriterium är uppfyllt om medelvärdena från alla försök ligger inom 10% av varandra.
6. Om ett av kriterierna i steg 7.5 inte var uppfyllt, felsöka jontofores mikroelektrod eller börja testa en annan.
7. Om jontofores mikroelektroden anses lämplig för experimentet, registrera det genomsnittliga transportnumret från alla försök i fältet Transportnummer N i Wanda GUI ( Figur 6a ).

jove_content ">
Figur 7: Walter Computer Software Interface. (A) Att välja datainsamlingsprogram i Walter: De "0. poster från" meny öppnas efter start av Walter programmet. Alternativet att ladda de poster som sparas av Wanda väljs genom att klicka på "Wanda / Voltoro" -knappen. ( B ) Välja data- och dataanalysutmatningsplatsen i Walter: [Vänster] Efter att lämpligt kalkylarkprogram öppnats väljs "Ark 1,3" för att mata ut alla Walter-dataanalyser till det tidigare öppnade kalkylprogrammet. [Höger] När dataanalysutmatningsplatsen har valts öppnas ett popup-fönster som gör att användaren kan välja de första och sista inspelningarna som ska läsas av Walter. ( C ) Välja inspelning för att analysera i Walter: [Höger] När filerna som ska läsas väljs, öppnas ett popup-fönster med alla valda records disSpelas som ett diagram (" Figur 2 "). [Vänster] I menyn "2.Options" klickas "välj rec" och musen används för att flytta crosshairs för att identifiera den första inspelningen för analys; Antingen musknappen trycks för att välja inspelningen. ( D ) Exportera dataanalysen från Walter till ett kalkylblad: Efter att data har anpassats visas ett popup-fönster och menyn "7. Resultat". [Vänster] Grafik för den valda inspelningen (blå) med den utrustade diffusionskurvan som genereras av Walter (röd). [Höger] Med menyn "7. Resultat" kan användaren skriva data från analysen till ett kalkylprogram genom att klicka på "Excel" -knappen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

8. Real-time Iontophoresis i hjärnskivor

1. Placera en 400 μm tjock hjärna sLöss i inspelningskammaren, se till att den är helt nedsänkt i den strömmande ACSF. Placera skivan med en akvarell pensel och försiktigt fäst den med ett galler.
2. Flytta både jontofores mikroelektroden och ISM ovanför intresseområdet på hjärnskivan. Dunk både i den flytande ACSF men över skivan.
3. Offset spänningen för både referens- och jonavkänningskanalerna till "0" mV. Vänta på att spänningen i båda kanalerna stabiliseras. På kartspelaren markerar du spänningen som mäts på ISM: ns jonavkänningskanal. Använd detta för att beräkna basvärdet V-parametern i Wanda.
4. Placera ISM och jontofores mikroelektrod 200 μm djup i skivan och 120 μm bort från varandra. Vänta på stabilisering av signalen efter att mikroelektroden flyttats in i hjärnskivan.
   OBS: Den biasström som appliceras på jontofores mikroelektroden orsakar en liten ackumulering av TMA. Det är ett vanligt misstag att ta arInspelning för tidigt och underskatta signaluppbyggnaden.
5. På kartspelaren markerar du den stabiliserade spänningen som mäts i hjärnskivan på ISM: s avkänningskanal. Beräkna spänningsskillnaden mellan TMA-signalen mätt i steg 8.3 och steg 8.4 och mata in det här värdet i fältet "Baseline V (mV)" i Wanda GUIs mätelektroddosa ( Figur 6a ).
6. På vänster sida av GUI, se till att alla experimentparametrar är korrekt inspelade / inmatade. Ange "Medium" till "Brain", "Transportnummer" till medelvärdet beräknat för jontofores mikroelektroden i steg 7.4 och "Temperatur" till temperaturen på badet som innehåller skivan.
   OBS: V måste registreras för varje uppsättning mätningar. Baslinjen V kommer att omvandlas av Wanda till baslinjen C (mM) -parametern ( dvs koncentrationen av TMA i hjärnvävnaden).
7. Starta inspelningen genom att klicka på "Acquire" och låta den spela en fullständig inspelning. Vänta tills TMA-signalen återgår till baslinjen innan du får en ny inspelning.
8. Ta två till tre på varandra följande inspelningar innan mikroelektroderna tas bort från den valda hjärnan. Ange temperaturen mätt i Wanda-programvaran direkt före varje inspelning.
9. Flytta båda mikroelektroderna diagonalt tillbaka till skivans yta. Lyft båda till minst 50 μm över skivan. Med hjälp av kartspelaren bestämmer du vilken ändring som helst mellan mätvärdet V och mätningen från steg 8.3.
10. Centrera tipsen för ISM och de jontoforetiska mikroelektroderna i relativ varandra i x-, y- och z-axlarna. Få eventuella avståndsförändringar, från displayen av mikromanipulatorns kontrollbox.

