Summary
sistemas de expressão em células de insecto Nonlytic são pouco utilizados para a produção, o tráfico celular / localização, e a análise funcional da proteína recombinante. Aqui, nós descrevemos métodos para gerar vectores de express e subsequente expressão da proteína transiente em linhas de células de lepidópteros disponíveis comercialmente. A co-localizao de aquaporinas de Bemisia tabaci com proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares também é apresentada.
Abstract
sistemas de expressão de proteínas heterólogas são utilizados para a produção de proteínas recombinantes, a interpretação de tráfico celular / localização, e a determinação da função bioquímica de proteínas ao nível sub-organismos. Embora os sistemas de baculovírus de expressão são cada vez mais utilizados para a produção de proteína em numerosos biotecnológica, farmacêutica e aplicações industriais, sistemas nonlytic que não envolvem infecção viral tem benefícios claros, mas muitas vezes são esquecidos e subutilizados. Aqui, descrevemos um método para a geração de vectores de expressão nonlytic e a expressão da proteína recombinante transiente. Este protocolo permite a localização celular eficiente de proteínas recombinantes e pode ser utilizado para discernir rapidamente proteína tráfico dentro da célula. Mostramos a expressão de quatro proteínas recombinantes em uma linha celular de insecto disponível comercialmente, incluindo duas proteínas aquaporina do Bemisia tabaci insectos, bemcomo proteínas marcadoras subcelulares específicos para a membrana plasmática da célula e para os lisossomas intracelulares. Todas as proteínas recombinantes foram produzidas como quimeras com marcadores de proteínas fluorescentes nas suas extremidades carboxilo, que permite a detecção directa das proteínas recombinantes. A dupla transfecção das células com plasmeos albergando construes para os genes de interesse e um marcador subcelular conhecido permite imagens de células vivas e melhorada validação de localização da proteína celular.
Introduction
A produção de proteínas recombinantes, utilizando sistemas de expressão de células de insecto oferece numerosos benefícios para o estudo de proteínas eucarióticas. Ou seja, as células de insectos possuir modificações semelhantes pós-tradução, processamento, e os mecanismos de triagem como os presentes em células de mamíferos, o que é vantajoso para a produção de proteínas correctamente dobradas 1, 2, 3. Sistemas de células de insectos também tipicamente requerem menos recursos e menos tempo e esforço para manutenção de linhas celulares de mamíferos 4, 5. O sistema de expressão de baculovírus é um tal sistema baseado em células de insecto que é agora amplamente utilizados em muitas disciplinas, incluindo a produção de proteínas recombinantes para caracterização da proteína e terapêutica, a apresentação imunogénica de peptídeos estranhos e proteínas virais para produção de vacinas, a síntese de múltiplas -proteína complexos, A produção de proteínas glicosiladas, etc. 1, 2, 4, 6. Existem, no entanto, situações em que a expressão de baculovírus pode não ser aplicável 3, 7, e a utilização de sistemas de expressão de insectos e nonlytic transientes podem ser mais apropriados. Especificamente, a expressão de células de insecto transiente oferece a possibilidade para a rápida síntese de proteína recombinante, requer menos desenvolvimento e manutenção, não envolve a lise celular viral-impostas, e fornece um meio para melhor estudar o tráfico celular durante a síntese 7, 8, 9, proteína, 10.
Este protocolo descreve a rápida geração de vectores de expressão utilizando duas etapas de PCR de extensão de sobreposição (OE-PCR) Escherichia coli. Os plasmídeos são usados para transfectar células de duplo de insecto em cultura disponíveis comercialmente e para produzir proteas representativas. O protocolo descreve a produção e utilização de duas proteínas marcadoras subcelular fluorescentemente marcadas diferentes e demonstra uma co-localização com duas proteínas aquaporina do Bemisia tabaci inseto. O protocolo seguinte fornece a metodologia básica para OE-PCR, a manutenção de células de insectos e de transfecção, e a microscopia de fluorescência para a localização celular de proteínas alvo.
