Summary
Nonlytic昆虫细胞表达系统没有得到充分利用进行生产，细胞运输/定位，和重组蛋白质功能分析。这里，我们描述的方法来产生在市售鳞翅目细胞系的表达载体和随后的瞬时表达。与亚细胞荧光标记蛋白烟粉虱水通道蛋白的共定位还提出。
Abstract
异源蛋白质表达系统用于生产重组蛋白，细胞运输/定位的解释，和蛋白质在子有机体水平的生化功能的确定。虽然杆状病毒表达系统在众多的生物技术，制药和工业应用中，不涉及病毒感染有明显的好处，但往往被忽视和未充分利用nonlytic系统越来越多地用于生产蛋白质。在这里，我们描述了用于产生nonlytic表达载体和瞬时重组蛋白表达的方法。该协议允许对重组蛋白的高效细胞定位和可用于在细胞内迅速辨别蛋白质运输。我们示出了四个重组蛋白在市售的昆虫细胞系的表达，包括来自昆虫烟粉虱 2水通道蛋白的蛋白质，以及作为特异于细胞质膜亚细胞标志物蛋白和细胞内溶酶体。所有的重组蛋白被生产为具有在它们的羧基末端，其允许直接检测重组蛋白的荧光蛋白标记的嵌合体。细胞与质粒构建携带针对感兴趣和已知的亚细胞标记物的基因的转染双允许活细胞成像，改进的蜂窝蛋白质定位的验证。
Introduction
生产用昆虫细胞表达系统重组蛋白的真核蛋白质的研究提供了许多好处。即，昆虫细胞具有相似的翻译后修饰，处理和排序机制的那些存在于哺乳动物细胞中，这是有利的用于制备正确折叠的蛋白1，2，3。昆虫细胞系统通常还需要更少的资源和较少的时间和精力用于维护比哺乳动物细胞系4,5。杆状病毒表达系统是一种这样的昆虫细胞为基础的系统，它现已被广泛地用于许多学科，包括生产用于蛋白质表征和治疗剂，外源肽和用于疫苗生产的病毒蛋白的免疫原性的介绍，多合成重组蛋白的 - 蛋白质复合物，生产糖基化蛋白等 。 1，2，4，6。有，但是，情况，其中杆状病毒表达可能不适用3,7，以及使用nonlytic和瞬态昆虫表达系统的可能更合适。具体而言，瞬态昆虫细胞表达提供了重组蛋白的快速合成的可能性，需要更少的开发和维护，不涉及病毒强加细胞裂解，并提供了蛋白质合成7，8，9中更好地研究细胞运输的手段， 10。
这个协议描述了使用快速生成的表达载体的两步骤的重叠延伸PCR（OE-PCR）
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Protocol
1. OE-PCR用于表达质粒的构建
注：请参阅表1在OE-PCR中使用的所有引物。建议对所有扩增使用高保真DNA聚合酶。然而，因为这些酶通常不留下3' A，有必要用Taq DNA聚合酶进行简短的，非放大孵育至‘A-尾’的PCR产物将它们克隆到TA昆虫细胞表达前向量。此协议演示了一个方法，以产生昆虫表达质粒携带嵌合蛋白，与框融合到感兴趣的基因的羧基末端的荧光蛋白（在这种情况下，两个烟粉虱水通道蛋白的蛋白质），或亚细胞标记蛋白（ 图1）。
- 使用OE-PCR，它由两个独立的轮扩增的，以产生：（1）编码感兴趣的基因的序列（ 烟粉虱水通道蛋白1：BtDrip1;框融合与称为EGFP或（2）的亚细胞标记物（ 果蝇性肽受体绿色荧光蛋白变体BtDrip2_v1）： 烟粉虱水通道蛋白2 DmSPR; 智人磷脂酶A2：HsPLA2）与所述的mCherry编码序列。直接结扎最终OE-PCR产品进入PIB / V5-他-TA质粒。
- 对于第一轮OE-PCR的，使用基因特异性有义引物（ 表1中以粗体示出）和嵌合反义引物（由AD和A'-D”在图1中所示）（在表1斜体）对应利息/亚细胞标记物的基因的最后15个碱基（无终止密码子）和至所需的荧光蛋白的5'端的15bp的（EGFP或mCherry的），以产生具有3' 突出端的产物。
注：请参见表2 PCR条件。 - 在一个单独的管中，使用基因特异性IC荧光蛋白反义引物包含来自感兴趣/亚细胞标记物的基因的3'末端15个碱基和15个碱基对来自期望的荧光5'端和嵌合有义引物（与表1中下划线示出）蛋白质以产生具有一个5' 突出端的产物。
