Summary
Les systèmes d'expression de cellules d'insecte non lytique sont sous-utilisées pour la production, le trafic / la localisation cellulaire, la protéine recombinante et l'analyse fonctionnelle. Nous décrivons ici les méthodes pour générer des vecteurs d'expression et l'expression des protéines transitoire suivante dans des lignées cellulaires lépidoptères disponibles dans le commerce. La co-localisation de Bemisia tabaci aquaporines avec des protéines de marqueur fluorescent subcellulaires est également présenté.
Abstract
Les systèmes d'expression de protéines hétérologues sont utilisées pour la production de protéines recombinantes, l'interprétation de trafic / localisation cellulaire, et la détermination de la fonction biochimique de protéines au niveau de la sous-organismal. Bien que les systèmes d'expression de Baculovirus sont de plus en plus utilisés pour la production de protéines dans de nombreuses applications biotechnologiques, pharmaceutiques et industriels, systèmes non lytique qui ne nécessitent pas l'infection virale ont des avantages évidents mais sont souvent négligés et sous-utilisés. Nous décrivons ici une méthode pour générer des vecteurs d'expression et non lytique expression de protéine recombinante transitoire. Ce protocole permet la localisation cellulaire efficace des protéines recombinantes et peuvent être utilisées pour discerner rapidement le trafic de protéines dans la cellule. Nous montrons l'expression de quatre protéines recombinantes dans une lignée de cellules d' insectes disponibles dans le commerce, y compris deux protéines aquaporines de la tabaci Bemisia insectes, ainsicomme protéines marqueurs subcellulaires spécifiques de la membrane plasmique de la cellule et pour les lysosomes intracellulaires. Toutes les protéines recombinantes ont été produites comme des chimères avec des marqueurs protéiques fluorescents à leur extrémité carboxyle, qui permet la détection directe des protéines recombinantes. La double transfection des cellules avec des plasmides hébergeant des constructions de gènes d'intérêt et un marqueur subcellulaire connu permet d'imagerie des cellules vivantes et l'amélioration de la validation de la localisation des protéines cellulaires.
Introduction
La production de protéines recombinantes en utilisant des systèmes d'expression de cellules d'insectes offre de nombreux avantages pour l'étude des protéines eucaryotes. A savoir, des cellules d' insectes possèdent des modifications post-traductionnelles similaires, de traitement et de tri des mécanismes que ceux présents dans les cellules de mammifères, ce qui est avantageux pour produire des protéines correctement repliées 1, 2, 3. Les systèmes de cellules d' insectes aussi nécessitent généralement moins de ressources et moins de temps et d' efforts pour l' entretien de lignées cellulaires de mammifères 4, 5. Le système d'expression baculoviral est un tel système à base de cellules d'insectes qui est maintenant largement utilisé dans de nombreuses disciplines, y compris la production de protéines recombinantes pour la caractérisation des protéines et de la thérapeutique, la présentation immunogène de peptides étrangers et des protéines virales pour la production de vaccins, la synthèse de plusieurs complexes-protéine, La production de protéines glycosylées, etc. 1, 2, 4, 6. Il existe cependant des situations dans lesquelles l' expression baculoviral peuvent ne pas être applicable 3, 7, et l'utilisation de systèmes d'expression d'insectes non lytique et transitoires peuvent être plus appropriés. Plus précisément, l' expression de cellules d'insecte transitoire offre la possibilité pour la synthèse rapide de protéine recombinante, nécessite moins de développement et de maintenance, ne concerne pas la lyse cellulaire imposée-virale, et fournit un moyen de mieux étudier le trafic cellulaire au cours de la synthèse des protéines 7, 8, 9, 10.
Ce protocole décrit la génération rapide de vecteurs d'expression en utilisant deux étapes extension de chevauchement PCR (OE-PCR) Escherichia coli. Les plasmides sont utilisés pour transfecter des cellules double d'insecte cultivées et disponibles dans le commerce pour produire des protéines représentatives. Le protocole décrit la production et l' utilisation de deux différentes protéines marqueurs subcellulaire marquées par fluorescence et montre une colocalisation avec deux protéines d'aquaporines du Bemisia tabaci insecte. Le protocole qui suit présente la méthode de base pour OE-PCR, l'entretien de cellules d'insectes et la transfection, et la microscopie à fluorescence pour la localisation cellulaire des protéines cibles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. OE-PCR pour la construction de Plasmides d'expression
Note: Voir le tableau 1 pour toutes les amorces utilisées dans OE-PCR. L'utilisation d'une ADN polymérase haute fidélité est recommandée pour tous les amplifications. Cependant, parce que ces enzymes fréquemment ne laissent pas de 3' A, il est nécessaire d'effectuer une brève incubation non-amplification avec une ADN-polymérase Taq à « A-tail » Les produits de PCR avant de les cloner dans une expression de cellules d'insecte TA vecteur. Ce protocole illustre une méthode pour générer des plasmides d'expression d' insecte abritant des protéines chimères, les protéines fluorescentes fusionnées dans le cadre à l'extrémité carboxy - terminale des gènes d'intérêt (dans ce cas, deux Bemisia tabaci protéines aquaporine) ou de protéines marqueurs subcellulaires (Figure 1).
