Summary
מערכות Nonlytic ביטוי תא חרקים הם מנוצלים לייצור, סחר / לוקליזציה הסלולר, וניתוח פונקציונלי חלבון רקומביננטי. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת וקטורי ביטוי והבעת חלבון חולפת עוקבת בשורות תא פרפראים זמינות מסחרי. שיתוף הלוקליזציה של aquaporins tabaci Bemisia עם חלבונים בסמן פלורסנטי התת-תאי מוצגת גם.
Abstract
מערכות חלבון ביטוי Heterologous משמשות לייצור חלבונים רקומביננטיים, הפרשנות של סחר / לוקליזציה הסלולר, ואת הנחישות של הפונקציה ביוכימית של חלבונים ברמה תת-אורגניזמים. למרות שמערכות ביטוי baculovirus משמשות יותר ויותר לייצור חלבון ביוטכנולוגית רבה, תרופות, ויישומים תעשייתיים, מערכות nonlytic שאינו כרוכות זיהום ויראלי יש יתרונות ברורים, אבל הם לעתים קרובות התעלמו ו מנוצלים. כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת וקטורי ביטוי nonlytic וביטוי חלבונים רקומביננטיים חולף. פרוטוקול זה מאפשר לוקליזציה הסלולר היעילה של חלבונים רקומביננטיים וניתן להשתמש בו כדי להבחין סחר חלבון במהירות בתוך התא. אנחנו מראים את הביטוי של ארבעה חלבונים רקומביננטיים בקו תא חרק זמין מסחרי, לרבות שני חלבוני aquaporin מן tabaci Bemisia החרקים, כמו גםכמו חלבוני סמן התת-תאי ספציפיים עבור הממברנה תא עבור lysosomes התאי. כל החלבונים רקומביננטי הופקו כמו מפלצות עם סמנים חלבון פלואורסצנטי ב Termini carboxyl שלהם, המאפשר זיהוי ישיר של חלבונים רקומביננטיים. Transfection הכפול של תאים עם פלסמידים מחסה בונים עבור הגנים של ריבית סמן התת-תאי ידוע מאפשר הדמית תא חייה ואימות משופרת של לוקליזציה חלבון הסלולר.
Introduction
ייצור חלבונים רקומביננטיים באמצעות מערכות ביטוי תא חרק מציע יתרונות רבים ללימוד חלבונים איקריוטיים. כלומר, תאי חרקים בעלי שלאחר translational שינויים דומים, עיבוד, ומנגנוני מיון כמו הנוכחים בתאי יונקים, המהווה יתרון לייצור חלבוני 1 מקופל כראוי, 2, 3. גם מערכות תא חרקים בדרך כלל דורשים פחות משאבים ופחות זמן ומאמץ לצורך תחזוקה מ שורות תאים יונקים 4, 5. מערכת ביטוי baculovirus היא מערכת מבוססת תא חרק אחד כזה, כי הוא עכשיו בשימוש נרחב בתחומים רבים, כוללים הייצור של חלבונים רקומביננטיים עבור ואפיון חלבונים ותרופות, מצגת immunogenic של פפטידים זרים וחלבונים נגיפיים לייצור חיסון, הסינתזה של רב מתחמי -protein, ייצור של חלבונים glycosylated, וכו. 1, 2, 4, 6. יש, עם זאת, במצבים בהם ביטוי baculovirus לא יכול להיות ישים 3, 7, ושימוש במערכות ביטוי חרקים nonlytic וחולפת עשוי להיות מתאים יותר. באופן ספציפי, ביטוי תא חרק חולף מציע את האפשרות לסינתזה המהירה של חלבון רקומביננטי, דורש פחות פיתוח ותחזוקה, אינו כרוכות ימסו תא ויראלי שהוטל, ומספק אמצעי ללמוד סחר הסלולר טוב יותר במהלך חלבון סינתזה 7, 8, 9, 10.
פרוטוקול זה מתאר את הדור המהיר של וקטורי ביטוי באמצעות הארכת חפיפת שני שלבי PCR (OE-PCR) coli Escherichia. פלסמידים משמשים-transfect הכפול זמינים מסחרי תאי חרק מתורבתים כדי לייצר חלבוני נציג. הפרוטוקול מתאר את ייצור ושימוש שני חלבונים שונים fluorescently שכותרתו התת-תאי סמן ומדגים colocalization עם שני חלבונים aquaporin מן tabaci Bemisia חרקים. הפרוטוקול הבא מספק את המתודולוגיה הבסיסית עבור OE-PCR, תחזוקת תא חרקי transfection, מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור הלוקליזציה של חלבוני יעד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. OE-PCR עבור בניית פלסמידים ביטוי
הערה: ראה טבלה 1 עבור כל פריימרים המשמשים OE-PCR. שימוש DNA פולימרז באיכות גבוהה מומלץ לכל הרחבות. עם זאת, בגלל אנזימים אלה לעתים קרובות לא להשאיר 3' א ', יש צורך לבצע דגירה קצרה, הלא הגברה עם DNA פולימרז תקי 'א-זנב' את PCR מוצרים לקראת שיבוט אותם לתוך ביטוי תא חרק ת"א וֶקטוֹר. פרוטוקול זה מדגים שיטה להפקת פלסמידים ביטוי חרקים מחסה חלבונים כימרי, עם חלבוני ניאון התמזגו בתוך מסגרת עד למסוף carboxyl של הגנים של עניין (במקרה זה, שני חלבונים aquaporin Bemisia tabaci) או חלבונים סמן התת-תאי (איור 1).
