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Biology

क्षणिक अभिव्यक्ति और पुनः संयोजक प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण सुसंस्कृत कीट कोशिकाओं में

doi: 10.3791/55756 Published: April 20, 2017

Summary

Nonlytic कीट सेल अभिव्यक्ति प्रणाली उत्पादन, सेलुलर तस्करी / स्थानीयकरण, और पुनः संयोजक प्रोटीन कार्यात्मक विश्लेषण के लिए underutilized कर रहे हैं। यहाँ, हम तरीकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध lepidopteran सेल लाइनों में अभिव्यक्ति वैक्टर और बाद क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति उत्पन्न करने के लिए का वर्णन। Subcellular फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन के साथ Bemisia tabaci aquaporins के सह स्थानीयकरण भी प्रस्तुत किया है।

Abstract

, सेलुलर तस्करी / स्थानीयकरण की व्याख्या, और उप जीवधारी स्तर पर प्रोटीन की जैव रासायनिक समारोह के निर्धारण Heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है। baculovirus अभिव्यक्ति सिस्टम तेजी से कई जैव प्रौद्योगिकी, दवा, और औद्योगिक अनुप्रयोगों, nonlytic प्रणाली है कि वायरल संक्रमण स्पष्ट लाभ शामिल नहीं है, लेकिन अक्सर अनदेखी और underutilized कर रहे हैं में प्रोटीन के उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है यद्यपि। यहाँ, हम nonlytic अभिव्यक्ति वैक्टर और क्षणिक पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति पैदा करने के लिए एक विधि का वर्णन। यह प्रोटोकॉल पुनः संयोजक प्रोटीन के कुशल सेलुलर स्थानीयकरण के लिए अनुमति देता है और तेजी से कोशिका के भीतर प्रोटीन की तस्करी विचार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। हम कीट Bemisia tabaci से दो aquaporin प्रोटीन सहित एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कीट सेल लाइन में चार पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति, दिखाने के लिए, साथ हीसेल प्लाज्मा झिल्ली के लिए विशिष्ट subcellular मार्कर प्रोटीन के रूप में और intracellular लाइसोसोम के लिए। सभी पुनः संयोजक प्रोटीन उनके कार्बाक्सिल टर्मिनी, जो पुनः संयोजक प्रोटीन के प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए अनुमति देता है पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर के साथ काइमेरा के रूप में तैयार किए गए। प्लास्मिड ब्याज और एक ज्ञात subcellular मार्कर के जीन के लिए निर्माणों को शरण देने के साथ कोशिकाओं की डबल अभिकर्मक लाइव सेल इमेजिंग और सेलुलर प्रोटीन स्थानीयकरण के बेहतर सत्यापन के लिए अनुमति देता है।

Introduction

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कीट सेल अभिव्यक्ति सिस्टम का उपयोग कर पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन यूकेरियोटिक प्रोटीन के अध्ययन के लिए कई लाभ प्रदान करता है। अर्थात्, कीट कोशिकाओं समान बाद translational संशोधनों, प्रसंस्करण, और स्तनधारी कोशिकाओं में मौजूद लोगों, जो ठीक से मुड़ा हुआ प्रोटीन 1, 2, 3 के उत्पादन के लिए फायदेमंद है के रूप में छँटाई तंत्र के अधिकारी। कीट सेल सिस्टम भी आम तौर पर स्तनधारी सेल लाइनों 4, 5 से रखरखाव के लिए कम संसाधनों और कम समय और प्रयास की आवश्यकता है। baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली एक ऐसी कीट सेल आधारित प्रणाली, प्रोटीन लक्षण वर्णन और चिकित्सा विज्ञान, विदेशी पेप्टाइड और टीका उत्पादन के लिए वायरल प्रोटीन की immunogenic प्रस्तुति, बहु के संश्लेषण के लिए पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन सहित कि है अब व्यापक रूप से कई विषयों में प्रयोग किया जाता है -protein परिसरों, ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन के उत्पादन, आदि। 1, 2, 4, 6। कर रहे हैं, हालांकि, परिस्थितियाँ होती हैं जिनमें baculovirus अभिव्यक्ति नहीं लागू 3, 7, हो सकता है और nonlytic और क्षणिक कीट अभिव्यक्ति प्रणाली के उपयोग के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है। विशेष रूप से, क्षणिक कीट सेल अभिव्यक्ति पुनः संयोजक प्रोटीन का तेजी से संश्लेषण के लिए संभावना प्रदान करता है, कम विकास और रखरखाव की आवश्यकता है, वायरल लगाया सेल को शामिल नहीं करता, और बेहतर प्रोटीन संश्लेषण 7, 8, 9 के दौरान सेलुलर तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक साधन प्रदान करता है, 10।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर अभिव्यक्ति वैक्टर का तेजी से पीढ़ी का वर्णन करता है दो कदम ओवरलैप विस्तार पीसीआर (ँ पीसीआर) Escherichia कोलाई में प्लाज्मिड डीएनए के मानक क्लोनिंग। प्लास्मिड डबल transfect व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सुसंस्कृत कीट कोशिकाओं को इस्तेमाल कर रहे हैं और प्रतिनिधि प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए। प्रोटोकॉल उत्पादन और दो अलग अलग fluorescently लेबल subcellular मार्कर प्रोटीन का उपयोग का वर्णन करता है और कीट Bemisia tabaci से दो aquaporin प्रोटीन के साथ colocalization को दर्शाता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल ँ पीसीआर, लक्ष्य प्रोटीन की सेलुलर स्थानीयकरण के लिए कीट सेल रखरखाव और अभिकर्मक, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए बुनियादी पद्धति प्रदान करता है।

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Protocol

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अभिव्यक्ति प्लास्मिड के निर्माण के लिए 1. ँ पीसीआर