9. Hjärndataanalys

1. Öppna ett nytt kalkylblad för analysutgången.
2. Upprepa steg 7.1-7.4 i Walter till analysE de inspelningar som tagits från hjärnan.
3. Skriv data på kalkylbladsprogrammet genom att klicka på "Excel" i Walter-menyn. Spela in a , volymfraktionen av hjärnan ECS; Λ , tortuositet i hjärnan ECS; Och k (s ^-1 ), icke-specifikt clearance.

10. Kontrollera transportnummer och ISM-kalibrering

1. Mäta ISM transportnummer (n _t) vid slutet av experimentet med användning av protokollet nedan. Alternativt, ta n _t efter kritiska prövningar eller när mätningar visas anomala. Om du inte kontrollerar n _t många gånger kan det leda till trauma i hjärnskivan.
2. Ta nya inspelningar i agaros. Se steg 6.4, 6.11, 6.12, 6.14, 6.15 och 6.17-6.22.
3. Upprepa steg 7.1-7.4 i Walter för att få _nt från de nya agarosinspelningarna. Kontrollera kalkylbladet: om n _t har ändrats med merän 10% från n _t erhållits före mätningarna hjärn, de data som erhållits med denna jontoforetisk mikroelektrod inte är tillförlitliga.
4. Utför en ny kalibrering (se steg 3.29) för ISM när alla hjärndata har samlats in. Använd nyligen erhållna ISM-kalibreringsdata som ingång i Wanda Calibrate-rutan (se steg 6.9 och 6.10) och kontrollera att lutningsvärdet skiljer sig med mindre än 10% från föregående kalibrering.
   OBS! Data som erhållits med denna ISM är inte tillförlitliga om lutningsvärdet skiljer sig med mer än 10% från föregående kalibrering.

Representative Results

Användningen av RTI-tekniken demonstreras i ett experiment utformat för att mäta förändringarna i a och under en hypoosmolär utmaning ( Figur 8 och Figur 9 ). Det har tidigare visat sig att minskning av osmolariteten hos ECS genom tvättning på hypotonisk ACSF kommer att ge en minskning av a och en ökning av A ¹³ .

I detta experiment utfördes RTI på råtthjärnskivor under både kontrollbetingelser och under tvättning av hypotonisk ACSF. En ISM tillverkades och dess kalibreringsparametrar matades in i Wanda för montering till Nicolsky ekvationen, som beräknade en lutning ( M ) på 58,21 mV. ISM- och jontofores mikroelektroderna placerades i agar och placerades 120 pm från varandra för att mäta transporten number. Tre inspelningar togs och kurvorna monterades och analyserades enligt proceduren i steg 6 i protokollet ( Figur 8a ). Den utrustade kurvan för varje försök överlappades med den råa kurvan ( Figur 8a ). Den uppmätta diffusionskoefficienten (D x 1E5), gjorde transport antalet (n _t), och skillnaden mellan den skenbara avståndet mellan mikroelektroderna (r_app) och deras verkliga avståndet (r) inte signifikant mellan de tre inspelningar (figur 8b, Inspelningar a1-3). Baserat på dessa kriterier ansågs denna jontofores mikroelektrod acceptabel att fortsätta med experimentet.

När väl den stabila jontoforesmikroelektroden valdes, togs kontrollvärden för a och X i råtthjälnsskivan för att fastställa en baslinje för dessa parametrar. preVious studier hittade kontrollvärden för råtta neocortex vara a = 0,18-0,22 och A = 1,54-1,65 ¹ . För att replikera dessa värden i detta experiment placerades ISM- och jontofores mikroelektroden 200 μm djup i råttgenokortex och 120 | im från varandra. Medelvärdet n _t , beräknat från data i Figur 8b , ingicks i Wanda-programmet för användning i beräkningarna av a och X. Ett skifte i baslinjen V från placeringen av de två mikroelektroderna omkring 200 μm djup i hjärnan registrerades och spänningshoppet ingicks i Wanda för att korrigera baslinjen TMA ( dvs. baslinjen C- parametern) koncentrationen. Tre inspelningar togs, och deras kurvor var monterade ( Figur 9a , Figur 9d och Figur 9f ). Passarna avslöjade ett medelvärdeA = 0,192 och A = 1,69 ( Figur 9e ). Avstånd och skift i baslinje V kontrollerades efter det att inspelningarna togs och de korrigerade värdena infördes i Wanda för att omanalysera data (som detaljerad i steg 8 i protokollet). De omräknade värdena skilde sig inte signifikant, och de värden som rapporterades i Figur 9d accepterades.

