Summary
Nonlytic 곤충 세포 발현 시스템은 생산 세포 트래 피킹 / 제이션, 및 재조합 단백질의 기능 분석을 위해 충분히 활용된다. 여기서 우리는 상업적으로 이용 가능한 나비목 세포주에서 발현 벡터 및 후속 과도 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명합니다. 세포 내 형광 마커 단백질과 Bemisia의 담배가 루이의 아쿠아 포린의 공동 제이션 또한 제공된다.
Abstract
이종 단백질 발현 시스템은 재조합 단백질의 생산에 사용되는, 셀룰러 피킹 / 제이션의 해석 및 서브 유기체 수준에서 단백질의 생화학 적 기능의 결정. 배큘로 바이러스 발현 시스템은 점점 더 많은 생명 공학, 제약 및 산업용 애플리케이션이 분명한 혜택을 바이러스 감염을 포함하지 않지만 종종 간과하고 충분히 활용하는 nonlytic 시스템에서 단백질 생산을 위해 사용되지만. 여기서는 nonlytic 발현 벡터 및 과도 재조합 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 재조합 단백질의 효율적인 세포 제이션을 허용하고 신속하게 세포 내 단백질 피킹을 식별하는데 사용될 수있다. 우리는뿐만 아니라, 곤충 Bemisia의 담배가 루이의 두 아쿠아 포린 단백질을 포함하여 시중에서 판매하는 곤충 세포주에서 네 개의 재조합 단백질의 발현을 보여세포 원형질막 세포 이하의 특정 마커 단백질로서 세포 내 리소좀에 대한. 모든 재조합 단백질은 재조합 단백질의 직접 검출을 가능하게 그들의 카복실 말단에서 형광 단백질 마커 키메라 같이 제조 하였다. 플라스미드 관심과 알려진 세포 내 마커의 유전자 구조를 숨겨와 세포의 이중 형질 전환 라이브 세포 이미징 및 세포 단백질 현지화의 개선 확인이 가능합니다.
Introduction
곤충 세포 발현 시스템을 사용하여 재조합 단백질의 생산은 진핵 세포 단백질의 연구에 많은 이점을 제공합니다. 즉, 곤충 세포 유사 번역 후 변형, 가공, 적절히 접힌 단백질 1, 2, 3의 제조에 유리하다 포유류 세포에 존재하는 것과 같은 정렬 메커니즘을 갖는다. 곤충 세포 시스템은 일반적으로 포유 동물 세포주 4, 5에 비해 유지 보수를 위해 더 적은 자원과 적은 시간과 노력을 필요로한다. 배큘로 바이러스 발현 시스템은 단백질의 특성화 및 치료제 외국 펩타이드 백신 생산 용 바이러스 단백질의 면역 원성 프레젠테이션 다중 합성 용 재조합 단백질의 생산을 포함하여 널리 다양한 분야에서 사용되는 하나의 곤충 세포 기반 시스템이며 - 단백질 복합체등의 당화 단백질의 제조. 1, 2, 4, 6. 있다, 그러나, 상황이되는 배큘로 바이러스 발현은 3, 7 적용되지 않을 수 있으며, nonlytic 과도 곤충 발현 시스템의 사용이 더 적합 할 수있다. 특히, 과도 곤충 세포 발현 재조합 단백질의 빠른 합성을위한 가능성을 제공, 바이러스 부과 세포 용해를 포함하지 않는 덜 개발 및 유지 보수를 필요로하고, 더 나은 단백질 합성 7, 8, 9시 세포 인신 매매를 연구하는 수단을 제공, 10.
이 프로토콜을 이용하여 발현 벡터의 신속한 생성을 설명 두 단계 PCR 중첩 확장 (OE-PCR) 및, 대장균에서 플라스미드 DNA의 표준 클로닝. 플라스미드는 이중 트랜 상업적으로 이용 가능한 배양 된 곤충 세포에 사용되는 대표적인 단백질을 생산 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 두 개의 서로 다른 형광 표지 세포 내 마커 단백질의 생산과 사용을 설명하고 곤충 Bemisia의 담배가 루이의 두 아쿠아 포린 단백질 colocalization을 보여줍니다. 다음 프로토콜 OE-PCR, 표적 단백질의 세포 지역화 곤충 세포 및 형질 유지하고, 형광 현미경의 기본 방법을 제공한다.
