Summary
Nichtlysierende Insektenzellexpressionssysteme sind für die Produktion, Zellmigration / Lokalisierung und rekombinante Protein funktionelle Analyse nicht ausgelastet. Hier beschreiben wir Verfahren, Expressionsvektoren und nachfolgende transiente Proteinexpression in kommerziell erhältlichen Lepidoptera-Zelllinien zu erzeugen. Die Co-Lokalisierung von Bemisia tabaci aquaporins mit subzellulären fluoreszierenden Markerproteinen wird ebenfalls vorgestellt.
Abstract
Heterologe Proteinexpressionssysteme sind für die Herstellung rekombinanter Proteine verwendet werden, die Interpretation von zellulärem Handel / Lokalisierung und die Bestimmung der biochemischen Funktion von Proteinen an der Unter organismal Ebene. Obwohl Baculovirus-Expressionssysteme werden zunehmend für die Proteinproduktion in zahlreichen biotechnologischen, pharmazeutischen und industriellen Anwendungen, nichtlysierende Systemen verwendet, die nicht virale Infektion haben klare Vorteile beinhalten sie sind aber oft übersehen und nicht ausgelastet. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Erzeugen nichtlysierende Expressionsvektoren und transiente Expression von rekombinantem Protein. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen und kann verwendet werden, um schnell den Proteintransport in der Zelle zu unterscheiden. Wir zeigen die Expression von vier rekombinanten Proteinen in einer handelsüblichen Insektenzelllinie, einschließlich zwei Aquaporin - Proteine aus dem Insekten Bemisia tabaci, sowieals subzellulären Markerproteine spezifisch für die Zellplasmamembran und für die intrazelluläre Lysosomen. Alle rekombinanten Proteine wurden als Chimären mit fluoreszierendem Protein-Marker an ihrer Carboxyltermini hergestellt, die für den direkten Nachweis der rekombinanten Proteine ermöglicht. Die Doppel-Transfektion von Zellen mit Plasmiden Konstrukten für die Gene von Interesse und einem bekannten subzellulären Marker ermöglicht lebende Zellen und eine verbesserte Validierung von zellulären Proteinlokalisierung beherbergen.
Introduction
Die Herstellung von rekombinanten Proteinen Insektenzellexpressionssysteme bietet zahlreiche Vorteile für die Untersuchung von eukaryotischen Proteinen. Und zwar besitzen Insektenzellen ähnliche post-translationale Modifikationen, die Verarbeitung und Sortiermechanismen wie jene , die in Säugetierzellen, die zur Herstellung von korrekt gefalteten Proteinen 1, 2, 3 vorteilhaft sind. Insektenzellsysteme , auch benötigen in der Regel weniger Ressourcen und weniger Zeit und Aufwand für die Wartung als Säugetier-Zelllinien 4, 5. Das Baculovirus-Expressionssystem ist ein solches Insektenzell-basiertes System, das heute weit verbreitet in vielen Disziplinen verwendet wird, einschließlich der Herstellung von rekombinanten Proteinen für die Proteincharakterisierung und Therapeutika, die immunogene Präsentation von Fremdpeptiden und virale Proteine, die für die Impfstoffherstellung, die Synthese von mehr -Protein KomplexeDie Herstellung von glycosylierten Proteinen, etc. 1, 2, 4, 6. Es gibt jedoch Situationen , in denen von Baculovirus - Expressions nicht anwendbar sein , 3, 7, und die Verwendung von nichtlysierende und transienten Insektenexpressionssystemen kann besser geeignet sein. Insbesondere transiente Insektenzellexpressions die Möglichkeit zur schnellen Synthese von rekombinantem Protein bieten, weniger Entwicklung und Wartung erfordert, nicht viralen auferlegte Zelllyse beteiligt, und stellt ein Mittel besseren zellularen Handel während Proteins zu studieren Synthese 7, 8, 9, 10.
Dieses Protokoll beschreibt die schnelle Erzeugung von Expressionsvektoren unter Verwendung von Zweistufen-Überlappungsverlängerungs-PCR (OE-PCR) Escherichia coli. Plasmide sind doppelt transfizieren kommerziell erhältlichen gezüchteten Insektenzellen verwendet und repräsentative Proteine zu produzieren. Das Protokoll beschreibt die Herstellung und Verwendung von zwei verschiedenen fluoreszenzmarkierten subzellulären Markerproteinen und zeigt Kolokalisation mit zwei Aquaporin - Proteinen aus dem Insekten Bemisia tabaci. Das folgende Protokoll stellt die grundlegende Methodik für OE-PCR, Insektenzell Wartung und Transfektion und Fluoreszenzmikroskopie für die zelluläre Lokalisation von Zielproteinen.
