Summary
Nonlytic sistemas de expresión de células de insectos están infrautilizados para la producción, celular tráfico / localización, y el análisis funcional de proteínas recombinantes. A continuación, describimos métodos para generar vectores de expresión y la expresión de proteína transitoria posterior en líneas celulares de lepidópteros disponibles comercialmente. También se presenta la co-localización de las acuaporinas de Bemisia tabaci con proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares.
Abstract
sistemas de expresión de proteína heteróloga se utilizan para la producción de proteínas recombinantes, la interpretación de celular tráfico / localización, y la determinación de la función bioquímica de las proteínas a nivel de sub-organismo. Aunque los sistemas de expresión de baculovirus se utilizan cada vez más para la producción de proteínas en numerosos biotecnológica, farmacéutica y aplicaciones industriales, sistemas nonlytic que no implican infección viral tiene evidentes ventajas, pero a menudo se pasa por alto y poco utilizados. A continuación, describimos un método para generar vectores de expresión nonlytic y expresión de la proteína recombinante transitoria. Este protocolo permite la localización celular eficiente de proteínas recombinantes y se puede utilizar para discernir rápidamente el tráfico de proteínas dentro de la célula. Mostramos la expresión de cuatro proteínas recombinantes en una línea de células de insecto disponibles comercialmente, incluyendo dos proteínas de acuaporina del insecto Bemisia tabaci, asícomo proteínas marcadoras subcelulares específicos para la membrana plasmática de la célula y para lisosomas intracelulares. Todas las proteínas recombinantes se produjeron como quimeras con marcadores de proteínas fluorescentes en sus extremos carboxilo, que permite la detección directa de las proteínas recombinantes. La doble transfección de células con plásmidos que albergan construcciones de los genes de interés y un marcador subcelular conocido permite para imágenes de células vivas y la mejora de validación de localización de la proteína celular.
Introduction
La producción de proteínas recombinantes utilizando sistemas de expresión de células de insectos ofrece numerosos beneficios para el estudio de proteínas eucarióticas. A saber, células de insectos poseen modificaciones similares después de la traducción, procesamiento, y los mecanismos de clasificación como los presentes en células de mamífero, lo que es ventajoso para la producción de proteínas correctamente plegadas 1, 2, 3. Sistemas de células de insectos también típicamente requieren menos recursos y menos tiempo y esfuerzo para el mantenimiento de líneas celulares de mamífero 4, 5. El sistema de expresión de baculovirus es un sistema basado en células de insectos de tal manera que ahora se utiliza ampliamente en muchas disciplinas, incluyendo la producción de proteínas recombinantes para la caracterización de proteínas y la terapéutica, la presentación inmunogénico de péptidos extraños y las proteínas virales para la producción de vacunas, la síntesis de múltiples complejos proteínicas, La producción de proteínas glicosiladas, etc. 1, 2, 4, 6. Hay, sin embargo, situaciones en las que la expresión de baculovirus puede no ser aplicable 3, 7, y el uso de sistemas de expresión de insectos nonlytic y transitorios pueden ser más apropiados. Específicamente, la expresión de células de insecto transitoria ofrece la posibilidad para la rápida síntesis de proteína recombinante, requiere menos desarrollo y mantenimiento, no implica la lisis celular viral impuesta, y proporciona un medio para estudiar mejor tráfico celular durante la síntesis de 7, 8, 9 proteínas, 10.
Este protocolo describe la rápida generación de vectores de expresión utilizando extensión de solapamiento de dos etapas de PCR (OE-PCR) Escherichia coli. Los plásmidos se utilizan para doble transfectar células de insecto cultivadas comercialmente disponibles y para producir proteínas representativas. El protocolo describe la producción y el uso de dos proteínas marcadoras subcelular marcados con fluorescencia diferentes y demuestra colocalización con dos proteínas de acuaporina del insecto Bemisia tabaci. El siguiente protocolo proporciona la metodología básica para OE-PCR, insecto mantenimiento de las células y la transfección, y microscopía de fluorescencia para la localización celular de proteínas diana.