Den normala osmolariteten hos ACSF är 300 mOsm. För att testa effekten av hypotonisk ACSF på a och λ i råttsatosensorisk neocortex gjordes ACSF med en osmolaritet av 150 mOsm genom att reducera NaCl-koncentrationen. Det antogs att denna hypotoniska ACSF skulle leda till svullnad av hjärnceller, vilket orsakade en lägre a och en potentiellt högre A ¹³ . Hjärnskivan superfusionerades med hypotonisk ACSF i ca 30 min, vilket möjliggjorde detAtt jämvikta med hjärnan. Under denna tid förblev mikroelektroderna på samma plats i neocortex som de var under tidigare mätningar av kontrollbetingelser. Fem inspelningar togs under hypotoniska förhållanden ( Figur 9b och f ). Detta genererade ett medelvärde a = 0,13 och A = 1,84 ( Figur 9e ). Dessa värden stämde överens med hypotesen att hyposmolaritet minskar a och ökar λ . Avstånd och förändringar i baslinjen V mättes och beaktades under analys- och monteringsproceduren.

Återställningsparametrar mättes också genom att tvätta på vanlig ACSF (300 mOsm) och ta nya inspelningar på samma plats i neocortexen. Eftersom svullnadseffekterna skulle vara reversibla, förväntades att a och λ skulle återhämta sig till kontrollnivåer. Värdena avRaderade över fyra poster som togs efter 30 min regelbunden ACSF-tvätt var α = 0,37 och A = 1,61 ( Figur 9c , Figur 9e och Figur 9f ). Detta visade att det fanns en oväntad överskott under återhämtningen av a under dessa förhållanden ( Figur 9e och Figur 9f ). Därefter återfördes mikroelektrodema till agar för att bekräfta att transporttalet för jontoforesmikroelektroden var oförändrad ( Figur 8c ). ISM-enheten omkalibrerades sedan, och den nya passformen till Nicolsky-ekvationen avslöjade lutningen att vara 58,21 mV.

Detta experiment är ett tydligt exempel på vad RTI ser ut under idealiska förhållanden. Följande delar av experimentet var nyckeln till dess framgång. För det första försöksdata som samlats inAgaros och hjärnan visade tillräcklig överlappning med de teoretiska kurvorna som genererades av Wanda ( Figur 8a och Figur 9a och Figur 9c ). Likheten i lutning, topp och återgång till en liknande baslinje är alla viktiga för att bestämma styrkan i matchen. Dessa delar av kurvan är ofta problematiska vid inspelning i agaros, och det är vanligt att flera inspelningar måste tas innan man finner de förhållanden som producerar välpassade kurvor ( dvs bra mikroelektroder). För det andra var de genomsnittliga transportnumren före och efter experimentet inom 10% av varandra ( Figur 8b och Figur 8c ). Om detta inte hade inträffat kunde inte värdena i hjärnan lita på. Detta är överlägset det vanligaste problemet som uppstår i RTI-experiment. För det tredje, ISM-kalibreringarna i standardiserade TMA-lösningar före och efterFör experimentet matchade (data ej visad). Kalibreringen av en fungerande ISM är vanligen inom 10%, vilket gör detta till en ovanlig orsak till experimentfel.

Figur 8: Idealiska kurvanpassningsdata i agar före och efter experiment i hjärnan. ( A ) Representativa data från en försök i agar: [Längst till vänster] Representativa data från en enda försök erhållen i agar som demonstrerar TMA-koncentrationskurvan. Före diffusionsmätningar applicerades en konstant biasström av +20 nA genom jontofores mikroelektroden. Vid tidpunkten = 10 s pulserades TMA från jontofores mikroelektroden in i agar genom att applicera en +60 nA huvudström i 50 s. En diffusionskurva genererades genom mätning av [TMA] över tiden med användning av en ISM positionerad 120 | im från källan. [Mellan] En anpassad kurva erhållen från data sRocessing i Walter. [Höger] Överlappningen av data och den monterade kurvan visar att kurvmonteringen som gjorts av Walter exakt modellerar diffusion i denna försök. ( B ) Tabell med agarmätningar före experiment i hjärnan: Data erhållna från tre försök (a1, diagram ovan) före de hypotoniska stressexperimenten ( Figur 9 ). Alla försök utfördes med jontofores mikroelektroden och ISM som användes för hypoosmotiska stressproverna. Uppgifterna uppfyllde de kriterier som behövs för att fortsätta med experimentet i hjärnskivor. Dessa kriterier innefattar tillfredsställande överlappning mellan data och monterad kurva (som ovan) och mindre än 10% variation i transportnummer. Ytterligare kriterier beskrivs i steg 7.6. ( C ) Tabell med agarmätningar efter experiment i hjärnan: Data erhållna från tre försök som utfördes i agar efter de hypoosmotiska stressexperimenten ( Figur 9 ). Den består Ency demonstrerade mellan försöken a1-3 och a4-6 föreslår starkt att ISM- och jontoforesmikroelektroderna var stabila i hela hjärnförsöket. Rec = inspelning eller provning; R = avståndet mellan ISM och jontofores mikroelektroden; Cb = baslinjekoncentration; Ref D x1E5 = teoretisk fri diffusionskoefficient x 10 ⁵ (cm ² s ^-1 ) baserat på en förberäknad standard; N _t = transportnummer (dimensionslös); D (E5) = uppmätt fri diffusionskoefficient x 10 ⁵ (cm ² s ^-1 ); R_app = tydligt mikroelektrodavstånd (cm) baserat på den uppmätta och referens D (E5); N _t apparent = uppenbart transportnummer baserat på r_app . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