- השתמש OE-PCR, אשר מורכב משני סיבובים עצמאיים של הגברה, כדי ליצור: (1) רצפי קידוד הגנים של עניין (B. tabaciaquaporin 1: BtDrip1; ב tabaci aquaporin 2: BtDrip2_v1) התמזגו בתוך מסגרת עם גרסה חלבון פלואורסצנטי ירוק שנקרא EGFP או (2) הסמנים התת-תאי (תסיסנית קולטן פפטיד מין: DmSPR; A2 פוספוליפאז ההומו ספיינס: HsPLA2) עם רצף קידוד mCherry. ישירות ולקשור את מוצרי OE-PCR הסופי לתוך פלסמיד PIB / V5-שלו-ת"א.
- לסיבוב הראשון של OE-PCR (מסומנת לספירה ו A'-D" באיור 1), להשתמש פריימר תחושת גן ספציפי (המודגשת בטבלה 1) ו פריימר antisense כימרי (באות נטויה בטבלה 1) המתאים אל 15 נ"ב הסופי (ללא קודון עצירה) של הגן של סמן ריבית / התת-תאי וכדי 15 נ"ב של סוף 5'של חלבון פלואורסצנטי הרצוי (EGFP או mCherry) כדי ליצור מוצר עם הסככה 3' .
הערה: ראה טבלה 2 תנאי PCR. - בצינור נפרד, להשתמש גן-specifפריימר antisense פלורסנט חלבון IC (מוצג עם קו תחתון בטבלה 1) ו פריימר תחושת כימרי המכיל 15 נ"ב מן הקצה 3'של של הגן של סמן ריבית / התת-תאי ו 15 נ"ב מן הקצה 5'של פלורסנט הרצוי חלבון כדי ליצור מוצר עם צילון 5' .
הערה: ראה טבלה 2 עבור תנאי PCR. תבנית PCR או יכולה להיות מוצר PCR-תוקף ברצף או, יותר רצוי, פלסמיד דנ"א מחסת הרצף הרצוי. המחקר המתואר כאן משתמש פלסמידים-תוקף ברצף. - הפרד את מוצרי ה- PCR עם 1% ג'ל אלקטרופורזה agarose (באמצעות agarose מולקולרית כיתה רגילה).
- ובלו ולטהר את המוצרים גדלים הצפוי (ראה טבלה 2) באמצעות ערכת חילוץ ג'ל DNA זמינה מסחרי (ראה טבלת חומרים עבור הערכה הספציפית להשתמש בפרוטוקול זה).
- השתמש במוצרי PCR מטוהר ג'ל משלב 1.1.4 על מנת ליצור את דואר החפיפה הסופימוצרי xtension (מסומן על ידי "" - ד "" באיור 1). השתמש פריימר תחושת גן ספציפי עבור הגן של סמן ריבית / התת-תאי ואת פריימר antisense גן ספציפי המתאים עבור חלבון פלואורסצנטי כדי ליצור רצף כימרי הרצוי.
הערה: ראה טבלה 2 עבור תנאי PCR. זה עשוי להיות נחוץ כדי לקבוע את הכמות האופטימלית אמפירי של מוצרי המשך חפיפה בסיבוב הראשון להוסיף לתערובת התגובה להניב מוצר PCR כימרי הסופי, באורך מלא. - הפרד את המוצרים בסיבוב השני OE-PCR על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose 1%. ובלו ולטהר את המוצרים באמצעות ערכת חילוץ ג'ל DNA זמינה מסחרי.
- דגירה מוצרים OE-PCR בסיבוב השני מטוהרים ג'ל עם 1 יחידה של שילוב הורים פולימראז תקי DNA עבור 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס כדי ליצור את המוצרים 3' adenylated (כלומר A-זנב) הדרושים שיבוט ת"א.
- ולקשור שהתקבלו מוצרי adenylated לתוך וקטור ביטוי PIB ולהשתמש בטכניקות שיבוט מולקולרי רגילות להפוך תאי coli Escherichia מוסמך כימי (חום הלם) או electrocompetent (electroporation). פלייט לילה על מדיום המכיל את סמן הבחירה המתאימה (כלומר, אמפיצילין או carbenicillin).