नोट: ँ पीसीआर में प्रयुक्त सभी प्राइमरों के लिए तालिका 1 देखें। एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ के उपयोग के सभी amplifications के लिए सिफारिश की है। तथापि, क्योंकि इन एंजाइमों अक्सर मत छोड़ो एक 3 'एक, यह एक Taq डीएनए पोलीमरेज़ के साथ एक संक्षिप्त, गैर परिवर्धित ऊष्मायन प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है करने के लिए "एक-टेल" पीसीआर उत्पादों उन्हें एक प्रादेशिक सेना कीट सेल अभिव्यक्ति में क्लोनिंग से पहले वेक्टर। यह प्रोटोकॉल एक विधि दर्शाता है उत्पन्न करने के लिए कीट अभिव्यक्ति प्लास्मिड (दो Bemisia tabaci aquaporin प्रोटीन को इस मामले में) कैमेरिक प्रोटीन को शरण देने subcellular मार्कर प्रोटीन या के हित के जीन की कार्बाक्सिल टर्मिनस में फ्रेम जुड़े हुए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ, (चित्रा 1)।

  1. प्रवर्धन के दो स्वतंत्र राउंड के होते हैं जो ँ पीसीआर, का प्रयोग करें, उत्पन्न करने के लिए: (1) ब्याज की जीन एन्कोडिंग दृश्यों (बी tabaciaquaporin 1: BtDrip1; बी tabaci aquaporin 2: BtDrip2_v1) EGFP या (2) subcellular मार्कर (ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर सेक्स पेप्टाइड रिसेप्टर कहा जाता है एक हरे रंग की फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रकार के साथ में फ्रेम जुड़े हुए: DmSPR; होमो सेपियन्स phospholipase A2: HsPLA2) mCherry अनुक्रम कोडन के साथ। सीधे PIB / वी 5-अपने-टीए प्लाज्मिड में अंतिम ँ पीसीआर उत्पादों ligate।
    1. ँ पीसीआर के पहले दौर के लिए, एक जीन विशेष भावना प्राइमर (तालिका 1 में बोल्ड में दिखाया गया है) और एक काइमेरिक एंटिसेंस प्राइमर का उपयोग (ई और A'-डी चित्र 1 में 'द्वारा इंगित) (तालिका 1 में italicized) इसी ब्याज / subcellular मार्कर के जीन के अंतिम 15 बीपी (स्टॉप कोडोन के बिना) और वांछित फ्लोरोसेंट प्रोटीन की 5'-अंत के 15 बीपी को (EGFP या mCherry) एक 3 'की अधिकता के साथ एक उत्पाद उत्पन्न करने के लिए।
      नोट: पीसीआर स्थितियों के लिए तालिका 2 देखें।
    2. एक अलग ट्यूब में, एक जीन-विशिष्ट का उपयोगआईसी फ्लोरोसेंट प्रोटीन एंटिसेंस प्राइमर और एक काइमेरिक भावना प्राइमर कि वांछित फ्लोरोसेंट की 5'-अंत से ब्याज / subcellular मार्कर के जीन की 3'-अंत से 15 बीपी और 15 बीपी शामिल (तालिका 1 में एक ड्रॉइंग के साथ दिखाया गया है) प्रोटीन एक 5 'की अधिकता के साथ एक उत्पाद उत्पन्न करने के लिए।
      नोट: पीसीआर स्थितियों के लिए तालिका 2 देखें। पीसीआर टेम्पलेट या तो एक दृश्य-मान्य पीसीआर उत्पाद हो सकता है या, अधिक बेहतर, प्लाज्मिड डीएनए को शरण देने वांछित अनुक्रम। यहाँ वर्णित अध्ययन अनुक्रम मान्य प्लास्मिड उपयोग करता है।
    3. अलग पीसीआर (मानक आणविक ग्रेड agarose का प्रयोग करके) 1% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ उत्पादों।
    4. उत्पाद शुल्क और उम्मीद आकार (तालिका 2 देखें) एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए जेल निष्कर्षण किट का उपयोग के उत्पादों को शुद्ध (विशिष्ट इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया किट के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    5. कदम 1.1.4 से जेल शुद्ध पीसीआर उत्पादों का उपयोग करें अंतिम ओवरलैप ई उत्पन्न करने के लिएXTension उत्पादों (- चित्र 1 में 'ए ने संकेत दिया' 'डी')। ब्याज / subcellular मार्कर के जीन और फ्लोरोसेंट प्रोटीन वांछित कैमेरिक अनुक्रम उत्पन्न करने के लिए के लिए इसी जीन विशेष एंटी-सेन्स प्राइमर के लिए एक जीन विशेष भावना प्राइमर का उपयोग करें।
      नोट: पीसीआर स्थितियों के लिए तालिका 2 देखें। यह अनुभव प्रतिक्रिया मिश्रण में जोड़ने के लिए अंतिम, पूर्ण लंबाई कैमेरिक पीसीआर उत्पाद उपज के लिए पहले दौर ओवरलैप विस्तार उत्पादों की इष्टतम मात्रा निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
    6. अलग करें 1% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा दूसरे राउंड ँ पीसीआर उत्पादों। उत्पाद शुल्क और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए जेल निष्कर्षण किट का उपयोग उत्पादों को शुद्ध।
    7. 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए Taq डीएनए पोलीमरेज़ मास्टर मिश्रण की 1 यूनिट के साथ जेल शुद्ध दूसरे राउंड ँ पीसीआर उत्पादों सेते 3 'adenylated (यानी एक पूंछ) टीए क्लोनिंग के लिए आवश्यक उत्पादों उत्पन्न करने के लिए।
    8. adenylated उत्पादों जिसके परिणामस्वरूप ligatePIB अभिव्यक्ति वेक्टर में और रासायनिक सक्षम (गर्मी आघात) या electrocompetent (इलेक्ट्रोपोरेशन) कोलाई कोशिकाओं को बदलने के लिए मानक आण्विक क्लोनिंग तकनीक का उपयोग करें। उचित चयन मार्कर (यानी, एम्पीसिलीन या कार्बेनिसिलिन) युक्त मध्यम पर प्लेट रात भर।
    9. एक वेक्टर विशिष्ट प्राइमर और एक डालने विशिष्ट प्राइमर का उपयोग कर डालने पॉजिटिव कालोनियों कि अभिव्यक्ति प्लास्मिड 5'-3 'अभिविन्यास में एक डालने को शरण देने के साथ बदल दिया गया की पहचान करने के लिए कॉलोनी पीसीआर 12 निष्पादित करें। कालोनियों की उम्मीद आकार के पीसीआर उत्पादों पैदा करने में रात भर संस्कृतियों तैयार करें।
    10. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए शुद्धि किट (विशिष्ट इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया किट के लिए देख सामग्री तालिका) का उपयोग प्लाज्मिड डीएनए को अलग। प्रत्यक्ष डीएनए अनुक्रमण द्वारा प्रत्येक डालने के अनुक्रम अखंडता सत्यापित करें।