- Utilisation OE-PCR, qui se compose de deux tours indépendantes d'amplification, pour produire: (1) les séquences codant pour les gènes d'intérêt (B. tabaciaquaporine 1: BtDrip1; B. tabaci aquaporine 2: BtDrip2_v1) fusionnée dans le cadre avec un variant de la protéine fluorescente verte appelée EGFP ou (2) les marqueurs subcellulaires (récepteur du peptide de sexe Drosophila melanogaster: DmSPR; Homo sapiens phospholipase A2: HsPLA2) avec la séquence codant pour mCherry. Directement ligaturer les produits finaux OE-PCR dans le pib / plasmide V5-His-TA.
- Pour le premier tour de OE-PCR (indiqué par la MA et A'-D » sur la figure 1), utiliser une amorce sens spécifique du gène (en gras dans le tableau 1) et une amorce antisens chimérique ( en italique dans le tableau 1) correspondant le 15 pb final (sans le codon d'arrêt) du gène de marqueur d'intérêt / subcellulaire et de 15 pb de l'extrémité 5 'du afin de générer un produit avec un surplomb en 3' protéine fluorescente souhaitée (EGFP ou mCherry).
Note: Voir le tableau 2 pour les conditions de PCR. - Dans un tube séparé, en utilisant un gène spécifamorce antisens de la protéine fluorescente ic (représenté avec un trait de soulignement dans le tableau 1) et une amorce sens chimère qui contient 15 pb de l'extrémité 3 'du gène de marqueur d'intérêt / subcellulaire et 15 pb de l'extrémité 5 ' de la fluorescence souhaitée protéine pour générer un produit avec un surplomb 5' .
Note: Voir le tableau 2 pour les conditions de PCR. La matrice de PCR peut être soit un produit de PCR de la séquence validée ou, de l'ADN de manière davantage préférée, le plasmide portant la séquence souhaitée. L'étude décrit ici utilise des plasmides validés séquence. - Séparer les produits de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose à 1% d'agarose (en utilisant la norme de qualité moléculaire).
- Accise et purifier les produits des tailles attendues (voir Tableau 2) en utilisant un kit d'extraction de gel d'ADN disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux pour le kit spécifique utilisé dans ce protocole).
- Utilisation des produits de PCR purifiés sur gel provenant de l'étape 1.1.4 pour générer le chevauchement finale eproduits XTension (indiqué par A '' - D '' sur la figure 1). Utiliser une amorce sens spécifique du gène pour le gène d'intérêt / marqueur subcellulaire et l'amorce anti-sens spécifique du gène correspondant à la protéine fluorescente pour générer la séquence chimère souhaitée.
Note: Voir le tableau 2 pour les conditions de PCR. Il peut être nécessaire de déterminer de façon empirique les quantités optimales de produits d'extension de chevauchement du premier tour à ajouter au mélange réactionnel pour obtenir le dernier, de pleine longueur produit de PCR chimère. - Séparer les produits de second tour OE-PCR par électrophorèse sur 1% d'agarose gel. Accise et purifier les produits en utilisant un kit d'extraction de gel d'ADN disponible dans le commerce.
- Incuber purifiés sur gel des produits de second tour OE-PCR avec une unité de mélange maître de l' ADN polymerase Taq pendant 10 min à 72 ° C pour produire les produits 3' polyadénylé (c. - A-tailed) nécessaires pour le clonage TA.
- Ligaturer les produits résultant adénylédans le vecteur d'expression FRP et en utilisant des techniques classiques de clonage moléculaire pour transformer chimiquement compétentes (choc thermique) ou électrocompétentes (électroporation) des cellules Escherichia coli. Pendant une nuit à plaques sur un milieu contenant le marqueur de sélection approprié ( par exemple, l' ampicilline ou à la carbénicilline).