- בצעו המושבה PCR 12 באמצעות פריימר וקטור ספציפי פריימר הכנס ספציפי לזהות מושבות הכנס חיובי כי כבר הפך עם פלסמידים ביטוי מחסה אינסרט באוריינטציה 5'-3' . הכן תרבויות לילה של מושבות יצירת מוצרי PCR הגדלים הצפויים.
- לבודד פלסמיד דנ"א באמצעות ערכת טיהור DNA זמינה מסחרי בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת החומרים עבור הערכה הספציפית להשתמש בפרוטוקול זה). אמת את יושרת הרצף של כל כנס ידי רצפי DNA ישירים.
- לסיבוב הראשון של OE-PCR (מסומנת לספירה ו A'-D" באיור 1), להשתמש פריימר תחושת גן ספציפי (המודגשת בטבלה 1) ו פריימר antisense כימרי (באות נטויה בטבלה 1) המתאים אל 15 נ"ב הסופי (ללא קודון עצירה) של הגן של סמן ריבית / התת-תאי וכדי 15 נ"ב של סוף 5'של חלבון פלואורסצנטי הרצוי (EGFP או mCherry) כדי ליצור מוצר עם הסככה 3' .
= "Jove_title"> 2. תחזוקת תרבית תאי חרקים
הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים, לנהל את כל המניפולציות התא הדורשים פתיחת הבקבוק בתרבית רקמה בתוך ברדס זרימה למינרית. להדליק את מנורת UV קוטל חידקים במנדף זרימה למינרית לפחות 1 שעות לפני מניפולציות סלולריות. יש להשתמש בכפפות ניטריל ו לטהר את השטח של הספסל, טפטפות, כלים, צינורות, צלוחיות עם אתנול 70% לפני השימוש בהם. היכרות עם טכניקות תרבית תאים בסיסיות מומלצת 13.
- השתמש בתאי שצבא יהיה (קו תרבית תאים הוקם נגזר Trichoplusia ני רקמת השחלה) מותאם סרום ללא בינוני ולשמור אותם כקובץ תרבות monolayer חסידה במדיום חרקי סרום ללא ב 28 מעלות צלזיוס ב T25 צלוחיות בתרבית רקמה.
- שמור על תאי Sf9 (קו תרבית תאים הוקם נגזר רקמת שחלת Spodoptera frugiperda) דומה אך באמצעות תרבות חרקי TNM-FH תוספת בינוניתed עם 10% עובריים שור סרום (FBS).
- זרעי התרבות הראשונית מן Sf9 הקפוא או תאים שצבא יהיה על ידי הסרת בקבוקוני מניות מן -80 ° C, ולאפשר להם להפשיר בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לטהר את צלוחיות עם 70% אתנול לאחר ההפשרה ומניחים אותם על הקרח.
- להוסיף 4 מ"ל של המדיום הסלולרי חרקים בבקבוק T25 חדש והעברת 1 מ"ל של תרחיף תאים חרקים מופשר. מניחים את הבקבוק בתוך חממה 28 ° C, ללא humidified ולאפשר לתאים לצרף 30-45 דקות.
- החלף את המדיום זריעה עם 5 מ"ל של המדיום המתאים ולהעביר את צלוחיות חממה 28 ° C הלא humidified. מעקב אחר תאי מפגש יומי. מעבר התאים כאשר הם מגיעים 90% confluency.
הערה: סיקור מלא של בקבוק T25 מתאים ~ 5 x 10 6 תאים. - מעבר תאי חרקים.
- למעבר התאים, להסיר תחילה את המדיום המותש מן הבקבוק המכיל תאים ומחוברים באמצעות פיפטה סרולוגיות 5 מיליליטר סטרילי.הטה את הבקבוק כך הבינוני זורם בפינה אחת, הרחק בשכבת התא. מוציאים בזהירות את המדיום בעזרת פיפטה מבלי להפריע את התאים.
- לסלק את התאים שהצבא יהיה ידי בעדינות שטיפה צלוחיות T25 המכיל בשכבה ומחוברות עם 4 מ"ל של מדיום חרקים סרום ללא שימוש פיפטה סרולוגיות חדש, סטרילי, 5 מ"ל. הזיזו את קצה פיפטה ברחבי הבקבוק לאט להשקות כדי להסיר תאים המחוברים באופן רופף לתחתית הבקבוק.
- בדקו הניתוק הנאות של תאים על ידי הסרת כל התקשורת, הפיכת הבקבוק מעל, והתבוננות כי החלק התחתון של הבקבוק הוא ברור.
- עבור תאי Sf9, אשר דבקים יותר בחוזקה, להוסיף 4 מיליליטר של מדיום חדש TNM-FH ולהשתמש מגרד תא כדי לסלק את התאים המצורפים. השתמש פיפטה סרולוגיות 5 מ"ל לערבב בעדינות ולהפחית clumping התא.
- השתמש נגד תא אוטומטי כדי להעריך את מספר תאי חרק קיימא לכל נפח של מדיום. העבר 0.1 מ"ל של התא / תערובת בינוני עד 1.5 מ"לצינור microfuge. בתוך צינור 0.5 מ"ל microfuge נפרד, להוסיף 10 μL של תאים / תערובת בינוני עד 10 μL של trypan כחול.