नोट: बाँझ की स्थिति बनाए रखने के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर टिशू कल्चर कुप्पी के उद्घाटन की आवश्यकता होती है सभी सेल जोड़तोड़ का आयोजन करेगा। सेल जोड़तोड़ से पहले लामिना का प्रवाह हुड यूवी कीटाणुनाशक दीपक चालू कम से कम 1 घंटे। nitrile दस्ताने पहनें और उनके उपयोग से पहले बेंच, pipettes, बर्तन, ट्यूब, और 70% इथेनॉल के साथ बोतल की सतह शुद्ध। बुनियादी सेल कल्चर तकनीक के साथ परिचित 13 की सिफारिश की है।

  1. TNI कोशिकाओं (एक स्थापित सेल संस्कृति लाइन Trichoplusia नी डिम्बग्रंथि ऊतक से व्युत्पन्न) सीरम मुक्त मध्यम करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं कि का उपयोग करें और उन्हें 28 डिग्री सेल्सियस T25 में टिशू कल्चर बोतल में सीरम मुक्त कीट माध्यम में एक पक्षपाती monolayer संस्कृति के रूप में बनाए रखें।
  2. Sf9 कोशिकाओं (एक स्थापित सेल संस्कृति लाइन स्पोडोप्टेरा frugiperda डिम्बग्रंथि ऊतक से व्युत्पन्न) इसी तरह, लेकिन का उपयोग कर टीएनएम-एफ एच कीट कल्चर माध्यम पूरक बनाए रखें10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ एड।
  3. -80 डिग्री सेल्सियस से शेयर शीशियों को दूर करने और उन्हें एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में पिघलना करने की अनुमति देकर जमे हुए Sf9 या TNI कोशिकाओं से प्रारंभिक संस्कृति बीज। विगलन के बाद 70% इथेनॉल के साथ शीशियों शुद्ध और बर्फ पर रख दें।
  4. कीट सेल मध्यम के 4 एमएल एक नया T25 फ्लास्क और हस्तांतरण thawed कीट सेल निलंबन के 1 एमएल में जोड़े। एक 28 डिग्री सेल्सियस, गैर humidified इनक्यूबेटर में कुप्पी रखें और कोशिकाओं 30-45 मिनट के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति देते हैं।
  5. उचित माध्यम के 5 एमएल के साथ बोने मध्यम बदलें और एक 28 डिग्री सेल्सियस गैर humidified इनक्यूबेटर करने के लिए बोतल हस्तांतरण। सेल संगम दैनिक निगरानी करें। मार्ग कोशिकाओं जब वे 90% confluency तक पहुँचते हैं।
    नोट: T25 फ्लास्क की पूरी कवरेज ~ 5 x 10 6 कोशिकाओं से मेल खाती है।
  6. कीट सेल पारित होने के।
    1. पारित होने कोशिकाओं के लिए, पहले एक बाँझ 5 एमएल सीरम वैज्ञानिक विंदुक का उपयोग कर संगामी कोशिकाओं से युक्त कुप्पी से थक मध्यम हटा दें।कुप्पी झुकाते हैं, ताकि मध्यम, एक कोने में बहती सेल monolayer से दूर। ध्यान से कोशिकाओं को परेशान किए बिना मध्यम एक विंदुक का उपयोग को हटा दें।
    2. धीरे नई, बाँझ, 5 एमएल सीरम वैज्ञानिक विंदुक का उपयोग कर सीरम मुक्त कीट मध्यम के 4 एमएल के साथ सहधारा monolayer युक्त T25 बोतल धोने के द्वारा TNI कोशिकाओं बेदखल। कुप्पी भर विंदुक टिप ले जाएँ और धीरे-धीरे शिथिल कुप्पी नीचे से जुड़ी कोशिकाओं को हटाने के लिए सिंचाई की सुविधा।
      1. सभी मीडिया को दूर करने, अधिक कुप्पी मोड़, और अवलोकन कि कुप्पी के नीचे स्पष्ट है द्वारा कोशिकाओं की पर्याप्त टुकड़ी के लिए जाँच करें।
    3. Sf9 कोशिकाओं है, जो अधिक मज़बूती से पालन के लिए, ताजा टीएनएम-एफ एच माध्यम की 4 एमएल जोड़ें और संलग्न कोशिकाओं को हटाने के लिए एक सेल स्क्रेपर का उपयोग करें। एक 5 एमएल सीरम वैज्ञानिक विंदुक का प्रयोग धीरे मिश्रण और सेल का एकत्रीकरण को कम।
    4. मध्यम की मात्रा प्रति व्यवहार्य कीट कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर का प्रयोग करें। 1.5 एमएल के लिए सेल / मध्यम मिश्रण के 0.1 एमएल स्थानांतरणmicrofuge ट्यूब। एक अलग 0.5 एमएल microfuge ट्यूब में, trypan नीले रंग के 10 μL करने के लिए सेल / मध्यम मिश्रण के 10 μL जोड़ें।
    5. इसकी पैकेजिंग से एक सेल काउंटर कक्ष स्लाइड निकालें और गिनती स्लाइड के प्रत्येक पक्ष के लिए सेल / मध्यम / trypan नीले रंग के मिश्रण के 10 μL जोड़ें। सेल काउंटर में स्लाइड सम्मिलित करें और सेल घनत्व और व्यवहार्यता का निर्धारण।
    6. सेल घनत्व का उपयोग करना, गणना करने और नए, बाँझ T25 बोतल के लिए कीट सेल मध्यम (5 एमएल के लिए) की उचित मात्रा में जोड़ें।
    7. ताजा मीडिया के साथ T25 बोतल के लिए लगभग 1-1.5 x 10 6 कोशिकाओं स्थानांतरण; सेल लाइन, तिथि, माध्यम का उपयोग किया, जोड़ा कोशिकाओं की संख्या, और पारित होने के नंबर (पी n + 1 पीढ़ी, जहां पी एन कोशिकाओं की पिछली पीढ़ी के लिए पारित होने संख्या है) के साथ बोतल लेबल; और अप करने के लिए 72 घंटे के लिए एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बोतल रखें।
      नोट: कीट कोशिकाओं लगातार प्रचारित किया जा सकता है, हालांकि कोशिकाएं कम अभिकर्मक और / या heterologous के लिए ग्रहणशील हो सकता है30 मार्ग के बाद प्रोटीन अभिव्यक्ति। 10% ब्लीच समाधान के साथ सभी को छोड़ दिया कोशिकाओं / मीडिया इलाज और निपटान से पहले डिस्पोजेबल प्लास्टिक बर्तन आटोक्लेव।