注：请参阅表2为PCR条件。将PCR模板可以是一个序列验证PCR产物，或更优选地，DNA质粒携带所需序列。这里所描述的研究使用了序列验证质粒。 - 分离，用1％琼脂糖凝胶电泳PCR产物（使用标准的分子级琼脂糖）。
- 消费和纯化预期大小（ 见表2），使用市售的DNA凝胶提取试剂盒的产品（见材料的表中这个协议所使用的特定试剂盒）。
- 使用凝胶纯化的PCR产物从步骤1.1.4以产生最终的重叠Èxtension产品（ -在图1中'A所示'' D'）。使用基因特异性有义引物对利息/亚细胞标记物的基因和用于荧光蛋白以产生期望的嵌合序列对应的基因特异性反义引物。
注：请参阅表2为PCR条件。它可能是必要的经验确定的第一轮重叠延伸产物的最佳量添加到反应混合物中以产生最终的，全长嵌合PCR产物。 - 分离由1％琼脂糖凝胶电泳第二轮OE-PCR产物。使用市售的DNA凝胶提取试剂盒消费和纯化产品。
- 孵育凝胶纯化第二轮OE-PCR产物用1个单位Taq DNA聚合酶预混的10分钟在72℃，以产生3'腺苷酸化（ 即 A尾）所需的TA克隆产品。
- 结扎造成的腺苷酸化产品到PIB表达载体并使用标准的分子克隆技术来转化化学感受（热休克）或电感受态（电穿孔） 大肠杆菌细胞中。在含有合适的选择标记（ 即，氨苄青霉素或羧苄青霉素）的培养基平板过夜。
- 使用载体特异性引物和特定的插入引物，以确定已用表达质粒窝藏在5'-3'方向插入插入阳性集落进行菌落PCR 12。准备克隆产生预期大小的PCR产物的过夜培养。
- 隔离使用根据制造商的说明可商购的DNA纯化试剂盒（参见材料 表对该协议所使用的特定试剂盒）质粒DNA。验证由直接DNA测序每个插入的序列完整性。
- 对于第一轮OE-PCR的，使用基因特异性有义引物（ 表1中以粗体示出）和嵌合反义引物（由AD和A'-D”在图1中所示）（在表1斜体）对应利息/亚细胞标记物的基因的最后15个碱基（无终止密码子）和至所需的荧光蛋白的5'端的15bp的（EGFP或mCherry的），以产生具有3' 突出端的产物。
注：为了保持无菌条件下，进行要求的组织培养烧瓶中的层流罩内的开口的所有细胞的操作。打开层流罩紫外线杀菌灯至少1个小时的细胞的操作之前。穿丁腈手套及其使用之前净化替补，移液管，器皿，管，并用70％乙醇的烧瓶的表面上。熟悉基本的细胞培养技术，推荐13。
- 使用Tni的细胞（来自粉纹夜蛾的卵巢组织来源的建立的细胞培养物线），它们适应于无血清培养基中并予以保持在无血清昆虫培养基在28℃下在T25组织培养瓶中贴壁单层培养。
- 保持的Sf9细胞（来自草地夜蛾卵巢组织来源的建立的细胞培养系）类似，但使用TNM-FH昆虫培养基补充编有10％胎牛血清（FBS）。
- 通过从-80℃取出的库存小瓶中并允许它们在37℃水浴中解冻种子从冷冻的Sf9或Tni的细胞的原始培养物。消毒用70％乙醇的小瓶解冻后，将它们放在冰上。
- 添加4mL的昆虫细胞培养基到一个新的T25烧瓶，并转移1mL的解冻的昆虫细胞悬浮液。将烧瓶置于28℃，非湿润的培养箱和允许细胞30-45分钟附着。
- 替换用5mL合适的培养基的接种培养基和培养瓶转移到28℃的非加湿培养箱。每天监测细胞汇合。通道的细胞，当他们达到90％汇合。
注意：T25烧瓶的完全覆盖对应于〜5×10个6个细胞。 - 昆虫细胞传代。
- 到通道中的细胞，首先除去从含有使用无菌5mL的血清吸液管汇合的细胞将烧瓶中的耗尽介质。使得介质流向一个角，从细胞单层远离倾斜烧瓶中。小心地取出使用移液管的介质，而不干扰细胞。
- 轻轻漂洗使用新的，无菌，5mL的血清吸液管包含用4mL无血清昆虫培养基的汇合的单层的T25烧瓶逐出Tni的细胞。移动跨越烧瓶中的移液管尖端，慢慢灌溉以除去松散附着在烧瓶底部的细胞。
- 通过删除所有媒体，翻转烧瓶中，并观察该瓶的底部是明确检查细胞充分分离。
