Summary
Nonlytic insectencel expressiesystemen onderbenut productie, cellulair transport / lokalisatie en recombinante eiwitten functionele analyse. We beschrijven werkwijzen voor expressievectoren en transiënte daaropvolgende eiwitexpressie genereren handel verkrijgbaar Lepidoptera cellijnen. De co-localisatie van Bemisia tabaci aquaporins met fluorescente subcellulaire markereiwitten wordt gepresenteerd.
Abstract
Heteroloog eiwit expressiesystemen worden gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten, de interpretatie van cellulaire transport / lokalisatie en het vaststellen van de biochemische functie van eiwitten op sub-organismal niveau. Hoewel baculovirus expressiesystemen in toenemende mate gebruikt voor eiwitproductie in talrijke biotechnologische, farmaceutische en industriële toepassingen, nonlytic systemen die geen virale infectie inhouden duidelijke voordelen, maar vaak vergeten en onderbenut. Hier beschrijven we een werkwijze voor het nonlytic expressievectoren en transiënte expressie van recombinant eiwit. Dit protocol maakt een efficiënte cellulaire lokalisatie van recombinante eiwitten en kunnen worden gebruikt om snel te onderscheiden eiwittransport in de cel. We tonen de expressie van vier recombinante eiwitten in een in de handel verkrijgbaar insectencellijn, waaronder twee aquaporine eiwitten van insecten Bemisia tabaci, enals subcellulaire markereiwitten specifiek voor het cel plasmamembraan en intracellulaire lysosomen. Alle recombinante eiwitten werden geproduceerd als chimeren met fluorescerende eiwit markers aan hun carboxyl termini, die zorgt voor de directe detectie van de recombinante eiwitten. De dubbele transfectie van cellen met plasmiden constructen voor de genen van belang en een bekende subcellulaire marker zorgt voor live-cell imaging en verbeterde validatie van cellulaire eiwitten lokalisatie.
Introduction
De productie van recombinante eiwitten met behulp van expressie in insectencellen systemen biedt tal van voordelen voor de studie van eukaryotische eiwitten. Namelijk insectencellen bezitten soortgelijke posttranslationele modificaties, verwerking en sorteermechanismen als die welke in zoogdiercellen, hetgeen voordelig is voor het produceren van correct gevouwen eiwitten 1, 2, 3. Insectencel systemen ook typisch minder middelen en minder tijd en moeite voor het onderhoud dan zoogdiercellijnen 4, 5. Het baculovirus expressiesysteem is zo'n insectencellen gebaseerde systeem dat nu algemeen wordt gebruikt in vele disciplines, waaronder de productie van recombinante eiwitten voor eiwitkarakterisering en therapie, de immunogène presentatie van vreemde peptiden en virale eiwitten voor vaccinproductie, de synthese van multi -proteïne complexenDe productie van geglycosyleerde eiwitten, enz. 1, 2, 4, 6. Er zijn echter situaties waarin baculovirus expressie niet van toepassing 3, 7, en het gebruik van nonlytic en insecten transiënte expressiesystemen geschikter zijn. Bijzonder transiënte expressie in insectencellen biedt de mogelijkheid voor de snelle synthese van recombinant eiwit, vereist minder ontwikkeling en onderhoud, niet gepaard gaat met virale opgelegde cellysis en verschaft een middel om cellulaire transport beter bestuderen tijdens eiwitsynthese 7, 8, 9, 10.
Dit protocol beschrijft de snelle vorming van expressievectoren gebruikt tweestaps overlap extension PCR (OE-PCR) Escherichia coli. Plasmiden worden gebruikt om dubbel transfecteren handel verkrijgbaar gekweekte insectencellen en representatieve eiwitten. Het protocol beschrijft de productie en het gebruik van twee verschillende fluorescent gelabelde subcellulaire markereiwitten en toont colocalisatie twee aquaporine eiwitten van het insect Bemisia tabaci. Het volgende protocol geeft de basismethode voor OE-PCR, insectencel onderhoud en transfectie en fluorescentiemicroscopie voor de cellulaire lokalisatie van doeleiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. OE-PCR voor de bouw van expressieplasmiden
Opmerking: zie tabel 1 voor alle primers die in OE-PCR. Het gebruik van een high-fidelity DNA polymerase wordt aanbevolen voor alle amplificaties. Omdat deze enzymen vaak geen reactie 3'A, is het noodzakelijk om een korte, niet-amplificeren incubatie voeren met een Taq DNA polymerase 'A-staart' van de PCR-producten voordat ze kloneren in een TA insectencel expressie vector. Dit protocol wordt een methode voor het genereren insect expressie plasmiden chimere eiwitten, waarbij de fluorescerende eiwitten gefuseerd in-frame aan de carboxylterminus van de genen van belang (in casu twee Bemisia tabaci aquaporine eiwitten) of subcellulaire markereiwitten (Fig 1).