">
Figur 9: Hyposmotisk stress minskar alfa och ökar lambda
växelström. Representativa data från försök i hjärnan under ( a ) kontroll, ( b ) hypoosmotiska och ( c ) återställningsförhållanden: Fasta linjer representerar data och streckade svarta linjer är utrustade kurvor. De tre förhållandena visar markant olika diffusionskurvor, inklusive olika sluttningar, amplituder och bredder. ( D ) Datatabell från kontrollprov: Datatabell för tre kontrollprov (b1, diagram ovan); A och λ är lika i alla försök och överensstämmer med publicerade data för råtta neocortex. För alla försök i hjärnan användes medelvärdet n _t från före och efter experiment agarmätningar ( Figur 8b och 8c ) för hjärnan n _t D _ref sattes till 1,25 × 10 ^-5 cm ² s ^-1 , baserat på en databas med diffusionskoefficienter (i Walter) som erhölls i råtthjärnan när T = 34,5 [C]. Parametern k ' [s ^-1 ] står för den lilla mängden TMA som förlorats från ECS under diffusionsmätningarna. Även om k ' är vanligtvis mycket liten, inklusive parametern i kurvanpassning, förbättras noggrannheten i RTI-metoden. Förlustparametern k ' representerar förmodligen cellulär upptagning eller förlusten av TMA till ACSF. ( E ) Jämförelse av kontroll-, hypoosmotiska och återhämtningsförhållanden: Medelvärden från alla försök i hjärnan under kontroll, hypoosmotiska och återhämtningsförhållanden. Data visar att hypoosmotisk stress minskar a och ökar λ . Under en återhämtningsperiod efter hypoosmotiska förhållanden, α överskott baslinje (kontroll), medan λÅtergår till baslinjen. Resultaten tyder på att förändringar i ECS under hypoosmotiska utmaningar är delvis reversibla. RTI-metoden är idealisk för att studera denna typ av akut reversibel effekt. ( F ) Diagram som visar dataklypning: Volymfraktionen (x-axeln) och tortuositeten (y-axeln) från varje försök är ritad som en enda punkt. Diagrammet visar dataklypning inom varje grupp ( dvs kontroll, hyposmolär och återhämtning), vilket tyder på att RTI har känsligheten för att detektera reproducerbara effekter av en hypoosmolär utmaning i hjärnans ECS. Rec = inspelning eller provning; R = avståndet mellan ISM och jontofores mikroelektrod; Cb = baslinjekoncentration; Alfa = volymfraktion; Lambda = tortuosity; K ' = icke-specifikt godkännande av sond. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande filer: Vänligen klicka här för att ladda ner filerna.