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Protocol
1. OE-PCR para la construcción de plásmidos de expresión
Nota: Véase la Tabla 1 para todos los cebadores utilizados en OE-PCR. El uso de una ADN polimerasa de alta fidelidad se recomienda para todas las amplificaciones. Sin embargo, debido a que estas enzimas con frecuencia no dejan un 3' A, es necesario realizar una breve no amplificar-incubación, con una ADN polimerasa Taq a productos 'A-cola' de la PCR antes de la clonación ellos en una expresión de células de insecto TA vector. Este protocolo demuestra un método para generar insectos plásmidos de expresión que alberga proteínas quiméricas, con las proteínas fluorescentes fusionados en marco al extremo carboxilo terminal de los genes de interés (en este caso, a dos tabaci acuaporina proteínas Bemisia) o a proteínas marcadoras subcelulares (Figura 1).
- Utilice OE-PCR, que consta de dos rondas independientes de amplificación, para generar: (1) las secuencias que codifican los genes de interés (B. tabaciacuaporina 1: BtDrip1; B. tabaci acuaporina 2: BtDrip2_v1) fusionada en marco con una variante de proteína verde fluorescente llamado EGFP o (2) los marcadores subcelulares (Drosophila melanogaster sexo péptido receptor: DmSPR; Homo sapiens fosfolipasa A2: HsPLA2) con la secuencia de codificación mCherry. Directamente ligar los productos finales OE-PCR en el plásmido pIB / V5-His-TA.
- Para la primera ronda de OE-PCR (indicado por AD y A'-D' en la Figura 1), utilizar una imprimación de genes específicos de sentido (mostrado en negrita en la Tabla 1) y un cebador antisentido quimérico (en cursiva en la Tabla 1) que corresponde al 15 pb final (sin el codón de parada) del gen de interés / marcador subcelular y a 15 pb del extremo 5 'de la proteína fluorescente deseado (EGFP o mCherry) para generar un producto con un saliente 3' .
Nota: Véase la Tabla 2 para las condiciones de PCR. - En un tubo separado, utilice un gen-specific cebador antisentido proteína fluorescente (se muestra con un subrayado en la Tabla 1) y un cebador sentido quimérico que contiene 15 pb del extremo 3 'del gen de interés / marcador subcelular y 15 pb desde el extremo 5' de la fluorescente deseado proteína para generar un producto con una proyección en 5' .
Nota: Véase la Tabla 2 para las condiciones de la PCR. La plantilla de PCR puede ser o bien un producto de PCR de secuencia validado o, más preferiblemente, el ADN plásmido que alberga la secuencia deseada. El estudio descrito aquí utiliza plásmidos de secuencia validada. - Separar los productos de PCR con electroforesis en gel de agarosa al 1% (utilizando agarosa estándar de grado molecular).
- Impuestos Especiales y purificar los productos de los tamaños esperados (véase la Tabla 2) utilizando un kit de extracción en gel de ADN disponible comercialmente (ver la tabla de materiales para el kit específico utilizado en este protocolo).
- Usar los productos de PCR purificados en gel de la etapa 1.1.4 para generar la superposición e finalproductos XTension (indicadas por A '' - D '' en la Figura 1). Use un cebador sentido específico de gen para el gen de interés / marcador subcelular y el correspondiente cebador antisentido específico de gen para la proteína fluorescente para generar la secuencia quimérica deseada.
Nota: Véase la Tabla 2 para las condiciones de la PCR. Puede ser necesario determinar empíricamente las cantidades óptimas de la primera ronda productos de extensión de solapamiento para añadir a la mezcla de reacción para producir el, quiméricos producto final de longitud completa por PCR. - Separar las de segunda ronda productos OE-PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Impuestos Especiales y purificar los productos usando un kit de extracción en gel de ADN disponible en el mercado.
- Incubar de segunda ronda productos OE-PCR purificados en gel con 1 unidad de Taq ADN polimerasa mezcla maestra durante 10 min a 72 ° C para generar los 3' productos adenilado (es decir, A-tailed) necesarios para clonación TA.
- Ligar los productos resultantes adeniladosen el vector de expresión pIB y usar técnicas de clonación molecular estándar para transformar células de Escherichia coli químicamente competentes (choque térmico) o electrocompetentes (electroporación). Durante la noche de la placa en medio que contiene el marcador de selección apropiado (es decir, la ampicilina o carbenicilina).