- Gebruik OE-PCR, die bestaat uit twee onafhankelijke rondes van amplificatie genereren: (1) die coderen voor de genen van belang (B. tabaciaquaporin 1: BtDrip1; B. tabaci aquaporin 2: BtDrip2_v1) gefuseerd in frame met een groen fluorescerend eiwit variant genaamd EGFP of (2) de subcellulaire markers (Drosophila melanogaster sex peptide receptor: DmSPR; Homo sapiens fosfolipase A2: HsPLA2) met mCherry coderende sequentie. Direct ligeren de uiteindelijke OE-PCR producten in de pIB / V5-His-TA plasmide.
- Voor de eerste ronde van OE-PCR (aangeduid met AD en A'-D' in figuur 1), gebruik van een gen-specifieke sense primer (vetgedrukt in Tabel 1) en een chimeer antisense primer (cursief in Tabel 1) gevonden de laatste 15 bp (zonder het stopcodon) van het gen van interesse / subcellulaire marker en 15 bp van het 5'-uiteinde van het gewenste fluorescerend eiwit (EGFP of mCherry) een productmengsel met een 3'-overhang genereren.
Opmerking: Zie tabel 2 voor PCR omstandigheden. - In een afzonderlijke buis, gebruik van een gen-specific fluorescerend eiwit antisense primer (afgebeeld met een onderstreping in tabel 1) en een chimère sense primer die 15 bp van het 3'-uiteinde van het gen van interesse / subcellulaire marker en 15 bp van het 5'-einde van de gewenste fluorescerende bevat eiwit aan een product met een 5'-overhang te genereren.
Opmerking: zie tabel 2 voor de PCR-omstandigheden. De PCR-matrijs kan hetzij een sequentie gevalideerde PCR product of, liever, plasmide-DNA dat de gewenste sequentie. De hier beschreven onderzoek maakt gebruik sequentie gevalideerde plasmiden. - Scheid de PCR producten met 1% agarose gelelektroforese (met behulp van standaard moleculair-grade agarose).
- Accijns en zuiveren van de producten van de verwachte afmetingen (zie tabel 2) met een commercieel beschikbare DNA gelextractiekit (zie de tabel van materialen voor de specifieke uitrusting die in dit protocol).
- Met de gel gezuiverde PCR-producten van stap 1.1.4 de definitieve overlap e genererenXTensie producten (aangegeven met A '- D '' in figuur 1). Met een gen sense primer voor het betreffende gen / subcellulaire marker en het overeenkomstige gen-specifieke antisense primer voor het fluorescerende eiwit aan de gewenste chimere sequentie te genereren.
Opmerking: zie tabel 2 voor de PCR-omstandigheden. Het kan nodig zijn om de optimale hoeveelheden eerste ronde overlap verlengingsproducten empirisch vast te voegen aan het reactiemengsel om het uiteindelijke volledige lengte chimere PCR product. - Scheid de tweede ronde OE-PCR producten door 1% agarose gelelektroforese. Accijns en zuiveren van de producten met behulp van een commercieel verkrijgbare DNA-gelextractiekit.
- Incubeer gel gezuiverde tweede ronde OE-PCR producten met 1 eenheid Taq DNA-polymerase master mix gedurende 10 minuten bij 72 ° C aan het 3'-geadenyleerde (dwz A-staart) producten nodig voor TA klonering genereren.
- Ligeren van de resulterende geadenyleerde productenpIB in de expressievector en het gebruik van standaard moleculaire kloneringstechnieken om chemisch competente (hitteschok) of elektrocompetente (elektroporatie) Escherichia coli cellen te transformeren. Plaat overnacht op medium dat de geschikte selectiemerker (bijvoorbeeld ampicilline of carbenicilline).
- Uitvoeren van kolonie-PCR 12 met behulp van een vector-specifieke primer en een plaats-specifieke primer voor insertie-positieve kolonies die zijn getransformeerd met expressie- plasmiden die een insert in de 5'-3' oriëntatie te identificeren. Bereid 's nachts culturen van kolonies genereren van PCR-producten van de verwachte grootte.