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Protocol
표현의 플라스미드의 건설 1. OE-PCR
참고 : OE-PCR에 사용 된 모든 프라이머는 표 1을 참조하십시오. 높은 충실도의 DNA 중합 효소의 사용은 모든 증폭하는 것이 좋습니다. 그러나 이러한 효소는 자주 방치하지 않기 때문에 3 'A는, 그것의 Taq DNA 중합 효소와 간단한 비 증폭 배양을 실시 할 필요가에 "A-꼬리"를 PCR 제품 조교 곤충 세포 발현로 복제하기 전에 벡터. 이 프로토콜은 곤충 발현 플라스미드가 세포 내 마커 단백질 (두 Bemisia의 담배가 루이 아쿠아 포린 단백질이 경우), 또는 관심의 유전자의 카복실 말단에 인 - 프레임 융합 형광 단백질, 키 메릭 단백질을 형질 생성하는 방법을 보여준다 (도 1).
- 증폭 개의 독립적 인 발사 구성 OE-PCR을 사용하여 생성한다 : (1) 관심의 유전자를 코딩하는 서열 (B. 담배가 루이아쿠아 포린 1 : BtDrip1; B.의 담배가 루이의 아쿠아 포린 2 BtDrip2_v1) EGFP 또는 (2) 세포 내 마커 (초파리 melanogaster의 성 펩타이드 수용체라는 녹색 형광 단백질 변이체에 프레임 융합 : DmSPR 호모 사피엔스 포스 포 리파제 A2 : HsPLA2)에 mCherry 코딩 시퀀스. 직접 PIB / V5-그의-TA 플라스미드로 최종 OE-PCR 제품을 결찰.
- OE-PCR의 첫 번째 라운드를 들면, (표 1에 볼드체로 도시) 유전자 특이 적 센스 프라이머 및 키메라 안티센스 프라이머를 사용하여 (AD 및 A'-D도 1은 '로 표시됨)에 대응 (표 1 이탤릭체) 관심 / 세포 내 마커 유전자 (종결 코돈이없는) 최종 15 BP로 원하는 형광 단백질의 5 '말단의 15 염기쌍 내지 (EGFP 또는 mCherry)는 3'오버행을 갖는 제품을 생성한다.
참고 : PCR 조건은 표 2를 참조하십시오. - 별도의 튜브에있어서,과 특이 유전자를 사용원하는 형광체의 5'- 말단으로부터 관심 / 세포 내 마커 유전자의 3 '말단의 15 염기쌍, 15 염기쌍을 포함하고 키메라 센스 프라이머 (표 1의 밑줄로 표시) IC 형광 단백질 안티센스 프라이머 단백질은 5 '오버행을 가진 제품을 생성합니다.
참고 : PCR 조건은 표 2를 참조하십시오. PCR 반응의 주형은 하나 이상의, 바람직하게 플라스미드 DNA는 목적하는 서열을 은닉하는 서열 확인 PCR 생성물 또는 일 수있다. 여기에 설명 된 연구는 순서 검증 된 플라스미드를 사용합니다. - (표준 분자 수준 오스를 사용하여) 1 % 아가로 스겔 전기 영동에 가진 PCR 산물을 분리한다.
- 소비세 시판 DNA 겔 추출 키트를 사용하여 예상되는 크기 (표 2 참조)의 생성물을 정제 (이 프로토콜에서 사용되는 특정 키트 물질의 표를 참조).
- 최종 오버랩 전자를 생성하는 단계 1.1.4에서 겔 정제 된 PCR 산물을 사용하여xtension 제품은 ( 'A로 표시된'- D ''를도 1). 관심 / 아세포의 마커 유전자와 목적하는 키메라 서열을 생성 할 수있는 형광 단백질에 해당하는 유전자 특이 적 안티센스 프라이머위한 유전자 특이 적 센스 프라이머를 사용한다.
참고 : PCR 조건은 표 2를 참조하십시오. 경험적 최종적 전체 길이 키메라 PCR 생성물을 수득하기 위해, 반응 혼합물에 추가 1 라운드 오버랩 신장 산물의 최적 량을 결정하는 것이 필요할 수있다. - 1 % 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 제 2 라운드 PCR-OE 제품 별개. 소비세는 시중에서 판매하는 DNA 젤 추출 키트를 사용하여 제품을 정화.
- TA 클로닝에 필요한 3 'adenylated (즉, 꼬리) 제품을 생성하는 72 ° C에서 10 분 동안의 Taq DNA 중합 효소의 마스터 믹스를 1 개 유닛으로 겔 정제 2 라운드 OE-PCR 제품 인큐베이션.
- 결과 adenylated 제품을 결찰이소 부틸 렌 발현 벡터에 화학적 능력 (열충격) 또는 electrocompetent (전기) 대장균 세포를 형질 전환 표준 분자 클로닝 기술을 사용한다. 적절한 선별 마커 (예, 암피실린 또는 베니 실린)을 함유하는 배지에서 밤새 플레이트.