3. कीट सेल अभिकर्मक

  1. के साथ एक T25 फ्लास्क बीज अप करने के लिए 1 x 10 एक उपयुक्त कीट सेल मध्यम में 6 TNI या Sf9 कोशिकाओं (TNI और Sf9 के लिए TNM-एफ एच के लिए सीरम मुक्त कीट मध्यम) और 28 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए confluency तक बढ़ता है।
  2. निकालें और पुराने मध्यम त्यागने और ताजा सीरम मुक्त कीट मध्यम के 4 एमएल के साथ कोशिकाओं को बेदखल (चरणों 2.6.2 और 2.6.3, ऊपर देखें)।
  3. एक स्वचालित सेल काउंटर (ऊपर चरण 2.6.4 देखें) का उपयोग करते हुए सेल घनत्व का अनुमान लगाएं।
  4. अलग-अलग 35 मिमी गिलास नीचे व्यंजनों के लिए लगभग 7 x 10 5 कोशिकाओं जोड़ें और कोशिकाओं 28 डिग्री सेल्सियस पर 20-25 मिनट के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति देते हैं।
  5. प्रत्येक अभिकर्मक के लिए, प्लाज्मिड डीएनए के 2 माइक्रोग्राम जोड़ने (या तो के लिए दो प्लास्मिड में से प्रत्येक से एक transfections के लिए एक प्लाज्मिड या 2 माइक्रोग्राम सेuble transfections) एक बाँझ 1.5 एमएल microfuge ट्यूब में दोनों Sf9 और TNI transfections) के लिए सीरम मुक्त कीट मध्यम (एफबीएस के बिना के 0.1 एमएल के लिए।
  6. एक अलग ट्यूब में सीरम मुक्त कीट माध्यम की 0.1 एमएल के साथ अभिकर्मक अभिकर्मक के 8 μL मिश्रण और उसके बाद ब्याज की प्लाज्मिड डीएनए युक्त ट्यूब कि समाधान के लिए स्थानांतरण। हल्के से भंवर और 20 के लिए आर टी पर सेते - 30 मिनट।
  7. सीरम मुक्त कीट माध्यम की 0.8 एमएल के साथ चरणों 3.5 से प्लाज्मिड-अभिकर्मक मिश्रण और 3.6 पतला ताकि कुल मात्रा 1 एमएल के बराबर होती है।
  8. ध्यान से गिलास संलग्न कोशिकाओं से युक्त व्यंजन से मीडिया को हटा दें। पतला प्लाज्मिड-अभिकर्मक माध्यम के साथ संलग्न कोशिकाओं ओवरले।
  9. 5 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं।
    नोट: अभिकर्मक के लिए शर्तों अधिक से अधिक अभिकर्मक दक्षता (के लिए अनुभवजन्य अनुकूलन की आवश्यकता होती है जैसे, रात भर के बजाय अभिकर्मक 5 घंटे, इस्तेमाल किया प्लाज्मिड डीएनए की राशि, अभिकर्मक अभिकर्मक के रसायन शास्त्रइस्तेमाल किया, आदि।)।
  10. निकालें और अभिकर्मक मध्यम त्यागने और धीरे, सीरम मुक्त कीट माध्यम के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोने कोशिकाओं को हटाने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है।
  11. ताजा कीट सेल मध्यम (TNI और Sf9 के लिए TNM-एफ एच के लिए सीरम मुक्त कीट मध्यम) के 2 एमएल जोड़ें और 48-72 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    ध्यान दें: एक बार फिर, स्थिति अधिक से अधिक heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए अनुभवजन्य अनुकूलन की आवश्यकता है।

4. confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

  1. 48-72 घंटे के बाद अभिकर्मक में आईपीएल-41 कीट माध्यम के 1 एमएल के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने और उसके बाद के 2 एमएल आईपीएल-41 इमेजिंग के लिए के साथ कवर किया।
    ध्यान दें: यह धोने कदम पृष्ठभूमि ऑटो प्रतिदीप्ति सामान्य कोशिका रखरखाव में प्रयोग किया जाता कीट सेल मध्यम के साथ मनाया कम कर देता है।
  2. हेक्स्ट लाइव सेल धुंधला अभिकर्मक के 4 बूँदें जोड़ें माध्यम से (इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता विशिष्ट परमाणु दाग ​​के लिए सामग्री की तालिका देखें) और 20-25 मिनट के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    नोट: अतिरिक्त nucसाफ़ दाग, प्रतिस्थापित किया जा सकता है, हालांकि डाई एक प्रतिदीप्ति प्रोफ़ाइल EGFP और mCherry से अद्वितीय होना चाहिए।
  3. आत्म संलग्न confocal खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर में एक 35 मिमी पकवान (विशिष्ट इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया उपकरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) रखें।
  4. हेक्स्ट, EGFP, और mCherry अवलोकन स्थितियों के लिए माइक्रोस्कोप समायोजित करें: हेक्स्ट उत्तेजना / उत्सर्जन - 359/461 एनएम; EGFP उत्तेजना / उत्सर्जन - 489/510 एनएम; mCherry उत्तेजना / उत्सर्जन - 580/610 एनएम।
  5. फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए और फिर एक 60x चरण विपरीत पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर स्कैनिंग मोड में स्विच एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर एक प्रारंभिक स्कैन।
  6. लेजर शक्ति (5-7%), डिटेक्टर की संवेदनशीलता (47-49%), स्कैनिंग गति, Z- अक्ष गहराई, और डिजिटल ज़ूम छवि कंट्रास्ट व रिज़ोल्यूशन अनुकूलन करने के लिए समायोजित करें। छवि 1.5X डिजिटल ज़ूम पर कोशिकाओं 90X प्रवर्धन की कुल देने के लिए।
    नोट: माइक्रोस्कोप मापदंडों इष्टतम के लिए अनुभवजन्य समायोजन की आवश्यकताछवि संग्रहण और उपयोग में साधन के लिए विशिष्ट हो सकता है।
  7. TIFF चित्र फ़ाइलें के रूप में कच्चे डेटा निर्यात करें और आंकड़ा पीढ़ी के लिए (फसल और ओवरले) को संशोधित करें।