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Protocol
1. OE-PCR para a construção de plasmídeos de expressão
Nota: Ver Tabela 1 para todos os iniciadores utilizados na OE-PCR. A utilização de uma polimerase de DNA de alta-fidelidade é recomendada para todas as amplificações. No entanto, porque estas enzimas frequentemente não deixe um 3' , é necessário realizar uma breve, a incubação não-amplificação com uma polimerase de ADN de Taq a 'um-cauda' produtos do PCR antes da clonagem-los em uma expressão de célula de insecto TA vetor. Este protocolo demonstra um método para gerar os plasmídeos de expressão de insecto abrigando proteínas quiméricas, com as proteínas fluorescentes fundidos em grelha com o terminal carboxilo dos genes de interesse (neste caso, de duas proteínas tabaci aquaporina Bemisia) ou às proteínas marcadoras subcelulares (Figura 1).
- Use OE-PCR, que consiste em duas rodadas independentes de amplificação, para gerar: (1) as sequências que codificam os genes de interesse (B. tabaciaquaporina 1: BtDrip1; B. tabaci aquaporina 2: BtDrip2_v1) fundido em grelha com uma variante da proteína fluorescente verde chamado EGFP ou (2) os marcadores subcelulares (receptor do péptido de Drosophila melanogaster sexo: DmSPR; Homo sapiens fosfolipase A2: HsPLA2) com a sequência de codificação mCherry. Directamente ligar os produtos finais OE-PCR no plasmídeo pIB / V5-His-TA.
- Para o primeiro ciclo de OE-PCR (indicado por AD e A'-D' na Figura 1), utilizar um iniciador específico do gene sentido (mostrada em negrito na Tabela 1) e um iniciador anti-sentido quimico (em itálico no Quadro 1) que corresponde para o de 15 pb final (sem o codão de terminação) do gene de interesse marcador / subcelular e de 15 pb da extremidade 5 'da proteína fluorescente desejada (EGFP ou mCherry) para gerar um produto com um extremo saliente 3' .
Nota: Ver Tabela 2 para as condições de PCR. - Num tubo separado, utilizar um gene-especific iniciador anti-sentido da proteína fluorescente (mostrado com um sublinhado na Tabela 1) e um iniciador de sentido quimérico que contém 15 pb da extremidade 3 'do gene de interesse marcador / subcelular e 15 pb a partir da extremidade 5' da desejada fluorescente proteína para gerar um produto com uma saliência 5' .
Nota: Ver Tabela 2 para as condições de PCR. O molde de PCR pode ser um produto de PCR validado-sequência ou, mais preferencialmente, ADN de plasmídeo que alberga a sequência desejada. O estudo descrito aqui usa plasmídeos validado de sequência. - Separa-se os produtos de PCR por electroforese em gel de agarose a 1% de agarose (utilizando o padrão de grau molecular).
- Consumo e purificar os produtos com os tamanhos esperados (ver Tabela 2) utilizando um kit de extraco de gel de DNA comercialmente disponíveis (ver a tabela de materiais para o kit específico utilizado neste protocolo).
- Utilizar os produtos de PCR purificados em gel a partir do passo 1.1.4 para gerar a sobreposição final Eprodutos xtension (indicado por A '' - D '' na Figura 1). Utilizar um iniciador com sentido específico para o gene para o gene de interesse marcador / subcelular e o correspondente iniciador anti-sentido específico para o gene para a proteína fluorescente para gerar a sequência quimérica desejado.
Nota: Ver Tabela 2 para as condições de PCR. Pode ser necessário determinar empiricamente as quantidades óptimas de primeira rodada produtos de extensão de sobreposição para adicionar à mistura de reacção para se obter o comprimento total do produto final, quimérico PCR. - Separa-se os produtos de segunda ordem OE-PCR por electroforese em gel de agarose a 1%. Consumo e purificar os produtos usando um kit de extração de gel de ADN comercialmente disponível.
- Incubar de segunda ordem produtos OE-PCR purificados em gel com 1 unidade de ADN polimerase Taq mistura principal durante 10 min a 72 ° C, para gerar os produtos de 3' adenilada (isto é, A-tailed) necessários para a clonagem TA.
- Ligadura dos produtos adenilada resultantesno vector de expressão pIB e usar técnicas de clonagem molecular convencionais para transformar células de Escherichia coli quimicamente competentes (choque térmico) ou electrocompetentes (electroporação). Durante a noite placa em meio contendo o marcador de selecção apropriado (isto é, a ampicilina ou a carbenicilina).