- 발현 플라스미드는 5'-3 '방향 인서트를 형질 형질 전환 된 인서트 양성 콜로니를 확인하기 위해 벡터 특이 프라이머 및 삽입 특이 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR을 수행한다 (12). 예상 된 크기의 PCR 제품을 생성하는 식민지의 야간 문화를 준비합니다.
- 제조업체의 지시에 따라 시판되는 DNA 정제 키트 (이 프로토콜에서 사용되는 특정 키트 재료 표 참조)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리. 직접적인 DNA 서열 분석에 의해 각각의 삽입 체의 서열 무결성을 검증.
- OE-PCR의 첫 번째 라운드를 들면, (표 1에 볼드체로 도시) 유전자 특이 적 센스 프라이머 및 키메라 안티센스 프라이머를 사용하여 (AD 및 A'-D도 1은 '로 표시됨)에 대응 (표 1 이탤릭체) 관심 / 세포 내 마커 유전자 (종결 코돈이없는) 최종 15 BP로 원하는 형광 단백질의 5 '말단의 15 염기쌍 내지 (EGFP 또는 mCherry)는 3'오버행을 갖는 제품을 생성한다.
주 : 무균 상태를 유지 층류 후드 내 조직 배양 플라스크의 개방을 요구하는 모든 셀의 조작을 수행하기 위해. 종래 셀 조작에 층류 후드 UV 살균 램프에 적어도 1 시간 우회전. 니트릴 장갑을 착용하고 그들의 사용하기 전에 70 % 에탄올로 벤치, 피펫,기구, 튜브 및 플라스크의 표면 오염을 제거. 기본 세포 배양 기술에 대한 지식 (13)를 권장합니다.
- 혈청이없는 배지에 적응 TNI 세포 (트리코 NI 난소 조직 유래의 확립 된 세포 배양 라인)을 사용하여 28 ° C T25의 조직 배양 플라스크에서 무 혈청 곤충 배지에서 점착성 단층 배양로 유지한다.
- Sf9 세포 (스포 도프 테라 프 루기 페르 난소 조직 유래의 확립 된 세포 배양 라인)와 유사하게 사용되지만 TNM-FH 곤충 배양 배지 보충 유지10 % 소 태아 혈청 (FBS) 에드.
- -80 ° C에서 재고의 튜브를 제거하고는 37 ° C의 물을 욕조에 해동 할 수 있도록하여 냉동 인 Sf9 또는 TNI 세포에서 배양 초기 종자. 해동 후 70 % 에탄올로 유리 병의 오염을 제거하고 얼음에 배치합니다.
- 새로운 T25 플라스크 전송 해동 곤충 세포 현탁액 1 ㎖에 곤충 세포 배지 4 mL를 넣고. 28 ° C, 비 가습 인큐베이터에 플라스크를 배치하고, 세포를 30-45 분 동안 부착 할 수있다.
- 적절한 배지 5 mL를 시딩 배지를 교체하고 28 ° C 비 가습 인큐베이터 플라스크 옮긴다. 매일 세포의 합류를 모니터링합니다. 통로 세포는 90 %의 포화 상태에 도달했을 때.
참고 : T25 플라스크의 전체 범위는 ~ 5 × 10 6 세포에 해당합니다. - 곤충 세포 통로.
- 세포 통로, 제 5 ㎖ 멸균 피펫을 사용하여 혈청 학적 융합 세포를 포함하는 플라스크에서 배출 된 매체를 제거한다.매체가 얻어 세포 단층에서, 하나 개의 코너로 흐르도록 플라스크를 기울인다. 조심스럽게 세포를 방해하지 않고 피펫을 사용하여 매체를 제거합니다.
- 부드럽게 새로운 살균 5 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 무 혈청 배지 곤충 4 mL를 합류 단층을 함유하는 T25 플라스크를 세척함으로써 세포를 TNI시키다. 플라스크에 걸쳐 피펫 팁을 이동 서서히 느슨하게 플라스크 바닥에 부착 된 세포를 제거하기 위해 관개.
- 모든 미디어를 제거를 통해 플라스크를 회전하고, 플라스크의 바닥이 깨끗한 지 관찰하여 세포의 적절한 분리를 확인합니다.
- 더 단단히 부착 Sf9 세포에 대해, 신선한 TNM-FH 배지 4 mL를 첨가하고, 세포 부착을 제거하는 셀 스크레이퍼를 사용한다. 부드럽게 혼합 세포 응집을 줄이기 위해 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용합니다.
- 매체의 볼륨 당 가능한 곤충 세포의 수를 추정하는 자동 세포 계수기를 사용합니다. 1.5 mL의 세포 / 배지 혼합물에 0.1 mL의 전송미세 원심 분리 튜브. 별도의 0.5 mL의 미세 원심 분리 튜브에, 트리 판 블루 10 μL로 세포 / 배지 혼합물 10 μL를 추가한다.