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Representative Results

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ँ पीसीआर

ँ पीसीआर कैमेरिक डीएनए उत्पादों के संश्लेषण कि, एक बार एक अभिव्यक्ति वेक्टर में डाला, पुनः संयोजक कैमेरिक ब्याज और फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन की किसी भी परीक्षा के लिए इसी जीन प्रोटीन के उत्पादन के लिए अनुमति देने के लिए अनुमति देता है। चित्रा 1 PIB अभिव्यक्ति बी tabaci aquaporin फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर EGFP साथ में फ्रेम दृश्यों (BtDrip1 और BtDrip2_v1) कोडिंग युक्त वैक्टर के उत्पादन के लिए एक सामान्य योजना का प्रतिनिधित्व करता है। इस परिदृश्य में, दो BtDrip कैमेरिक उनके कार्बाक्सिल टर्मिनी पर EGFP युक्त प्रोटीन तैयार किए गए। यह प्रोटोकॉल भी दो कीट subcellular मार्कर प्रोटीन, DmSPR और PLA2G15 (चित्रा 1), उनके कार्बाक्सिल टर्मिनी पर mCherry साथ काइमेरा के रूप में निर्मित के विकास के लिए तरीकों का प्रदर्शन किया। EGFP और mCherry क्योंकि उनके उत्सर्जन स्पेक्ट्रा पर्याप्त भिन्न हैं चुने गए हैं, टी के लिए अनुमतिवह स्वतंत्र पता लगाने और परीक्षण प्रोटीन से संकेत के सह स्थानीयकरण (जैसे।, BtDrip-EGFP) और DmSPR- और PLA2G15-mCherry लेबल मार्कर प्रोटीन। सभी पीसीआर प्रतिक्रियाओं की उम्मीद आकार के बैंड का उत्पादन किया है और सफलतापूर्वक PIB में क्लोन किया गया। सभी प्लास्मिड डीएनए अनुक्रमण द्वारा पुष्टि की गई सही ओरिएंटेशन में और में फ्रेम फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर के साथ उचित आवेषण को रोकने के लिए।

कीट सेल संस्कृति में क्षणिक पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति

PIB / BtDrip1-EGFP, PIB / BtDrip2_v1-EGFP, PIB / DmSPR-mCherry, और PIB / PLA2G15-mCherry के लिए इसी अभिव्यक्ति वैक्टर के निर्माण के बाद, कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे थे और जीवित कोशिकाओं में पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति कोंफोकल प्रतिदीप्ति का उपयोग कर कल्पना की गई थी माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2)। सफल अभिकर्मक और पुनः संयोजक BtDrip1-EGFP की अभिव्यक्ति स्पष्ट ख हैy TNI कोशिकाओं (चित्रा 2 बी, 2F) की सतह पर हरी प्रतिदीप्ति की उपस्थिति। ग्रीन प्रतिदीप्ति BtDrip2_v1-EGFP (चित्रा 2J, 2N) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट TNI कोशिकाओं के भीतर मनाया जाता है, BtDrip2_v1 के intracellular अभिव्यक्ति का संकेत है। इसी तरह, TNI PIB / DmSPR-mCherry (चित्रा 2C, 2K) या PIB / PLA2G15-mCherry (चित्रा 2 जी, 2O) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं, लाल प्रतिदीप्ति दिखाने संबंधित काइमेरा की अभिव्यक्ति का संकेत है।

पुनः संयोजक BtDrip प्रोटीन और subcellular मार्कर के सह स्थानीयकरण

TNI कोशिकाओं की डबल अभिकर्मक दो फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन की सह-अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। ट्रांसफ़ेक्ट TNI कोशिकाओं है कि नारंगी / पीले कर रहे हैं के ऊपर रखा गया छवियों संकेत मिलता है कि कोशिकाओं दोनों EGFP और mCherry और उत्पादन प्लास्मिड बंदरगाह का सुझाव है कि प्रोटीन एक ही सु भीतर सह स्थानीयकृत हैंbcellular संरचनाओं (चित्रा 2 डी, 2H, 2L और 2P)। यह पिछले परिणाम है कि BtDrip1 और DmSPR कोशिका की सतह 14, 15, 16 पर व्यक्त कर रहे हैं पुष्टि करता है। TNI कोशिकाओं PIB / BtDrip1-EGFP और PIB / DmSPR-mCherry साथ डबल ट्रांसफ़ेक्ट का ओवरले, हरे और लाल प्रतिदीप्ति संकेत (चित्रा 2 डी) के ओवरलैप से पता चलता सुझाव BtDrip1-EGFP और DmSPR-mCherry के सह स्थानीयकरण कोशिका की सतह पर । इससे पहले, Maroniche एट अल। 17 प्रदर्शन किया है कि PLA2G15 मायत लाइसोसोम के एक मार्कर जब mCherry साथ एक कल्पना के रूप में Sf9 कोशिकाओं में व्यक्त किया है। हालांकि यह भविष्यवाणी की थी कि पुनः संयोजक BtDrip2_v1-EGFP प्रोटीन कोशिका की सतह को सरकाना होता है, यह पहले से दिखाया गया था कि कैमेरिक प्रोटीन मुख्य रूप से ट्रांसफ़ेक्ट TNI कोशिकाओं 15 के भीतर intracellularly स्थानीय था। इस के समर्थन में, वहाँ थोड़ा evid थाहरे और लाल फ्लोरोसेंट संकेत जब BtDrip2_v1-EGFP PIB / DmSPR-mCherry (चित्रा 2L) के साथ सह व्यक्त की गई थी के सह स्थानीयकरण के लिए खिलाडि़यों। इसके विपरीत, PIB / BtDrip2_v1-EGFP और PIB / PLA2G15-mCherry के सह-अभिव्यक्ति cytoplasmic हरे और लाल फ्लोरोसेंट संकेत (चित्रा 2P) में एक महत्वपूर्ण ओवरलैप के परिणामस्वरूप, दृढ़ता से सुझाव है कि BtDrip2_v1 संभावना intracellular लाइसोसोम को तस्करी कर रहा है।