Discussion

Figur 10: Icke-idealiska data som visar gemensamma tekniska problem. (A) diagram av gemensamma tekniska problem med jontofores microelectrodes: Jämförelse av normal frisättning av TMA från en fungerande jontofores mikroelektrod med tre källor visar tekniska frågor. [Hög förstoring, a1] Strömmen i en ideell jontoforetisk källa bärs lika med TMA-frigöring och kloridupptagning. [Hög förstoring, a2] En jontofores mikroelektrod med låg n _t släpper mindre TMA och tar upp mer klorid än normalt. [Hög förstoring, a3] En jontofores mikroelektrode som visar elektroosmos frigör TMA, klorid och lösningsmedel. [Hög förstoring, a4] En jontofores mikroelektrode som visar växande frisättning över tiden ( dvs. "uppvärmning"). ( B ) Grafik av icke-idealiska data oUppnåddes i agar: Uppgifterna är inte tillräckligt modellerade av den kurva som utrustats av Walter och kan därför inte tolkas noggrant. Den exakta orsaken till avvikelsen är oklart. C ) Tabell över icke-ideala data erhållna i agar: Normala eller förväntade resultat i agar visas i översta raden (grafad i Figur 8a ) för jämförelse med den icke-idealiska data i den andra raden (grafad i Figur 10b ). Den dåliga överlappningen mellan data och den monterade kurvan i Figur 10b betyder att den monterade kurvan inte exakt modellerar diffusionsdata; Därför kan de beräknade värdena (markerade med *) inte tolkas. Detta kan ha orsakats av problem med jontofores mikroelektroden ( t.ex. uppvärmning) eller ISM ( t.ex. långsamt svar). Felsökning: byt mikroelektroder en åt gången, börja med jontofores mikroelektroden. Rec = inspelning eller provning; r= Avståndet mellan ISM och jontofores mikroelektrod Cb = baslinjekoncentration; Ref D x1E5 = teoretisk fri diffusionskoefficient x 10 ⁵ (cm ² s ^-1 ) baserat på en förberäknad standard; N _t = transportnummer (dimensionslös); D (E5) = uppmätt fri diffusionskoefficient x 10 ⁵ (cm ² s ^-1 ); R_app = tydligt mikroelektrodavstånd (cm) baserat på den uppmätta och referens D (E5); N _t apparent = uppenbart transportnummer baserat på r_app . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Medan experimentet som visas i figur 8 och figur 9 hade en stabil och fungerande jontofores mikroelektrod och ISM, finns det många experiment där antingen eller boMikroelektroderna äventyras och ger inte idealiska resultat. En "normal" TMA jontofores mikroelektrod har ett värde av n _t 0,3. Figur 10a visar tre vanliga problem med den jontofores mikroelektrod som kan uppstå under RTI-experiment.

Låg utsläpp. Jontofores mikroelektroden släpper ut mycket lite TMA när biasströmmen eller huvudströmmen appliceras, vilket resulterar i n _t <0,1. Strömmen passerar fortfarande genom spetsen, men det mesta bärs av Cl anjonen in i spetsen och väldigt lite av TMA-katjonen som lämnar spetsen. Om n _t är stabil i flera på varandra följande försök kan dessa jontofores mikroelektroder användas. Detta rekommenderas dock inte, eftersom de inte fungerar optimalt, vilket innebär att ytterligare problem kan utvecklas. En ännu större extremitetUppträder när spetsen på den jontoforetiska mikroelektroden blockeras och inga joner lämnar eller kommer in i spetsen. I detta fall kommer ingen kurva att produceras. I sådana fall, efter att ha kontrollerat att alla elektriska anslutningar är ordentliga, bör jontofores mikroelektrod kasseras.

Hög frisättning (elektroosmos). Förutom TMA släpper jontofores mikroelektroden också vatten, vilket resulterar i n _t > 0,5. Om n _t är stabil över flera försök kan dessa jontofores mikroelektroder användas, men det rekommenderas inte, eftersom ytterligare problem kan utvecklas. Det enda felsökningssteget att ta är att minska strömmen. Detta eliminerar ibland vattenavgivning och orsakar att n _t minskar under 0,5.

Växande frisättning ("uppvärmning"). I detta fall ökar TMA-frisättningen över tiden. När "uppvärmningen" är snabb,Diffusionskurvan har en form som liknar den som visas i figur 10b , och den kan inte monteras på ett tillförlitligt sätt. I detta fall visar diffusionskurvan en långsam uppgång i TMA-koncentrationen under huvudströmens initialfas, och TMA-koncentrationen är inte platå. En otillförlitlig passform skapar en felaktig uppmätt D , som påverkar konsistensen av det uppmätta transportnumret och r_app- värdena. När "värmer upp" är mer gradvis, inte ha en betydande inverkan på formen av individuella spridningskurvor, men det manifesteras i ett n _t som ökar över successiva försök. Ett uppvärmningsförhållande kan ibland åtgärdas genom att pulsera jontofores mikroelektroden under en tidsperiod (ca 30 min). Detta görs genom att växla mellan en biasström och en högströmström (+200 nA) i några sekunder i taget. Om en jontofores mikroelektrod fortfarande inte ger en stablE transportnummer, är det bäst att helt enkelt prova en ny.