- 포장에서 셀 카운터 챔버 슬라이드를 제거하고 계산 슬라이드의 각 측면에 셀 / 중간 / 트리 판 블루 혼합물 10 μL를 추가한다. 세포 카운터에 슬라이드 삽입하고, 세포 밀도 및 생존 능력을 결정한다.
- 세포 밀도를 사용하여 계산하고 새로운 무균 T25 플라스크에 곤충 세포 배지 (최대 5 ㎖까지)의 적절한 부피를 추가한다.
- 신선한 미디어와 T25 플라스크에 약 1.5 × 10 6 세포로 이동; (P, N의 셀의 이전 세대 통로 번호 P의 N + 1 세대) 세포 라인을 사용 날짜, 중간 부가 세포 수 및 통로 번호 플라스크 라벨; 최대 72 시간 동안 28 ° C의 배양기에서 플라스크를 배치했다.
주 : 곤충 세포가 연속적으로 전달 될 수 있고, 세포를 형질 감염 및 / 또는 이종 덜 들일 수도 있지만통로 (30) 후 단백질 발현. 10 % 표백제 용액으로 파기 세포 / 미디어를 처리하고, 처리 전에 일회용 플라스틱 제품을 오토 클레이브.
3. 곤충 세포 형질
- 와 T25 플라스크 시드 최대 1 × 적합한 곤충 세포 배지에서 6 TNI 또는 인 Sf9 세포 (인 Sf9위한 TNI 및 TNM-FH 용 무 혈청 곤충 배지), 28 ° C에서 72 시간 동안 포화 상태로 성장한다.
- 제거하고 기존 매체를 버리고 신선한 혈청이없는 곤충 매체의 4 mL로 세포를 이동시키다 (위의 단계 2.6.2과 2.6.3을 참조).
- 자동 세포 계수기 (위의 단계 2.6.4 참조)를 사용하여 세포 농도를 추정한다.
- 각각의 35mm의 유리 - 바닥 접시에 약 7 × 105 세포를 첨가하고, 세포를 28 ℃에서 20-25 분 동안 부착 할 수있다.
- 각각의 형질 감염을 위해, 플라스미드 DNA의 2 μg의 추가 (DO 중 하나에 대한 두 개의 플라스미드들 각각으로부터 하나의 플라스미드 형질 하나 또는 2 μg의 행멸균 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브 인 Sf9 및 형질 TNI) 모두 FBS가없는 무 혈청 곤충 배지 (0.1 mL를 행 uble 형질).
- 별도의 튜브에, 무 혈청 곤충 배지 0.1 ㎖의 트랜 스펙 션 시약의 8 μL를 혼합하고 관심의 플라스미드 DNA를 함유하는 용액 튜브에 옮긴다. 가볍게 와동 및 20 RT 부화 - 30 분.
- 전량을 1 mL로 같도록 혈청 곤충 배지 0.8 mL의 플라스미드 형질 단계 3.5 내지 3.6의 혼합물을 희석.
- 조심스럽게 부착 된 세포를 포함하는 유리 접시에서 용지를 제거합니다. 희석 된 플라스미드 형질 감염 배지 부착 세포 오버레이.
- 5 시간 동안 28 ℃에서 세포를 인큐베이션.
주 : 형질 조건은 최대 형질 전환 효율 (경험적 최적화를 필요로 예를 들면 밤새 형질보다 5 시간, 사용 된 플라스미드 DNA의 양, 형질 감염 시약 화학사용, 등.). - 제거하고 형질 매체를 폐기하고 부드럽게 세포를 꺼 내려하지 않도록주의, 무 혈청 곤충 매체의 1 mL로 세포를 씻어.
- 신선한 곤충 세포 배지 (인 Sf9에 대한 TNI와 TNM-FH에 대한 혈청이없는 곤충 매체)의 2 mL를 추가하고 48 ~ 72 시간 동안 28 ° C에서 품어.
참고 : 다시, 조건이 최대 이종 단백질 발현에 대한 경험적 최적화가 필요합니다.
4. 공 초점 형광 현미경
- 48-72 시간 후 형질 감염에서 IPL-41 곤충 배지 1 ㎖로 한번 세포를 세척하고 2 mL의 IPL-41 촬상 용 커버.
참고 :이 세척 단계는 정상 세포의 유지에 사용되는 곤충 세포 매체 관찰 배경 자동 형광을 줄일 수 있습니다. - 훽스트 살아있는 세포 염색 시약을 4 방울을 가하여 매체 (이 프로토콜에서 사용되는 특정 핵 염색 재료의 테이블 참조)를 20-25 분 동안 28 ℃에서 배양한다.