- 为Sf9细胞，其附着越紧，加入4毫升新鲜TNM-FH培养基中，并用细胞刮棒以移去贴壁细胞。使用5毫升血清吸管轻轻混匀并减少细胞聚集。
- 使用自动细胞计数器来估计每介质的体积活昆虫细胞的数目。转移0.1mL的细胞/培养基混合物的至1.5mL的微量离心管中。在一个单独的0.5毫升微量离心管中，细胞/培养基混合物的添加10μL至台盼蓝的10μL。
- 从包装中取出细胞计数器室滑动件和添加细胞/培养基/台盼蓝混合液10μL于计数滑动的每一侧上。插入幻灯片进入细胞计数器和确定细胞密度和生存力。
- 使用的细胞密度，计算并添加昆虫细胞培养基（最多5 mL）添加到新的无菌T25烧瓶的适当体积。
- 输送约1-1.5×10 6个细胞用新鲜培养基T25烧瓶;标记烧瓶与细胞系，日期，介质使用时，加入的细胞数，和通道号（P N + 1的生成，其中，P n是上一代细胞的传代次数）;并将其放置在一个28℃的培养箱中培养瓶长达72小时。
注意：昆虫细胞可以连续地传播，尽管细胞可以是转染和/或异源更少接受后30代蛋白质表达。治疗与10％漂白溶液中的所有丢弃细胞/培养基和处置前高压灭菌的一次性塑料器皿。
3.昆虫细胞转染
- 播种T25烧瓶高达1×10 6个或Tni的Sf9细胞在合适的昆虫细胞培养基（对于TN1和TNM-FH为的Sf9无血清昆虫培养基）并生长至融合72小时在28℃。
- 取下并丢弃旧的介质，并用4毫升新鲜的无血清昆虫培养基移出细胞（参见步骤2.6.2和2.6.3，上文）。
- 估计使用自动细胞计数器（参照步骤2.6.4，上文）的细胞密度。
- 添加约7×10 5细胞至个体35毫米玻璃底培养皿和允许细胞在28℃下20-25分钟附着。
- 对于每次转染，加入2微克质粒DNA（从一个质粒用于转染单或2微克来自各两个质粒用于做的在无菌的1.5mL微量离心管uble转染）到0.1毫升无血清昆虫培养基（无FBS两者的Sf9和Tni的转染）的。
- 在一个单独的管中，混合8μL转染试剂用0.1mL无血清昆虫培养基中，然后该溶液转移到含有目的质粒DNA的管中。轻轻涡，并在室温孵育20 - 30分钟。
- 稀释从步骤3.5将质粒转染混合物和3.6用0.8毫升无血清昆虫培养基，使得总体积等于1毫升。
- 小心地从含有贴壁细胞的玻璃培养皿取出介质。覆盖贴壁细胞与稀释的质粒的转染培养基。
- 孵育细胞在28℃5小时。
注意：用于转染的条件要求实现最大转染效率（经验优化例如，转染过夜而不是5小时，质粒DNA的使用量，将转染试剂的化学性质使用的， 等 ）。 - 卸下并丢弃转染培养基，轻轻地用1mL无血清昆虫培养基洗细胞，小心不要以移去细胞。
- 加入2毫升的新鲜昆虫细胞培养基（对于TN1和TNM-FH为的Sf9无血清昆虫培养基）中，并在28℃下孵育48-72小时。
注：同样，条件需要最大的异源蛋白表达经验优化。
4.共聚焦荧光显微镜
- 在48-72小时后转染，用1mL IPL-41昆虫培养基洗细胞一次，然后用2mL的IPL-41用于成像覆盖。
注意：此洗涤步骤减少了与在正常细胞的维持使用昆虫细胞介质中观察到的背景自发荧光。 - 加入4滴Hoechst的活细胞染色试剂（见的用于本协议中使用的特定的核染色材料的表）的培养基中并在28℃下孵育20-25分钟。
注：其他NUC利尔污渍可以被取代，尽管染料应具有EGFP和的mCherry独特荧光分布。 - 放置35mm培养皿到自封闭的激光扫描共聚焦显微镜（见材料的表中这个协议所使用的特定仪器）。
- 调整的Hoechst，EGFP，和mCherry的观察条件的显微镜：Hoechst的激发/发射 - 四百六十一分之三百五十九纳米; EGFP激发/发射 - 510分之489纳米; mCherry的激发/发射 - 六百十分之五百八十〇纳米。
- 使用10x物镜，以确认荧光表达，然后使用60X相衬水浸物镜切换为扫描模式下执行的初始扫描。
- 调整激光功率（5-7％），检测器灵敏度（47-49％），扫描速度，Z轴的深度，和数码变焦，以优化图像对比度和分辨率。图像将细胞在1.5X数码变焦，得到总90X放大。