- Realizar colonia PCR 12 usando un cebador específico de vector y un cebador específico de inserción para identificar colonias de inserción positiva que han sido transformadas con plásmidos de expresión que alberga un inserto en la orientación 5'-3' . Preparar cultivos de una noche de colonias que generan productos de PCR de los tamaños esperados.
- Aislar el ADN plásmido usando un kit de purificación de ADN disponible en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (véase la Tabla de Materiales para el kit específico utilizado en este protocolo). Validar la integridad de la secuencia de cada inserto mediante secuenciación de ADN directa.
- Para la primera ronda de OE-PCR (indicado por AD y A'-D' en la Figura 1), utilizar una imprimación de genes específicos de sentido (mostrado en negrita en la Tabla 1) y un cebador antisentido quimérico (en cursiva en la Tabla 1) que corresponde al 15 pb final (sin el codón de parada) del gen de interés / marcador subcelular y a 15 pb del extremo 5 'de la proteína fluorescente deseado (EGFP o mCherry) para generar un producto con un saliente 3' .
Nota: Para mantener condiciones estériles, realizar todas las manipulaciones celulares que requieren la abertura del frasco de cultivo de tejidos dentro de una campana de flujo laminar. Encender la lámpara germicida campana UV de flujo laminar al menos 1 h antes de manipulaciones celulares. Use guantes de nitrilo y descontaminar la superficie de la banqueta, pipetas, utensilios, tubos y frascos con 70% de etanol antes de su uso. Familiaridad con las técnicas básicas de cultivo celular se recomienda 13.
- Utilice células TnI (una línea de cultivo celular establecida derivada de Trichoplusia tejido ovárico ni) que están adaptados a medio libre de suero y mantenerlas como un cultivo en monocapa adherente en medio de insecto libre de suero a 28 ° C en matraces de cultivo tisular T25.
- Mantener las células Sf9 (una línea de cultivo celular establecida derivada de Spodoptera frugiperda tejido ovárico) De manera similar pero usando suplemento de medio de cultivo de insecto TNM-FHed con 10% de suero bovino fetal (FBS).
- Sembrar el cultivo inicial de Sf9 congelados o células TNI mediante la eliminación de los viales del stock de -80 ° C y permitiendo que se descongelen en un baño de agua a 37 ° C. Descontaminar los viales con 70% de etanol después de la descongelación y colocarlos en hielo.
- Añadir 4 ml de medio de células de insecto a un nuevo matraz T25 y la transferencia de 1 ml de la suspensión de células de insecto descongelado. Colocar el matraz en un 28 ° C, incubadora no humidificado y permitir que las células se unieran durante 30-45 min.
- Reemplazar el medio de siembra con 5 ml del medio apropiado y transferir los matraces a una incubadora de 28 ° C no humidificado. Monitorear la confluencia celular todos los días. Passage las células cuando alcanzan el 90% de confluencia.
Nota: La cobertura completa del frasco T25 corresponde a ~ 5 x 10 6 células. - Paso célula de insecto.
- Para el paso de las células, eliminar primero el medio agotado de la matraz que contenía células confluentes utilizando una pipeta serológica estéril 5 ml.Incline el frasco de forma que el medio fluye a una esquina, lejos de la monocapa de células. Retirar con cuidado el medio utilizando una pipeta sin perturbar las células.
- Desalojar las células TNI enjuagando suavemente los matraces T25 que contienen el monocapa confluente con 4 ml de medio de insecto libre de suero usando nuevo,, 5 ml pipeta serológica estéril. Mueva la punta de pipeta a través del matraz y lentamente irrigar para eliminar las células poco adheridas a la parte inferior del matraz.
- Compruebe que la separación adecuada de las células mediante la eliminación de todos los medios, al girar el matraz durante, y la observación de que el fondo del matraz está clara.
- Para las células Sf9, que se adhieren más fuertemente, añadir 4 ml de medio fresco TNM-FH y usar un raspador celular para desprender las células unidas. Utilizar una pipeta serológica de 5 ml de mezclar y reducir la formación de grumos de células suavemente.
- Utilice un contador de células automatizado para estimar el número de células de insectos viables por volumen de medio. Transferir 0,1 ml de células mezcla / medio a un 1,5 mLtubo de microcentrífuga. En un tubo de microcentrífuga separado 0,5 ml, añadir 10 l de células mezcla / medio a 10 l de azul de tripano.