- Isoleer plasmide-DNA met behulp van een commercieel verkrijgbare DNA zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materialen voor de specifieke uitrusting die in dit protocol). Valideer de sequentie integriteit van elk inzetstuk door directe DNA-sequentiebepaling.
- Voor de eerste ronde van OE-PCR (aangeduid met AD en A'-D' in figuur 1), gebruik van een gen-specifieke sense primer (vetgedrukt in Tabel 1) en een chimeer antisense primer (cursief in Tabel 1) gevonden de laatste 15 bp (zonder het stopcodon) van het gen van interesse / subcellulaire marker en 15 bp van het 5'-uiteinde van het gewenste fluorescerend eiwit (EGFP of mCherry) een productmengsel met een 3'-overhang genereren.
Opmerking: Om steriele omstandigheden te handhaven over tot alle cellen manipulaties die de opening van de weefselkweek kolf onder een laminaire stroming kap. Schakel de laminaire stroming kap UV kiemdodende lamp tenminste 1 uur voor cel manipulaties. Draag nitril en decontamineren oppervlak van de bank, pipetten, werktuigen, buizen en kolven met 70% ethanol voor het gebruik ervan. Bekendheid met elementaire celcultuur technieken wordt aanbevolen 13.
- Gebruik Tni cellen (een gevestigde celcultuur die afgeleid van Trichoplusia ni ovarieel weefsel) die zijn aangepast aan serumvrij medium en onderhouden als hechtende monolaag kweek in serumvrij insect medium bij 28 ° C in T25 weefselkweekflessen.
- Handhaven Sf9-cellen (een gevestigde celcultuur die afgeleid is van Spodoptera frugiperda ovariële weefsel) die gelijk maar met gebruik TNM-FH insect kweekmedium supplemented met 10% foetaal runderserum (FBS).
- Zaad van de eerste kweek uit bevroren Sf9 of Tni-cellen door het verwijderen stock flesjes van -80 ° C en zodat ze ontdooien in een 37 ° C waterbad. Decontamineren flesjes met 70% ethanol na ontdooien en plaats ze op ijs.
- Voeg 4 ml insectencel medium in nieuw T25 fles en breng 1 ml van het ontdooide insectencel suspensie. Plaats de kolf in een 28 ° C, niet-bevochtigde incubator en de cellen te laten hechten gedurende 30-45 min.
- Vervang het enten medium met 5 ml van het geschikte medium en de flessen te brengen naar een 28 ° C niet bevochtigde incubator. Monitor cel samenvloeiing dagelijks. Passage van de cellen bij het bereiken van 90% samenvloeiing.
Opmerking: de volledige dekking van T25 fles overeenkomt met ~ 5 x 10 6 cellen. - Insectencel passage.
- Om doorgang de cellen eerst de uitgeputte medium uit de confluente kolf met cellen met een steriele 5 ml serologische pipet.Kantel de kolf zodat het medium stroomt naar een hoek, weg van de celmonolaag. Verwijder voorzichtig het medium met behulp van een pipet zonder verstoring van de cellen.
- Los TNI cellen door zachtjes spoelen van de T25 kolven met de confluente monolaag met 4 ml serumvrij medium insect middels nieuwe, steriele, 5 ml serologische pipet. Verplaats de pipetpunt in de kolf langzaam irrigatie cellen losjes bevestigd aan de bodem kolf te verwijderen.
- Controleer de adequate losmaken van cellen door alle media, het draaien van de kolf, en het waarnemen dat de bodem van de kolf helder.
- Voor Sf9-cellen, die strakker hechten wordt 4 ml vers TNM-FH-medium en gebruikt een cel schraper om de gehechte cellen te verwijderen. Met een 5 ml serologische pipet zachtjes mengen en verkleinen cellen klonteren.
- Gebruik een geautomatiseerde celteller het aantal levensvatbare insectencellen per volume medium schatten. Overdracht 0,1 ml cellen / mediummengsel met 1,5 mLmicrofugebuis. In een afzonderlijke 0,5 ml microcentrifugebuis, voeg 10 ul cellen / mediummengsel 10 pi van trypan blauw.
- Verwijderen celteller kamer slede uit de verpakking en voeg 10 ul van de cel / medium / trypan blue mengsel aan weerszijden van de slede tellen. Steek de schuif in de cel teller en bepaal de celdichtheid en de levensvatbaarheid.