注：显微镜参数需要优化经验调整图像采集，并且可以具体到使用仪器。 - 导出原始数据为TIFF图像文件，并修改（作物和覆盖）的数字产生。
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Representative Results
OE-PCR
OE-PCR允许的是，一旦被插入到表达载体中，允许产生对应于目标和荧光标记蛋白的任何测试基因的重组嵌合蛋白的嵌合DNA产物的合成。 图1表示用于生产含有烟粉虱水通道蛋白编码符合读框的序列（BtDrip1和BtDrip2_v1）与荧光蛋白质标记EGFP PIB的表达载体的一般方案。在这种情况下，制备含有EGFP在它们的羧基末端2个BtDrip嵌合蛋白。该协议还展示了开发两种昆虫亚细胞标记蛋白，DmSPR和PLA2G15（ 图1），在它们的羧基末端与嵌合体mCherry的制造方法。 EGFP和mCherry的被选中，因为它们的发射光谱是充分发散，从而允许吨他独立的检测和从测试信号的蛋白共定位（ 例如 ，BtDrip-EGFP）和DmSPR-和PLA2G15-mCherry-标记的标记蛋白。所有的PCR反应产生的预期大小的条带，并成功克隆到PIB。所有的质粒通过DNA测序证实含有在正确的方向和在框内与荧光蛋白标记物的适当的插入件。
在昆虫细胞培养物中的瞬时重组蛋白质表达
以下对应于PIB / BtDrip1-EGFP，PIB / BtDrip2_v1-EGFP，PIB / DmSPR-mCherry的，和PIB / PLA2G15-mCherry的表达载体的构建，将细胞转染，并使用共聚焦荧光可视化在活细胞中重组蛋白的表达显微镜（ 图2）。成功的转染和重组BtDrip1-EGFP的表达是明显bÿ绿色荧光的细胞Tni的（ 图2B，2F）的表面上的存在。绿色荧光与BtDrip2_v1-EGFP（ 图2J，2N）转染的细胞Tni的内观察到，表明BtDrip2_v1的胞内表达。同样地，与PIB / DmSPR-mCherry的（ 图2C，2K）或PIB / PLA2G15-mCherry的（ 图2G，2O）转Tni的细胞显示红色荧光，表示各嵌合体的表达。
重组蛋白质BtDrip和亚细胞标记的共定位
Tni的细胞的转染双允许两种荧光标记蛋白的共表达。是橙色/黄色染Tni的细胞的重叠的图像表明细胞怀有同时产生EGFP和mCherry的和质粒表明蛋白质相同苏内共定位bcellular结构（ 图2D，2H，2L＆2P）。这证实了BtDrip1和DmSPR在细胞表面14，15，16上表达以前的结果。 Tni的细胞双重转染PIB / BtDrip1-EGFP和PIB / DmSPR-mCherry的的重叠图显示了绿色和红色的荧光信号（ 图2D）的重叠，表明BtDrip1-EGFP和DmSPR-mCherry的共定位在细胞表面上。此前，Maroniche 等 。 17证明PLA2G15是细胞间溶酶体的标志物中的Sf9细胞与mCherry的嵌合体表达时。虽然有人预测，重组BtDrip2_v1-EGFP蛋白将转位到细胞表面，它以前表明嵌合蛋白主要被转染的细胞Tni的15内细胞内本地化。为了支持这一点，也很少有EVIDENCE用于当BtDrip2_v1-EGFP用PIB / DmSPR-mCherry的（ 图2L）共表达绿色和红色荧光信号的共定位。与此相反，PIB / BtDrip2_v1-EGFP和PIB / PLA2G15-的mCherry的共表达导致在细胞质绿色和红色的荧光信号（ 图2P）一个显著重叠，强烈暗示BtDrip2_v1很可能投放到细胞内的溶酶体。