- Realizar PCR de colias 12 utilizando um iniciador específico do vector e um iniciador específico do inserto para identificar colónias de inserção-positiva que foram transformadas com os plasmídeos de expressão abrigando uma inserção na orientação 5'-3' . Preparar culturas durante a noite de colónias que geram produtos de PCR com os tamanhos esperados.
- Isolar o ADN de plasmídeo utilizando um kit de purificação de ADN disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante (ver o Quadro Materiais para o kit específico utilizado neste protocolo). Validar a integridade da sequência de cada inserção por sequenciação de ADN directa.
- Para o primeiro ciclo de OE-PCR (indicado por AD e A'-D' na Figura 1), utilizar um iniciador específico do gene sentido (mostrada em negrito na Tabela 1) e um iniciador anti-sentido quimico (em itálico no Quadro 1) que corresponde para o de 15 pb final (sem o codão de terminação) do gene de interesse marcador / subcelular e de 15 pb da extremidade 5 'da proteína fluorescente desejada (EGFP ou mCherry) para gerar um produto com um extremo saliente 3' .
Nota: Para manter condições estéreis, realizar todas as manipulações de células que requerem a abertura do frasco de cultura de tecido dentro de uma câmara de fluxo laminar. Ligar a lâmpada germicida de UV exaustor de fluxo laminar, pelo menos, 1 h antes de manipulações das células. Usar luvas de borracha nitrílica e descontaminar a superfície da bancada, pipetas, utensílios, tubos e garrafas com etanol a 70% antes da sua utilização. A familiaridade com técnicas básicas de cultura de células é recomendado 13.
- Use células TNI (uma linha de cultura celular estabelecida derivada de Trichoplusia ni tecido do ovário) que estão adaptados para meio isento de soro e mantê-los como uma cultura em monocamada aderente em meio de insectos isento de soro a 28 ° C em frascos de cultura de tecidos T25.
- Manter as células Sf9 (uma linha de cultura celular estabelecida derivada de Spodoptera frugiperda tecido ovariano) Do mesmo modo, mas utilizando TNM-FH de cultura de insectos de suplemento médioed com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS).
- Semear a cultura inicial de células Sf9 congelado ou TNI removendo frascos de banco de -80 ° C e permitindo-lhes a descongelar em um banho de água a 37 ° C. Descontaminar os frascos com álcool 70% após o descongelamento e colocá-los no gelo.
- Adicionar 4 ml de meio de células de insectos para um novo frasco T25 e transferir 1 ml da suspensão de células de insecto descongeladas. Colocar o balão em um 28 ° C, incubadora humidificada e não permitem que as células a aderir durante 30-45 min.
- Substituir o meio de sementeira com 5 mL do meio apropriado e transferir os frascos a 28 ° C uma incubadora não humidificada. Monitorar confluência celular diária. Passagem das células quando atingirem 90% de confluência.
Nota: A cobertura completa do frasco T25 corresponde a ~ 5 x 10 6 culas. - Passagem de células de insecto.
- Para passagem, as células, primeiramente remover o meio exausto a partir do frasco contendo as células confluentes utilizando uma pipeta serológica 5 ml estéril.Inclinar o balão de modo a que o fluido passa para um canto, para longe da monocamada de células. Remova cuidadosamente o meio com uma pipeta sem perturbar as células.
- Desalojar as células TNI enxaguando suavemente os frascos T25 contendo a monocamada confluente com 4 mL de meio de insectos isento de soro utilizando nova, estéril, 5 mL pipeta serológica. Mover a ponta da pipeta entre o frasco e, lentamente, irrigar para remover as células fracamente ligadas ao balão de fundo.
- Entrada para o desprendimento adequado de células, removendo todos os meios, rodando o frasco durante, e observando-se que o fundo do frasco é clara.
- Para as células de Sf9, que aderem mais firmemente, adicionar 4 mL de meio TNM-FH fresco e utilizar um raspador de células para desalojar as células ligadas. Usar uma pipeta serológica 5 mL de misturar suavemente e reduzir a aglutinação de células.
- Utilizar um contador de células automatizado para estimar o número de células de insecto viáveis por volume de meio. Transferir 0,1 mL da mistura de células / meio de um 1,5-mltubo de microcentrífuga. Num tubo de microcentruga separado de 0,5 ml, adicionar 10 mL de mistura de célula / meio a 10 uL de azul de tripano.