- Gebruik van de celdichtheid, bereken en voeg de juiste hoeveelheid van insectencellen celmedium (maximaal 5 ml) nieuwe, steriele T25 flessen.
- Breng ongeveer 1-1,5 x 10 6 cellen T25 flessen met vers medium; etiket van de flessen met de cellijn, datum, drager, aantal cellen toegevoegd en passage nummer (Pn + 1 generatie, waarbij P n is het aantal passages van de vorige generatie cellen); en plaatst de flessen in een 28 ° C incubator gedurende maximaal 72 uur.
Opmerking: Insectencellen kunnen continu worden voortgeplant, hoewel cellen minder ontvankelijk voor transfectie en / of heteroloog kan zijneiwitexpressie na 30 passages. Behandelen weggegooid cellen / Media met 10% bleekmiddeloplossing autoclaaf en wegwerp plastic waren vóór verwijdering.
3. insectencel Transfectie
- Zaad een T25 kolf met tot 1 x 10 6 Tni of Sf9-cellen in een geschikt insectencel medium (serumvrij insect medium voor Tni en TNM-FH Sf9) en groeien tot confluentie gedurende 72 uur bij 28 ° C.
- Verwijder de oude medium en los de cellen met 4 ml vers serumvrij insectenmedium (zie stap 2.6.2 en 2.6.3 hierboven).
- Schat de celdichtheid met behulp van een geautomatiseerde celteller (zie stap 2.6.4, hierboven).
- Voeg ongeveer 7 x 10 5 cellen afzonderlijke 35 mm glazen bodem gerechten en de cellen te laten hechten gedurende 20-25 minuten bij 28 ° C.
- Voor elke transfectie, voeg 2 pg plasmide DNA (hetzij een plasmide voor enkele transfecties of 2 ug van elk van de twee plasmiden voor doeuble transfecties) tot 0,1 ml serumvrij insectenmedium (zonder FBS zowel Sf9 en Tni transfecties) in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis.
- In een afzonderlijke buis, meng 8 pl transfectiereagens met 0,1 ml serumvrij medium insecten en breng deze oplossing aan de buis bevattende het plasmide-DNA van belang. Licht vortex en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20-30 min.
- Verdun het plasmide-transfectie mengsel van stap 3.5 en 3.6 met 0,8 ml serumvrij medium insect, zodat het totale volume gelijk aan 1 ml.
- Verwijder voorzichtig de media uit de glazen schalen met aangehechte cellen. Overlay de aangehechte cellen met het verdunde plasmide-transfectie medium.
- Incubeer de cellen bij 28 ° C gedurende 5 uur.
Opmerking: De omstandigheden voor transfectie vereist empirische optimalisatie voor maximale transfectie-efficiëntie (bijvoorbeeld overnacht transfectie plaats van 5 uur, de hoeveelheid plasmide-DNA dat de chemie van het transfectiereagensgebruikt, enz.). - Verwijder de transfectie medium en voorzichtig wassen van de cellen met 1 ml serumvrij medium insect, dat evenwel niet om cellen los te maken.
- Voeg 2 ml vers insectencel medium (serumvrij insect medium voor Tni en TNM-FH Sf9) en incubeer bij 28 ° C gedurende 48-72 uur.
Opmerking: Nogmaals, dit vereisen empirische optimalisatie voor maximale expressie van heteroloog eiwit.
4. Confocale fluorescentie microscopie
- Op 48-72 h na transfectie was de cellen eenmaal met 1 ml IPL-41 insectenmedium en dek af met 2 ml IPL-41 voor beeldvorming.
Opmerking: Deze wasstap vermindert de achtergrond auto-fluorescentie waargenomen met insect cel medium dat wordt gebruikt in normale cel onderhoud. - 4 druppels Hoechst levende cellen kleurend reagens (zie de tabel van materialen voor de specifieke nucleaire kleurstof gebruikt in dit protocol) aan het medium en incubeer bij 28 ° C gedurende 20-25 min.
Opmerking: Extra nucLear vlekken kunnen worden gesubstitueerd, hoewel de kleurstof een fluorescentieprofiel uniek van EGFP en mCherry moeten hebben. - Plaats een 35 mm schaal in de in zichzelf besloten laser scanning confocale microscoop (zie de tabel van materialen voor het specifieke instrument dat in dit protocol).