图1：示意用于构建使用重叠延伸PCR（OE-PCR）表达构建体。 OE-PCR用于构建含PIB的表达载体的烟粉虱水通道蛋白1 / EGFP（BtDrip1-EGFP）， 烟粉虱水通道蛋白2_variant 1 / EGFP（BtDrip2_v1-EGFP）， 黑腹果蝇性肽受体/ mCherry的（DmSPR- mCherry的），和智人磷脂酶A2 / mCherry的（HsPLA2G15-mCherry的）产品。第一轮OE-PCR的产生对应于感兴趣的全长cDNA片段，BtDrip1（A），BtDrip2_v1（B），DmSPR（C），和HsPLA2G15（D），含有相应于一小的3'重叠区域无论是EGFP或mCherry的荧光标记蛋白的5'末端。同时，从EGFP和mCherry的全长cDNA是PCR扩增，并包含（，BtDrip2_v1（B '），DmSPR（C”），或HsPLA2G15小5'对应于BtDrip1 A）的3'末端重叠区域'（ D”）。请注意，用于扩增感兴趣的cDNA（ 即 BtDrip1，BtDrip2_v1，DmSPR和HsPLA2G15）在第一轮OE-PCR的所有引物缺乏通常发现在每一个编码序列的3'端的终止密码子。所有首轮OE-PCR产物扩增，通过琼脂糖凝胶分离当选rophoresis，并凝胶纯化。第二轮OE-PCR的使用汇集对凝胶纯化的PCR产物的来自第一轮OE-PCR的作为全长嵌合产物的扩增模板。对于每个反应，有义引物对应于感兴趣的编码序列的cDNA的5'末端和反义引物与EGFP或mCherry的的3'端互补，其终止密码子的完整（A“”，B” 'C'”和D ''）。四个第二轮OE-PCR产物凝胶纯化，用腺苷酸化Taq聚合酶，并连接到PIB / V5-的His-表达载体。质粒被传播在大肠杆菌和纯化的质粒DNA用于转染昆虫细胞。 烟粉虱水通道蛋白BtDrip1和BtDrip2_v1在深蓝色和青色分别显示，和亚细胞标记DmSPR和PLA2G15分别在橙色和粉红色，显示。 EGFP是SH自己在绿色和mCherry的是红色。有色箭头表示的方向（在反向方向上的前进方向和反义引物有义引物）和基因特异性引物的位置（一个引物的颜色表示的引物序列的来源）。请参阅表1的引物信息。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：双转染的细胞Tni的表达重组BtDrip1-EGFP，BtDrip2_v1-EGFP，DmSPR-mCherry的，和PLA2G15-mCherry的蛋白质的实时成像。 粉纹夜蛾 （TNI）细胞进行双转染PIB / BtDrip1-EGFP和PIB / DmSPR-mCherry的（AD），PIB / BtDrip1-EGFP和PIB / PLA2G15-mCherry的（EH），PIB / BtDrip2_v1-EGFP和PIB / DmSPR -mCherry（<强> IL），或PIB / BtDrip2_v1-EGFP和PIB / PLA2G15-mCherry的（MP）。图像用在90X放大使用60X相衬水浸物镜（NA 1.2）的激光扫描共聚焦显微镜捕获。赫司特板显示染色的细胞核（EX /发射=四百六十一分之三百五十九纳米）的代表活细胞的图像。的EGFP的图显示用EGFP嵌合体（EX /发射=五百十分之四百八十九纳米）转染的细胞的荧光表达。所述的mCherry的图显示用的mCherry嵌合体（EX /发射=六百一分之五百八十○纳米）转染的细胞的荧光表达。合并面板显示所有三个荧光通道（ 即 Hoechst公司，EGFP，和的mCherry）的叠加。比例尺=10μm以下。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