- הסרת שקף קאמרי תא לדלפק מהאריזה להוסיף 10 μL של התא / בינוני / תערובת trypan הכחולה בכל צד של שקופית הספירה. הכנס את השקופית לתוך דלפק התא ולקבוע את צפיפות כדאי התא.
- שימוש צפיפות התאים, לחשב ולהוסיף הנפח הנאות של מדיום סלולארי חרקים (עד 5 מיליליטר) צלוחיות T25 חדשות, סטרילי.
- העבר כ 1-1.5 x 10 6 תאי צלוחיות T25 עם תקשורת טריה; התווית צלוחיות עם שורת תאים, תאריך, בינוני בשימוש, מספר תאי הוסיף, ומספר הקטע (P n + 1 דור, כאשר P n הוא מספר המעבר לדור הקודם של תאים); ולמקם את צלוחיות C חממה 28 ° עד 72 h.
הערה: תאי חרקים עשויים להיות מופצים באופן רציף, למרות תאים עשויים להיות פחות קשוב transfection ו / או Heterologousביטוי חלבון לאחר 30 קטעים. פנק את כל תאים מושלכים / מדיה עם פתרון אקונומיקה 10% ו חיטוי כלי פלסטיק חד פעמים לפני הסילוק.
3. Transfection תא חרקים
- הזרע, בקבוק T25 עם עד 1 x 10 6 תאים שהצבא יהיה או Sf9 במדיום הסלולרי חרקים המתאים (מדיום חרקים נטולי סרום עבור שהצבא יהיה ו TNM-FH עבור Sf9) ולגדול confluency עבור 72 שעות ב 28 מעלות צלזיוס.
- הסר וזורקים את המדיום הישן לסלק את התאים עם 4 מ"ל של מדיום חרקים סרום ללא טריים (ראה צעדים 2.6.2 ו 2.6.3, לעיל).
- הערך את צפיפות התאים באמצעות דלפק תא אוטומטי (ראה שלב 2.6.4, לעיל).
- להוסיף כ 7 x 10 5 תאים 35 מ"מ בודדים מנות עם רצפת זכוכית ולאפשר לתאים לצרף עבור 20-25 דקות ב 28 מעלות צלזיוס.
- במשך כל transfection, להוסיף 2 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד (בין פלסמיד אחד עבור transfections בודד או 2 מיקרוגרם מכל אחת משני פלסמידים עבור מטלותtransfections uble) כדי 0.1 מ"ל של מדיום חרקים נטולי סרום (ללא FBS הן Sf9 ו transfections שהצבא יהיה) בצינור 1.5 מ"ל microfuge סטרילית.
- בצינור נפרד, לערבב 8 μL של מגיב transfection עם 0.1 מ"ל של מדיום חרקים נטולי סרום ולאחר מכן להעביר פתרון אל צינור המכיל פלסמיד דנ"א של עניין. בעדינות מערבולת לדגור על RT במשך 20 - 30 דקות.
- לדלל את התערובת פלסמיד-transfection מן הצעדים 3.5 ו 3.6 עם 0.8 מ"ל של מדיום חרקים סרום ללא כך הנפח הכולל שווה 1 מ"ל.
- מוציא בזהירות את התקשורת בין מנות הזכוכית המכילות תאים מצורפים. Overlay התאים המצורפים עם מדיום פלסמיד-transfection המדולל.
- דגירת התאים ב 28 מעלות צלזיוס למשך 5 h.
הערה: התנאים transfection דורש אופטימיזציה אמפירית ליעילות transfection מירבית (למשל, לילה transfection ולא 5 h, כמות ה- DNA פלסמיד המשמש, את הכימיה של מגיב transfectionמשומש, וכו.). - הסר וזורקים את המדיום transfection בעדינות ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של מדיום חרקים נטולי סרום, נזהרים שלא לסלק תאים.
- להוסיף 2 מ"ל של המדיום הסלולרי טרי חרקים (מדיום חרקים נטולי סרום עבור שהצבא יהיה ו TNM-FH עבור Sf9) לדגור על 28 מעלות צלזיוס למשך 48-72 שעות.
הערה: שוב, התנאים דורשים אופטימיזציה אמפירי עבור ביטוי חלבון Heterologous מירבית.
4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal
- בשעה 48-72-transfection פוסט h, לשטוף את התאים פעם עם 1 מ"ל של מדיום חרקים IPL-41 ואז לכסות עם 2 מ"ל של IPL-41 עבור הדמיה.
הערה: שלב זה לשטוף מפחית את אוטומט קרינת הרקע שנצפתה עם מדיום סלולארי חרקים המשמש תחזוקת תא נורמלית. - להוסיף 4 טיפות של ריאגנט מכתים לחיות תאי Hoechst (ראה טבלת חומרים עבור הכתם הספציפי הגרעיני להשתמש בפרוטוקול זה) למדיום לדגור 28 מעלות צלזיוס למשך 20-25 דקות.