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Protocol
1. OE-PCR für die Konstruktion von Expressionsplasmiden
Hinweis: Siehe Tabelle 1 für alle verwendeten Primer in OE-PCR. Die Verwendung einer High-Fidelity DNA-Polymerase wird für alle Amplifikationen empfohlen. Da jedoch diese Enzyme häufig nicht verlassen, ein 3' A, ist es notwendig, eine kurze, nicht-Amplifizierung Inkubation mit einer Taq-DNA-Polymerase zu ‚A-tail‘ auszuführen, um die PCR-Produkte, bevor sie in einen TA-Insektenzellen-Expressions klonen Vektor. Dieses Protokoll zeigt ein Verfahren insect Expressionsplasmide Proteine beherbergt chimäre zu erzeugen, mit den fluoreszierenden Proteinen in-Rahmen zu dem Carboxylterminus der Gene von Interesse fusioniert ist (in diesem Fall zu zwei Bemisia tabaci Aquaporin - Proteine) oder subzellulären Markerproteine (Abbildung 1).
- Verwenden OE-PCR, die aus zwei unabhängigen Amplifikationsrunden bestehen, zu erzeugen: (1) Sequenzen , die die Gene von Interesse (B. tabaciAquaporin 1: BtDrip1; B. tabaci Aquaporin 2: BtDrip2_v1) , fusioniert in-frame mit einem grün fluoreszierenden Protein EGFP Variante genannt , oder (2) die subzelluläre Marker (Drosophila melanogaster sex peptide receptor: DmSPR; Homo sapiens Phospholipase A2: HsPLA2) mit der mCherry kodierenden Sequenz. Direkt abzubinden die endgültigen OE-PCR-Produkte in das PIB / V5-His-TA-Plasmid.
- Für die erste Runde des OE-PCR (angezeigt durch AD und A'-D‘in Figur 1), mit einem Gen-spezifischer Sense - Primer und einen chimäres Antisense - Primer (in Fettdruck in Tabelle 1 gezeigt) (kursiv dargestellt in Tabelle 1) entspricht , an die letzten 15 bp (ohne das Stopcodon) des Gens von Interesse / subzellulären Marker und auf 15 bp des 5'-Endes des fluoreszierenden Proteins (EGFP oder mCherry) gewünscht wird, ein Produkt mit einem 3'-Überhang zu erzeugen.
Hinweis: Siehe Tabelle 2 für die PCR - Bedingungen. - In einem separaten Röhrchen, mit einem Gen-spezifIC - fluoreszierender Protein - Antisense - Primer und ein chimären Sense - Primer (mit einer Unterstreichungs in Tabelle 1 gezeigt), die 15 bp von dem 3'-Ende des Gens von Interesse / subzellulären Marker und 15 bp von dem 5'-Ende der gewünschten Fluoreszenz enthält Protein, das ein Produkt mit einem 5'-Überhang zu erzeugen.
Hinweis: Siehe Tabelle 2 für die PCR - Bedingungen. Das Template PCR kann entweder ein sequenz validierte PCR-Produkt oder stärker bevorzugt sein, Plasmid-DNA die gewünschte Sequenz enthält. Die hier beschriebene Studie verwendet sequenz validiert Plasmide. - Trennt die PCR-Produkte mit 1% Agarose-Gelelektrophorese (unter Verwendung von Standard-Agarose Molekular-grade).
- Verbrauch und reinigen , die Produkte der erwarteten Größen (siehe Tabelle 2) einen im Handel erhältlichen DNA Gel - Extraktions - Kits (siehe die Tabelle von Materialien für die spezifische Kit in diesem Protokoll verwendet).
- Mithilfe der gelgereinigten PCR-Produkte aus Schritt 1.1.4 die endgültige Überdeckung E zu erzeugen,xtension Produkte (angegeben durch A '' - D '' in Figur 1). Verwenden, um einen genspezifische Sense-Primer für das Gen von Interesse / subzellulären Marker und dem entsprechenden genspezifische Antisense-Primer für das fluoreszierende Protein der gewünschten chimäre Sequenz zu erzeugen.
Hinweis: Siehe Tabelle 2 für die PCR - Bedingungen. Es kann notwendig sein, um empirisch die optimalen Mengen der ersten Runde Überlappungsverlängerungsprodukte zu bestimmen, zu dem Reaktionsgemisch hinzuzufügen, um das endgültige, in voller Länge chimären PCR-Produkt zu ergeben. - Trennt die zweite Runde OE-PCR-Produkte durch 1% Agarose-Gelelektrophorese. Verbrauch und reinigen, die Produkte eines im Handel erhältlichen DNA Gel-Extraktions-Kit.
- Inkubieren gelgereinigt zweite Runde OE-PCR - Produkte mit 1 Einheit Taq - DNA - Polymerase - Master - Mix für 10 min bei 72 ° C , um die 3' adenyliert (dh A-tailed) Produkte für TA Cloning erforderlich zu erzeugen.
- Ligieren der resultierenden Produkte adenyliertein den PIB - Expressionsvektor und Standard molekularer Klonierungstechniken verwenden chemisch kompetente (Hitzeschock) oder elektro (Elektroporation) Escherichia coli - Zellen zu transformieren. Platte über Nacht auf dem Medium das geeignete Selektionsmarker enthält (dh Ampicillin oder Carbenicillin).