Exakt mätning av transportnummer och stabilitet under hela experimentet är viktigt för att säkerställa ett korrekt värde för α . Att upprätthålla avståndet mellan mikroelektroder är avgörande för bestämningen av både a och λ . Om avståndet ändras efter en mätning, antingen i agaros eller i hjärnan, kan raklinjans avstånd mellan mikroelektrodernas spetsar matas in i utdata kalkylbladet och reanalyseras av Walter. Om värdena skiljer sig för mycket, måste mätningen kasseras. Temperaturfluktuering kan också vara en bidragande faktor till felaktighet, så det är viktigt att använda en exakt temperatursond och ett pålitligt kammareuppvärmningselement.

Jontofores mikroelektroden är den vanligaste källan till problem i RTI-tekniken; Att skapa och använda en stabil ISM är avgörande för att få bra data. ONe möjligt problem med ISM kan vara ett trögt svar, vilket kan orsakas av mycket hög impedans i spetsen. Med en svagt svarande ISM kommer alla jontofores mikroelektroder att visa en uppvärmningseffekt ( Figur 10b ), men kurvan orsakas helt enkelt av ISM: s oförmåga att upptäcka de förändrade TMA-koncentrationerna tillräckligt snabbt. Öka avståndet mellan mikroelektroderna (upp till 150 μm) kan ge mer tid för ISM att reagera och kan förbättra kurvanpassningen. Ett trögt svar kan indikera att jonbytaren har återgått inuti spetsen. Detta kan ses under ett sammansatt mikroskop och, om det är närvarande, betyder silaniseringen dålig och att ISM måste kasseras. Dessutom kan drift i ISM-signalen orsaka felaktiga passar för data. Det är upp till experimenten att avgöra om driften påverkar data bortom tolerans.

Begränsningar av RTI

THär finns flera begränsningar för RTI-metoden på grund av antaganden som ligger till grund för dataanalysen. Dessa antaganden innefattar ett krav på vävnadshomogenitet och vävnadsisotropi i både hjärnregionen av intresse och en sfärisk volym som omger denna region. I samband med RTI kräver vävnadshomogenitet att diffusionsparametrarna är konstanta inom området av intresse. Vävnadsisotropi innebär att ett enda värde av D ^* gäller för alla tre rymdaxlarna. Varje molekyl som släpps från en mikroelektrodkälla tar en slumpvis väg innan den kommer till positionen för inspelnings-ISM. Spänningen på ISM, som representerar antalet molekyler ( dvs koncentration) som spelas in vid en enda gång, innefattar molekyler som har rest i alla tre rumsliga axlarna, liksom vissa molekyler som har rest utöver ISM och har återvänt till mätningen Punkt ( figur 1c ). Under RTI-data analys, Walter-programmet generAtes genomsnittliga a och λ , vilket inkluderar diffusion av alla molekyler som reser i alla axlar från en punktkälla till ISM. Om diffusionshastigheten är signifikant olika i någon av de tre rumsliga axlarna (anisotropi) eller om vävnaden är icke-homogen krävs ytterligare datainsamling och dataanalys för att beräkna a och A, ^{8 , 14} .

Förutom ovanstående vävnadsförutsättningar kräver RTI-metoden att avståndet mellan en punktkälla och ISM, som benämns r , är ungefär 80-130 pm. När r sänks under 50 μm, kan ISM-svaret inte vara tillräckligt snabbt för att registrera diffusionsberoende förändringar i koncentrationen av sondmolekylen. Detta kan åtgärdas i framtiden med hjälp av koncentriska ISM med snabbare svarstider ^{10 , 15} . Större rAvstånd minimerar också hjärnregionsoberoende skillnader i ECS-miljön, ISM-tipstorlek och hjärnvävnadsskada vid ISM-placering. Omvänt när r ökas över 150 pm är diffusionen av molekyler från den jontoforetiska punktkällan mer mottaglig för inflytande av icke-isotropa, inhomogena element som omger hjärnområdet av intresse eller vävnadsperfusatgränsen ¹⁴ .

Innehåller RTI och alternativa tekniker för att utforska ECS

RTI-metoden hör till en större grupp av tekniker som utnyttjar en molekylär prob för att studera ECS; Varje metod har sina egna fördelar och brister. Medan RTI möjliggör en korrekt beräkning av både a och λ i realtid kräver metoden en laddad molekylär sond som kan detekteras av en jonbytare. I experiment där jontofores inte är lämplig, såsom studier av en oladdad sond, iOntophores kan ersättas av tryckutstötning. Tyvärr tillåter nuvarande tekniker inte beräkningen av a med tryckutstötning, eftersom volymen som frigör beror på egenskaperna hos det injicerade mediet ¹⁶ . För att använda en sond för vilken ingen växlare existerar kan sonden vara fluorescensmärkt och dess diffusion genom ECS mätt med epifluorescerande mikroskopi. Denna teknik, känd som integrativ optisk bildbehandling (IOI), är begränsad av storleken och tillgängligheten av fluorescensmärkta molekyler och potentialen för cellulär upptagning ^{17 , 18} . IOI-tekniken har fördelen att makromolekyler kan användas som prober, och detta har visat att A ökar med molekylstorlek. Slutligen har en viktig klass av diffusionsmetoder använts radiotracers, men de är inte längre vanligt förekommande ² .