הערה: nuc נוסףכתמי ליר ניתן להחליף, אם כי הצבע צריך להיות פרופיל קרינה ייחודי מן EGFP ו mCherry. - מניחים בצלחת 35 מ"מ לתוך מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר סגור בתוך עצמו (ראו טבלה של חומרים עבור המכשיר הספציפי בשימוש בפרוטוקול זה).
- התאם את מיקרוסקופ עבור Hoechst, EGFP, ותנאי תצפית mCherry: עירור Hoechst / פליטה - 359/461 ננומטר; EGFP עירור / פליטה - 489/510 ננומטר; mCherry עירור / פליטה - 580/610 ננומטר.
- בצע סריקה ראשונית באמצעות מטרת 10x כדי לאשר ביטוי פלורסנט ולאחר מכן לעבור למצב סריקה באמצעות מטרת 60X לעומת שלב מי טבילה.
- התאם את עוצמת הלייזר (5-7%), רגישות גלאי (47-49%), מהירות סריקה, עומק Z ציר, וזום דיגיטלי כדי לייעל את הניגוד התמונה והרזולוציה. תמונת התאים ב זום דיגיטלי 1.5x לתת סך של הגברת 90X.
הערה: הפרמטרים מיקרוסקופ דורשים התאמה אמפירית אופטימליאוסף תמונה יכול להיות ספציפי המכשיר בשימוש. - יצוא הנתונים הגולמיים כמו קבצי תמונת TIFF ולשנות (יבול ואת כיסוי) לצורך יצירת דמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OE-PCR
OE-PCR מאפשר לסינתזה של מוצרי ה- DNA כימרי כי, להכניס פעם לתוך וקטור ביטוי, לאפשר ייצור של חלבונים רקומביננטיים כימרי המתאים לכל גן המבחן של עניין וחלבון בסמן פלורסנטי. איור 1 מייצג תוכנית כללית לייצור וקטורים ביטוי PIB המכיל B. tabaci aquaporin קידוד רצפי (BtDrip1 ו BtDrip2_v1) ב-מסגרת עם EGFP סמן חלבון פלואורסצנטי. בתרחיש זה, שני חלבונים כימרי BtDrip המכיל EGFP ב Termini carboxyl שלהם יוצרו. גם פרוטוקול זה הוכיח שיטות לפיתוח שני חלבוני סמן התת-תאי חרקים, DmSPR ו PLA2G15 (איור 1), המיוצר כמו מפלצות עם mCherry ב Termini carboxyl שלהם. EGFP ו mCherry נבחרו בגלל ספקטרום הפליטה שלהם הוא סוטה במידה מספקת, המאפשרים tהוא איתור עצמאי ושיתוף לוקליזציה של אותות מן החלבונים הבדיקה (למשל., BtDrip-EGFP) ואת DmSPR- ו PLA2G15-mCherry שכותרתו חלבונים סמן. כל תגובות PCR הפיקו להקות הגדלים הצפויים היו משובטות בהצלחה לתוך PIB. כל פלסמידים אושרו על ידי רצפי DNA כדי להכיל את המוסיף המתאים בכיוון הנכון וב-מסגרת עם סמני חלבון פלואורסצנטי.
ביטוי חלבון רקומביננטי חלוף תרבית תאי חרקים
בעקבות בניית וקטורים ביטוי המתאים PIB / BtDrip1-EGFP, PIB / BtDrip2_v1-EGFP, PIB / DmSPR-mCherry, ו PIB / PLA2G15-mCherry, התאים היו transfected ואת הביטוי של חלבונים רקומביננטיים בתאים חיים היה דמיינו באמצעות פלואורסצנטי confocal מיקרוסקופ (איור 2). transfection ביטוי מוצלח של BtDrip1-EGFP רקומביננטי הוא b ניכרy בנוכחות פלואורסצנטי ירוק על פני השטח של תאי שהצבא יהיה (איור 2B, 2F). פלואורסצנטי ירוק הוא ציין בתוך תאים שצבא יהיה טרנספקציה עם BtDrip2_v1-EGFP (האיור 2J, 2N), המציין את הביטוי התאי של BtDrip2_v1. כמו כן, תאי שהצבא יהיה טרנספקציה עם PIB / DmSPR-mCherry (איור 2C, 2K) או PIB / PLA2G15-mCherry (איור 2G, 2O) להראות הקרינה אדום, המציין את הביטוי של מפלצות בהתאמה.