异源蛋白质表达系统可用于产生在许多下游应用4中使用的重组蛋白的重要工具。从现有的各种表达系统选择取决于感兴趣的蛋白质的最终目标。几个昆虫细胞表达系统是可用的提供灵活的替代原核和真核细胞表达系统5,6。需要杆状病毒感染，以驱动蛋白表达的昆虫系统是目前最流行的和广泛使用的昆虫系统中，用在研究和治疗应用1，2，3中使用很多这样的蛋白质。杆状病毒表达确实，但是，具有局限性，包括：1）将病毒生命周期涉及宿主细胞的溶解; 2）被裂解宿主细胞典型地释放高摩降解酶的UNTS; 3）的稳定细胞系的产生是耗时的，并且可能不适用于细胞毒性蛋白质可行的; 4）不连续的表达需要频繁的维护; 5）矢量生成经常需要多个克隆步骤; 6）昆虫细胞密度通常反比于病毒感染;和7）的重组蛋白以高水平在细胞表面主要贩卖或分泌3,7，9，10。基于与质粒DNA昆虫细胞转染Nonlytic瞬时基因表达提供了生产重组蛋白的替代技术，在没有一些与杆状病毒7,8相关联的独特的挑战。即，瞬时昆虫细胞表达提供较短的周转上载体构建和蛋白质的合成，避免challeng与病毒感染和细胞裂解有关的ES，并提供了可靠的手段以观察蛋白质的细胞运输。
在此，2个有效表达构建体用于测定烟粉虱水通道蛋白蛋白质BtDrip1和BtDrip2_v1的亚细胞定位。 DmSPR-mCherry的是用于等离子体细胞膜16的标记物，和PLA2G15-mCherry的细胞溶酶体内17局部化。 图2示出了用于评估蛋白质的位置，诸如标记物的值兴趣在此情况下，BtDrip1-EGFP的共定位DmSPR-mCherry的在细胞表面和BtDrip2_v1-EGFP用PLA2G15-mCherry的溶酶体内。因此，如这里所示和在以前的调查14，15，16，18，19，屁股=“外部参照”> 20，这种方法可用于昆虫细胞内迅速查明蛋白质运输。尽管这里（ 图2）中所示Tni的细胞内的蛋白质表达和贩卖，需要注意的是，协议可以被优化，并且同样适用于其它的昆虫细胞系（SF9，将Sf21，BM-N，S2 等 ）是重要。
像所有的异源蛋白质表达系统中，有培养的昆虫细胞内的限制瞬态蛋白质生产。即，阳性细胞质粒衍生的表达的比例通常比从杆状病毒或从使用的稳定细胞系来实现低。因此，产生了可以在瞬时系统下重组蛋白（S）的量;然而，使用不同的启动子和基因增强剂的结合可以克服这个潜在的限制7，21，22。 Ť他协议演示Tni的细胞具有两个PIB矢量，每个携带不同的蛋白质编码序列（ 图2）共转染。尽管观察到对用于转染细胞Tni的（数据未显示）的所有四个表达载体相似的转染效率，这并不总是可能的。因此，利用这种瞬时表达载体实验可能需要大量经验优化（ 例如，在每个矢量，转染时间，转染试剂化学等的量的变化），以实现等效的转染效率和/或重组蛋白表达的水平。此外，可能的是，在加入荧光蛋白的可能影响或限制亚细胞贩卖蛋白靶23，24。两种蛋白质的亚细胞共定位的荧光观察的识别用标记蛋白质不necessarily表示关注24，25蛋白之间的直接蛋白质-蛋白质相互作用。因此，解释这样的共定位结果时警告是必需的。
瞬时基因表达也比现有杆状病毒表达系统提供几个优点。瞬时表达需要较少的时间和劳动载体的构建和重组蛋白的合成，瞬时表达不涉及与杆状病毒的致病生命周期相关联的细胞裂解，并瞬时表达可以为的亚细胞贩卖提供一个更好的学习系统蛋白3，7，9。该协议强调了通过直接掺入的感兴趣的基因的入PIB表达载体使用重叠延伸PCR（ 图1的易用性和建筑构造的速度26。此外，尽管EGFP 27和28 mCherry的在这里并入在两个烟粉虱水通道蛋白蛋白质的羧基末端，OE-PCR也可以用于放置许多其他的变体的荧光标记蛋白26在这些蛋白质的氨基末端。值得注意的是，除了使用OE-PCR构建许多表达质粒，制备了许多传统的表达克隆盒，并且可以用于产生在帧与所述荧光蛋白EGFP，金星和mCherry的兴趣几乎任何蛋白质，稠合在氨基或末端。这样的表达盒可根据要求提供。
“基因组学”的时代已经提供了前所未有的体积，并获得有意义ðATA。然而，差距不断基因的发现和功能基因产物的分配之间的扩大;因此，被迫切需要额外经验工具来加速功能基因组学。而，基因编辑和体内基因操纵系统其它可能最终提供用于分配基因功能典型方法中，异源蛋白质表达系统可能会保持为有价值的蛋白质的biomanufacture和用于解密蛋白质结构和功能是重要的。这个协议描述了用于表达质粒的构建增强和重组蛋白在昆虫细胞中的瞬时表达的方法。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢林恩Forlow-Jech和丹尼尔尔·勒罗伊技术援助。植物保护检疫[项目＃2020-22620-022-00D]以商品名称或商品的JAF和JJH提及这篇文章仅仅是为目的 - 这项工作是由基地CRIS资金USDA ARS，国家304计划支持的提供具体资料，也没有通过美国农业部门暗示推荐或认可。美国农业部是一个平等的机会提供者和雇主。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
References
- Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).
- Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).
- Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
- Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).
- Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. , Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).
- Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
- Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).
- Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
- Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).
- Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).
- Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).
- Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific. Available from: http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0 (2014).
- Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).
- Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
- Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).
- Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).
- Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).
- Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).
- Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
- Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
- Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).