- Remover uma lâmina de câmara de contador de células da embalagem e adicionar 10? L do meio de mistura de células / / azul de tripano para cada lado da lâmina de contagem. Inserir a lâmina para o contador de células e determinar a densidade celular e viabilidade.
- Usando a densidade celular, calcular e adicionar o volume apropriado de meio de células de insectos (até 5 mL) para novos frascos T25, estéreis.
- Transferir cerca de 1-1,5 x 10 6 células para frascos T25 com meio fresco; rotular os frascos com a linha de células, a data, o meio utilizado, o número de células adicionadas, e número de passagens (P n + 1 geração, onde P n é o número de passagem para a geração anterior de células); e colocar os frascos em uma incubadora C 28 ° C durante até 72 h.
Nota: As células de insecto podem ser propagadas continuamente, embora as células podem ser menos receptivo a transfecção e / ou heterólogaexpressão da proteína após 30 passagens. Tratar todos descartados células / meios com uma solução de lixívia a 10% e autoclave utensílios de plástico descartável antes de ser descartado.
3. Insecto Transfecção celular
- Semente um frasco T25 com até 1 x 10 6 culas Sf9 TNI ou em um meio de células de insecto apropriado (meio de insectos isento de soro para Tni e TNM-FH para Sf9) e crescer até à confluência durante 72 h a 28 ° C.
- Remover e descartar o meio antigo e desalojar as células com 4 mL de meio de insectos isento de soro fresco (ver passos 2.6.2 e 2.6.3, acima).
- Estimar a densidade celular utilizando um contador de células automatizado (ver o passo 2.6.4, acima).
- Adicionar cerca de 7 x 10 5 células a pratos de vidro com fundo de 35 mm individuais e permitir que as células a aderir durante 20-25 min a 28 ° C.
- Para cada transfeco, adiciona-se 2 ug de ADN de plasmídeo (quer a partir de um plasmídeo para transfecções individuais ou 2? G de cada um dos dois plasmídeos para fazertransfecções uble) a 0,1 mL de meio de insectos isento de soro (sem FBS para ambos Sf9 e transfecções TNI) em um tubo de microcentrifugação esterilizado de 1,5 mL.
- Num tubo separado, mistura 8 mL de reagente de transfeco com 0,1 mL de meio de insectos isento de soro e, em seguida, transferir essa solução ao tubo contendo o DNA do plasmídeo de interesse. Levemente vortex e incubar à temperatura ambiente durante 20 - 30 min.
- Dilui-se a mistura de plasmídeo-transfecção dos passos 3,5 e 3,6 com 0,8 mL de meio de insectos isento de soro, de modo que o volume total é igual a 1 mL.
- Cuidadosamente remover os meios de comunicação a partir dos pratos de vidro contendo as células anexadas. Sobrepor as células anexadas com o meio de transfecção do plasmídeo-diluída.
- Incubar as células a 28 ° C durante 5 h.
Nota: As condições de transfecção requerem optimização empírica para a eficiência de transfecção máxima (por exemplo, a transfeco durante a noite, em vez de 5 h, a quantidade de DNA de plasmídeo usado, a química do reagente de transfecçãousados, etc.). - Remover e descartar o meio de transfecção e suavemente lavar as células com 1 ml de meio de insectos isento de soro, tendo cuidado para não deslocar células.
- Adicionar 2 mL de meio de células de insecto fresco (meio de insectos isento de soro para Tni e TNM-FH para Sf9) e incubar a 28 ° C durante 48-72 h.
Observação: Uma vez mais, as condições requerem optimização empírica para a expressão da proteína heteróloga máxima.
4. confocal microscopia de fluorescência
- Em 48-72 h pós-transfecção, lavar as células uma vez com 1 mL de IPL-41 meio de insecto e, em seguida cobrir com 2 mL de IPL-41 para geração de imagens.
Nota: Este passo de lavagem reduz o fundo auto-fluorescência observado com meio de células de insectos utilizada na manutenção de células normais. - Adicionar 4 gotas de reagente de coloração de Hoechst-de células vivas (ver a tabela de materiais para o corante nuclear específico utilizado neste protocolo) ao meio e incubar a 28 ° C durante 20-25 min.
