Summary
Nonlytic системы экспрессии клеток насекомых недостаточно для производства, торговли сотовой / локализации, а также рекомбинантного белка функционального анализа. Здесь мы описываем методы для генерации векторов экспрессии и последующей кратковременной экспрессию белка в коммерчески доступных чешуекрылых клеточных линиях. Совместно локализация Bemisia tabaci аквапоринов с субклеточных флуоресцирующих белков - маркеров также представлены.
Abstract
Гетерологичных системах экспрессии белка используются для получения рекомбинантных белков, интерпретация клеточного оборота / локализации, а также определение биохимической функции белков в суб-организменном уровне. Хотя выражение бакуловирусных системы все чаще используются для производства белка в многочисленных биотехнологическом, фармацевтическом и промышленных применениях, nonlytic систем, которые не связаны с вирусной инфекцией имеют очевидные преимущества, но часто упускаются из вида и недостаточно. Здесь мы опишем способ генерации nonlytic векторов экспрессии и переходную экспрессии рекомбинантного белка. Этот протокол позволяет эффективно клеточной локализации рекомбинантных белков и может быть использован для быстрого перемещения белков различить внутри клетки. Покажет экспрессию четыре рекомбинантных белков в коммерчески доступной линии клеток насекомых, в том числе двух аквапориных белков из насекомых Bemisia tabaci, а такжев субклеточных маркерных белков, специфичных для плазматической мембраны клетки и внутриклеточные лизосомы. Все рекомбинантные белки получали в виде химер с флуоресцентными маркерами белка в их карбоксильных концах, что позволяет для прямого обнаружения рекомбинантных белков. Двойная трансфекция клеток плазмид, несущие конструкции для генов, представляющего интереса и известных субклеточных маркеров позволяет клетки живого изображения и улучшенной проверке локализации клеточного белка.
Introduction
Получение рекомбинантных белков с использованием насекомыми системы экспрессии клеток предлагает многочисленные преимущества для изучения эукариотических белков. А именно, клетки насекомых обладают сходными посттрансляционными модификациями, обработку и сортировки механизмов , как присутствующие в клетках млекопитающих, что является предпочтительным для получения правильно свернутых белков 1, 2, 3. Системы клеток насекомых , как правило , также требуют меньше ресурсов и меньше времени и усилий для поддержания чем клеточных линий млекопитающих 4, 5. Система экспрессии бакуловируса является одним из таких насекомых клеточной системы на основе, которая в настоящее время широко используется во многих областях, в том числе получения рекомбинантных белков для белка характеристик и терапевтических средств, иммуногенной презентации чужеродных пептидов и вирусных белков для производства вакцин, синтеза мульти -protein комплексы, Производство гликозилированных белков и т.д.. 1, 2, 4, 6. Есть, однако, ситуации , в которых бакуловирус выражение не может быть применимо 3, 7, а также использование nonlytic и переходных систем экспрессии насекомых может быть более подходящим. В частности, выражение переходных клеток насекомых дает возможность для быстрого синтеза рекомбинантного белка, требует меньше усилий и техническое обслуживания, не включает в себя вирусный взимаемые лизис клеток, а также предоставляют средства для лучшего изучения клеточной торговли людей во время синтеза белка 7, 8, 9, 10.
Этот протокол описывает быстрое формирование векторов экспрессии, используя два этапа расширения перекрытия ПЦР (ОЕ-ПЦР)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. OE-PCR для строительства экспрессирующих плазмид
Примечание: В таблице 1 для всех праймеров , используемых в OE-PCR. Использование ДНК-полимеразы высокой точности рекомендуется для всех усилений. Однако, поскольку эти ферменты часто не оставляют 3' А, необходимо выполнить краткие, не-усилительные инкубации с полимеразой Taq ДНК с „А-хвостом“ продукты ПЦРА перед клонированием их в выражение клеточного насекомых Т.А. вектор. Этот протокол демонстрирует способ для генерации насекомых экспрессии плазмиды , несущая химерных белки, с флуоресцентными белками , слитых в рамке считывания с карбоксильным концом генов , представляющего интереса (в данном случае, к двум Bemisia tabaci аквапорина белков) или субклеточным белкам - маркеров (рис 1).