- Effectuer colonie PCR 12 utilisant une amorce spécifique de vecteur et une amorce spécifique à l' insert pour identifier les colonies d'insertion positives qui ont été transformées avec des plasmides d'expression abritant un insert dans l'orientation 5'-3 ' . Préparer les cultures des colonies de nuit générant des produits de PCR des tailles attendues.
- Isoler l' ADN de plasmide en utilisant un kit de purification d'ADN disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux pour le kit spécifique utilisé dans ce protocole). Valider l'intégrité de la séquence de chaque insert par séquençage d'ADN direct.
- Pour le premier tour de OE-PCR (indiqué par la MA et A'-D » sur la figure 1), utiliser une amorce sens spécifique du gène (en gras dans le tableau 1) et une amorce antisens chimérique ( en italique dans le tableau 1) correspondant le 15 pb final (sans le codon d'arrêt) du gène de marqueur d'intérêt / subcellulaire et de 15 pb de l'extrémité 5 'du afin de générer un produit avec un surplomb en 3' protéine fluorescente souhaitée (EGFP ou mCherry).
Remarque: Pour maintenir des conditions stériles, effectuer toutes les manipulations cellulaires nécessitant l'ouverture du flacon de culture de tissu dans une hotte à flux laminaire. Allumer la hotte à flux laminaire lampe UV germicide au moins 1 h avant manipulations cellulaires. Porter des gants en nitrile et décontaminer la surface du banc, des pipettes, des ustensiles, des tubes et des flacons avec 70% d'éthanol avant leur utilisation. La connaissance des techniques de culture cellulaire de base est recommandé 13.
- Utiliser des cellules TNI (e de la ligne de culture cellulaire établie dérivée de tissu ovarien Trichoplusia ni) qui sont adaptées à un milieu sans sérum et les conserver en tant que culture en monocouche adhérente en milieu insecte dépourvu de sérum à 28 ° C dans des flacons de culture de tissu T25.
- Maintenir les cellules Sf9 (une lignée de culture cellulaire établie dérivée de Spodoptera frugiperda tissu ovarien) De même , mais en utilisant la culture d'insecte TNM-FH supplément de milieued avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS).
- Semences de la culture initiale de Sf9 congelés ou des cellules TNI en enlevant des flacons stock de -80 ° C et en leur permettant de dégeler dans un bain d'eau à 37 ° C. Décontaminer les flacons avec 70% d'éthanol après décongélation et placez-les sur la glace.
- Ajouter 4 ml de milieu de cellules d'insecte à un nouveau flacon T25 et le transfert de 1 ml de la suspension de cellules d'insecte décongelé. Placer le ballon dans un 28 ° C, incubateur non humidifiée et permettent aux cellules de se fixer pendant 30-45 min.
- Remplacer le milieu d'ensemencement avec 5 ml du milieu approprié et transférer les flacons à un 28 ° C incubateur non humidifié. Surveiller la confluence des cellules par jour. Passage des cellules quand ils atteignent 90% de confluence.
Remarque: la couverture complète du flacon T25 correspond à environ 5 x 10 6 cellules. - Passage de cellules d' insecte.
- Pour le passage des cellules, d'abord éliminer le milieu épuisé du flacon contenant des cellules confluentes en utilisant une pipette sérologique de 5 ml stérile.Incliner le flacon de sorte que le milieu circule dans un coin, à l'écart de la monocouche cellulaire. Retirez délicatement le milieu à l'aide d'une pipette sans perturber les cellules.
- Déloger les cellules TNI en rinçant doucement les flacons T25 contenant la monocouche confluente avec 4 ml de milieu d'insecte dépourvu de sérum en utilisant de nouveau, stérile, 5 mL pipette sérologique. Déplacez la pointe de la pipette dans le flacon et l'irrigation lentement pour éliminer les cellules lâchement au fond du flacon.
- Vérifiez que le détachement adéquat de cellules en supprimant tous les médias, en tournant le ballon sur, et en observant que le fond du flacon est clair.
- Pour les cellules Sf9, qui adhèrent plus étroitement, ajouter 4 ml de milieu frais TNM-FH et utiliser un grattoir cellulaire pour déloger les cellules attachées. Utiliser une pipette sérologique 5 ml à mélanger délicatement et réduire agglomérante cellulaire.
- Utiliser un compteur de cellules automatisé pour estimer le nombre de cellules d'insectes viables par volume de milieu. Transférer 0,1 ml de mélange de cellules / milieu à 1,5 mlle tube microfuge. Dans un tube de 0,5 ml de microcentrifugation séparé, ajouter 10 ul de mélange de cellules / milieu de 10 pi de bleu trypan.