आकृति 1
चित्र 1: ओवरलैप एक्सटेंशन पीसीआर (ँ पीसीआर) का उपयोग कर अभिव्यक्ति Constructs बनाने के लिए योजनाबद्ध। ँ पीसीआर PIB अभिव्यक्ति युक्त वैक्टर के निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है Bemisia tabaci aquaporin -1 / EGFP (BtDrip1-EGFP), बी tabaci aquaporin-2_variant 1 / EGFP (BtDrip2_v1-EGFP), ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर सेक्स पेप्टाइड रिसेप्टर / mCherry (DmSPR- mCherry), और होमो सेपियन्स phospholipase-A2 / mCherry(HsPLA2G15 mCherry) उत्पादों। ँ पीसीआर के पहले दौर ब्याज की पूर्ण लंबाई cDNAs करने के लिए इसी टुकड़े उत्पन्न करता है, BtDrip1 (ए), BtDrip2_v1 (बी), DmSPR (सी), और HsPLA2G15 (डी), एक छोटे से 3 'अतिव्यापी क्षेत्र के लिए इसी युक्त या तो EGFP या mCherry फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन की 5'-अंत। इसके साथ ही, EGFP और mCherry से पूर्ण लंबाई cDNAs पीसीआर प्रवर्धित और एक छोटे से 5 'अतिव्यापी क्षेत्र BtDrip1 (ए की 3'-समाप्त होता है के लिए इसी'), BtDrip2_v1 (बी '), DmSPR (सी), या HsPLA2G15 होते हैं (हैं डी ')। ध्यान दें कि ँ पीसीआर के पहले दौर में ब्याज की cDNAs (यानी BtDrip1, BtDrip2_v1, DmSPR, और HsPLA2G15) बढ़ाना करने के लिए इस्तेमाल सभी प्राइमरों स्टॉप कोडोन सामान्य रूप से प्रत्येक अनुक्रम कोडन की 3'-अंत में पाया की कमी है। सभी पहले दौर ँ पीसीआर उत्पादों परिलक्षित कर रहे हैं, agarose जेल चुनाव से अलग कर दियाrophoresis, और जेल शुद्ध। ँ पीसीआर के दूसरे दौर पूर्ण लंबाई कैमेरिक उत्पादों के प्रवर्धन के लिए टेम्पलेट्स के रूप में ँ पीसीआर के पहले दौर से जेल शुद्ध पीसीआर उत्पादों की जमा जोड़े उपयोग करता है। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, भावना प्राइमर ब्याज कोडिंग दृश्यों के सीडीएनए की 5'-अंत से मेल खाती है और एंटी-सेन्स प्राइमर EGFP या mCherry के 3'-अंत करने के लिए पूरक है, बरकरार कोडोन अपने स्टॉप (ए ', बी' के साथ 'सी' 'और डी' ')। चार दूसरे राउंड ँ पीसीआर उत्पादों जेल शुद्ध, Taq पोलीमरेज़ साथ adenylated, और PIB / वी 5-His- अभिव्यक्ति वेक्टर में ligated कर रहे हैं। प्लास्मिड ई कोलाई में उगाया जाता है, और शुद्ध प्लाज्मिड डीएनए कीट कोशिकाओं transfect किया जाता है। बी tabaci aquaporins BtDrip1 और BtDrip2_v1 क्रमश: गहरे नीले और सियान में दिखाया जाता है, और subcellular मार्कर DmSPR और PLA2G15 नारंगी और गुलाबी, क्रमशः में दिखाए जाते हैं। EGFP श हैहरे और mCherry में खुद को लाल रंग में है। रंगीन तीर दिशा (विपरीत दिशा में आगे की दिशा और एंटी-सेन्स प्राइमरों में भावना प्राइमरों) और जीन विशिष्ट प्राइमरों के स्थान का संकेत (एक प्राइमर का रंग प्राइमर अनुक्रम के स्रोत की ओर संकेत)। प्राइमर जानकारी के लिए तालिका 1 देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: जताते पुनः संयोजक BtDrip1-EGFP, BtDrip2_v1-EGFP, DmSPR-mCherry, और PLA2G15-mCherry प्रोटीन डबल-ट्रांसफ़ेक्ट TNI कोशिकाओं के लाइव इमेजिंग। Trichoplusia नी (TNI) कोशिकाओं PIB / BtDrip1-EGFP और PIB / DmSPR-mCherry (एडी), PIB / BtDrip1-EGFP और PIB / PLA2G15-mCherry (EH), PIB / BtDrip2_v1-EGFP और PIB / DmSPR साथ डबल ट्रांसफ़ेक्ट गया -mCherry (<strong> IL), या PIB / BtDrip2_v1-EGFP और PIB / PLA2G15-mCherry (मध्य प्रदेश)। छवियाँ एक confocal खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर 90X प्रवर्धन पर एक 60x चरण विपरीत पानी विसर्जन उद्देश्य (एनए 1.2) का उपयोग कर के साथ कब्जा कर लिया गया। हेक्स्ट पैनलों दाग सेल नाभिक (पूर्व / em = 359/461 एनएम) के प्रतिनिधि को लाइव सेल छवियों दिखा। EGFP पैनलों EGFP काइमेरा (पूर्व / em = 489/510 एनएम) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति दिखा। mCherry पैनलों mCherry काइमेरा (पूर्व / em = 580/610 एनएम) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति दिखा। समावेशन पैनल सभी तीन फ्लोरोसेंट चैनलों (यानी हेक्स्ट, EGFP, और mCherry) के ओवरले को दर्शाता है। स्केल बार 10 सुक्ष्ममापी =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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Heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली पुनः संयोजक कई बहाव के अनुप्रयोगों 4 में इस्तेमाल किया प्रोटीन के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। उपलब्ध विविध अभिव्यक्ति सिस्टम से चयन ब्याज की प्रोटीन के लिए अंतिम लक्ष्य पर निर्भर करता है। कई कीट सेल अभिव्यक्ति सिस्टम उपलब्ध की पेशकश प्रोकार्योटिक और यूकेरियोटिक सेल अभिव्यक्ति प्रणाली 5, 6 के लिए लचीला विकल्प हैं। कीट सिस्टम प्रोटीन अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए baculovirus संक्रमण की आवश्यकता होती है कई तरह के अनुसंधान और चिकित्सीय अनुप्रयोगों 1, 2, 3 में प्रयुक्त प्रोटीन के साथ, अब तक के सबसे लोकप्रिय और व्यापक रूप से इस्तेमाल कीट प्रणाली द्वारा कर रहे हैं। Baculovirus अभिव्यक्ति है, लेकिन, सीमाओं, सहित कि है: 1) वायरल जीवन चक्र मेजबान सेल के lysis शामिल है; 2) मेजबान कोशिकाओं lysed रहे हैं कि आम तौर पर उच्च एमो जारीdegradative एंजाइम की unts; 3) स्थिर सेल लाइनों की पीढ़ी समय लेने और साइटोटोक्सिक प्रोटीन के लिए संभव नहीं हो सकता है, 4) असंतत अभिव्यक्ति अक्सर रखरखाव की आवश्यकता है, 5) वेक्टर पीढ़ी अक्सर कई क्लोनिंग चरणों की आवश्यकता है; 6) कीट सेल घनत्व अक्सर विपरीत रूप से वायरल संक्रमण के लिए आनुपातिक हैं; और 7) पुनः संयोजक प्रोटीन मुख्य रूप से कोशिका की सतह को उच्च स्तर पर तस्करी कर रहे हैं या 3, 7, 9, 10 स्रावित होते हैं। Nonlytic क्षणिक जीन प्लाज्मिड डीएनए के साथ कीट सेल अभिकर्मक के आधार पर अभिव्यक्ति अद्वितीय baculoviruses 7, 8 के साथ जुड़े चुनौतियों में से कुछ के बिना, पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक वैकल्पिक तकनीक प्रदान करता है। अर्थात्, क्षणिक कीट सेल एक्सप्रेशन छोटा कायापलट प्रदान करता है वेक्टर निर्माण और प्रोटीन संश्लेषण पर, challeng से बचा जाता है तों वायरल संक्रमण और सेल के साथ जुड़ा हुआ है, और प्रोटीन की सेलुलर तस्करी निरीक्षण करने के लिए एक मजबूत साधन प्रदान करता है।