- Kolonie - PCR durchzuführen 12 einen Vektor-spezifischen Primer und einen Einsatz-spezifische Primer insert-positive Kolonien zu identifizieren , die mit Expressionsplasmide beherbergen ein Insert in der Orientierung 5'-3' transformiert wurden. Bereiten Sie über Nacht Kulturen von Kolonien zu erzeugen PCR-Produkte der erwarteten Größen.
- Isolieren Plasmid - DNA eines im Handel erhältlichen DNA - Reinigungs - Kits unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers (siehe Werkstoff - Tabelle für den spezifischen Kit in diesem Protokoll verwendet). Überprüfen der Sequenzintegrität jeden Einsatz durch direkte DNA-Sequenzierung.
- Für die erste Runde des OE-PCR (angezeigt durch AD und A'-D‘in Figur 1), mit einem Gen-spezifischer Sense - Primer und einen chimäres Antisense - Primer (in Fettdruck in Tabelle 1 gezeigt) (kursiv dargestellt in Tabelle 1) entspricht , an die letzten 15 bp (ohne das Stopcodon) des Gens von Interesse / subzellulären Marker und auf 15 bp des 5'-Endes des fluoreszierenden Proteins (EGFP oder mCherry) gewünscht wird, ein Produkt mit einem 3'-Überhang zu erzeugen.
Hinweis: Um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, führen alle Manipulationen Zelle die Öffnung der Gewebekulturflasche in einer Laminarströmungshaube erforderlich ist. Schalten Sie den Laminarströmungshaube UV-Entkeimungslampe mindestens 1 h vor der Zellmanipulationen. Nitril-Handschuhe tragen und dekontaminieren, die Oberfläche der Bank, Pipetten, Geräte, Röhren und Flaschen mit 70% igem Ethanol vor der Verwendung. Die Vertrautheit mit grundlegenden Zellkulturtechniken wird 13 empfohlen.
- Verwenden Tni - Zellen (eine etablierte Zellkulturlinie , abgeleitet von Trichoplusia ni Ovarialgewebe), die an serumfreies Medium angepasst sind , und halten sie als adhärente Monolayer - Kultur in serumfreien Insektenmedium bei 28 ° C in T25 - Gewebekulturflaschen.
- Pflegen Sf9 - Zellen (eine etablierte Zellkulturlinie von Spodoptera frugiperda abgeleitet Ovarialgewebe) in ähnlicher Weise , aber unter Verwendung TNM-FH Insektenkulturmedium Ergänzunged mit 10% fötalen Rinderserum (FBS).
- Seed die Vorkultur von gefrorenem Sf9 oder Tni Zellen durch Vorratsröhrchen von -80 ° C zu entfernen und so dass sie in einem 37 ° C warmen Wasserbad auftauen. Dekontaminieren die Fläschchen mit 70% Ethanol nach dem Auftauen und legen sie auf Eis.
- 4 ml Insektenzellmedium auf eine neue T25-Kolben gegeben und 1 ml der aufgetauten Insektenzellsuspension. Der Kolben wird in einem 28 ° C, nicht-befeuchteten Inkubator und lassen die Zellen für 30-45 min befestigen.
- Ersetzen das Seeding-Mediums mit 5 ml des entsprechenden Mediums und übertragen die Kolben zu einem 28 ° C nicht-befeuchteten Inkubator. Überwachen Sie Zellkonfluenz täglich. Passage der Zellen, wenn sie erreichen 90% Konfluenz.
Hinweis: Vollständige Abdeckung der T25 - Flasche entspricht ca. 5 x 10 6 Zellen. - Insektenzellpassage.
- Zu den Zellen Passage, entfernen zuerst das erschöpfte Medium aus dem Kolben, die konfluenten Zellen mit einer sterilen 5 ml serologischen Pipette.Neigen des Kolbens, so dass das Medium zu einer Ecke strömt, weg von der Zellmonolayer. Entfernen Sie vorsichtig das Medium mit einer Pipette, ohne die Zellen zu stören.
- Abzulösen die Tni-Zellen durch vorsichtiges die T25-Kolben Spülen der konfluenten Monoschicht mit 4 ml serumfreien Insektenmedium unter Verwendung von neuen, sterilen, 5 ml serologische Pipette enthält. Bewegen, um die Pipettenspitze in den Kolben gegeben und langsam bewässern Zellen lose an dem Kolbenboden zu entfernen.
- Überprüfen Sie für die angemessene Ablösung von Zellen durch alle Medien zu entfernen, drehen die Kolben über, und die Beobachtung, dass der Boden des Kolbens ist klar.
- Für Sf9-Zellen, die festen haften, 4 ml frischen TNM-FH-Medium und einen Zellschaber verwenden, um die anhaftenden Zellen abzulösen. Verwenden, um eine 5 ml serologische Pipette vorsichtig mischen und Zelle Verklumpen zu reduzieren.