- Retirer une lame de chambre de compteur de cellules de son emballage et ajouter 10 ul de la cellule / support / mélange de bleu trypan à chaque côté de la lame de comptage. Insérer la diapositive dans le compteur de cellule et déterminer la densité de cellules et la viabilité.
- En utilisant la densité cellulaire, calculer et ajouter le volume approprié de milieu de cellules d'insectes (jusqu'à 5 ml) à de nouveaux flacons T25 stériles.
- Transférer environ 1 à 1,5 x 10 6 cellules dans des flacons T25 avec du milieu frais; étiqueter les flacons avec la lignée cellulaire, la date, le milieu utilisé, le nombre de cellules ajoutées, et le numéro de passage (P n + 1 de génération, où P n est le nombre de passage pour la génération précédente de cellules); et placer les flacons dans un incubateur à 28 ° C pendant jusqu'à 72 h.
Remarque: Les cellules d'insectes peuvent être propagées de façon continue, bien que les cellules peuvent être moins réceptifs à la transfection et / ou hétérologueexpression de la protéine après 30 passages. Traiter toutes les cellules mis au rebut / support avec une solution d'eau de Javel à 10% et autoclave articles en plastique jetable avant d'être éliminés.
3. Transfection cellulaire d'insecte
- Ensemencer un flacon T25 avec un maximum de 1 x 10 6 TNI ou des cellules Sf9 dans un milieu de cellules d'insecte approprié (milieu insecte dépourvu de sérum pour Tni et TNM-FH de Sf9) et de croître jusqu'à confluence pendant 72 heures à 28 ° C.
- Retirez et jetez l'ancien milieu et déloge les cellules avec 4 ml de milieu d'insectes sans sérum frais (voir les étapes 2.6.2 et 2.6.3, ci-dessus).
- Estimer la densité cellulaire en utilisant un compteur de cellules automatisé (voir l'étape 2.6.4, ci-dessus).
- Ajouter environ 7 x 10 5 cellules à des boîtes individuelles à fond de verre de 35 mm et laisser les cellules se fixer pendant 20 à 25 min à 28 ° C.
- Pour chaque transfection, on ajoute 2 pg d'ADN de plasmide (soit à partir d'un plasmide unique ou pour des transfections 2 pg de chacun des deux plasmides pour dotransfections üble) à 0,1 ml de milieu d'insecte dépourvu de sérum (sans FBS pour les deux transfections Sf9 et TNI) dans un tube de 1,5 ml de microcentrifugation stérile.
- Dans un tube séparé, mélanger 8 pi de réactif de transfection avec 0,1 ml de milieu d'insecte dépourvu de sérum, puis transférer cette solution dans le tube contenant l'ADN plasmidique d'intérêt. vortex légèrement et incuber à température ambiante pendant 20 - 30 min.
- On dilue le mélange plasmide-transfection des étapes 3,5 et 3,6 avec 0,8 ml de milieu d'insecte dépourvu de sérum de sorte que le volume total est égal à 1 mL.
- Retirez délicatement les médias de la vaisselle en verre contenant des cellules attachées. Superposer les cellules fixées avec le milieu plasmide-transfection diluée.
- Incuber les cellules à 28 ° C pendant 5 h.
Remarque: Les conditions de transfection nécessitent une optimisation empirique pour une efficacité maximale de transfection (par exemple, la transfection pendant la nuit au lieu de 5 h, la quantité d'ADN de plasmide utilisé, la chimie du réactif de transfectionutilisé, etc.). - Enlever et jeter le milieu de transfection et doucement laver les cellules avec 1 ml de milieu d'insecte dépourvu de sérum, en faisant attention à ne pas déloger les cellules.
- Ajouter 2 mL de milieu de cellules d'insecte frais (milieu insecte dépourvu de sérum pour Tni et TNM-FH de Sf9) et incuber à 28 ° C pendant 48-72 h.
Remarque: Encore une fois, les conditions exigent une optimisation empirique pour l'expression de la protéine hétérologue maximale.
4. confocale Microscopie Fluorescence
- A 48-72 h après la transfection, laver les cellules une fois avec 1 ml de milieu d'insecte IPL-41, puis couvrir avec 2 ml d'IPL-41 pour l'imagerie.
Note: Cette étape de lavage réduit l'auto-fluorescence de fond observée avec un milieu de cellules d'insectes utilisés dans l'entretien des cellules normales. - Ajouter 4 gouttes de réactif de coloration Hoechst direct des cellules (voir la table des matières pour la coloration nucléaire spécifique utilisé dans ce protocole) au milieu et incuber à 28 ° C pendant 20 à 25 min.