इधर, दो मान्य अभिव्यक्ति निर्माणों बी tabaci aquaporin प्रोटीन BtDrip1 और BtDrip2_v1 के subcellular स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। DmSPR-mCherry प्लाज्मा कोशिका झिल्ली 16 के लिए एक मार्कर है, और PLA2G15-mCherry सेलुलर लाइसोसोम 17 के भीतर localizes। चित्र 2 के प्रोटीन के स्थानों का आकलन करने के लिए इस तरह के मार्करों के मूल्य से पता चलता ब्याज-इस मामले में, BtDrip1-EGFP की कोशिका की सतह पर DmSPR-mCherry और BtDrip2_v1-EGFP साथ PLA2G15-mCherry साथ लाइसोसोम भीतर सह स्थानीयकरण। इसलिए, यहाँ दिखाया गया है और पिछले जांच में 14, 15, 16, 18, 19,गधा = "xref"> 20, इस पद्धति तेजी से कीट कोशिकाओं के भीतर प्रोटीन की तस्करी पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। हालांकि प्रोटीन अभिव्यक्ति और तस्करी TNI कोशिकाओं के भीतर यहाँ (चित्र 2) दिखाया गया है, ऐसा लगता है कि प्रोटोकॉल अनुकूलित किया जा सकता है और अन्य कीट सेल लाइनों (Sf9, Sf21, बी.एम.-एन, एस 2, आदि) के लिए समान रूप से अच्छी तरह से लागू किया नोट करना महत्वपूर्ण है ।

सभी heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियों की तरह, वहाँ सुसंस्कृत कीट कोशिकाओं के भीतर क्षणिक प्रोटीन के उत्पादन की सीमाएं हैं। अर्थात्, प्लाज्मिड व्युत्पन्न अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत आम तौर पर baculovirus से या स्थिर सेल लाइनों का उपयोग करने से हासिल की है कि तुलना में कम है। इस प्रकार, पुनः संयोजक प्रोटीन (रों) का उत्पादन एक क्षणिक प्रणाली में कम हो सकता है की राशि; हालांकि, विभिन्न प्रमोटरों के उपयोग और आनुवंशिक वर्धक का समावेश इस संभावित सीमा 7, 21, 22 को दूर कर सकते। टीउसकी प्रोटोकॉल दो PIB वैक्टर, प्रत्येक को शरण देने विभिन्न प्रोटीन कोडिंग दृश्यों (चित्रा 2) के साथ TNI कोशिकाओं के सह अभिकर्मक को दर्शाता है। हालांकि ही प्रभावी TNI कोशिकाओं (नहीं दिखाया डेटा) transfect करने के लिए उपयोग किए गए सभी चार अभिव्यक्ति वैक्टर के लिए मनाया गया, यह हमेशा संभव नहीं है। इसलिए, इस तरह के क्षणिक अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ प्रयोग व्यापक अनुभवजन्य अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है (जैसे, प्रत्येक वेक्टर, अभिकर्मक समय, अभिकर्मक अभिकर्मक रसायन विज्ञान, आदि की राशि में परिवर्तन) बराबर अभिकर्मक क्षमता और / या पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के लिए। इसके अलावा, यह है कि एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अलावा प्रभावित करने या subcellular तस्करी प्रतिबंधित की प्रोटीन 23 को लक्षित करता है, 24 सकता है संभव है। प्रतिदीप्ति के अवलोकन से दो प्रोटीन की subcellular सह स्थानीयकरण की पहचान मार्कर प्रोटीन के साथ necessaril नहीं हैy ब्याज 24, 25 के प्रोटीन के बीच सीधा प्रोटीन प्रोटीन अन्योन्य क्रिया संकेत मिलता है। इसलिए, सावधानी जब इस तरह के सह स्थानीयकरण परिणाम की व्याख्या की आवश्यकता है।