Framtida tillämpningar av RTI

in vivo och expandera dess potential ^{1 , 4 , 6} . Det kan också användas för att testa effekterna av en rad olika förändringar i hjärnfysiologi, såsom de som induceras av förändringar i den kemiska miljön, farmakologi, trauma eller genetisk knockout ¹ . Så länge som förändringen inducerad i ECS varar i en period av cirka 2 minuter eller mer, kan RTI tillhandahålla en exakt kvantifiering av ECS-volymfraktion och tortuositet.

Medan betydande insikter i strukturen och funktionen hos hjärnans ECS har genererats under de senaste 50 åren därFörblir många obesvarade frågor. Till exempel är det fortfarande oklart om och hur hemostatiska mekanismer reglerar α och hur förändringar i α påverkar hjärnans funktion. Datormodeller har hjälpt till att uppskatta relativa bidrag från cellgeometri och andra faktorer som påverkar λ , men mer arbete behövs ¹ . Slutligen är ECS: s roll i patogenesen av neurologisk sjukdom (och vice versa) i stor utsträckning outexplored. I den närmaste framtiden kan RTI-mätningar förbättra målinriktad läkemedelsleverans till specifika hjärnregioner ¹⁹ .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A/D and D/A converter	National Instruments Corporation	NI USB-6221 DAQ	The NI USB-6221 is still sold as a 'Legacy' device by NI. They recommend using NI USB-6341 X Series DAQs for new installations, however we have not tested the newer units. We describe the use of the NI USB-6221 with MATLAB and Windows 7 (32-bit). Alternatives: the much older PCI-MIO-16E-4 A/D converter (Used under Windows XP or older OS only) with BNC-2090 BNC connector panel and SH68-68-EP cable. As noted in the Wanda Manual, an experimental MATLAB program to use Axon Binary Files is available.
agarose	Lonza	NuSieve GTG Agarose #50081	to prepare dilute agarose gel for RTI measurements
amplifier for ISM	Dagan	Model IX2-700 Dual Intracellular Preamplifier	ion and reference voltage amplifier with N=0.1 (for reference barrel) and N=0.001 (for ion barrel) headstages
biological compound miscroscope (with 4x and 10x objective)			for chipping the microelectrode tips and inspecting microelectrodes; various suppliers, e.g. AmScope
borosilicate theta capillary glass tubing	Harvard Apparatus	Warner Instruments model TG200-4; order #64-0811	double-barreled glass tubing for ion-selective microelectrodes and iontophoretic microelectrodes; O.D. 2.0 mm, I.D. 1.4 mm, septum 0.2 mm, length 10 cm
brush	Winsor & Newton	University Series 233, size 0	round shoft handle brush, available from Amazon
bunsen burner	Fisher
camera for visualizing micropipettes	Olympus	OLY-150	requires monitor, IR filter on substage illuminator is optional
chart recorder			to record continuously voltages on ion-selective microelectrode during calibration in tetramethylammonium standards and during RTI experiment; e.g. Kipp & Zonen type BD112 dual-cannel chart recorded, available refurbished
chlorotrimethylsilane, puriss., > 99%	Sigma-Aldrich	catalog # 92360	for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, reacts violently with water, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
Commercial Software	The MathWorks	MATLAB, Data acquisition toolbox	for data acquisition and analysis using Wanda and Walter programs. Note that an academic license is available.
eye protective goggles	Fisher
fixed-stage compound microscope	Olympus	BX51WI	can use other compound microscopes with fixed stages
forceps	Fine Science Tools	#11251-10	to chip glass capillary; Dumond #5, preferably used and no longer needed for fine work
fume hood			for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; various supliers, e.g. Captair with approriate filter sold by Erlab
glass microscope slide	Fisher	#12-550A	to chip microelectrode tips
heater/stirrer	Fisher	Corning PC-420D	to prepare dilute agarose gel and stir solutions
iontophoretic unit	Dagan	ION-100 and PS-100	ION-100 is a single channel iontophoresis unit +/- 130 V compliance; PS-100 is an external power supply; alternatives: e.g. Axoprobe-1A made by Axon Instruments (now Molecular Devices), out of production, check for availability of refurbished units (eBay and other sites)