Note: NUC supplémentairesles taches Lear peut être substitué, bien que le colorant doit avoir un profil de fluorescence unique à partir de EGFP et mCherry. - Placer une boîte de 35 mm dans le microscope confocal à balayage laser fermée auto-(voir la table des matières de l'appareil spécifique utilisé dans ce protocole).
- Ajuster le microscope pour Hoechst, EGFP, et les conditions d'observation mCherry: Hoechst excitation / émission - 359/461 nm; EGFP excitation / émission - 489/510 nm; excitation mCherry / émission - 580/610 nm.
- Effectuer une analyse initiale en utilisant un objectif 10x pour confirmer l'expression fluorescent, puis passer au mode de balayage en utilisant un objectif d'immersion dans l'eau de contraste de phase 60X.
- Régler la puissance du laser (5-7%), de la sensibilité du détecteur (47-49%), la vitesse de balayage, la profondeur de l'axe Z, et le zoom numérique pour optimiser le contraste de l'image et la résolution. Imager les cellules à zoom 1,5x numérique pour donner un total d'amplification 90X.
Remarque: Les paramètres de microscope nécessitent un réglage optimal empiriquecollection d'images et peut être spécifique à l'instrument utilisé. - Exporter les données brutes sous forme de fichiers d'images TIFF et modifier (culture et overlay) pour la production de la figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OE-PCR
OE-PCR permet la synthèse de produits d'ADN chimères qui, une fois inséré dans un vecteur d'expression, de permettre la production de protéines chimères recombinantes correspondant à un gène de test d'intérêt et de la protéine marqueur fluorescent. La figure 1 représente un schéma général pour la production de vecteurs d'expression contenant FRP B. tabaci séquences codant pour l' aquaporine (BtDrip1 et BtDrip2_v1) dans le cadre avec le marqueur de protéine fluorescente EGFP. Dans ce scénario, deux protéines chimères BtDrip contenant EGFP à leurs extrémités carboxyle ont été produits. Ce protocole a également démontré des procédés pour le développement de deux protéines marqueurs subcellulaires insectes, DmSPR et PLA2G15 (figure 1), produites en tant que chimères avec mCherry à leur extrémité carboxyle. EGFP et mCherry ont été choisis parce que leurs spectres d'émission sont suffisamment divergentes, ce qui permet de til détection indépendante et la co-localisation des signaux provenant des protéines d'essai (par ex., BtDrip-EGFP) et les protéines de marquage marqué PLA2G15-mCherry DmSPR- et. Toutes les réactions PCR produit des bandes de tailles attendues et ont été clonés avec succès dans pib. Tous les plasmides ont été confirmés par séquençage d'ADN pour contenir les inserts appropriés dans l'orientation correcte et dans le cadre avec des marqueurs protéiques fluorescents.
l'expression transitoire de la protéine recombinante dans une culture de cellules d'insecte
Après la construction de vecteurs d'expression correspondant à FRP / BtDrip1-EGFP, PIB / BtDrip2_v1-EGFP, PIB / DmSPR-mCherry et FRP / PLA2G15-mCherry, les cellules ont été transfectées et l'expression de protéines recombinantes dans des cellules vivantes a été visualisée en utilisant la fluorescence confocale microscopie (Figure 2). Une transfection réussie et l'expression de recombinant BtDrip1-EGFP est évident by la présence de fluorescence verte sur la surface des cellules TNI (figure 2B, 2F). La fluorescence verte est observée dans les cellules transfectées avec TNI BtDrip2_v1-EGFP (Figure 2J, 2N), ce qui indique l'expression intracellulaire de BtDrip2_v1. De même, les cellules transfectées avec TNI FRP / DmSPR-mCherry (Figure 2C, 2K) ou FRP / PLA2G15-mCherry (figure 2G, 2O) montrent une fluorescence rouge, indiquant l'expression des chimères respectives.