क्षणिक जीन अभिव्यक्ति वर्तमान में उपलब्ध baculovirus अभिव्यक्ति प्रणालियों तुलना में अधिक लाभ की पेशकश करता है। क्षणिक अभिव्यक्ति वैक्टर के निर्माण के लिए कम समय और श्रम की आवश्यकता है और पुनः संयोजक प्रोटीन के संश्लेषण के लिए, क्षणिक अभिव्यक्ति baculovirus की रोगजनक जीवन चक्र के साथ जुड़े सेल शामिल नहीं है, और क्षणिक अभिव्यक्ति की subcellular तस्करी के लिए एक बेहतर अध्ययन प्रणाली प्रदान कर सकते हैं प्रोटीन 3, 7, 9। यह प्रोटोकॉल PIB अभिव्यक्ति वेक्टर में ब्याज की एक जीन की प्रत्यक्ष समावेश के माध्यम से आसानी और इमारत निर्माणों की गति ओवरलैप विस्तार पीसीआर (चित्रा 1 का उपयोग कर पर प्रकाश डाला गया 26 की एक विस्तृत चयन के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, हालांकि EGFP 27 और mCherry 28 दो बी tabaci aquaporin प्रोटीन की कार्बाक्सिल टर्मिनी पर यहाँ शामिल कर लिया गया, ँ पीसीआर भी इन प्रोटीनों की अमीनो टर्मिनी पर कई अन्य संस्करण फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन 26 रखने में किया जा सकता है। यह उल्लेखनीय है कि, कई अभिव्यक्ति ँ पीसीआर का उपयोग करके बनाया प्लास्मिड के अलावा, कई पारंपरिक अभिव्यक्ति क्लोनिंग कैसेट तैयार किए गए और फ्लोरोसेंट प्रोटीन EGFP, शुक्र, और mCherry साथ में फ्रेम हित के लगभग किसी भी प्रोटीन के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, इनकार या तो अमीनो या टर्मिनल सिरों पर। इस तरह की अभिव्यक्ति कैसेट अनुरोध पर उपलब्ध हैं।

"जीनोमिक्स" के युग सार्थक घ के एक अभूतपूर्व मात्रा और पहुँच प्रदान की गई हैअता। हालांकि, खाई जीन की खोज और जीन उत्पादों के लिए समारोह का काम बीच चौड़ा करने के लिए जारी; इस प्रकार, अतिरिक्त अनुभवजन्य उपकरण सख्त कार्यात्मक जीनोमिक्स में तेजी लाने की आवश्यकता है। जबकि, जीन संपादन और इन विवो जीन में गड़बड़ी प्रणालियों में अन्य अंत में जीन समारोह असाइन करने के लिए सर्वोत्कृष्ट दृष्टिकोण प्रदान कर सकता है, heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली की संभावना बहुमूल्य प्रोटीन की biomanufacture के लिए और प्रोटीन संरचना और समारोह गूढ़ रहस्य के लिए महत्वपूर्ण रहेगा। यह प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति प्लास्मिड की बढ़ी निर्माण और कीट कोशिकाओं में पुनः संयोजक प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए एक विधि का वर्णन है।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए लिन Forlow-Jech और डैनियल लिरो धन्यवाद। इस काम यूएसडीए एआरएस के आधार क्रिस धन, राष्ट्रीय कार्यक्रम 304 द्वारा समर्थित किया गया - फसल संरक्षण और संगरोध [परियोजना # 2020-22620-022-00D] व्यापारिक नाम या व्यावसायिक उत्पादों की JAF और JJH उल्लेख करने के लिए इस लेख प्रयोजन के लिए है की विशिष्ट जानकारी प्रदान करने और अमेरिका के कृषि विभाग द्वारा की गई अनुशंसाओं या बेचान संकेत नहीं करता। यूएसडीए एक समान अवसर प्रदाता और नियोक्ता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD DNA Polymerase EMD Millipore 71085-3 High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA Polymerase TaKaRa-Clontech RR001B DNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix Lucigen 30033-1 DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler Biometra/LABRepCo 070-851
Agarose LE Benchmark Scientific A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit EMD Millipore LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit ThermoFisher K89020 Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep Kit Qiagen 27104
QIAcube Robotic Workstation Qiagen 9001292
Purifier Vertical Clean Bench Labconco 3970401
Tni cultured insect cell Line Allele Biotech ABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell Line Allele Biotech ABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture Medium Allele Biotech ABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture Medium Allele Biotech ABP-MED-10001
IPL-41 Insect Medium ThermoFisher 11405081
Cellfectin II Transfection Reagent ThermoFisher 10362100
16 cm Disposable Cell Scrapers Sarstedt 83.1832 Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps Life Science Products CT-229331
Transfer Pipets Fisher 1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes Life Science Products CT-229475
PipetteBoy VWR 14222-180
5 mL Serological Pipettes Sarstedt 86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes Fisher 14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags Fisher 01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes Matsunami Glass D35-14-1.5-U 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510E VWR 35823-961
Countess II FL Cell Counter ThermoFisher AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent ThermoFisher C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope Olympus FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA transOMIC Technologies TCH1303
pmCherry Vector Clontech 632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) ThermoFisher R37605

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References

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क्षणिक अभिव्यक्ति और पुनः संयोजक प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण सुसंस्कृत कीट कोशिकाओं में
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Fabrick, J. A., Hull, J. J. Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells. J. Vis. Exp. (122), e55756, doi:10.3791/55756 (2017).More

Fabrick, J. A., Hull, J. J. Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells. J. Vis. Exp. (122), e55756, doi:10.3791/55756 (2017).

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