- Retirar un cámara de deslizamiento contador de células de su embalaje y añadir 10 l de la / media mezcla azul célula / tripano a cada lado de la corredera de recuento. Insertar la diapositiva en el contador de células y determinar la densidad celular y viabilidad.
- Utilizando la densidad celular, calcular y añadir el volumen apropiado de medio de células de insecto (hasta 5 ml) a nuevos matraces T25 estériles.
- Transferir aproximadamente 1-1,5 x 10 6 células a matraces T25 con medio fresco; etiquetar los frascos con la línea celular, la fecha, medio utilizado, el número de células añadido, y el número de paso (P n + 1 generación, donde P n es el número de paso para la generación anterior de las células); y colocar los matraces en una incubadora a 28 ° para un máximo de 72 h.
Nota: Las células de insecto pueden ser propagadas de forma continua, aunque las células pueden ser menos receptivos a la transfección y / o heterólogaexpresión de la proteína después de 30 pasajes. Tratar a todo el desechado células / media con una solución de lejía al 10% y autoclave artículos de plástico desechable antes de su eliminación.
3. Transfección de células de insectos
- Sembrar un matraz T25 con hasta 1 x 10 6 células TnI o Sf9 en un medio de células de insecto adecuado (medio de insecto libre de suero durante TNI y TNM-FH para Sf9) y crecer hasta la confluencia durante 72 horas a 28 ° C.
- Quitar y desechar el medio viejo y desalojar las células con 4 ml de medio de insecto fresco libre de suero (consulte los pasos 2.6.2 y 2.6.3, más arriba).
- Estimar la densidad de células usando un contador de células automatizado (véase el paso 2.6.4, más arriba).
- Añadir aproximadamente 7 x 10 5 células a platos con fondo de vidrio individuales de 35 mm y permitir que las células se unieran durante 20-25 min a 28 ° C.
- Para cada transfección, añadir 2 g de ADN plásmido (ya sea de un plásmido para las transfecciones simples o 2 g de cada uno de los dos plásmidos para dotransfecciones üble) a 0,1 ml de medio de insecto libre de suero (sin FBS tanto para Sf9 y transfecciones TnI) en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
- En un tubo separado, mezclar 8 l de reactivo de transfección con 0,1 ml de medio de insecto libre de suero y luego transferir esa solución al tubo que contiene el plásmido de ADN de interés. Ligeramente vórtice y se incuba a TA durante 20 - 30 min.
- Diluir la mezcla de plásmido de la transfección de los pasos 3,5 y 3,6 con 0,8 ml de medio de insecto libre de suero de manera que el volumen total es igual a 1 ml.
- Retire cuidadosamente los medios de comunicación de los platos de vidrio que contienen células unidas. Superposición de las células unidas con el medio plásmido-transfección diluida.
- Se incuban las células a 28 ° C durante 5 h.
Nota: Las condiciones para la transfección requieren optimización empírica para la eficacia de transfección máxima (por ejemplo, la transfección durante la noche en lugar de 5 h, la cantidad de ADN plásmido utilizado, la química del reactivo de transfecciónusado, etc.). - Retirar y desechar el medio de transfección y lavar suavemente las células con 1 ml de medio de insecto libre de suero, teniendo cuidado de no desalojar las células.
- Añadir 2 ml de medio de células de insecto fresco (medio de insecto libre de suero durante TNI y TNM-FH para Sf9) y se incuba a 28 ° C durante 48-72 h.
Nota: Una vez más, las condiciones lo requieren optimización empírica para la expresión de proteínas heterólogas máxima.
4. confocal de microscopía de fluorescencia
- En 48-72 h después de la transfección, se lavan las células una vez con 1 ml de IPL-41 medio de insectos y luego cubrir con 2 ml de IPL-41 para formación de imágenes.
Nota: Esta etapa de lavado reduce el fondo auto-fluorescencia observada con medio de célula de insecto usado en el mantenimiento de células normal. - Añadir 4 gotas de reactivo de tinción de células vivas Hoechst (véase la tabla de materiales para la tinción nuclear específico utilizado en este protocolo) al medio y se incuba a 28 ° C durante 20-25 min.
Nota: Nuc adicionalmanchas Lear puede estar sustituido, aunque el colorante debe tener un perfil de fluorescencia única de EGFP y mCherry. - Colocar una placa de 35 mm en el microscopio confocal de barrido láser encerrado en sí mismo (ver la tabla de materiales para el instrumento específico usado en este protocolo).