- Stel de microscoop voor Hoechst, EGFP en mCherry observatiecondities: Hoechst excitatie / emissie - 359/461 nm; EGFP excitatie / emissie - 489/510 nm; mCherry excitatie / emissie - 580/610 nm.
- Uitvoeren van een initiële scan met een 10x objectief fluorescerende expressie te bevestigen en daarna naar aftastmodus met gebruik van een 60X fasecontrast water immersie objectief.
- Pas het laservermogen (5-7%), detectorgevoeligheidsbereik (47-49%), scansnelheid, Z-as diepte en digitale zoomfunctie om het beeldcontrast en resolutie optimaliseren. Het imago van de cellen met 1,5x digitale zoom om een totaal van 90X versterking te geven.
Opmerking: Microscoop parameters nodig empirische aanpassing voor optimalebeeldcollectie en kunnen specifiek zijn voor het instrument in gebruik. - Exporteer de ruwe data zoals TIFF beeldbestanden en wijzigen (gewas en overlay) voor de figuur generatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OE-PCR
OE-PCR maakt de synthese van chimere DNA-producten die, wanneer in een expressievector ingebracht, maken de productie van recombinante chimere eiwitten overeenkomend naar proeven gen van belang en fluorescent merkereiwit. Figuur 1 een algemeen schema voor de bereiding van expressievectoren die pIB B. tabaci aquaporine coderende sequenties (BtDrip1 en BtDrip2_v1) in-frame met het fluorescerende proteïne EGFP marker. In dit scenario zijn twee BtDrip chimere eiwitten die EGFP tot hun carboxy termini geproduceerd. Dit protocol toonde ook werkwijzen voor het ontwikkelen van twee insecten subcellulaire markereiwitten, DmSPR en PLA2G15 (figuur 1), geproduceerd zoals chimeren met mCherry aan hun carboxyl termini. EGFP en mCherry werden gekozen omdat hun emissiespectra voldoende uiteen, waardoor tHij onafhankelijke detectie en co-localisatie van signalen van de test eiwitten (bijv., BtDrip-EGFP) en DmSPR- en PLA2G15 mCherry-gelabelde marker eiwitten. Alle PCR-reacties geproduceerde banden van de verwachte grootte en werden met succes gekloond in pIB. Alle plasmiden werden bevestigd door DNA-sequentiebepaling om de juiste inserties in de juiste oriëntatie en in-frame met fluorescerend eiwit merkers.
Transiënte expressie van recombinant eiwit in insecten celkweek
Na de constructie van expressievectoren die overeenkomt met pIB / BtDrip1-EGFP, pIB / BtDrip2_v1-EGFP, pIB / DmSPR-mCherry en pIB / PLA2G15-mCherry werden cellen getransfecteerd en de expressie van recombinante eiwitten in levende cellen werd gevisualiseerd met behulp van confocale fluorescentie microscopie (Figuur 2). Succesvolle transfectie en expressie van recombinant BtDrip1-EGFP is duidelijk by de aanwezigheid van groene fluorescentie op het oppervlak van Tni cellen (Figuur 2B, 2F). Groene fluorescentie waargenomen in cellen die met Tni BtDrip2_v1-EGFP (figuur 2J, 2N) waarin de intracellulaire expressie van BtDrip2_v1. Evenzo Tni cellen die met pIB / DmSPR-mCherry (figuur 2C, 2K) of pIB / PLA2G15-mCherry (figuur 2G, 2O) vertonen rode fluorescentie, waarin de expressie van de respectievelijke chimeren.