Nota: nuc adicionaismanchas lear pode ser substituído, embora o corante deve ter um perfil de fluorescência único a partir de EGFP e mCherry. - Coloque um prato de 35 mm no microscópio confocal de auto-fechado de varrimento a laser (ver a tabela de materiais para o instrumento específico utilizado neste protocolo).
- Ajustar o microscópio para as condições de observação Hoechst, EGFP, e mCherry: Hoechst excitação / emissão - 359/461 nm; EGFP excitação / emissão - 489/510 nm; mCherry excitação / emissão - 580/610 nm.
- Realizar uma verificação inicial utilizando uma objectiva de 10x para confirmar a expressão fluorescente e em seguida mudar para o modo de varrimento usando uma objectiva de contraste de imersão em água 60X fase.
- Ajustar a potência do laser (5-7%), a sensibilidade do detector (47-49%), velocidade de varrimento, a profundidade do eixo Z, e zoom digital para optimizar o contraste de imagem e resolução. Imagem as células na 1.5X zoom digital para dar um total de amplificação de 90X.
Nota: Os parâmetros Microscópio necessitar de ajuste empírico para optimalcoleção de imagens e pode ser específica para o instrumento em uso. - Exportar os dados brutos como arquivos de imagem TIFF e modificar (colheita e de sobreposição) para a figura geração.
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Representative Results
OE-PCR
OE-PCR permite a síntese de produtos de ADN quiméricas que, uma vez inserida num vector de expressão, para permitir a produção de proteínas quiméricas recombinantes correspondentes a qualquer gene de teste de interesse e proteína marcador fluorescente. A Figura 1 representa um esquema geral para a produção de vectores de expressão contendo PIB B. sequências de codificação (BtDrip1 e BtDrip2_v1) em grelha com o marcador fluorescente de EGFP proteína aquaporina tabaci. Neste cenário, duas proteínas quiméricas contendo BtDrip EGFP nas suas extremidades carboxilo foram produzidos. Este protocolo demonstrou também métodos para o desenvolvimento de duas proteínas de insecto subcelulares marcador, DmSPR e PLA2G15 (Figura 1), produzidas como quimeras com mCherry nas suas extremidades carboxilo. EGFP e mCherry foram escolhidos porque seus espectros de emissão são suficientemente divergentes, permitindo tele detecção independente e de co-localização de sinais das proteínas de teste (por ex., BtDrip-EGFP) e a DmSPR- e PLA2G15-mCherry marcado com proteínas marcadoras. Todas as reacções de PCR produziu bandas dos tamanhos esperados e foram clonados com sucesso em pIB. Todos os plasmídeos foram confirmadas por sequenciação de ADN para conter as inserções apropriadas na orientação correcta e na estrutura com proteínas marcadores fluorescentes.
a expressão da proteína recombinante transiente em cultura de células de insecto
Após a construção de vectores de expressão correspondentes a pIB / BtDrip1-EGFP, pIB / BtDrip2_v1-EGFP, pIB / DmSPR-mCherry, e pIB / PLA2G15-mCherry, as células foram transfectadas e a expressão de proteínas recombinantes em células vivas foi visualizada utilizando confocal de fluorescência microscopia (Figura 2). A transfecção bem sucedida e expressão recombinante de BtDrip1-EGFP é evidente by a presença de fluorescência verde na superfície de células TNI (Figura 2B, 2F). Fluorescência verde dentro das células é observada TNI transfectadas com BtDrip2_v1-EGFP (Figura 2J, 2N), indicando a expressão intracelular de BtDrip2_v1. Da mesma forma, as células transfectadas com TNI pIB / DmSPR-mCherry (Figura 2C, 2K) ou pIB / PLA2G15-mCherry (Figura 2G, 2O) mostram fluorescência vermelha, indicando a expressão das respectivas quimeras.