Co-לוקליזציה של חלבונים רקומביננטיים BtDrip וסמנים התת-תאי
Transfection הכפולה של תאים שצבא יהיה מאפשרת שיתוף הביטוי של שני חלבוני ניאון שכותרתו. תמונות שכבות מתארות תאי שהצבא יהיה טרנספקציה כי הם כתומים / צהובים עולות כי תאי נמל פלסמידים מייצר גם EGFP ו mCherry ולהציע כי החלבונים הם שותף מקומיים בתוך אותו suמבנים bcellular (איור 2D, 2H, 2L & 2P). זו מאשרת תוצאות קודמות כי BtDrip1 ו DmSPR באים לידי ביטוי על פני תא 14, 15, 16. כיסוי של תאים שהצבא יהיה כפול-טרנספקציה עם PIB / BtDrip1-EGFP ו PIB / DmSPR-mCherry מציגה חפיפה של אותות הקרינה ירוק ואדום (איור 2D), דבר המצביע על שיתוף לוקליזציה של BtDrip1-EGFP ו DmSPR-mCherry על פני התא . בעבר, Maroniche ואח. 17 הוכיח כי PLA2G15 הוא סמן של lysosomes אינטר כאשר הביע בתאי Sf9 בתעתוע עם mCherry. למרות שזה היה צפוי כי חלבון BtDrip2_v1-EGFP רקומביננטי היה translocate אל פני התא, זה הוצג בעבר כי חלבון כימרי היה מקומי בעיקר intracellularly בתוך התאים שהצבא יהיה טרנספקציה 15. בתמיכה זו, חל Evid הקטןence עבור שיתוף לוקליזציה של אותות ניאון ירוק ואדום כאשר BtDrip2_v1-EGFP היה שיתוף הביע עם PIB / DmSPR-mCherry (איור 2L). לעומת זאת, שיתוף הביטוי של PIB / BtDrip2_v1-EGFP ו PIB / PLA2G15-mCherry הביא חפיפה משמעותית אותות הניאון הירוקים ואדום ציטופלסמית (איור 2P), דבר המצביע בחום BtDrip2_v1 הוא נסחר סביר lysosomes התאי.
איור 1: סכמטי בונה בונת ביטוי באמצעות החפיפה הרחבה PCR (OE-PCR). OE-PCR משמש לבנות וקטורים ביטוי PIB המכיל את Bemisia tabaci aquaporin-1 / EGFP (BtDrip1-EGFP), B. tabaci aquaporin-2_variant 1 / EGFP (BtDrip2_v1-EGFP), קולטן פפטיד מין תסיסנית / mCherry (DmSPR- mCherry), ואת ההומו ספיינס פוספוליפאז-A2 / mCherry(HsPLA2G15-mCherry) מוצרים. הסבב הראשון של OE-PCR מייצר שברים המתאימים cDNAs באורך המלא של עניין, BtDrip1 (א), BtDrip2_v1 (B), DmSPR (C), ו HsPLA2G15 (D), המכיל באזור חופף 3' קטן מתאים 5'-סוף גם את EGFP או mCherry חלבונים בסמן פלורסנטי. במקביל, cDNAs באורך מלא מן EGFP ו mCherry הם PCR מוגבר ומכילים באזור חופפים המתאים 3'-הקצוות של BtDrip1 (א '5' קטנים), BtDrip2_v1 (ב'), DmSPR (ג"), או HsPLA2G15 ( D"). שים לב כל פריימרים בשימוש כדי להגביר את cDNAs של עניין (כלומר BtDrip1, BtDrip2_v1, DmSPR, ו HsPLA2G15) בסיבוב הראשון של OE-PCR חסרים את קודון עצירה בדרך כלל נמצא בבית-סוף 3'של של כל רצף קידוד. כל המוצרים בסיבוב הראשון OE-PCR הם מוגברים, מופרדים על ידי נבחר ג'ל agaroserophoresis, וכן ג'ל מטוהר. הסבב השני של OE-PCR משתמש זוגות נקוו מוצרי PCR מטוהר-ג'ל מן הסיבוב הראשון של OE-PCR כתבניות עבור ההגברה של מוצרי כימרי באורך מלא. עבור כל תגובה, תחל תחושת מתאים לקצה 5'של cDNA של רצפי קידוד הריבית תחל antisense הוא משלים 3'-end של EGFP או mCherry, עם עצירה שלה קודון שלם (א ', ב" "ג"" ו-ד ''). ארבעת המוצרים בסיבוב השני OE-PCR הם ג'ל מטוהרים, adenylated עם פולימראז תקי, ו ligated לתוך וקטור ביטוי PIB / V5-את שלו. פלסמידים מופצים חיידק, ו- DNA פלסמיד מטוהר משמש transfect תאי חרקים. .