참고 : 추가 NUC염료 EGFP 및 mCherry에서 독특한 형광 프로파일을 가져야하지만 리어 얼룩은 치환 될 수있다. - 자기 밀폐 된 공 촛점 현미경 스캐닝 레이저로 35mm 접시 (이 프로토콜에 사용되는 특정 악기 재료의 표 참조)을 놓습니다.
- 훽스트, EGFP 및 mCherry 관찰 조건 현미경 조정 : 훽스트 여기 / 방출 - 461분의 359 나노 미터; EGFP 여기 / 방출 - 510분의 489 나노 미터; mCherry 여기 / 방출 - 610분의 580 내지.
- 형광 발현을 확인한 후 60X 위상 대조 물 액침 대물 주사를 사용 모드로 전환하기 위해 10 배 대물 렌즈를 사용하여 초기 검사를 수행한다.
- 화상 콘트라스트, 해상도를 최적화하기위한 레이저 파워 (5-7 %), 검출 감도 (47-49 %), 주사 속도, Z 축 깊이, 디지털 줌을 조정한다. 이미지 1.5 배 디지털 줌의 세포는 90X 증폭의 총을 제공합니다.
참고 : 현미경 매개 변수를 최적화에 대한 경험적 조정 필요및 이미지 컬렉션 사용 기기에 특정 될 수있다. - TIFF 이미지 파일로 원시 데이터를 내보내고 그림 세대 (작물 및 오버레이)를 수정합니다.
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Representative Results
OE-PCR
OE-PCR 일단 관심 형광 마커 단백질의 임의의 테스트에 대응하는 유전자 재조합 키 메릭 단백질의 생성을 허용, 발현 벡터에 삽입 키메라 DNA 산물의 합성을 허용한다. 도 1은 형광 단백질 마커 EGFP에 프레임 시퀀스 (BtDrip1 및 BtDrip2_v1)를 부호화 B.의 담배가 루이의 아쿠아 포린 PIB를 함유하는 발현 벡터의 제조에 대한 일반적인 구조를 나타낸다. 이 경우, 그 카르복실기 말단에서 EGFP를 포함하는 두 BtDrip 키메라 단백질을 제조 하였다. 이 프로토콜은 또한 카복실 테르 mCherry 키메라와 같이 제조 개의 곤충 세포 내 마커 단백질과 DmSPR PLA2G15 (도 1)를 개발하기위한 방법을 설명했다. 그 방출 스펙트럼은 충분히 발산 때문에 EGFP 및 mCherry는 t를 허용 선택되었다그 독립 검출 시험 단백질로부터의 신호의 공동 제이션 (예., BtDrip-EGFP) 및 DmSPR- 마커 단백질 PLA2G15-mCherry는 표지. 모든 PCR 반응은 예상 크기의 밴드를 생산하고 성공적으로 PIB에 클로닝되었다. 모든 플라스미드를 올바른 방향으로 프레임과 형광 단백질 마커 적절한 삽입을 포함하는 DNA 서열 분석에 의해 확인 하였다.
곤충 세포 배양에서 재조합 단백질을 일시 발현
PIB / BtDrip1-EGFP, PIB / BtDrip2_v1-EGFP, PIB / DmSPR-mCherry 및 PIB / PLA2G15-mCherry에 대응하는 발현 벡터의 구축에 이어, 세포를 형질 전환하고, 생균의 재조합 단백질의 발현은 공 초점 형광을 사용하여 가시화 현미경 (그림 2). 성공적인 형질 재조합 BtDrip1-EGFP의 발현은 명백하다 BY TNI 세포 (도 2B, 2 층)의 표면에 녹색 형광의 존재. 녹색 형광 BtDrip2_v1의 세포 내 발현을 나타내는 BtDrip2_v1-EGFP (도 2J, 2N)로 형질 TNI 셀들 내에 관찰된다. 마찬가지로, PIB / DmSPR-mCherry (도 2C, 2K) 또는 PIB / PLA2G15-mCherry (도 2G, 2O)로 형질 TNI 셀 각각 키메라의 발현을 나타내는 적색 형광을 나타낸다.