- Используйте OE-PCR, который состоит из двух независимых циклов амплификации, для генерации: (1) последовательности , кодирующие гены , представляющие интерес (Б. tabaciаквапорин 1: BtDrip1; Б. tabaci аквапорин 2: BtDrip2_v1) , слитый в рамке с зеленым флуоресцентным белком вариант под названием EGFP , или (2) субклеточных маркеров (дрозофилы пол пептид рецептора: DmSPR; гомо сапиенс фосфолипазы А2: HsPLA2) с кодирующей последовательностью mCherry. Непосредственно лигировании конечных продуктов ОГО-ПЦР в плазмиду ПИБ / V5-His-TA.
- Для первого раунда OE-PCR (обозначенный AD и А'-D»на рисунке 1), используют ген-специфический смысловой праймер (показанный жирным шрифтом в таблице 1) и химерного антисмыслового праймера (выделены курсивом в таблице 1) , соответствующих до конечной 15 пар оснований (без стоп-кодона) гену интереса / субклеточных маркеров и 15 п.о. 5'-конца желаемого флуоресцентного белка (EGFP или mCherry), чтобы генерировать продукт с свесом 3' .
Примечание: В таблице 2 условий ПЦР. - В отдельной пробирке, используют ген-specifIC флуоресцентный белок антисмыслового праймер (показан с подчеркиванием в таблице 1) и химерный смысловой праймером , который содержит 15 пар оснований с 3'-конца гена интереса / субклеточных маркера и 15 пар оснований от 5'-конца желаемого флуоресцентного белок, чтобы генерировать продукт с свесом 5' .
Примечание: см таблицу 2 для условий ПЦР. Шаблон ПЦР может быть либо последовательностью подтверждено ПЦР-продукт или, более предпочтительно, плазмидной ДНК, несущий желаемую последовательность. Исследование, описанное здесь, использует последовательность апробирована плазмиды. - Отдельные продукты ПЦР с 1% электрофореза в агарозном геле (с использованием стандартных молекулярно-класса агарозы).
- Акциз и очистить продукты ожидаемого размера (смотри таблицу 2) с использованием коммерчески доступного набора для экстракции геля ДНК (смотри таблицу материалов для конкретного набора , используемого в данном протоколе).
- С помощью гель-очищенных ПЦР-продуктов со стадии 1.1.4 для создания окончательного перекрытия еXtension изделия (обозначается A '' - D '' на фиг.1). Используйте ген-специфический смысловой праймер для интересующего гена / маркеров субклеточных и соответствующего ген-специфического антисмыслового праймера для флуоресцентного белка, чтобы генерировать желаемую химерную последовательность.
Примечание: см таблицу 2 для условий ПЦР. Это может быть необходимо, чтобы эмпирически определить оптимальные количества первого раунда расширения продуктов перекрытия, чтобы добавить к реакционной смеси с получением конечного, полной длины химерного продукта ПЦР. - Отделить вторые круглые продукты ОГО-ПЦР на 1% электрофорезе в агарозном геле. Акциз и очистки продуктов с использованием коммерчески доступного набора для экстракции геля ДНК.
- Инкубировать гель-очистке второго круглых продуктов ОЕ-ПЦР с 1 единицу Taq - ДНК - полимеразы мастер смеси в течение 10 мин при 72 ° C , чтобы генерировать 3' adenylated (т.е. А-хвостатых) продукты , необходимые для клонирования TA.
- Лигирования в результате adenylated продуктыв вектор экспрессии ПИБ и использовать стандартные методы молекулярного клонирования для трансформации химически компетентных (теплового шока) или Электрокомпетентные (электропорации) клетки кишечной палочки. Тарелка в течение ночь на среду , содержащей соответствующий маркер выбора (то есть, ампициллин или карбенициллин).
- Выполните ПЦР колоний 12 с использованием вектора-специфического праймера и праймера вставки специфичные для идентификации вставки-позитивные колонии , которые были трансформированы с экспрессирующие плазмиды , несущие вставки в ориентации 5'-3' . Приготовьте ночные культуры колоний, порождающих продуктов ПЦР ожидаемых размеров.
- Изолировать плазмидной ДНК с использованием коммерчески доступного набора для очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя (см Материалы таблицу для конкретного набора , используемого в данном протоколе). Проверка целостности последовательности каждой вставки путем прямого секвенирования ДНК.
- Для первого раунда OE-PCR (обозначенный AD и А'-D»на рисунке 1), используют ген-специфический смысловой праймер (показанный жирным шрифтом в таблице 1) и химерного антисмыслового праймера (выделены курсивом в таблице 1) , соответствующих до конечной 15 пар оснований (без стоп-кодона) гену интереса / субклеточных маркеров и 15 п.о. 5'-конца желаемого флуоресцентного белка (EGFP или mCherry), чтобы генерировать продукт с свесом 3' .