Co-localização de proteínas recombinantes e BtDrip marcadores subcelulares
A dupla transfecção de células TNI permite a co-expressão de duas proteínas fluorescentes marcadas. imagens sobrepostas de células transfectadas que são TNI laranja / amarelo indicam que as células abrigar plasmídeos que produzem tanto EGFP e mCherry e sugerem que as proteínas são co-localizados dentro do mesmo suestruturas bcellular (Figura 2D, 2H, 2L & 2P). Isto confirma os resultados anteriores que BtDrip1 e DmSPR são expressas na superfície das células 14, 15, 16. Uma sobreposição de células TNI duplo-transfectadas com pIB / BtDrip1-EGFP e pIB / DmSPR-mCherry mostra a sobreposição dos sinais de fluorescência verde e vermelha (Figura 2D), sugerindo a co-localizao de BtDrip1-EGFP e DmSPR-mCherry na superfície da célula . Anteriormente, Maroniche et al. 17 demonstrou que PLA2G15 é um marcador de lisossomas intercelulares quando expresso em células Sf9 como uma quimera com mCherry. Embora a previsão era de que a proteína recombinante de EGFP-BtDrip2_v1 seria translocar para a superfície celular, que foi previamente demonstrado que a proteína quimérica foi localizada principalmente intracelularmente dentro das células transfectadas TNI 15. Em apoio desta, havia pouco Evidcia para a co-localização de sinais de fluorescência verdes e vermelhas quando BtDrip2_v1-EGFP foi co-expressa com pIB / DmSPR-mCherry (Figura 2L). Em contraste, a co-expressão de pIB / BtDrip2_v1-EGFP e pIB / PLA2G15-mCherry resultou em uma sobreposição significativa nos sinais de fluorescência verde e vermelha no citoplasma (Figura 2P), sugerindo fortemente que BtDrip2_v1 é susceptível de tráfico para os lisossomas intracelulares.
Figura 1: Diagrama esquemático para a construção de construções de expressão que usam PCR de sobreposição de extensão (OE-PCR). OE-PCR é utilizado para construir vectores de expressão contendo o Pib Bemisia tabaci aquaporina-1 / EGFP (BtDrip1-EGFP), B. tabaci aquaporina-2_variant 1 / EGFP (BtDrip2_v1-EGFP), receptor do peptídeo sexo da Drosophila melanogaster / mCherry (DmSPR- mCherry), e Homo sapiens fosfolipase-A2 / mCherry(HsPLA2G15-mCherry) produtos. A primeira ronda de OE-PCR gera fragmentos correspondentes aos cDNAs completos de interesse, BtDrip1 (A), BtDrip2_v1 (B), DmSPR (C), e HsPLA2G15 (D), contendo uma região 3' sobreposição pequeno correspondente ao extremidade 5 ', quer do EGFP ou mCherry proteínas marcadoras fluorescentes. Simultaneamente, os ADNc de comprimento completo a partir de EGFP e mCherry são amplificadas por RCP e contêm uma região 5' de sobreposição correspondente às extremidades 3 'de BtDrip1 (A 'pequeno), BtDrip2_v1 (B'), DmSPR (C'), ou HsPLA2G15 ( D'). Note-se que todos os iniciadores utilizados para amplificar os ADNc de interesse (ou seja, BtDrip1, BtDrip2_v1, DmSPR, e HsPLA2G15) na primeira ronda de OE-PCR falta o cod de paragem encontrado normalmente na extremidade 3 'de cada sequência de codificação. Todos os produtos da primeira fase de OE-PCR são amplificados, separados por gel de agarose eleitorophoresis, e purificado em gel. A segunda ronda de OE-PCR utiliza pares reunidos dos produtos de PCR purificados em gel a partir da primeira volta de OE-PCR como moldes para a amplificação dos produtos quiméricos de comprimento total. Para cada reacção, o iniciador de sentido corresponde à extremidade 5 'do cDNA de sequências de codificação de interesse e o iniciador anti-sentido é complementar à extremidade 3' de EGFP ou mCherry, com o seu cod de terminao intactos (A '', B' 'C'' e D ''). Os quatro produtos de segunda ordem OE-PCR são purificados em gel, com adenilada de Taq polimerase, e ligado ao vector de expressão pIB / V5-His. Os plasmídeos são propagados em E. coli, e o ADN plasmídico purificado é usado para transfectar células de insecto. O B. tabaci aquaporinas BtDrip1 e BtDrip2_v1 são mostrados a azul escuro e ciano, respectivamente, e os marcadores subcelulares DmSPR e PLA2G15 são mostrados na laranja e rosa, respectivamente. EGFP é shprópria em verde e mCherry está em vermelho. Setas coloridas indicam o sentido (iniciadores com sentido nos iniciadores de sentido e anti-sentido para a frente em sentido inverso) e localização de iniciadores específicos para o gene (a cor de um iniciador indica a fonte da sequência do iniciador). Ver Tabela 1 para detalhes de primers. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: imagem ao vivo de células duplamente transfectadas TNI Expressam recombinante BtDrip1-EGFP, BtDrip2_v1-EGFP, DmSPR-mCherry, e proteínas PLA2G15-mCherry. Trichoplusia ni células (TNI) foram duplamente transfectada com pIB / BtDrip1-EGFP e pIB / DmSPR-mCherry (AD), pIB / BtDrip1-EGFP e pIB / PLA2G15-mCherry (EH), pIB / BtDrip2_v1-EGFP e pIB / DmSPR -mCherry (<forte> IL), ou pIB / BtDrip2_v1-EGFP e pIB / PLA2G15-mCherry (MP). As imagens foram capturadas com um microscópio confocal de varrimento a laser usando um contraste objectiva de imersão em água 60X fase (NA 1.2) em 90X amplificação. Os painéis Hoechst mostrar imagens ao vivo de células representativas de núcleos de células coradas (ex / em = 359/461 nm). Os painéis EGFP mostrar a expressão de fluorescência de células transfectadas com EGFP quimeras (ex / em = 489/510 nm). Os painéis mCherry mostrar a expressão de fluorescência de células transfectadas com quimeras mCherry (ex / em = 580/610 nm). O painel de intercalação mostra a sobreposição de todos os três canais de fluorescência (isto é, Hoechst, EGFP, e mCherry). Escala da barra = 10 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Sistemas de expressão de proteínas heterólogas são ferramentas importantes para a produção de proteínas recombinantes utilizadas em numerosas aplicações a jusante 4. Escolhendo a partir de diversos sistemas de expressão disponíveis depende do objectivo final para a proteína de interesse. Vários sistemas de expressão em células de insecto estão disponíveis que oferecem alternativas flexíveis para sistemas de expressão de células procariotas e eucariotas 5, 6. Sistemas de insectos que requerem infecção de baculovírus para dirigir a expressão de proteína são, de longe, o sistema de insecto mais populares e largamente usadas, com muitas destas proteínas utilizados em pesquisa e aplicações terapêuticas 1, 2, 3. de expressão de baculovírus, no entanto, têm limitações, incluindo os que: 1) o ciclo de vida viral envolve a lise da célula hospedeira; 2) as células hospedeiras que são submetidas a lise tipicamente libertar alta amounts de enzimas de degradação; 3) a geração de linhas celulares estáveis é demorado e pode não ser viável para proteínas citotóxicas; 4) expressão descontínuo requer manutenção frequente; 5) geração de vectores frequentemente requer múltiplos passos de clonagem; 6) as densidades de células de insecto muitas vezes são inversamente proporcional à infecção virai; e 7) as proteínas recombinantes são de tráfico principalmente em níveis elevados para a superfície celular ou são segregadas 3, 7, 9, 10. A expressão do gene transitório Nonlytic baseada em transfecção de células de insectos com ADN plasmídeo oferece uma técnica alternativa para a produção de proteínas recombinantes, sem alguns dos desafios únicos associados com baculovírus 7, 8. Nomeadamente, a expressão transiente de células de insecto oferece mais curto reviravolta na construção do vector e a síntese de proteínas, evita challeng es associada com infecção viral e a lise das células, e fornece um meio robusto para observar a tráfico celular de proteínas.
Aqui, duas construções de expressão validados foram usadas para determinar a localizao subcelular do B. tabaci aquaporina proteínas BtDrip1 e BtDrip2_v1. DmSPR-mCherry é um marcador para a membrana da célula de plasma 16, e PLA2G15-mCherry localiza dentro lisossomas celulares 17. A Figura 2 mostra o valor de tais marcadores para avaliar os locais de proteínas de interesse, neste caso, a co-localização de BtDrip1-EGFP com DmSPR-mCherry na superfície da célula e BtDrip2_v1-EGFP com PLA2G15-mCherry dentro dos lisossomos. Por conseguinte, como mostrado aqui e nas investigações anteriores 14, 15, 16, 18, 19,burro = "refex"> 20, esta metodologia pode ser utilizada para determinar rapidamente tráfego de proteínas no interior das células de insecto. Embora a expressão da proteína e tráfico dentro de células TNI é mostrado (Figura 2), é importante notar que o protocolo pode ser optimizado e aplicado igualmente bem a outras linhas celulares de insecto (Sf9, Sf21, BM-N, S2, etc.) .