- Ajuste el microscopio en busca de condiciones de observación Hoechst, EGFP, y mCherry: Hoechst excitación / emisión - 359/461 nm; EGFP excitación / emisión - 489/510 nm; mCherry excitación / emisión - 580/610 nm.
- Realizar una exploración inicial utilizando un objetivo de 10x para confirmar la expresión fluorescente y luego cambiar a modo de exploración usando un objetivo de contraste de la inmersión en agua 60X fase.
- Ajustar la potencia del láser (5-7%), la sensibilidad del detector (47-49%), la velocidad de barrido, la profundidad del eje Z, y zoom digital para optimizar el contraste de imagen y resolución. Imagen de las células en 1,5X zoom digital para dar un total de amplificación de 90X.
Nota: Los parámetros del microscopio requieren un ajuste empírico para una óptimacolección de imágenes y puede ser específico para el instrumento en uso. - Exportar los datos en bruto como archivos de imagen TIFF y modificar (cultivos y la superposición) para la generación de figura.
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Representative Results
OE-PCR
OE-PCR permite la síntesis de los productos de ADN quiméricas que, una vez insertado en un vector de expresión, permitir la producción de proteínas quiméricas recombinantes correspondientes a cualquier gen de prueba de interés y la proteína de marcador fluorescente. La figura 1 representa un esquema general para la producción de vectores de expresión que contienen PIB B. tabaci acuaporina secuencias (BtDrip1 y BtDrip2_v1) en marco de codificación con el fluorescente EGFP marcador de proteína. En este escenario, se produjeron dos proteínas quiméricas que contienen BtDrip EGFP en sus extremos carboxilo. Este protocolo también demostró métodos para el desarrollo de dos proteínas de insecto subcelulares marcadores, DmSPR y PLA2G15 (Figura 1), producido como quimeras con mCherry en sus extremos carboxilo. EGFP y mCherry fueron elegidos porque sus espectros de emisión son suficientemente divergente, lo que permite tél detección independiente y co-localización de las señales de las proteínas de prueba (por ejemplo., BtDrip-EGFP) y el DmSPR- y PLA2G15-mCherry marcado con proteínas marcadoras. Todas las reacciones de PCR produjeron bandas de los tamaños esperados y se clonaron con éxito en pIB. Todos los plásmidos se confirmaron por secuenciación del ADN para contener las inserciones apropiadas en la orientación correcta y en el marco con los marcadores de proteínas fluorescentes.
expresión de la proteína recombinante transitoria en cultivo de células de insectos
Después de la construcción de vectores de expresión correspondientes a PIB / BtDrip1-EGFP, PIB / BtDrip2_v1-EGFP, PIB / DmSPR-mCherry, y pIB / PLA2G15-mCherry, se transfectaron las células y la expresión de proteínas recombinantes en células vivas se visualizó usando fluorescencia confocal microscopía (Figura 2). transfección satisfactoria y expresión de recombinante BtDrip1-EGFP es evidente by la presencia de fluorescencia verde en la superficie de las células TnI (Figura 2B, 2F). La fluorescencia verde se observa dentro de las células transfectadas con TNI BtDrip2_v1-EGFP (Figura 2J, 2 N), lo que indica la expresión intracelular de BtDrip2_v1. Del mismo modo, las células transfectadas con TNI pIB / DmSPR-mCherry (Figura 2C, 2C) o pIB / PLA2G15-mCherry (Figura 2G, 2O) muestran fluorescencia de color rojo, lo que indica la expresión de los respectivos quimeras.