Примечание: Для поддержания стерильных условий, проводить все манипуляции клеток, требующих открытие колбы культуры ткани в пределах колпака с ламинарным потоком. Включите ламинарный поток капота УФ бактерицидную лампу, по меньшей мере за 1 ч до клеточных манипуляций. Wear нитриловые перчатки и обеззаразить поверхность скамьи, пипетки, столовые приборы, трубки и колбы с 70% -ным этанолом перед их использованием. Знакомство с основными методами клеточной культуры рекомендуется 13.
- Используйте ВСИТЕ клетки (установленная для культивирования клеток линий получены из Trichoplusia щий ткани яичников), которые адаптированы к среде без сыворотки и поддерживать их в качестве клейкой монослойной культуры в среде насекомых без сыворотки при 28 ° С в T25 колбах для культуры ткани.
- Поддерживать клетки Sf9 (установленную культуру линии клеток , полученную из Spodoptera frugiperda ткани яичников) Аналогично , но с использованием TNM-FH культуры насекомых среднего дополненияред с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
- Семенной первоначальную культуру от замороженного Sf9 или ВСИ клеток путем удаления из запаса флаконов -80 ° С и дают им возможность оттаивать в водяной бане при 37 ° C. Обеззараживать ампулы с 70% этанолом после оттаивания и поместить их на льде.
- Добавить 4 мл среды клеток насекомых в новую колбу Т25 и перенос 1 мл талых насекомых клеточной суспензии. Поместите колбу в 28 ° C, не-увлажненном инкубаторе и позволяют клеткам прикрепляться в течение 30-45 мин.
- Заменить высев среду с 5 мл соответствующей среды и переносят в колбы на 28 ° C, не увлажненный инкубатор. Монитор клеток впадения ежедневно. Пассаж клетка, когда они достигают 90% сплошность.
Примечание: Полный охват Т25 колбы соответствует ~ 5 × 10 6 клеток. - Клеток насекомых проход.
- Для того, чтобы прохождение клеток, сначала удалить истощенную среду из колбы, содержащей сливные клеток с использованием стерильной 5 мл серологической пипетки.Наклон колбы таким образом, чтобы среда течет в одном углу, вдали от монослоя клеток. Аккуратно извлеките носитель с помощью пипетки, не нарушая клетки.
- Выбивать ВСИ клетки осторожно промывки колбы Т25, содержащую сливающийся монослой с 4 мл среды насекомых без сыворотки с использованием новой, стерильная, 5 мл серологической пипетки. Перемещение наконечник пипетки через колбу и медленно орошает, чтобы удалить клетки слабо прикрепленные к нижней части колбы.
- Проверьте наличие адекватного отрыва клеток путем удаления всех средств массовой информации, поворачивая колбу снова, и наблюдая, что дно колбы ясно.
- Для клеток Sf9, которые прилипают более плотно, добавить 4 мл свежей среды TNM-FH и использовать сотовый скребок, чтобы сместить прикрепленные клетки. С помощью серологической пипетки 5 мл осторожно перемешать и уменьшить клетки комкова.
- С помощью автоматизированного счетчика клеток для оценки количества жизнеспособных клеток насекомых на объем среды. Передача 0,1 мл / клеточной среде смеси до 1,5 млмикрофужная трубка. В отдельных 0,5 мл микроцентрифужной пробирки, добавляют 10 мкла клетки / средней смеси до 10 мкл трипанового синего.
- Удаление счетчика клеток в камере слайд из упаковки и добавить 10 мкл клеточной среды / / трипанового синего смеси в каждую сторону от счетной слайда. Вставьте слайд в счетчик клеток и определить плотность клеток и жизнеспособность.
- Используя плотность клеток, рассчитать и добавить собственный объем насекомых среды клеток (до 5 мл) к новым, стерильные колбы Т25.
- Передача примерно 1-1,5 × 10 6 клеток в колбы Т25 с свежей средой; маркировать колбы с клеточной линией, датой, используемой средой, количеством клеток , добавленным, и номером канала (P N + 1 поколением, где Р п является номером прохода для предыдущего поколения клеток); и помещают в колбы в инкубаторе C 28 ° до 72 ч.