- Verwenden eines automatisierten Zellzähler die Anzahl von lebensfähigen Insekten- Zellen pro Volumen des Mediums zu schätzen. Übertragung von 0,1 ml Zellen / Medium Gemisch in einen 1,5-mlMicrofuge-Röhrchen. In einem getrennten Mikrozentrifugenröhrchen 0,5 ml, werden 10 & mgr; l Zellen / Medium-Gemisch zu 10 & mgr; l von Trypanblau.
- Entfernen eines Zellzählers Kammer Schieber aus seiner Verpackung und dann werden 10 ul der Zell / mittel / Trypanblau-Mischung auf jeder Seite des Zählens Folie. Legen Sie die Folie in den Zellenzähler und bestimmt die Zelldichte und Lebensfähigkeit.
- Unter Verwendung der Zelldichte, berechnen und das richtige Volumen von Insektenzellmedium hinzu (bis zu 5 ml), um neue, sterile T25-Kolben.
- Übertragen etwa 1-1,5 × 10 6 Zellen auf T25 - Kolben mit frischen Medien; bezeichnet die Kolben mit der Zelllinie, Datum, Medium verwendet, die Anzahl der Zellen zugegeben, und Passagezahl (P n + 1 - Generation, wobei P n die Kanal - Nummer für die vorherige Generation von Zellen ist); und legt die Kolben in einem 28 ° C Inkubator für bis zu 72 h.
Hinweis: Insektenzellen können kontinuierlich vermehrt werden, obwohl Zellen weniger empfänglich sein können, um die Transfektion und / oder heterologenProtein-Expression nach 30 Durchgängen. Behandeln alle verworfen Zellen / Medium mit 10% Bleichlösung und autoklaviert Einwegplastikware vor der Entsorgung.
3. Insect Zelltransfektion
- Samt eine T25 - Kolbe mit bis zu 1 x 10 6 Tni oder Sf9 - Zellen in einem geeigneten Insektenzellmedium (serumfreien Insektenmedium für Tni und TNM-FH für Sf9) und wachsen zu Konfluenz für 72 h bei 28 ° C.
- Entfernen und das alte Medium verworfen und die Zellen mit 4 ml frischem serumfreien Insektenmedium entfernen (siehe Schritte 2.6.2 und 2.6.3, oben).
- Abschätzen, ob die Zelldichte eines automatisierten Zellzähler (siehe Schritt 2.6.4, oben).
- Mit ca. 7 x 10 5 Zellen zu einzelnen 35 mm Glasbodenschalen und lassen die Zellen bei 28 ° C für 20-25 min befestigen.
- Für jede Transfektion, add 2 ug Plasmid-DNA (entweder von einem Plasmid für die einzelnen Transfektionen oder 2 & mgr; g von jedem der beiden Plasmide für double Transfektionen) zu 0,1 ml serumfreien Insektenmedium (ohne FBS für beide Sf9 und Tni Transfektionen) in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- In einem separaten Röhrchen, mischte 8 uL Transfektionsreagenz mit 0,1 ml serumfreien Insektenmedium, und dann diese Lösung in das Röhrchen übertragen, den Plasmid-DNA von Interesse enthält. Leicht verwirbeln und 20 bei RT inkubieren - 30 min.
- Verdünne die Plasmid-Transfektionsgemisch aus den Schritten 3.5 und 3.6 mit 0,8 ml serumfreien Insektenmedium, so daß das Gesamtvolumen 1 ml beträgt.
- Entfernen Sie vorsichtig den Medien aus den Glasschalen haftenden Zellen enthält. Überlagern die anhaftenden Zellen mit dem verdünnten Plasmid-Transfektionsmedium.
- Inkubieren der Zellen bei 28 ° C für 5 Stunden.
Anmerkung: Die Bedingungen für die Transfektion erfordern empirische Optimierung für maximale Transfektionseffizienz (beispielsweise über Nacht Transfektion anstatt 5 h beträgt die Menge an Plasmid - DNA verwendet, die Chemie des TransfektionsreagenzGebrauchte, etc.). - Entfernen und die Transfektionsmedium verwerfen und die Zellen vorsichtig mit 1 ml serumfreien Insektenmedium waschen, darauf achten, daß Zellen zu entfernen.
- Fügen Sie 2 ml frischen Insektenzellmedium (serumfreien Insektenmedium für Tni und TNM-FH für Sf9) und inkubiere bei 28 ° C für 48-72 h.
Hinweis: Auch hier Bedingungen erfordern empirische Optimierung für maximale heterologe Proteinexpression.
4. Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie
- Bei 48-72 h nach der Transfektion, wäscht die Zellen einmal mit 1 ml IPL-41-Insektenmedium, und dann die Abdeckung mit 2 ml IPL-41 für die Bildgebung.
Anmerkung: Dieser Waschschritt vermindert die Hintergrund-Autofluoreszenz mit Insektenzellmedium beobachtete in normaler Zell Wartung verwendet. - 4 Tropfen Hoechst Lebendzell-Färbereagenz (siehe die Tabelle von Materialien für die spezifische Kernfärbung in diesem Protokoll verwendet) zum Medium und Inkubation bei 28 ° C für 20-25 min.