Co-localización de las proteínas recombinantes BtDrip y marcadores subcelulares
La doble transfección de células TNI permite la co-expresión de dos proteínas marcadas con fluorescencia. imágenes superpuestas de células transfectadas TNI que son de color naranja / amarillo indican que las células albergan plásmidos que producen tanto EGFP y mCherry y sugieren que las proteínas se co-localizada dentro de la misma suestructuras bcellular (Figura 2D, 2H, 2L y 2P). Esto confirma resultados anteriores que BtDrip1 y DmSPR se expresan en la superficie celular 14, 15, 16. Una superposición de las células TNI doble transfectadas con pIB / BtDrip1-EGFP y pIB / DmSPR-mCherry muestra la superposición de las señales de fluorescencia verde y rojo (Figura 2D), lo que sugiere co-localización de BtDrip1-EGFP y DmSPR-mCherry en la superficie celular . Anteriormente, Maroniche et al. 17 demostraron que PLA2G15 es un marcador de lisosomas intercelulares cuando se expresa en células Sf9 como una quimera con mCherry. Aunque se predijo que la proteína BtDrip2_v1-EGFP recombinante sería translocarse a la superficie celular, se ha demostrado previamente que la proteína quimérica fue localizada principalmente intracelularmente dentro de las células transfectadas TNI 15. En apoyo de esto, hubo poca EVIDENCE para la co-localización de las señales fluorescentes verdes y rojas cuando BtDrip2_v1-EGFP se co-expresaron con pIB / DmSPR-mCherry (Figura 2 l). Por el contrario, la co-expresión de PIB / BtDrip2_v1-EGFP y pIB / PLA2G15-mCherry resultó en un solapamiento significativo en las señales fluorescentes verdes y rojas citoplasmáticas (Figura 2P), lo que sugiere fuertemente que BtDrip2_v1 es probable que trafica a los lisosomas intracelulares.
Figura 1: Esquema para la construcción construcciones de expresión utilizando extensión de solapamiento PCR (OE-PCR). OE-PCR se utiliza para construir vectores de expresión que contienen PIB de la Bemisia tabaci acuaporina-1 / EGFP (BtDrip1-EGFP), B. tabaci acuaporina-2_variant 1 / EGFP (BtDrip2_v1-EGFP), Drosophila melanogaster receptor del péptido sexo / mCherry (DmSPR- mCherry), y Homo sapiens fosfolipasa-A2 / mCherry(HsPLA2G15-mCherry) los productos. La primera ronda de OE-PCR genera fragmentos correspondientes a los ADNc de longitud completa de interés, BtDrip1 (A), BtDrip2_v1 (B), DmSPR (C), y HsPLA2G15 (D), que contiene una pequeña región de solapamiento 3' correspondiente a la extremo 5 'de cualquiera de la EGFP o mCherry proteínas marcadoras fluorescentes. Simultáneamente, ADNc de longitud completa de EGFP y mCherry se amplifican por PCR y contiene una pequeña zona de solapamiento correspondiente a los extremos 3 'de BtDrip1 (A '5' ), BtDrip2_v1 (B'), DmSPR (C'), o HsPLA2G15 ( D'). Tenga en cuenta que todos los cebadores usados para amplificar el ADNc de interés (es decir BtDrip1, BtDrip2_v1, DmSPR, y HsPLA2G15) en la primera ronda de OE-PCR carecen del codón de parada que normalmente se encuentran en el extremo 3 'de cada secuencia de codificación. Todos de primera ronda productos OE-PCR se amplifican, separadas por electo gel de agarosarophoresis, y se purificó en gel. La segunda ronda de OE-PCR utiliza pares agrupados de los productos de PCR purificados en gel de la primera ronda de OE-PCR como plantillas para la amplificación de los productos quiméricos de longitud completa. Para cada reacción, el cebador con sentido corresponde al extremo 5 'del ADNc de secuencias de codificación de interés y el cebador antisentido es complementaria a la del extremo 3' de EGFP o mCherry, con su codón de parada intacto (A '', B' 'C'' y D ''). Los cuatro de segunda ronda productos OE-PCR se purifican en gel, adenylated con Taq polimerasa, y se ligó en el vector de expresión pIB / V5-His-. Los plásmidos se propagaron en E. coli, y el ADN plasmídico purificado se usa para transfectar células de insecto. El B. tabaci aquaporinas de BtDrip1 y BtDrip2_v1 se muestran en azul oscuro y cian, respectivamente, y los marcadores subcelulares DmSPR y PLA2G15 se muestran en naranja y rosa, respectivamente. EGFP es shpropia en verde y mCherry está en rojo. Flechas coloreadas indican la dirección (cebadores sentido en los cebadores de dirección y antisentido adelante en la dirección inversa) y la ubicación de los cebadores específicos de genes (el color de un cebador indica la fuente de la secuencia