Co-localisation des protéines recombinantes et des marqueurs BtDrip subcellulaires
La double transfection de cellules TNI permet la co-expression de deux protéines à marquage fluorescent. images de cellules OVERLAID TNI transfectées qui sont orange / jaune indiquent que les cellules abritent des plasmides produisant à la fois EGFP et mCherry et suggèrent que les protéines sont co-localisés dans le même sustructures bcellular (Figure 2D, 2H, 2L & 2P). Cela confirme les résultats précédents que BtDrip1 et DmSPR sont exprimés sur la surface cellulaire 14, 15, 16. Une superposition de cellules TNI double transfectées avec FRP / BtDrip1-EGFP et FRP / DmSPR-mCherry montre le chevauchement des signaux de fluorescence verte et rouge (Figure 2D), ce qui suggère la co-localisation de BtDrip1-EGFP et DmSPR-mCherry sur la surface cellulaire . Auparavant, Maroniche et al. 17 démontré que PLA2G15 est un marqueur des lysosomes intracellulaires lorsqu'elle est exprimée dans des cellules Sf9 comme une chimère avec mCherry. Bien qu'il ait été prédit que la protéine recombinante BtDrip2_v1-EGFP serait translocation à la surface cellulaire, il a été précédemment montré que la protéine chimérique est principalement localisée au niveau intracellulaire dans les cellules transfectées 15 TNI. À l'appui de cela, il y avait peu preurence pour la co-localisation de signaux de fluorescence verte et rouge lorsque BtDrip2_v1-EGFP a été co-exprimée avec FRP / DmSPR-mCherry (Figure 2L). En revanche, la co-expression de FRP / BtDrip2_v1-EGFP et FRP / PLA2G15-mCherry a donné lieu à un chevauchement significatif dans les signaux de fluorescence verte et rouge cytoplasmiques (Figure 2P), suggérant fortement que BtDrip2_v1 est probablement un trafic vers les lysosomes intracellulaires.
Figure 1: Schéma de Constructs d'expression bâtiment à l' aide Overlap PCR extension (OE-PCR). OE-PCR est utilisé pour construire des vecteurs d'expression FRP contenant le Bemisia tabaci aquaporine-1 / EGFP (BtDrip1-EGFP), B. tabaci aquaporine-2_variant 1 / EGFP (BtDrip2_v1-EGFP), le récepteur du peptide de sexe Drosophila melanogaster / mCherry (DmSPR- mCherry) et Homo sapiens phospholipase-A2 / mCherryproduits (HsPLA2G15-mCherry). La première série de OE-PCR génère des fragments correspondant aux ADNc complets d'intérêt, BtDrip1 (A), BtDrip2_v1 (B), DmSPR (C), et HsPLA2G15 (D), contenant une petite zone de chevauchement 3' correspondant à la extrémité 5 'de l'une ou l'autre des protéines marqueurs fluorescents EGFP ou mCherry. En même temps, des ADNc de pleine longueur à partir de l' EGFP et mCherry sont amplifiés par PCR et contient une petite zone de chevauchement correspondant aux extrémités 3 'des BtDrip1 (A '5' ), BtDrip2_v1 (B'), DmSPR (C »), ou HsPLA2G15 ( D »). Notez que toutes les amorces utilisées pour amplifier l'ADNc d'intérêt ( à savoir BtDrip1, BtDrip2_v1, DmSPR et HsPLA2G15) dans le premier tour de OE-PCR manque le codon d'arrêt qui se trouvent normalement à l'extrémité 3 'de chaque séquence codante. Tous les produits de première ronde OE-PCR sont amplifiés, séparés par élue sur gel d'agaroserophoresis, et purifié sur gel. Le second tour de OE-PCR utilise des paires mises en commun des produits de PCR purifiés sur gel à partir de la première série de OE-PCR comme matrices pour l'amplification de la pleine longueur des produits chimères. Pour chaque réaction, l'amorce sens correspond à l'extrémité 5 ' de l'ADNc de séquences codantes d'intérêt et l'amorce antisens est complémentaire de l'extrémité 3' de la EGFP ou mCherry, avec son codon d' arrêt intact (A « », B » 'C' » et D ''). Les quatre produits de second tour OE-PCR sont purifiés sur gel, polyadénylé avec la polymerase Taq, et ligaturé dans le PIB / V5-His vecteur d'expression. Les plasmides sont propagés dans E. coli, et l' ADN de plasmide purifié est utilisé pour transfecter des cellules d' insectes. B. tabaci aquaporines BtDrip1 et BtDrip2_v1 sont en bleu foncé et cyan, respectivement, et les marqueurs subcellulaires DmSPR et PLA2G15 sont en orange et rose, respectivement. EGFP est shpropre en vert et mCherry est en rouge. flèches de couleur indiquent la direction (des amorces sens dans le sens avant et les amorces anti-sens dans le sens inverse) et l'emplacement des amorces spécifiques de gènes (la couleur d'une amorce indique la source de la séquence d'amorce). Voir le tableau 1 pour plus de détails d'amorce. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Imagerie en direct de cellules TNI Double-transfectées recombinant Exprimant BtDrip1-EGFP, BtDrip2_v1-EGFP, DmSPR-mCherry et protéines PLA2G15-mCherry. Trichoplusia ni cellules (TNI) sont à double transfectée avec FRP / BtDrip1-EGFP et FRP / DmSPR-mCherry (AD), PIB / BtDrip1-EGFP et FRP / PLA2G15-mCherry (EH), PIB / BtDrip2_v1-EGFP et FRP / DmSPR -mCherry (<strong> IL), ou FRP / BtDrip2_v1-EGFP et FRP / PLA2G15-mCherry (MP). Les images ont été capturées avec un microscope confocal à balayage laser en utilisant un objectif d'immersion dans l'eau de contraste de phase 60X (NA 1,2) à 90X amplification. Les panneaux Hoechst montrent des images de cellules vivantes représentatives des noyaux cellulaires colorés (ex / em = 359/461 nm). Les panneaux EGFP montrent l'expression de fluorescence des cellules transfectées avec EGFP (chimères ex / em = 489/510 nm). Les panneaux mCherry montrent l'expression de fluorescence des cellules transfectées avec (ex mCherry chimères / em = 580/610 nm). Le panneau de fusion montre la superposition des trois canaux fluorescents (c. -à- Hoechst, EGFP et mCherry). Barre d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Systèmes d'expression de protéines hétérologues sont des outils importants pour la production de protéines recombinantes utilisées dans de nombreuses applications en aval 4. Le choix des divers systèmes d'expression disponibles dépend de l'objectif final de la protéine d'intérêt. Plusieurs systèmes d'expression de cellules d' insectes sont disponibles qui offrent des alternatives flexibles aux systèmes d'expression de cellules procaryotes et eucaryotes 5, 6. Les systèmes d' insectes nécessitant une infection baculoviral pour conduire l' expression des protéines sont de loin le plus populaire et largement utilisé système d'insecte, avec beaucoup de ces protéines utilisées dans la recherche et les applications thérapeutiques 1, 2, 3. expression baculoviral ne, cependant des limitations, y compris: 1) le cycle de vie virale implique la lyse de la cellule hôte; 2) les cellules hôtes qui sont lysées typiquement libèrent haute amounts d'enzymes de dégradation; 3) la génération de lignées cellulaires stables prend du temps et peut ne pas être réalisable pour des protéines cytotoxiques; 4) l'expression discontinue nécessite un entretien fréquent; 5) génération de vecteurs nécessite souvent de multiples étapes de clonage; 6) des densités de cellules d'insecte sont souvent inversement proportionnelle à une infection virale; et 7) les protéines recombinantes sont principalement la traite à des niveaux élevés à la surface cellulaire ou sont sécrétées 3, 7, 9, 10. Non lytique expression transitoire de gènes basé sur la transfection de cellules d' insecte avec de l' ADN plasmidique propose une autre technique pour la production de protéines recombinantes, sans certains des défis uniques associés à des baculovirus 7, 8. A savoir, l'expression de cellules d'insecte transitoire offre construction retournement sur le vecteur plus court et la synthèse des protéines, évite Challeng es associés à une infection virale et la lyse cellulaire, et fournit un moyen robuste pour observer le trafic cellulaire des protéines.
Ici, deux constructions d'expression validées ont été utilisés pour déterminer la localisation subcellulaire des protéines de B. tabaci aquaporine BtDrip1 et BtDrip2_v1. DmSPR-mCherry est un marqueur de la membrane cellulaire plasmatique 16 et PLA2G15-mCherry se localise à l'intérieur des lysosomes cellulaires 17. La figure 2 représente la valeur de ces marqueurs pour l' évaluation de l'emplacement des protéines d'intérêt, dans ce cas, la co-localisation de BtDrip1-EGFP avec DmSPR-mCherry à la surface cellulaire et BtDrip2_v1-EGFP avec PLA2G15-mCherry à l'intérieur des lysosomes. Par conséquent, comme indiqué ici et dans les enquêtes précédentes 14, 15, 16, 18, 19,ass = « xref »> 20, cette méthodologie peut être utilisée pour déterminer rapidement le trafic de protéines dans des cellules d'insecte. Bien que l' expression de la protéine et le trafic dans les cellules TNI est signalée ici (figure 2), il est important de noter que le protocole peut être optimisé et appliqué aussi bien à d' autres lignées de cellules d' insectes (Sf9, Sf21, BM-N, S2, etc.) .