ב tabaci aquaporins BtDrip1 ו BtDrip2_v1 מוצגים כחול ציאן כהים, בהתאמה, ואת הסמנים התת-תאי DmSPR ו PLA2G15 מוצגים כתום ורוד, בהתאמה. EGFP הוא shעצמו בירוק mCherry הוא באדום. חצים צבעוניים מצביעים בכיוון (פריימרים טעם פריימרים כיוון antisense קדימה בכיוון ההפוך) ומיקום של פריימרים גן ספציפי (צבע פריימר מציין את מקור רצף פריימר). ראה טבלה 1 לפרטים פריימר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הדמיה חיה של תאים שהצבא יהיה פעמיים טרנספקציה הבעת רקומביננטי BtDrip1-EGFP, BtDrip2_v1-EGFP, DmSPR-mCherry, ו PLA2G15-mCherry חלבונים. Trichoplusia ני (שהצבא יהיה) בתאים פעמיים טרנספקציה עם PIB / BtDrip1-EGFP ו PIB / DmSPR-mCherry (AD), PIB / BtDrip1-EGFP ו PIB / PLA2G15-mCherry (EH), PIB / BtDrip2_v1-EGFP ו PIB / DmSPR -mCherry (<strong> IL), או PIB / BtDrip2_v1-EGFP ו PIB / PLA2G15-mCherry (MP). תמונות שנתפסו עם מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר באמצעות המטרה 60X לעומת שלב מים טבילה (NA 1.2) בשעה הגברה 90X. הפאנלים Hoechst להראות נציג תמונות תא חי של גרעין התא מוכתם (לשעבר / em = 359/461 ננומטר). פנלי EGFP להראות את ביטוי הקרינה של תאי transfected עם מפלצות EGFP (לשעבר / em = 489/510 ננומטר). פנלי mCherry להראות את ביטוי הקרינה של תאי transfected עם מפלצות mCherry (לשעבר / em = 580/610 ננומטר). פנל המיזוג מציג את הכיסוי של כל שלושת ערוצי הניאון (כלומר Hoechst, EGFP, ו mCherry). בר סולם = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכות ביטוי חלבון Heterologous הם כלים חשובים לייצור חלבונים רקומביננטיים בשימוש ביישומים במורד הזרם רבים 4. בחירה ממערכות ביטוי המגוונות הזמינות תלוי בסופו של דבר המטרה של החלבון של עניין. כמה מערכות תא ביטוי חרק זמינות המציעים חלופות גמישות למערכות ביטוי תא פרוקריוטים ו איקריוטיים 5, 6. מערכות חרקים מחייבות זיהום baculovirus לנהוג ביטוי חלבון רחוק ידי מערכת חרקים הפופולרית ביותר בשימוש נרחב, עם חלבונים כאלה רבים השתמשו במחקר יישומים טיפוליים 1, 2, 3. ביטוי baculovirus, עושה זאת, יש מגבלות, ובכלל זה: 1) במחזור החיים ויראלי כרוך תמס של התא המארח; 2) תאי המארח כי הם lysed בדרך כלל לשחרר amo גבוההunts של אנזימים degradative; 3) את הדור של שורות תאי יציבות גוזל זמן רב לא יכול להיות ריאלי עבור חלבונים ציטוטוקסיות; 4) ביטוי רציף דורש תחזוקה תכופה; 5) דור וקטור קרוב דורש צעדי שיבוט מרובים; 6) צפיפות תא חרקים הן בדרך כלל ביחס הפוך זיהום ויראלי; חלבונים רקומביננטיים ו 7) נסחרים בעיקר ברמות גבוהות אל פני התא או מופרשים 3, 7, 9, 10. ביטוי גנים חולף Nonlytic מבוסס על transfection תא החרק עם פלסמיד דנ"א מציעה טכניקה חלופית לייצור חלבונים רקומביננטיים, בלי חלק מהאתגרים הייחודיים הקשורים 7 baculoviruses, 8. כלומר, ביטוי תא חרק חולף מציע סיבוב סביב קצר על בניית וקטור סינתזת חלבון, נמנע challeng es הקשורות לזיהום ויראלי ימס תא, וכן מספקת אמצעי חזק כדי לשמור על הסחר בבני הסלולר של חלבונים.
הנה, שני המבנים ביטוי תוקף שימשו לקביעת לוקליזציה subcellular של tabaci B. aquaporin חלבונים BtDrip1 ו BtDrip2_v1. DmSPR-mCherry הוא סמן של קרום התא פלזמה 16, ו PLA2G15-mCherry מבצע לוקליזציה בתוך lysosomes הסלולר 17. איור 2 מראה את הערך של סמנים כאלה להערכת מיקומם של חלבונים של עניין, במקרה זה, את שיתוף לוקליזציה של BtDrip1-EGFP עם DmSPR-mCherry על פני התא ואת BtDrip2_v1-EGFP עם PLA2G15-mCherry בתוך lysosomes. לכן, כפי שמוצג כאן בחקירות קודמות 14, 15, 16, 18, 19,תחת = "Xref"> 20, מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי לברר סחר חלבון במהירות בתוך תאי חרק. למרות הבעת חלבון וסחר בתוך תאים שצבא יהיה מוצגת כאן (איור 2), חשוב לציין כי הפרוטוקול ניתן אופטימיזציה ויישומים באותה מידת שורות תאי חרקים אחרות (Sf9, Sf21, BM-N, S2, וכו ') .