Co-lokalisatie van recombinante eiwitten en BtDrip subcellulaire markers
De dubbele transfectie van cellen Tni maakt de co-expressie van twee fluorescerend gemerkte eiwitten. Overlay afbeeldingen Tni getransfecteerde cellen die oranje / geel zijn geven aan dat cellen die plasmiden herbergen die zowel EGFP en mCherry en suggereren dat de eiwitten mede gelokaliseerd binnen dezelfde subcellular structuren (figuur 2D, 2H, 2L en 2P). Dit bevestigt eerdere resultaten BtDrip1 en DmSPR expressie worden gebracht op het celoppervlak 14, 15, 16. Een bekleding van Tni cellen dubbel getransfecteerd met pIB / BtDrip1-EGFP en pIB / DmSPR-mCherry toont overlapping van de groene en rode fluorescentie signalen (Figuur 2D), wat suggereert co-lokalisatie van BtDrip1-EGFP en DmSPR-mCherry op het celoppervlak . Voorheen Maroniche et al. 17 aangetoond dat PLA2G15 een marker van intracellulaire lysosomen bij expressie in Sf9-cellen een chimeer met mCherry. Hoewel voorspeld werd dat de recombinante BtDrip2_v1 EGFP-eiwit zou translocatie naar het celoppervlak, werd eerder aangetoond dat het chimere eiwit voornamelijk intracellulair is gelokaliseerd in getransfecteerde cellen 15 Tni. Ter ondersteuning van dit, was er weinig Evidence voor co-lokalisatie van groene en rode fluorescentiesignalen bij BtDrip2_v1-EGFP werd mede tot expressie gebracht met pIB / DmSPR-mCherry (Figuur 2L). In tegenstelling, de co-expressie van pIB / BtDrip2_v1-EGFP en pIB / PLA2G15-mCherry resulteerde in een significante overlap in de cytoplasmatische groene en rode fluorescentiesignalen (figuur 2P), sterk suggereert dat BtDrip2_v1 waarschijnlijk wordt verhandeld intracellulaire lysosomen.
Figuur 1: Schema voor het bouwen expressieconstructen gebruikt Overlap Extension PCR (OE-PCR). OE-PCR wordt gebruikt om pIB expressievectoren die het bouwen Bemisia tabaci aquaporine-1 / EGFP (BtDrip1-EGFP), B. tabaci aquaporine-2_variant 1 / EGFP (BtDrip2_v1-EGFP), Drosophila melanogaster geslacht peptide receptor / mCherry (DmSPR- mCherry) en Homo sapiens fosfolipase-A2 / mCherry(HsPLA2G15-mCherry) producten. De eerste ronde van OE-PCR genereert fragmenten die overeenkomen met het volledige-lengte cDNA van interesse, BtDrip1 (A), BtDrip2_v1 (B), DmSPR (C) en HsPLA2G15 (D), dat een kleine 3'overlappend gebied dat overeenkomt met de 5'-uiteinde van ofwel de EGFP of mCherry fluorescente merker eiwitten. Tegelijkertijd, volledige lengte cDNA's van EGFP en mCherry worden PCR geamplificeerd en bevat een kleine 5'overlappende gebied dat overeenkomt met het 3'-uiteinden van BtDrip1 (A '), BtDrip2_v1 (B'), DmSPR (C) of HsPLA2G15 ( D'). Merk op dat alle primers gebruikt om het cDNA van belang (bijv BtDrip1, BtDrip2_v1, DmSPR en HsPLA2G15) amplificeren in de eerste ronde van OE-PCR niet de stopcodon die normaal aan het 3'-uiteinde van elke coderende sequentie. All eerste ronde OE-PCR producten geamplificeerd, gescheiden door agarosegel electrophoresis en gel-gezuiverd. De tweede ronde van OE-PCR gebruikt gepoolde paren van de gel gezuiverde PCR-producten uit de eerste ronde van OE-PCR als matrijzen voor de amplificatie van de volledige lengte chimere producten. Voor elke reactie, de sense primer correspondeert met het 5'-uiteinde van het cDNA van interesse coderende sequenties en de antisense primer is complementair aan het 3'-uiteinde van EGFP of mCherry, met een stopcodon intact (A ', B' 'C' en D '). De vier tweede ronde OE-PCR producten op gel gezuiverd, geadenyleerd met Taq-polymerase, en geligeerd in de pIB / V5-His- expressievector. Plasmiden worden vermeerderd in E. coli en gezuiverd plasmide-DNA wordt gebruikt om insectencellen te transfecteren. De B. tabaci aquaporines BtDrip1 en BtDrip2_v1 getoond in donkerblauw en cyaan, respectievelijk, en de subcellulaire markers DmSPR en PLA2G15 zijn in oranje en roze resp. EGFP is sheigen in groen en mCherry is in het rood. Gekleurde pijlen geven de richting (sense primers in de voorwaartse richting en antisense primers in de omgekeerde richting) en de plaats van genspecifieke primers (de kleur van een primer geeft de bron van de primersequentie). Zie tabel 1 voor primer details. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Live-Imaging van dubbel getransfecteerde cellen die recombinant Tni BtDrip1-EGFP, BtDrip2_v1-EGFP, DmSPR-mCherry en PLA2G15-mCherry eiwitten. Trichoplusia ni (Tni) werden dubbel getransfecteerd met pIB / BtDrip1-EGFP en pIB / DmSPR-mCherry (AD), pIB / BtDrip1-EGFP en pIB / PLA2G15-mCherry (EH), pIB / BtDrip2_v1-EGFP en pIB / DmSPR -mCherry (<strong> IL), of pIB / BtDrip2_v1-EGFP en pIB / PLA2G15-mCherry (MP). Beelden werden vastgelegd met een laser scanning confocale microscoop met een 60X fasecontrast water-immersie objectief (NA 1,2) bij 90X amplificatie. De Hoechst panelen tonen representatieve live cell beelden van gebrandschilderd celkernen (ex / em = 359/461 nm). EGFP fluorescentie panelen tonen de expressie van cellen getransfecteerd met EGFP chimeren (ex / em = 489/510 nm). De mCherry panelen tonen de fluorescentie expressie van cellen getransfecteerd met chimeren mCherry (ex / em = 580/610 nm). Het samenvoegen paneel toont de overlay van de drie fluorescente kanalen (bijv Hoechst, EGFP, en mCherry). Schaalstaaf = 10 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heterologe eiwitexpressie zijn belangrijk voor de vervaardiging van recombinante eiwitten gebruikt in talrijke afgeleide toepassingen 4. Het kiezen van de diverse expressiesystemen beschikbaar afhankelijk van het einddoel voor het eiwit van belang. Verschillende expressie in insectencellen systemen zijn beschikbaar die flexibele alternatieven voor prokaryote en eukaryote celexpressiesystemen 5, 6 te bieden. Insecten systemen die baculovirus infectie eiwitexpressie te drijven zijn veruit de meest populaire en meest gebruikte insectensysteem wordt door vele zulke eiwitten gebruikt voor onderzoek en therapeutische toepassingen 1, 2, 3. Baculovirus expressie komt hebben echter beperkingen, zoals: 1) de virale levenscyclus omvat de lysis van de gastheercel; 2) de gastheercellen worden gelyseerd die meestal vrij hoog amounts afbrekende enzymen; 3) het genereren van stabiele cellijnen is tijdrovend en kunnen niet haalbaar voor cytotoxische eiwitten; 4) discontinu expressie vereist frequent onderhoud; 5) vector generatie brengt vaak meervoudige kloneringstappen; 6) insectencel dichtheden vaak omgekeerd evenredig met virale infectie; en 7) recombinant eiwitten zijn vooral verhandeld op een hoog niveau op het celoppervlak of uitgescheiden 3, 7, 9, 10. Nonlytic transiënte genexpressie op basis insectencel transfectie met plasmide DNA biedt een alternatieve techniek voor de productie van recombinante eiwitten, zonder enige van de unieke uitdagingen in verband met baculovirussen 7, 8. Namelijk, voorbijgaande expressie in insectencellen biedt kortere turn-around on vector bouw en eiwitsynthese, vermijdt challeng es geassocieerd met virale infectie en cellysis en een robuuste wijze om de cellulaire transport van eiwitten nemen.
Hier werden twee gevalideerde expressieconstructen gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van het B. tabaci Aquaporin eiwitten BtDrip1 en BtDrip2_v1 bepalen. DmSPR-mCherry is een marker voor de plasmacel membraan 16 en PLA2G15-mCherry lokaliseert in cellulaire lysosomen 17. Figuur 2 de waarde van dergelijke merkers voor de beoordeling van de locaties van eiwitten van belang in dit geval, de co-lokalisatie van BtDrip1-EGFP met DmSPR-mCherry aan het celoppervlak en BtDrip2_v1-EGFP met PLA2G15-mCherry in lysosomen. Daarom, zoals hier getoond en beschreven in eerdere onderzoeken 14, 15, 16, 18, 19,ass = "xref"> 20, kan deze methodologie worden gebruikt om snel bepalen eiwittransport in insectencellen. Hoewel eiwitexpressie en de handel in Tni cellen here (figuur 2) is weergegeven, is het belangrijk op te merken dat het protocol kan worden geoptimaliseerd en evengoed toegepast op andere insecten cellijnen (Sf9, Sf21, BM-N, S2, etc.) .