Comme tous les systèmes d'expression de protéines hétérologues, il y a des limites à la production de protéines transitoire dans les cellules d'insectes en culture. A savoir, le pourcentage de cellules positives pour l'expression dérivé d'un plasmide est généralement inférieure à celle obtenue à partir de baculovirus ou d'utiliser des lignées cellulaires stables. Ainsi, la quantité de protéine recombinante (s) produite peut être plus faible dans un système transitoire; Cependant, l'utilisation de différents promoteurs et l'incorporation d'amplificateurs génétiques peuvent surmonter cette limitation potentielle 7, 21, 22. Tson protocole démontre la co-transfection de cellules avec deux vecteurs TNI FRP, chacun hébergeant des séquences codant pour la protéine (figure 2). Bien que l'efficacité de transfection similaires ont été observés pour les quatre vecteurs d'expression utilisés pour transfecter les cellules TNI (données non représentées), ce n'est pas toujours possible. Par conséquent, des expériences avec de tels vecteurs d'expression transitoire peuvent nécessiter une vaste optimisation empirique (par exemple, variation de la quantité de chaque vecteur, le temps de transfection, la chimie des réactifs de transfection, etc.) afin d' obtenir l' efficacité de transfection équivalents et / ou les niveaux d'expression de protéine recombinante. De plus, il est possible que l'ajout d'une protéine fluorescente peut influencer ou restreindre le trafic subcellulaire des protéines cibles 23, 24. L'identification de la co-localisation subcellulaire de deux protéines par l'observation de la fluorescence avec des protéines marqueurs ne pas necessarily indiquent des interactions protéine-protéine directe entre les protéines d'intérêt 24, 25. Par conséquent, la prudence est requise lors de l'interprétation des résultats co-localisation.
l'expression génique transitoire n'offre plusieurs avantages par rapport aux systèmes d'expression baculoviraux actuellement disponibles. L'expression transitoire nécessite moins de temps et de main-d'œuvre pour la construction de vecteurs et pour la synthèse de protéines recombinantes, l'expression transitoire ne comporte pas la lyse cellulaire associée au cycle de vie pathogène de baculoviral, et l'expression transitoire peut fournir un meilleur système d'étude pour le trafic subcellulaire protéines 3, 7, 9. Ce protocole met en évidence la facilité et la rapidité de constructions de renforcement par incorporation directe d'un gène d'intérêt dans le vecteur d'expression FRP en utilisant l' extension de chevauchement PCR (Figure 1 26. En outre, bien que EGFP 27 et mCherry 28 ont été incorporés ici à l'extrémité carboxylique de deux B. tabaci protéines aquaporines, OE-PCR pourrait également être utilisé pour placer de nombreuses autres protéines de marqueur fluorescent variante 26 au termini aminés de ces protéines. Il est à noter que, en plus de nombreux plasmides d'expression construits en utilisant OE-PCR, de nombreuses cassettes de clonage d'expression traditionnelles ont été préparées et peuvent être utilisées pour produire pratiquement toute protéine d'intérêt en phase avec les protéines fluorescentes EGFP, Vénus et mCherry, fusionnés soit à l'extrémité amino ou des extrémités terminales. Ces cassettes d'expression sont disponibles sur demande.
L'ère de la « génomique » a fourni un volume sans précédent et l'accès à un sens dà. Cependant, l'écart continue de se creuser entre la découverte de gènes et l'attribution de la fonction des produits géniques; ainsi, des outils empiriques supplémentaires sont désespérément nécessaires pour accélérer la génomique fonctionnelle. Considérant que, gène d'édition et d' autres in vivo des systèmes de manipulation de gènes peuvent finalement fournir des approches par excellence pour assigner la fonction des gènes, des systèmes d'expression de protéines hétérologues restera probablement importante pour la bio - fabrication de protéines précieuses et pour déchiffrer la structure des protéines et la fonction. Ce protocole décrit un procédé pour la construction améliorée de plasmides d'expression et l'expression transitoire de protéines recombinantes dans des cellules d'insectes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions Lynn Forlow-Jech et Dannialle LeRoy pour l'assistance technique. Ce travail a été soutenu par un financement CRIS de base ARS USDA, Programme national de 304 - Protection des cultures et de la quarantaine [Projet # 2020-22620-022-00D] JAF et JJH mention des noms commerciaux ou des produits commerciaux dans cet article est uniquement à des fins de fournir des informations spécifiques et ne signifie pas la recommandation ou l'approbation par le ministère américain de l'Agriculture. L'USDA est un fournisseur égal d'opportunité et de l'employeur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
References
- Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).
- Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).
- Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
- Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).
- Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. , Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).
- Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
- Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).
- Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
- Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).
- Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).
- Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).
- Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific. Available from: http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0 (2014).
- Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).
- Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
- Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).
- Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).
- Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).
- Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).
- Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
- Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
- Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).