Como todos os sistemas de expressão de proteínas heterólogas, existem limitações para a produção de proteína transiente em células de insecto em cultura. Ou seja, a percentagem de células positivas para a expressão de derivados de plasmídeo é tipicamente menor do que o obtido a partir de baculovírus ou de usar linhas celulares estáveis. Assim, a quantidade de proteína (s) recombinante produzido pode ser inferior em um sistema transiente; no entanto, o uso de promotores diferentes e a incorporação de intensificadores genéticas pode superar esta potencial limitação 7, 21, 22. Tseu protocolo demonstra a co-transfecção de células com dois vectores de TNI Pib, cada abrigando diferentes sequências de codificação da proteína (Figura 2). Embora as eficiências de transfecção similares foram observados para todos os quatro vectores de expressão utilizados para transfectar as células TNI (dados não mostrados), isso nem sempre é possível. Assim, as experiências com tais vectores de expressão transiente pode exigir grande optimização empírica (por exemplo, a variação na quantidade de cada um dos vectores, o tempo de transfeco, transfeco reagente química, etc.) para conseguir a eficiência e / ou níveis de expressão da proteína recombinante de transfecção equivalentes. Além disso, é possível que a adição de uma proteína fluorescente pode influenciar ou restringir o tráfico subcelular de proteínas tem como alvo 23, 24. A identificação da co-localização subcelular de duas proteínas pela observação de fluorescência com proteínas marcadoras não necessarily indicam interacções proteína-proteína directas entre as proteas de interesse 24, 25. Por isso, é preciso ter cuidado na interpretação destes resultados de co-localização.
expressão gênica transitória não oferece diversas vantagens sobre os sistemas de expressão de baculovírus disponíveis atualmente. A expressão transiente necessita de menos tempo e trabalho para a construção de vectores e para a síntese de proteínas recombinantes, a expressão transiente não envolve a lise celular associada com o ciclo de vida do patogénico de baculovírus, e a expressão transiente pode proporcionar um melhor sistema de estudo para o tráfico subcelular de proteínas 3, 7, 9. Este protocolo destaca a facilidade e velocidade de construção de construções através da incorporação directa de um gene de interesse no vector de expressão pIB utilizando extensão de sobreposição PCR (Figura 1 26. Além disso, embora EGFP 27 e mCherry 28 foram incorporadas aqui no terminal carboxilo de duas proteínas aquaporina B. tabaci, OE-PCR também pode ser usada para colocar muitas outras proteínas variante fluorescente do marcador 26 nos terminais amino destas proteínas. É de notar que, em adição a vários plasmídeos de expressão construídos utilizando OE-PCR, muitas cassetes de expressão de clonagem tradicionais foram preparados e podem ser utilizados para produzir virtualmente qualquer proteína de interesse in frame com as proteínas fluorescentes EGFP, Vénus, e mCherry, fundido na extremidade amino ou extremidades terminais. Tais cassetes de expressão estão disponíveis mediante solicitação.
A era do "genômica" forneceu um volume sem precedentes e acesso a d significativaata. No entanto, a diferença continua a aumentar entre a descoberta do gene e a atribuição da função de produtos de genes; Assim, ferramentas empíricas adicionais são desesperadamente necessários para acelerar a genómica funcional. Considerando que, gene de edição e outra em sistemas de manipulação de genes in vivo pode, finalmente, fornecer abordagens por excelência para a atribuição da função de genes, sistemas de expressão de proteínas heterólogas provavelmente permanecerá importante para o biomanufacture de proteínas valiosas e para decifrar a estrutura e função das proteínas. Este protocolo descreve um método para a construção de plasmídeos de expressão aumentada e a expressão transitória de proteínas recombinantes em células de insecto.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos Lynn Forlow-Jech e Dannialle LeRoy para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por um financiamento de base CRIS a USDA ARS, Programa Nacional 304 - Crop Protection and Quarantine [Project # 2020-22620-022-00D] para JAF e JJH A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais neste artigo é apenas para o propósito de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo Departamento de Agricultura dos EUA. O USDA é um fornecedor de oportunidades iguais e empregador.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
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