del cebador). Ver Tabla 1 para detalles de imprimación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imágenes en vivo de células doble transfectadas que expresan TNI recombinante BtDrip1-EGFP, BtDrip2_v1-EGFP, DmSPR-mCherry, y las proteínas PLA2G15-mCherry. Trichoplusia ni células (TnI) se doble-transfectadas con pIB / BtDrip1-EGFP y pIB / DmSPR-mCherry (AD), PIB / BtDrip1-EGFP y pIB / PLA2G15-mCherry (EH), PIB / BtDrip2_v1-EGFP y pIB / DmSPR -mCherry (<strong> IL), o PIB / BtDrip2_v1-EGFP y pIB / PLA2G15-mCherry (MP). Las imágenes fueron capturadas con un microscopio confocal de barrido láser utilizando un contraste objetivo de inmersión en agua 60X fase (NA 1,2) en 90X amplificación. Los paneles Hoechst muestran imágenes de células vivas representativas de núcleos de células teñidas (ex / em = 359/461 nm). Los paneles EGFP muestran la expresión de fluorescencia de las células transfectadas con las quimeras EGFP (ex / em = 489/510 nm). Los paneles mCherry muestran la expresión de fluorescencia de las células transfectadas con las quimeras mCherry (ex / em = 580/610 nm). El panel de fusión muestra la superposición de los tres canales fluorescentes (es decir, Hoechst, EGFP, y mCherry). Barra de escala = 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Sistemas de expresión de proteínas heterólogas son herramientas importantes para la producción de proteínas recombinantes utilizadas en numerosas aplicaciones aguas abajo 4. La elección de los diversos sistemas de expresión disponibles depende del objetivo final de la proteína de interés. Varios sistemas de expresión de células de insecto están disponibles que ofrecen alternativas flexibles para sistemas de expresión de células procariotas y eucariotas 5, 6. Sistemas de insectos que requieren la infección de baculovirus para dirigir la expresión de proteínas son, de lejos el sistema de insectos más popular y ampliamente utilizado, con muchos de tales proteínas utilizadas en investigación y aplicaciones terapéuticas 1, 2, 3. expresión de Baculovirus, sin embargo, tienen limitaciones, incluyendo que: 1) el ciclo de vida viral implica la lisis de la célula huésped; 2) las células huésped que se lisan típicamente liberan alta amounts de enzimas degradativas; 3) la generación de líneas celulares estables que está consumiendo tiempo y puede no ser factible para las proteínas citotóxicas; 4) la expresión discontinua requiere un mantenimiento frecuente; 5) de generación de vectores frecuentemente requiere múltiples etapas de clonación; 6) las densidades de células de insectos son a menudo inversamente proporcional a la infección viral; y 7) las proteínas recombinantes son objeto de trata principalmente a altos niveles a la superficie celular o se secretan 3, 7, 9, 10. Expresión génica transitoria nonlytic basado en la transfección de células de insecto con ADN de plásmido ofrece una técnica alternativa para la producción de proteínas recombinantes, sin algunos de los desafíos únicos asociados con baculovirus 7, 8. A saber, la expresión transitoria en células de insecto ofrece vuelco más corto en la construcción del vector y la síntesis de proteínas, evita challeng ES asociados con la infección viral y la lisis celular, y proporciona un medio robusto para observar el tráfico celular de las proteínas.
Aquí, se utilizaron dos constructos de expresión validadas para determinar la localización subcelular de la B. tabaci acuaporina proteínas BtDrip1 y BtDrip2_v1. DmSPR-mCherry es un marcador de la membrana celular de plasma 16, y PLA2G15-mCherry localiza dentro de los lisosomas celulares 17. La Figura 2 muestra el valor de dichos marcadores para la evaluación de las ubicaciones de las proteínas de interés, en este caso, la co-localización de BtDrip1-EGFP con DmSPR-mCherry en la superficie celular y BtDrip2_v1-EGFP con PLA2G15-mCherry dentro de los lisosomas. Por lo tanto, como se muestra aquí y en las investigaciones anteriores 14, 15, 16, 18, 19,culo = "xref"> 20, esta metodología se puede utilizar para determinar rápidamente el tráfico de proteínas dentro de las células de insectos. Aunque la expresión de proteína y el tráfico dentro de las células TNI se muestra aquí (Figura 2), es importante tener en cuenta que el protocolo se puede optimizar y se aplica igualmente bien a otras líneas de células de insecto (Sf9, Sf21, BM-N, S2, etc.) .