liquid ion exchanger (LIX) for tetramethylammonium	World Precision Instruments	IE190 Potassium Ion Exchanger	Note: this is equivalent to the original Corning potassium exchanger 477317 based on tetraphenlyborate - do not confuse with neutral carrier potassium exchanger originating from the laboartory of Dr. Simon, ETH, Zurich, which does not sense tetramethylammonium, and is sold by Fluka. You can also make liquid ion exchanger for tetramethylammonium yourself: 3% by weight potassium tetrakis = (p-chlorophenyl) borate dissolved in 2,3-dimethylnitrobenzene. Buy chemicals from Fluka (now part of Sigma). See Oehme and Simon (1976) Anal. Chim. Acta 86: 21-25; CAUTION: The toxicological properties of this liquid ion exchanger have not been fully determined. Ingestion or contact with the human body may be harmful. Exercise due care! Liquid ion exchangers should be stored in a cool place out of direct sunlight.
microelectrode holder	WPI	M3301EH	to hold ion-selective microeletrode prefabricate for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; WPI sells two versions of this holder, clear M3301EH and black M3301EH. In our experience, the clear M3301EH appears to be sturdier then the black M3301EH.
micromanipulator	Narishige	MM-3	to position ion-selective microelectrode prefabricate during silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; can be substituted with any three-axis micromanipulator in good working condition
micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-97	to pull double-barreled glass tubing; other pullers can be used as long as they can accommodate large diameter double-barreled glass tubing
microprobe thermometer	Physiotemp	Model BAT-12R	fine probe of this thermometer is placed close to recording site
needle	BD	Syringes and Needles # 305122 (25 gauge)	for silanization; BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in (0.5 mm x 16 mm)
objective 5X dry	Olympus	MPlan N
objective 10X water immersion	Olympus	UMPlan FL N	10X objective is water immersion, numerical aperture is 0.3, working distance is 3.3 mm
plastic containers (with lids)	Fisher	#14-375-148	to store tetramethylammonium standard solutions and microelectrodes
platform and x-y translation stage for fixed-stage microscope	EXFO	Gibraltar Burleigh	platform holds slice chamber, micromanipulators and accesorries, x-y translational stage moves microscope without compromising recording stability
porous minicup			for RTI measurements in a dilute agarose gel; homemade
reusable adhesive	Bostik	Blu-Tack	for securing microelectrodes to holding vessel and other uses; various suppliers, available from Amazon
robotic micromanipulator with precise x,y,z positioning	Sutter Instruments	MP-285	two mircomanipulators are needed to hold separately ion-selective microelectrode and iontophoretic microelectrode. Also possible to glue micropipettes in a spaced array (see text).
signal conditioning unit with low-pass filter	Axon Instruments	CyberAmp 320 or 380	no longer available from the manufacturer but may be available from E-Bay; alternatives: e.g. FLA-01 Filter/Amplifier from Cygnus Technology. This is a single channel instrument with a minimum cutoff at 10 Hz using a multipole Bessel filter but the company may be willing to modify it for a lower cutoff frequency (2 Hz) if needed.
silver wire	A-M Systems	#7830	diameter 0.015", bare (no coating)
slice chamber	Harvard Apparatus	Warner Model RC-27L	this is submersion slice chamber; do not use interface slice chamber
stereomicroscope			for silanization and filling the tip of ion-selective barrel with liquid ion exchanger; horizontally mounted; various suppliers
syringe, 10 mL	BD	Syringes and Needles #309604	to backfill microelectrodes and for silanization; BD Luer-Lok tip
syringe filter 0.22 µm pore	Whatman	#6780-1302	to filter backfill solutions; available from Fisher
syringe needle, 28 gauge, 97mm	World Precision Instruments	MicroFil MF28G-5	to backfill microelectrodes
Teflon (=PTFE) tubing	Component Supply	STT-28 PTFE tube light wall (28 gauge)	for silanization of ion-selective barrel; fits on BD PrecisionGlide needles 25 G x 5/8 in. Note: Teflon is essential, PVC tubing would melt by hot wax.
temperature control system	Harvard Apparatus	Warner Models TC-344B and SH-27A	TC-344B is a dual automatic temperature controller, SH-27A is an in-line heater; controller and heater work with Warner slice chambers
tetramethyammonium (TMA) chloride	Sigma-Aldrich	T-3411	5 M solution; CAUTION: acute toxicity (oral, dermal, inhalation), carcinogenicity, hazardous to the aquatic environment, see Sigma-Aldrich Safety Information for full description
vibrating blade microtome	Leica	VT1000S	to cut brain slices
xylenes	Fisher	X5-1	for silanization; CAUTION: flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation), skin corrosion, eye damage, carcinogenicity, see Fisher Safety Information for full description