재조합 BtDrip 단백질 및 세포 내 마커의 공동 현지화
TNI 세포의 이중 형질 두 형광 표지 된 단백질의 동시 발현을 허용한다. 노란색 / 오렌지색 형질 전환 된 TNI 세포의 오버레이 이미지는 세포 EGFP 및 mCherry 모두를 생산하는 플라스미드 항구 단백질이 같은 SU 내에서 지역화 공동 것을 제안 나타냅니다bcellular 구조 (도 2d, 2H, 2L 및 2P). 이것은 BtDrip1 DmSPR 및 셀 표면 14, 15, 16로 표현된다 이전 결과를 확인한다. PIB / BtDrip1-EGFP 및 PIB / DmSPR-mCherry 이중 형질 TNI 셀의 오버레이는 세포 표면 BtDrip1-EGFP와 DmSPR-mCherry 공동 제이션 제안 녹색 및 적색 형광 시그널 (도 2D)의 중첩을 도시 . 이전 Maroniche 등. 17 mCherry 가진 키메라로 Sf9 세포에서 발현이 간 경우 PLA2G15 리소좀의 마커임을 보여 주었다. 이 재조합 BtDrip2_v1-EGFP 단백질은 세포 표면으로 이동시키다 것이라고 예측되었지만, 그것은 이전 키메라 단백질은 주로 형질 TNI 셀 (15) 내의 세포 내에서 지역화 된 것으로 나타났다. 이 지원에는 거의 EVID가 있었다BtDrip2_v1-EGFP이 PIB / DmSPR-mCherry (도 2L)와 공동 발현 녹색 및 적색 형광 신호의 동시 지역화 줬어. 대조적으로, PIB / BtDrip2_v1-EGFP 및 PIB / PLA2G15-mCherry의 공동 발현이 강하게 BtDrip2_v1 가능성 세포 리소좀으로 피킹되는 것을 시사 세포질 녹색 및 적색 형광 시그널 (도 2P)에 상당한 중첩 결과.
도 1 : 오버랩 익스텐션 PCR (OE-PCR)을 사용하여 발현 작 제물을 만들기위한 회로도. OE-PCR 함유 PIB 발현 벡터를 구축하는데 사용되는 Bemisia 담배가 루이 아쿠아 포린 -1- / EGFP (BtDrip1-EGFP), B.의 담배가 루이의 아쿠아 포린-2_variant 1 / EGFP (BtDrip2_v1-EGFP), 초파리 melanogaster의 성 펩타이드 수용체 / mCherry (DmSPR- mCherry), 그리고 호모 사피엔스 포스-A2 / mCherry(HsPLA2G15-mCherry) 제품. OE-PCR의 첫 번째 라운드 관심의 전체 길이의 cDNA에 대응하는 단편을 생성 BtDrip1 (A) BtDrip2_v1에 대응 작은 3 '중첩 영역을 포함하는 (B) DmSPR (C), 및 HsPLA2G15 (D) EGFP 또는 mCherry 형광 마커 단백질 중 하나의 5'- 말단. 동시에, EGFP 및 mCherry에서 전체 길이의 cDNA를 PCR 증폭하고 ( '(BtDrip2_v1 (B') DmSPR (C '), 또는 HsPLA2G15 작은 5 BtDrip1 A)의 3'- 말단에 상응하는 중복 영역을'포함하다 D '). OE-PCR의 첫 라운드에서 관심있는 cDNA를 (즉 BtDrip1, BtDrip2_v1, DmSPR 및 HsPLA2G15)를 증폭하는 데 사용되는 모든 프라이머는 일반적으로 각각의 코딩 서열의 3'- 말단에있는 정지 코돈이 부족합니다. 모든 1 차 OE-PCR 생성물은 아가 로스 겔에 의해 분리 차기, 증폭rophoresis 및 겔 - 정제 하였다. OE-PCR의 두 번째 라운드 전장 키메라 생성물의 증폭을위한 템플릿으로 OE-PCR의 첫 번째 라운드에서 겔 - 정제 된 PCR 산물의 풀링 쌍을 사용한다. 각 반응의 경우, 센스 프라이머는 관심의 코딩 서열의 cDNA를 5 '말단에 대응하는 상기 안티센스 프라이머는 본래 코돈의 정지 (A', B '로, EGFP 또는 mCherry의 3'- 말단에 상보 'C'및 D ''). 네 번째 라운드 OE-PCR 산물을 겔 정제, Taq 중합 효소에 adenylated 및 PIB / V5-된 His 발현 벡터에 라이 게이션된다. 플라스미드는 E. coli에 전파되고, 정제 된 플라스미드 DNA가 형질 감염 곤충 세포를 위해 사용된다. 바실러스 담배가 루이는 BtDrip1 및 BtDrip2_v1 각각 진한 청색 및 시안 색에 나타낸다 아쿠아 포린 및 세포 내 마커 DmSPR 및 PLA2G15 각각 오렌지 핑크에 나타낸다. EGFP는 쉬입니다녹색과 mCherry에서 자신의 빨간색입니다. 색깔의 화살표 방향 (역방향 정방향 프라이머 및 안티센스 프라이머의 센스 프라이머) 및 유전자 - 특이 적 프라이머의 위치를 나타내는 (a 프라이머의 색상은 프라이머 서열의 소스를 나타낸다). 