Hinweis: Weitere NukLear Flecken substituiert sein kann, obwohl der Farbstoff ein Fluoreszenzprofil einzigartig von EGFP und mCherry haben sollte. - Legen Sie eine 35 mm-Schale in die in sich geschlossenen Laser-Scanning-Konfokalmikroskop (siehe die Tabelle von Materialien für das jeweilige Instrument in diesem Protokoll verwendet).
- Stellen Sie das Mikroskop für Hoechst, EGFP und mCherry Beobachtungsbedingungen: Hoechst Anregungs- / Emissions - 359/461 nm; EGFP Anregungs- / Emissions - 489/510 nm; mCherry Anregungs- / Emissions - 580/610 nm.
- Durchführen einen anfänglichen Scan ein 10-fach Objektiv unter Verwendung von fluoreszierender Expression zu bestätigen und dann wechseln Abtastmodus ein 60X Phasenkontrastwasserimmersionsobjektiv.
- Justieren der Laserleistung (5-7%), Detektorempfindlichkeit (47-49%), Abtastgeschwindigkeit, Z-Achsen-Tiefe, und Digitalzoom den Bildkontrast und die Auflösung zu optimieren. Bild die Zellen bei 1,5X digitalem Zoom insgesamt 90X Verstärkung zu geben.
Hinweis: Mikroskop Parameter erfordern empirische Anpassung für eine optimaleBildsammlung und kann mit dem Instrument in Gebrauch sein spezifisch. - Exportieren Sie die Rohdaten als TIFF-Bilddateien und ändern (Ernte und Overlay) für Abbildung Generation.
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Representative Results
OE-PCR
OE-PCR ermöglicht die Synthese von chimären DNA-Produkten, die, einmal in einen Expressionsvektor eingefügt ist, ermöglichen die Herstellung von rekombinanten chimären Proteinen zu jedem Test Gen von Interesse und fluoreszierenden Markerprotein entsprechen. 1 stellt ein allgemeines Schema für die Herstellung von PIB - Expressionsvektoren , enthaltend B. tabaci Aquaporin - codierenden Sequenzen (BtDrip1 und BtDrip2_v1) in-frame mit dem fluoreszierenden Protein EGFP Marker. In diesem Szenario werden zwei chimäre Proteine EGFP BtDrip an ihren Carboxytermini enthalten, wurden hergestellt. Dieses Protokoll auch für die Entwicklung von Methoden nachgewiesen zwei Insekten subzellulären Markerproteine, DmSPR und PLA2G15 (Abbildung 1), mit Chimären mCherry an ihrer Carboxyltermini hergestellt. EGFP und mCherry wurden ausgewählt, da ihre Emissionsspektren ausreichend divergent sind, so dass für ter unabhängige Detektion und Kolokalisation von Signalen von den Testproteinen (z. B. BtDrip-EGFP) und die DmSPR- und PLA2G15-mCherry-markierte Markerproteine. Alle PCR-Reaktionen Banden der erwarteten Größen hergestellt und wurden erfolgreich in PIB geklont. Alle Plasmide wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigen die entsprechenden Inserts in der richtigen Orientierung und im Leseraster mit fluoreszierendem Protein-Marker zu enthalten.
Transiente Expression von rekombinantem Protein in Insektenzellkultur
Im Anschluss an die Konstruktion von Expressionsvektoren entsprechend PIB / BtDrip1-EGFP, PIB / BtDrip2_v1-EGFP, PIB / DmSPR-mCherry und PIB / PLA2G15-mCherry wurden die Zellen transfiziert und die Expression von rekombinanten Proteinen in lebenden Zellen wurde unter Verwendung von konfokaler Fluoreszenz sichtbar gemacht Mikroskopie (Abbildung 2). Erfolgreiche Transfektion und Expression von rekombinanten BtDrip1-EGFP ist evident by die Anwesenheit der grünen Fluoreszenz auf der Oberfläche der Tni - Zellen (2B, 2F). Grüne Fluoreszenz transfiziert mit BtDrip2_v1-EGFP (2J, 2N) innerhalb Tni - Zellen beobachtet, was die intrazelluläre Expression von BtDrip2_v1 anzeigt. Ebenso transfizierte Tni - Zellen mit PIB / DmSPR-mCherry (2C, 2K) oder PIB / PLA2G15-mCherry (2G, 2O) zeigen rote Fluoreszenz, was auf die Expression des betreffenden Chimären.