כמו כל מערכות ביטוי חלבון Heterologous, יש מגבלות ייצור חלבון חולף בתוך תאי חרק תרבותיים. כלומר, אחוז התא חיובי עבור ביטוי הנגזרות פלסמיד הוא בדרך כלל נמוך מזה שהושג מן baculovirus או משימוש שורות תאי יציבות. לפיכך, הסכום של חלבון רקומביננטי (הים) המיוצר יכול להיות נמוך במערכת חולפת; עם זאת, שימוש יזמים שונים ושילובם של משפרים גנטיים יכולים להתגבר על מגבלת 7 הפוטנציאל הזה, 21, 22. Tהפרוטוקול שלו ממחיש את שיתוף transfection של תאים שצבא יהיה עם שני וקטורי PIB, כל רצפי קידוד חלבון שונה מחסה (איור 2). למרות יעילות transfection דומה נצפתה כל וקטורי הביטוי בארבעה המשמשים transfect התאים שהצבא יהיה (מידע לא מוצג), זה לא תמיד אפשרי. לפיכך, ניסויים עם וקטורים ביטוי חולף כזה עשוי לדרוש אופטימיזציה אמפירי נרחב (למשל, וריאציה בסך כל וקטור, זמן transfection, כימיה מגיב transfection, וכו ') כדי להשיג יעילות transfection המקבילה ו / או רמות הביטוי של חלבון רקומביננטי. יתר על כן, יתכן כי תוספת של חלבון פלורסנטי עשוי להשפיע או להגביל סחר subcellular של חלבון מטרות 23, 24. זיהוי של שיתוף הלוקליזציה subcellular של שני חלבונים על ידי התצפית של קרינה עם חלבוני סמן אינו necessarily מצביע אינטראקציות חלבון-חלבון ישירים בין החלבונים של עניין 24, 25. לפיכך, זהירות נדרשת כאשר לפרש תוצאות שיתוף לוקליזציה כאלה.
ביטוי גני חלוף אין מציע כמה יתרונות על פני מערכות ביטוי baculovirus זמינות כרגע. ביטוי חולף דורש פחות זמן עבודה לבניית וקטורים לסינתזה של חלבונים רקומביננטיים, הביטוי חולף שאין עימה ימס תא הקשורים למחזור החיים פתוגניים של baculovirus, וביטוי חולף יכול לספק מערכת לימוד טובה יותר עבור סחר subcellular של חלבונים 3, 7, 9. פרוטוקול זה מדגיש את הקלות והמהירות של המבנים הבניין באמצעות שילוב ישיר של הגן של עניין לתוך וקטור ביטוי PIB באמצעות חפיפה הרחבה PCR (איור 1 26. יתר על כן, למרות EGFP 27 ו mCherry 28 שולבו כאן על Termini carboxyl של שני חלבונים aquaporin B. tabaci, OE-PCR יכול לשמש גם כדי למקם חלבונים בסמן פלורסנטי וריאנט רבים אחרים 26 ב Termini אמינו של חלבונים אלה. יש לציין כי, בנוסף פלסמידים ביטוי רבים שנבנו באמצעות OE-PCR, שיבוט ביטוי מסורתיות רבות קלטות הוכנו וניתן להשתמש בו כדי לייצר כמעט כל חלבון של עניין מסגרת עם חלבוני ניאון EGFP, ונוס, ו mCherry, התמזגו בבית או אמינו או מסתיים במסוף. קלטות הביטוי כאלה זמינים לפי בקשה.
תם העידן "גנומיקה" ספק להיקף חסר תקדים של וגישת ד משמעותיאתא. עם זאת, הפער ממשיך להתרחב בין גילוי גן ואת המשימה של פונקציה למוצרי גן; וכך, כלים אמפיריים נוספים נדרשים נואשות להאיץ גנומיקה תפקודית. בעוד, גן-עריכה אחרת במערכות מניפולצית גן vivo עלולה בסופו של דבר לספק גישות מובהקות עבור הקצאת תפקוד גן, מערכות ביטוי חלבון Heterologous תישארנה חשוב סבירה עבור biomanufacture של חלבונים בעלי ערך לפענוח מבנה חלבון ותפקודו. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבניית פלסמידים ביטוי המשופרת ואת הביטוי החולף של חלבונים רקומביננטיים בתאי חרקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לין Forlow-Jech ו Dannialle לירוי לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מימון שקריס הבסיס USDA ARS, התכנית הלאומית 304 - להגנת הצומח ההסגר [פרויקט # 2020-22620-022-00D] להזכיר JAF ו JJH של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה הוא אך ורק לשם מתן מידע ספציפי ואינו משתמע המלצה או תמיכה על ידי משרד החקלאות האמריקני. USDA היא ספקית הזדמנות שווה מעסיק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
References
- Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).
- Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).
- Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
- Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).
- Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. , Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).
- Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
- Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).
- Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
- Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).
- Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).
- Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).
- Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific. Available from: http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0 (2014).
- Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).
- Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
- Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).
- Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).
- Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).
- Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).
- Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
- Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
- Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).