Como todos los sistemas de expresión de proteínas heterólogas, hay limitaciones a la producción de proteína transitoria dentro de células de insecto cultivadas. A saber, el porcentaje de células positivas para la expresión plásmido derivado es típicamente menor que la conseguida a partir de baculovirus o del uso de líneas celulares estables. Por lo tanto, la cantidad de proteína recombinante (s) producido puede ser menor en un sistema transitorio; sin embargo, el uso de diferentes promotores y la incorporación de potenciadores genéticos pueden superar esta limitación potencial 7, 21, 22. Tsu protocolo demuestra la co-transfección de células TNI con dos vectores de PIB, cada uno alberga diferente codificante de la proteína secuencias (Figura 2). Aunque se observaron eficiencias de transfección similares para los cuatro vectores de expresión utilizados para transfectar las células TnI (datos no mostrados), esto no siempre es posible. Por lo tanto, los experimentos con tales vectores de expresión transitoria pueden requerir amplia optimización empírica (por ejemplo, la variación en la cantidad de cada vector, el tiempo de la transfección, la química reactivo de transfección, etc.) para lograr la eficiencia y / o niveles de expresión de la proteína recombinante de transfección equivalentes. Además, es posible que la adición de una proteína fluorescente puede influir o restringir el tráfico subcelular de la proteína se dirige a 23, 24. La identificación de la subcelular co-localización de dos proteínas por la observación de la fluorescencia con proteínas marcadoras no necessarilY indican interacciones proteína-proteína directas entre las proteínas de interés 24, 25. Por lo tanto, se requiere precaución en la interpretación de tales resultados co-localización.
la expresión génica transitoria sí ofrece varias ventajas sobre los sistemas de expresión de baculovirus disponibles en la actualidad. La expresión transitoria requiere menos tiempo y mano de obra para la construcción de vectores y para la síntesis de proteínas recombinantes, la expresión transitoria no implica la lisis celular asociada con el ciclo de vida patógena de baculovirus, y la expresión transitoria puede proporcionar un mejor sistema de estudio para el tráfico subcelular de proteínas 3, 7, 9. Este protocolo destaca la facilidad y velocidad de construcciones de edificio a través de la incorporación directa de un gen de interés en el vector de expresión pIB usando PCR de extensión por solapamiento (Figura 1 26. Además, aunque EGFP 27 y mCherry 28 fueron incorporadas aquí en los extremos carboxilo de dos proteínas de acuaporina B. tabaci, OE-PCR también podría ser usado para colocar muchas otras proteínas variante marcador fluorescente 26 en los extremos terminales amino de estas proteínas. Es notable que, además de numerosos plásmidos de expresión construidos usando OE-PCR, muchos de clonación de expresión cassettes tradicionales se prepararon y se pueden utilizar para producir virtualmente cualquier proteína de interés en el marco con las proteínas fluorescentes EGFP, Venus, y mCherry, fusionados en el extremo amino o extremos terminales. Tales casetes de expresión están disponibles bajo petición.
La era de la genómica "" ha proporcionado un volumen sin precedentes de y el acceso a d significativaATA. Sin embargo, la brecha sigue aumentando entre el descubrimiento de genes y la asignación de función para productos génicos; por lo tanto, las herramientas empíricas adicionales se necesitan desesperadamente para acelerar la genómica funcional. Considerando que, gen de edición y otros sistemas de manipulación de genes in vivo en última instancia, puede proporcionar enfoques por excelencia para la asignación de la función génica, los sistemas de expresión de proteínas heterólogas es probable que siguen siendo importantes para la biomanufacture de proteínas valiosas y para descifrar la estructura y función de proteínas. Este protocolo describe un método para la construcción mejorada de plásmidos de expresión y la expresión transitoria de proteínas recombinantes en células de insecto.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a Lynn Forlow-Jech y Dannialle LeRoy para la asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la financiación CRIS base para USDA ARS, Programa Nacional 304 - Protección de las plantas y de cuarentena [Proyecto # 2020-22620-022-00D] para JAF y JJH La mención de marcas o productos comerciales en este artículo es el único fin de proporcionar información específica y no implica recomendación ni aprobación por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos. USDA es un proveedor y empleador que ofrece igualdad de oportunidades.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
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