Co-Lokalisierung von rekombinanten Proteinen und subzellulären BtDrip Marker
Die Doppel-Transfektion von Tni-Zellen erlaubt die Co-Expression von zwei fluoreszenzmarkierten Proteinen. Überlagerte Bilder von Tni-Zellen transfiziert, die angeben, orange / gelb sind, dass Zellen beherbergen Plasmide sowohl EGFP und mCherry Herstellung und legen nahe, dass die Proteine co-lokalisiert innerhalb derselben subcellular Strukturen (Figur 2d, 2H, 2L & 2P). Dies bestätigt vorhergehende Ergebnisse , die BtDrip1 DmSPR und werden auf der Zelloberfläche exprimiert 14, 15, 16. Eine Überlagerung von Tni - Zellen doppelt transfizierten mit PIB / BtDrip1-EGFP und PIB / DmSPR-mCherry zeigt Überlappung der grünen und roten Fluoreszenz - Signale (2D), was darauf hindeutet , Co-Lokalisierung von BtDrip1-EGFP und DmSPR-mCherry auf der Zelloberfläche . Zuvor Maroniche et al. 17 demonstriert , dass PLA2G15 ein Marker der interzellularen Lysosomen ist , wenn in Sf9 - Zellen als eine Chimäre mit mCherry ausgedrückt. Obwohl es , dass das rekombinante BtDrip2_v1-EGFP - Protein an die Zelloberfläche vorhergesagt wurde , würde transloziert wurde zuvor gezeigt , dass das chimäre Protein in erster Linie intrazellulär innerhalb transfizierter Tni - Zellen 15 lokalisiert wurde. Zur Unterstützung dieser gab es wenig evidENCE für die Co-Lokalisation der grünen und roten Fluoreszenz - Signale , wenn BtDrip2_v1-EGFP mit PIB / DmSPR-mCherry (2L) coexprimiert wurde. Im Gegensatz dazu führte die Coexpression von PIB / BtDrip2_v1-EGFP und PIB / PLA2G15-mCherry in einer erheblichen Überlappung in den zytoplasmatischen grünen und roten Fluoreszenzsignalen (Abbildung 2P), was stark darauf hindeutet , dass BtDrip2_v1 wahrscheinlich an intrazelluläre Lysosomen frequentiert.
Abbildung 1: Schematische Darstellung für den Aufbau Expression Konstrukte mit Overlap - Extension - PCR (OE-PCR). OE-PCR wird verwendet , PIB - Expressionsvektoren , enthaltend die Bemisia tabaci Aquaporin-1 / EGFP (BtDrip1-EGFP), B. tabaci Aquaporin-2_variant 1 / EGFP (BtDrip2_v1-EGFP), Drosophila melanogaster sex peptide receptor / mCherry (DmSPR- zu bauen mCherry) und Homo sapiens Phospholipase-A2 / mCherry(HsPLA2G15-mCherry) Produkte. Die erste Runde der OE-PCR erzeugt Fragmente , um das Volllänge - cDNAs von Interesse entsprechen, BtDrip1 (A), BtDrip2_v1 (B), DmSPR (C) und HsPLA2G15 (D), einen kleinen 3' überlappenden Bereich zum umgebenden entsprechenden 5'-Ende entweder den EGFP oder mCherry fluoreszierender Markerproteine. Gleichzeitig werden cDNAs voller Länge von EGFP und mCherry PCR amplifiziert und einen kleinen 5' - überlappenden Bereich an das 3'-Enden von BtDrip1 (A 'entspricht, enthält), BtDrip2_v1 (B'), DmSPR (C‘) oder HsPLA2G15 ( D‘). Man beachte , dass alle Primer verwendet , um die cDNAs von Interesse zu verstärken (dh BtDrip1, BtDrip2_v1, DmSPR und HsPLA2G15) in der ersten Runde des OE-PCR fehlen den Stopcodon normalerweise am 3'-Ende jeder codierende Sequenz gefunden. Alle Erstrunden-OE-PCR-Produkte werden verstärkt, getrennt durch Agarose-Gel-electrophoresis und gelgereinigt. Die zweite Runde des OE-PCR verwendet gepoolten Paare der gelgereinigt PCR-Produkte aus der ersten Runde des OE-PCR als Template für die Amplifikation der in voller Länge chimären Produkte. Für jede Reaktion entspricht der Sense - Primer an das 5'-Ende der cDNA von Interesse kodierenden Sequenzen und der Antisense - Primer ist komplementär zu dem 3'-Ende des EGFP oder mCherry mit seinem Stopcodon intakt (A ‚‘, B‘ 'C'‘und D ''). Die vier zweiten Runde OE-PCR-Produkte sind gelgereinigt adenyliert mit Taq-Polymerase und ligiert in das PIB / V5-His- Expressionsvektor. Plasmide werden in E. coli vermehrt und gereinigte Plasmid - DNA wird verwendet, um Insektenzellen zu transfizieren. Die B. tabaci Aquaporinen BtDrip1 und BtDrip2_v1 sind in dunkelblau und Cyan gezeigt sind, und die subzelluläre Marker DmSPR und PLA2G15 sind in Orange und Pink, gezeigt. EGFP ist shSelbst in grün und mCherry ist in rot. Farbige Pfeile die Richtung (Sense-Primer, die in der Vorwärtsrichtung und Antisense-Primer, die in der Rückwärtsrichtung) und die Lage der genspezifischen Primern angeben (die Farbe eines Primers gibt die Quelle der Primersequenz). Siehe Tabelle 1 für die Primer-Details. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Live - Imaging von Double-transfizierten Tni Zellen Rekombinante BtDrip1-EGFP exprimieren, BtDrip2_v1-EGFP, DmSPR-mCherry und PLA2G15-mCherry Proteine. Trichoplusia ni (TNI) Zellen wurden doppelt transfizierten mit PIB / BtDrip1-EGFP und PIB / DmSPR-mCherry (AD), PIB / BtDrip1-EGFP und PIB / PLA2G15-mCherry (EH), PIB / BtDrip2_v1-EGFP und PIB / DmSPR -mCherry (<strong> IL) oder PIB / BtDrip2_v1-EGFP und PIB / PLA2G15-mCherry (MP). Die Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop erfasst ein 60X Phasenkontrastwasserimmersionsobjektiv (NA 1,2) bei 90X-Amplifikation unter Verwendung. Die Hoechst-Panels zeigen repräsentative Bilder lebender Zellen von gefärbten Zellkerne (ex / em = 359/461 nm). Die EGFP Tafeln zeigen die Fluoreszenz die Expression von Zellen mit EGFP transfizierten Chimären (ex / em = 489/510 nm). Die mCherry Tafeln zeigen die Fluoreszenz die Expression von Zellen mit mCherry Chimären transfiziert (ex / em = 580/610 nm). Das Merge - Feld zeigt die Überlagerung aller drei Fluoreszenzkanäle (dh Hoechst, EGFP und mCherry). Maßstabsbalken = 10 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Heterologe Proteinexpressionssysteme sind wichtige Werkzeuge für die Herstellung von rekombinanten Proteinen in zahlreichen Anwendungen eingesetzt Downstream 4. Die Auswahl aus den verschiedenen Expressionssystemen zur Verfügung, hängt vom Endziel für das Protein von Interesse. Mehr Insektenzellexpressionssysteme zur Verfügung , die flexible Alternativen zu pro- und eukaryotischen Zellexpressionssystemen 5, 6 bieten. Insektensysteme Baculovirusinfektion erfordern Protein - Expression zu fahren sind mit Abstand der beliebtesten und am weitesten Insektensystem verwendet, mit vielen solchen Proteinen , die in Forschung und therapeutischen Anwendungen 1, 2, 3. Baculovirus-Expression ist, hat jedoch Einschränkungen, einschließlich: 1) der virale Lebenszyklus die Lyse der Wirtszelle beinhaltet; 2) die Wirtszellen, die lysiert werden lösen typischerweise hohe amoUNTS von abbauenden Enzymen; 3) die Erzeugung von stabilen Zelllinien ist zeitaufwendig und kann nicht für zytotoxische Proteine durchführbar sein; 4) diskontinuierliche Expression erfordert häufige Wartung; 5) Vektorerzeugung erfordert häufig mehrere Klonierungsschritte; 6) Insektenzelldichten sind oft umgekehrt proportional zur viralen Infektion; und 7) Rekombinante Proteine werden in hohen Mengen an die Zelloberfläche oder in erster Linie frequentiert sezerniert 3, 7, 9, 10. Nichtlysierende transiente Genexpression auf Insektenzell Transfektion mit Plasmid - DNA bietet eine alternative Technik zur Herstellung von rekombinanten Proteinen basieren, ohne einige der besonderen Herausforderungen , die mit Baculoviren , 7, 8. Das heißt, vermeidet transiente Insektenzellexpressions bietet kürzere Turn-around auf Vektorkonstruktion und die Proteinsynthese, challeng es mit viralen Infektionen und Zelllyse verbunden ist, und stellt ein robustes Mittel, um die Zellmigration von Proteinen zu beobachten.
Hier wurden zwei validierte Expressionskonstrukte verwendet , um die subzelluläre Lokalisierung des B. tabaci , um zu bestimmen Aquaporin Proteine BtDrip1 und BtDrip2_v1. DmSPR-mCherry ist ein Marker für die Plasmazellmembran 16 und PLA2G15-mCherry lokalisiert innerhalb zellulären Lysosomen 17. Abbildung 2 zeigt den Wert dieses Markers für die Beurteilung der Positionen von Proteinen von Interesse, in diesem Fall, die Co-Lokalisierung von BtDrip1-EGFP mit DmSPR-mCherry an der Zelloberfläche und BtDrip2_v1-EGFP mit PLA2G15-mCherry in Lysosomen. Daher ist , wie hier dargestellt und in früheren Untersuchungen 14, 15, 16, 18, 19,ass = „xref“> 20, kann diese Methode schnell verwendet werden , um den Proteintransport innerhalb Insektenzellen zu ermitteln. Obwohl die Proteinexpression und der Handel innerhalb Tni - Zellen hier gezeigt sind (Figur 2), ist es wichtig zu beachten , dass das Protokoll optimiert werden kann und angewandt ebenso gut auf andere Insektenzelllinien (Sf9, Sf21, BM-N, S2, etc.) .