Zoals alle heterologe eiwitexpressie systemen zijn er beperkingen voor transiënte eiwitproductie in gekweekte insectencellen. Namelijk het percentage cellen positief voor expressie plasmide afgeleide doorgaans lager is dan die bereikt met baculovirus of gebruiken stabiele cellijnen. Aldus is de hoeveelheid recombinant eiwit (ten) die lager zijn in een voorbijgaande systeem; echter kan het gebruik van verschillende promoters en de opname van genetische enhancers deze potentiële beperking 7, 21, 22 overwonnen. TZijn protocol toont de co-transfectie van cellen met twee Tni pIB vectoren herbergen elk ander eiwit coderende sequenties (Figuur 2). Hoewel soortgelijke transfectie-efficiënties werden waargenomen voor alle vier expressievectoren gebruikt om de Tni cellen (gegevens niet getoond) te transfecteren, is dit niet altijd mogelijk. Derhalve kunnen dergelijke experimenten met transiënte expressievectoren uitgebreide empirische optimalisatie vereisen (bijv variatie in de hoeveelheid van elke vector, transfectie tijd transfectiereagens chemie, etc.) gelijkwaardige transfectie-efficiëntie en / of niveaus van expressie van recombinant eiwit te bereiken. Verder is het mogelijk dat de toevoeging van een fluorescerend eiwit kunnen beïnvloeden of beperken subcellulaire handel eiwit target 23, 24. De identificatie van de subcellulaire co-lokalisatie van beide eiwitten door de waarneming van fluorescentie met markereiwitten niet necessarily geven directe eiwit-eiwit interacties tussen de eiwitten van belang 24, 25. Derhalve is voorzichtigheid geboden bij de interpretatie van dergelijke co-lokalisatie resultaten.
Transiënte genexpressie heeft verschillende voordelen bieden ten opzichte van momenteel verkrijgbare baculovirus expressiesystemen. Transiënte expressie vergt minder tijd en arbeid voor de constructie van vectoren en voor de synthese van recombinant proteïnen, heeft kortstondige expressie niet cellysis geassocieerd met pathogene levenscyclus van baculovirus omvatten en tijdelijke expressie kan een betere studie te verschaffen voor de subcellulaire handel in eiwitten 3, 7, 9. Dit protocol wijst op het gemak en de snelheid van opbouw constructen door de directe incorporatie van een gen van belang in de pIB expressievector gebruikt overlap extension PCR (Figuur 1 26. En hoewel EGFP 27 en 28 mCherry Hier werden opgenomen in de carboxyl termini van twee B. tabaci aquaporine eiwitten, kunnen OE-PCR worden gebruikt om vele andere variante fluorescente merker eiwitten plaats 26 aan de amino-termini van deze eiwitten. Opvallend is dat, naast tal expressieplasmiden gebouwd met OE-PCR, werden veel traditionele expressieklonering cassettes bereid en kunnen worden gebruikt voor vrijwel elk eiwit van interesse in-frame met de fluorescerende eiwitten EGFP, Venus en mCherry produceren, gefuseerd aan ofwel het amino- of uiteinden. Dergelijke expressiecassettes zijn op aanvraag.
De tijd van "genomics" een ongekende hoeveelheid en toegang tot zinvolle d verstrektata. Echter, het verschil steeds groter tussen de genen en de toewijzing van de functie genproducten; aldus, worden extra empirische instrumenten hard nodig om functionele genomica te versnellen. Dat gen-editing en andere in vivo genmanipulatie systemen kan uiteindelijk zorgen typische methoden voor het toekennen van genfunctie, zullen heteroloog eiwit expressiesystemen waarschijnlijk blijven belangrijk voor biomanufacture waardevolle eiwitten en ontcijferen van eiwitstructuur en functie. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de verbeterde constructie van expressieplasmiden en de transiënte expressie van recombinant eiwitten in insectencellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Lynn Forlow-Jech en Dannialle LeRoy voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door base CRIS financiering van USDA ARS, Nationaal Programma 304 - Crop Protection and Quarantine [Project # 2020-22620-022-00D] om JAF en JJH Vermelding van handelsnamen of commerciële producten die in dit artikel is alleen voor het doel van het verstrekken van specifieke informatie en impliceert geen aanbeveling of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van Landbouw. USDA is een gelijke kans provider en werkgever.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
References
- Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).
- Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).
- Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
- Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).
- Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. , Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).
- Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
- Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).
- Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
- Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).
- Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).
- Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).
- Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific. Available from: http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0 (2014).
- Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).
- Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
- Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).
- Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).
- Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).
- Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).
- Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
- Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
- Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).