프라이머 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 재조합 BtDrip1-EGFP, BtDrip2_v1-EGFP, DmSPR-mCherry 및 PLA2G15 - mCherry 단백질을 표현 더블 형질 전환 된 TNI 세포의 라이브 영상. 트리코 NI는 (TNI) 세포 PIB / BtDrip1-EGFP 및 PIB / DmSPR-mCherry (AD), PIB / BtDrip1-EGFP 및 PIB / PLA2G15-mCherry (EH), PIB / BtDrip2_v1-EGFP 및 PIB / DmSPR로 이중 형질 감염시켰다 -mCherry (<강한> IL) 또는 PIB / BtDrip2_v1-EGFP 및 PIB / PLA2G15-mCherry (MP). 화상은 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 90X 60X 증폭에 위상차 물 액침 대물 (NA 1.2)를 사용하여 포착 하였다. 훽스트 (Hoechst) 패널은 스테인드 세포 핵 (예는 / 그들을 461분의 359 나노 미터 =)의 대표 라이브 셀 이미지를 보여줍니다. EGFP 패널 EGFP 키메라 (예 :은 / 안에 510분의 489 nm의 =)로 형질 감염된 세포의 형광 발현을 나타낸다. mCherry 패널 mCherry 키메라 (예 :은 / 안에 610분의 580 nm의 =)로 형질 감염된 세포의 형광 발현을 나타낸다. 병합 패널 세 형광 채널 (즉, 훽스트, EGFP 및 mCherry)의 오버레이를 도시한다. 스케일 바는 10 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이종 단백질 발현 시스템은 다수의 다운 스트림 애플리케이션 4에 사용되는 재조합 단백질의 생산을위한 중요한 도구입니다. 사용할 수있는 다양한 발현 시스템에서 선택하면 관심있는 단백질의 최종 목표에 따라 달라집니다. 여러 곤충 세포 발현 시스템은 원핵 생물과 진핵 세포 발현 시스템 5, 6 유연한 대안을 제공하는 사용할 수 있습니다. 단백질 발현을 유도하는 배큘로 바이러스 감염을 필요로하는 곤충 시스템은 연구 및 치료 응용 프로그램 1, 2, 3에서 사용되는 많은 단백질로, 지금까지 가장 인기 있고 널리 사용되는 곤충 시스템이다. 배큘로 바이러스 발현은, 그러나, 포함한 한계가 1) 바이러스의 라이프 사이클은 숙주 세포의 용해를 포함한다; 2) 용해 된 숙주 세포는 통상적으로 높은 AMO 해제degradative 효소 unts; 3) 안정한 세포주의 생성에 시간이 소요되고 독성 단백질 가능하지 않을 수있다; 4) 불연속 식은 잦은 유지 보수를 요구한다; 5) 벡터의 생성은 종종 다중 클로닝 단계를 요구한다; 6) 곤충 세포 밀도는 종종 바이러스 감염에 반비례; 7) 재조합 단백질은 주로 세포의 표면에 높은 수준으로 트래 피킹 3, 7, 9, 10을 분비한다. 플라스미드 DNA를 가진 곤충 세포의 형질 전환에 기초 Nonlytic 일시적 유전자 발현에는 배큘로 바이러스 (7), (8)과 관련된 고유 한 문제 중 일부 않고, 재조합 단백질의 생산을위한 대안적인 기술을 제공한다. 즉, 과도 곤충 세포 발현이 짧은 턴 - 주위에 제공 벡터 건설 및 단백질 합성에 challeng을 방지 ES는 바이러스 감염 및 세포 용해와 관련된 단백질의 세포 트래 피킹을 관찰하는 강력한 방법을 제공한다.
여기서, 두 개의 검증 식 구조 단백질과 BtDrip1 BtDrip2_v1을 아쿠아 포린 바실러스 담배가 루이의 세포 내 위치 파악을 결정하는데 사용 하였다. DmSPR-mCherry 플라즈마 세포막 16 마커이며 PLA2G15-mCherry 셀룰러 리소좀 17 내에 편재. 도 2는 단백질의 위치를 평가하기 위해 이러한 마커의 값을 나타낸다 관심이 경우, 리소좀 내의 PLA2G15-mCherry와 세포 표면에 DmSPR-mCherry 및 BtDrip2_v1-EGFP와 BtDrip1-EGFP의 공동 제이션. 따라서, 다음과 같이 이전의 연구에서 14, 15, 16, 18, 19,엉덩이 = "외부 참조"> (20)는,이 방법은 빠르게 곤충 세포 내에서 단백질 피킹을 확인하는데 사용될 수있다. TNI 세포 내의 단백질 발현 및 피킹 여기 (도 2) 도시되어 있지만,이 프로토콜에 최적화 및 다른 곤충 세포주 (인 Sf9,를 Sf21, BM-N, S2 등)에 동일하게 적용될 수 있다는 것을 유의해야 .