Wie alle heterologe Proteinexpressionssysteme gibt es Beschränkungen in Bezug auf transiente Proteinproduktion in kultivierten Insektenzellen. Das heißt, der Prozentsatz an Zellen, die positiv für die Plasmid-abgeleiteten Expressions typischerweise geringer als die von Baculovirus erreicht oder unter Verwendung von stabilen Zelllinien. Somit kann die Menge an rekombinantem Protein (en) hergestellt wird, kann in einem transienten System geringer sein; jedoch kann die Verwendung von verschiedenen Promotoren und der Einbau von genetischen Enhancer überwinden diese potentielle Einschränkung 7, 21, 22. Tsein Protokoll zeigt die Co-Transfektion von Zellen mit zwei Tni PIB Vektoren, die jeweils unterschiedliche beherberge Protein-kodierenden Sequenzen (Abbildung 2). Obwohl ähnliche Transfektionseffizienzen für alle vier Expressionsvektoren verwendet wurden beobachtet, die Tni-Zellen (Daten nicht gezeigt) zu transfizieren, ist dies nicht immer möglich. Daher Experimente mit solchen transienten Expressionsvektoren können umfangreiche empirische Optimierung erfordern (beispielsweise Variation der Menge jedes Vektors, Transfektionszeit, Transfektionsreagenz Chemie, etc.) äquivalente Transfektionseffizienzen und / oder Mengen an rekombinanter Proteinexpression zu erreichen. Darüber hinaus ist es möglich , dass die Zugabe eines fluoreszierenden Proteins beeinflussen kann oder subzellulären Handel beschränkt Protein 23 zielt, 24. Die Identifikation des subzellulären Kolokalisation von zwei Proteinen, die durch die Beobachtung der Fluoreszenz mit Markerproteinen nicht necessarily zeigt , direkte Protein-Protein - Wechselwirkungen zwischen den Proteinen von Interesse 24, 25. Daher ist Vorsicht geboten, wenn eine solche Co-Lokalisierung der Interpretation der Ergebnisse.
Transiente Genexpression mehrere Vorteile gegenüber derzeit verfügbaren Baculovirus Expressionssysteme bietet. Transiente Expression erfordert weniger Zeit und Arbeit für den Bau von Vektoren und für die Synthese von rekombinanten Proteinen, wird eine transiente Expression der Zell-Lyse nicht mit dem pathogenen Lebenszyklus von Baculovirus- und transiente Expression kann ein besseres Studie System für die subzelluläre Handel assoziierter beinhalten bereitzustellen 3 - Proteine, 7, 9. Dieses Protokoll unterstreicht die Leichtigkeit und Geschwindigkeit des Gebäudes Konstrukte durch die direkte Inkorporation eines Gens von Interesse in den Vektor PIB - Expression unter Verwendung von Overlap - Extension - PCR (Abbildung 1 26. Obwohl ferner EGFP 27 und 28 wurden mCherry hier am Carboxyltermini von zwei B. tabaci Aquaporin Proteinen, OE-PCR könnte auch viele anderen Varianten fluoreszierende Markerproteine 26 am Amino - Termini dieser Proteine Ort eingebaut werden verwendet. Es ist bemerkenswert, dass, zusätzlich zu den zahlreichen Expressionsplasmide mit OE-PCR, viele traditionelle Expressionsklonierungsverfahren Kassetten hergestellt wurden gebaut und verwendet werden kann praktisch jedes Protein von Interesse im Rahmen mit den fluoreszierenden Proteinen EGFP, Venus und mCherry, verschmolzen zu produzieren an entweder dem Amino- oder terminalen Enden. Derartige Expressionskassetten sind auf Anfrage erhältlich.
Die Ära der „Genomics“ hat eine beispiellose Volumen und den Zugang zu aussagekräftigen d bereitgestelltan einer. Allerdings bleibt der Spalt zwischen Genentdeckung und der Zuordnung der Funktion zu Genprodukten verbreitern; so werden zusätzliche empirische Werkzeuge dringend zu beschleunigen functional genomics benötigt. Während, Gen-Editing und andere in vivo Genmanipulation Systemen letztlich fundamentale Ansätze zur Zuordnung von Genfunktion, heterologe Proteinexpressionssysteme für die biomanufacture von wertvollen Proteinen und zur Dechiffrierung Proteinstruktur und -funktion wahrscheinlich bleiben wichtig bereitstellen können. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für die verbesserte Konstruktion von Expressionsplasmiden und der transienten Expression von rekombinanten Proteinen in Insektenzellen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken Lynn Forlow-Jech und Dannialle LeRoy für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von Basis CRIS Finanzierung USDA ARS, Nationales Programm 304 unterstützt - Crop Protection and Quarantine [Projekt # 2020-22620-022-00D] JAF und JJH Die Erwähnung von Handelsnamen oder Handelsprodukten in diesem Artikel ausschließlich zum Zweck ist die Bereitstellung spezifische Information und stellen keine Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture implizieren. USDA eine Politik der Chancengleichheit Anbieter und Arbeitgeber.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
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