모든 이종 단백질 발현 시스템과 마찬가지로, 배양 된 곤충 세포 내에서 과도 단백질 생산에 제한이 있습니다. 즉, 플라스미드 유래의 발현 양성 세포의 비율은 배큘 또는 안정한 세포주를 사용 달성보다 일반적으로 낮다. 따라서, 과도 시스템 낮을 수 생산 된 재조합 단백질 (들)의 양; 그러나, 다른 프로모터를 사용하는 유전 증진제의 혼입 가능성이 제한 7, 21, 22을 극복 할 수있다. 티그 프로토콜은 두 PIB 벡터를 각각 형질 다른 단백질 - 코딩 서열 (도 2)와 TNI 세포의 공동 - 형질 감염을 보여준다. 유사한 형질 전환 효율은 TNI 셀 (도시되지 않은 데이터)를 사용하는 형질 네 발현 벡터 관찰 되었으나, 이는 항상 가능한 것은 아니다. 따라서, 이러한 일시적인 발현 벡터 실험 광범위한 실험적인 최적화가 필요 (예를 들어, 각각의 벡터, 형질 전환 시간, 형질 전환 시약 화학 물질 등의 양의 변동) 등가 형질 감염 효율 및 / 또는 재조합 단백질의 발현 수준을 달성한다. 또한, 형광 단백질의 첨가에 영향을 미치거나 단백질 23 타겟 24 세포 내 피킹을 제한 할 수있다. 마커 단백질과 형광 관찰 두 단백질의 세포 내 공 편재 식별 necessaril 않는다Y는 관심 (24), (25)의 단백질 사이의 직접 단백질 - 단백질 상호 작용을 나타냅니다. 이러한 공동 제이션 결과를 해석 할 때 따라서,주의가 필요하다.
일시적인 유전자 발현은 현재 배큘로 바이러스 발현 시스템에 비해 몇 가지 장점을 제공 않습니다. 과도 발현은 벡터의 건설 적은 시간과 노동을 필요로하고 재조합 단백질의 합성, 일시적인 발현은 바큘로 바이러스의 병원성 라이프 사이클과 관련된 세포 용해를 포함하지 않으며, 일시적 발현의 세포 내 인신 매매에 대한 더 나은 학습 시스템을 제공 할 수 있습니다 단백질 3, 7, 9. 이 프로토콜은 중첩 연장 PCR (도 1을 사용하여 PIB 발현 용 벡터에 목적 유전자의 직접적인 결합을 통해 용이하게 건물 구조물의 속도를 강조 (26)의 폭 넓은 선택을 허용한다. 또한, EGFP 27 mCherry 28 비록 두 B. 담배가 루이 아쿠아 포린 단백질의 카르복시 말단에서 여기에 인용하고, OE-PCR은 또한이 단백질의 아미노 말단에 다수의 다른 변형 형광 마커 단백질 (26)를 배치하는데 사용될 수있다. 이 OE-PCR을 사용하여 구축 된 수많은 발현 플라스미드뿐만 아니라, 많은 전통적인 표현 복제 카세트를 제조하고 형광 단백질 EGFP, 금성, 그리고 mCherry와의 프레임 관심의 거의 모든 단백질을 생산하는 데 사용할 수 있습니다, 융합, 주목할 만하다 또는 아미노 말단에 하나. 이러한 발현 카세트의 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
"게놈"의 시대 의미 내지 D 전례의 볼륨 액세스를 제공했다ATA. 그러나, 갭은 유전자의 검색 및 유전자 산물에 대한 기능의 할당 사이에서 계속 넓혀; 따라서, 추가 실험 도구는 필사적으로 기능 유전체학을 가속화 할 필요가있다. 반면 유전자 편집 및 생체 내 유전자 조작 시스템의 다른 궁극적으로 유전자 기능을 할당하기위한 전형적인 방법을 제공 할 수 있으며, 이종 단백질 발현 시스템 가능성 유용한 단백질 biomanufacture 및 단백질 구조 및 기능을 해독 중요한 남아있을 것이다. 이 프로토콜은 발현 플라스미드의 향상된 구조 및 곤충 세포에서 재조합 단백질의 일시적 발현을위한 방법을 설명한다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원을 린 Forlow-Jech 및 Dannialle 리로이 감사합니다. 이 문서는 목적으로 만입니다 무역 이름 또는 상용 제품의 JAF 및 JJH 언급 작물 보호 및 검역 [프로젝트 # 2020-22620-022-00D] -이 작품은 USDA ARS에 기본 CRIS 자금, 국가 프로그램 (304)에 의해 지원되었다 특정 정보를 제공하고 미국 농무부에 의해 추천이나 승인을 의미하지는 않습니다. USDA는 동등한 기회를 제공하는 고용 기관입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
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