Примечание: Клетки насекомых могут непрерывно распространяться, хотя клетки могут быть менее восприимчивы к трансфекции и / или гетерологичномуэкспрессии белка после 30 пассажей. Рассматривать все отбрасывается клеток / носитель с 10% -ным раствором хлорной извести и автоклав одноразовой пластиковой посуды перед утилизацией.
3. Insect Cell Трансфекция
- Семенной в T25 колбу с до 1 × 10 6 ВСИ или Sf9 клетки в соответствующей клеточной среде насекомых (бессывороточную среда для насекомых ВСИ и TNM-FH для Sf9) и расти до конфлюэнтности в течение 72 ч при 28 ° С.
- Удаляют старую среду и сместить клетки с 4 мл среды насекомых свежей сыворотки (см шагов 2.6.2 и 2.6.3, выше).
- Оценка плотности клеток с использованием автоматического счетчика клеток (смотри стадию 2.6.4, выше).
- Добавить приблизительно 7 х 10 5 клеток на отдельные 35 мм с прозрачным дном посуды и позволяют клеткам прикрепляться в течение 20-25 мин при температуре 28 ° С.
- Для каждой трансфекции добавляют 2 мкг плазмидной ДНК (либо из одной плазмиды для одиночной или трансфекции 2 мкг из каждых из этих двух плазмид для делuble трансфекция) в 0,1 мл среды без сыворотки насекомых (без FBS для обоего Sf9 и ВСИТЕ трансфекции) в стерильных 1,5 мл микроцентрифужной пробирки.
- В отдельной пробирке, смешать 8 мкл реагента для трансфекции с 0,1 мл среды насекомых без сыворотки, а затем передать этот раствор в пробирку, содержащую плазмидную ДНК, представляющий интерес. Слегка вихрь и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 - 30 мин.
- Развести плазмиды трансфекции смесь из шагов 3,5 и 3,6 с 0,8 мл среды насекомых без сыворотки, так что общий объем равен 1 мл.
- Аккуратно извлеките носитель из стеклянной посуды, содержащей прикрепленные клетки. Перекрытие прикрепленные клетки с разбавленной плазмиды трансфекции среды.
- Инкубируйте клетки при 28 ° С в течение 5 ч.
Примечание: Условия для трансфекции требуют эмпирической оптимизации для максимальной эффективности трансфекции (например, в течение ночи трансфекции , а не 5 ч, количество плазмидной ДНК использовали, химический состав реагента для трансфекцииб и др.). - Удаляем трансфекции среды и осторожно промыть клетки с 1 мл среды насекомых без сыворотки, осторожно, чтобы не сместить клетки.
- Добавьте 2 мл свежей среды клеток насекомых (не содержащую сыворотку среды без насекомых для ВСИ и TNM-FH для Sf9) и инкубируют при 28 ° С в течение 48-72 ч.
Примечание: Опять же, условия требуют эмпирической оптимизации для максимальной экспрессии гетерологичных белков.
4. конфокальной флуоресцентной микроскопии
- В 48-72 ч после трансфекции, промыть клетки один раз 1 мл IPL-41 среды насекомых, а затем покрывают 2 мл IPL-41 для работы с изображениями.
Примечание: Эта стадия промывки снижает фоновые автофлуоресценции наблюдаемых со средой клеток насекомых, используемой в обычном обслуживании клеток. - Добавьте 4 капли Hoechst окрашивающего реагента живых клеток (смотрите таблицу материалов для конкретного ядерного красителя, используемого в данном протоколе) к среде и инкубируют при 28 ° С в течение 20-25 мин.
Примечание: Дополнительная писLear пятно может быть замещено, хотя краситель должен иметь профиль флуоресценции уникальный от EGFP и mCherry. - Поместите 35 мм блюдо в замкнуты лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (см таблицу материалов для конкретного инструмента, используемого в данном протоколе).
- Настройка микроскопа для условий наблюдения Хехст, EGFP и mCherry: Хехст возбуждения / эмиссии - 359/461 нм; EGFP возбуждения / эмиссии - 489/510 нм; mCherry возбуждения / эмиссии - 580/610 нм.
- Выполнить первоначальное сканирование с использованием 10x цели, чтобы подтвердить флуоресцентное выражение, а затем перейти в режим сканирования с помощью цели контраста вода-погружения в 60X фазы.
- Регулировка мощности лазера (5-7%), чувствительность детектора (47-49%), скорость сканирования, глубина Z-ось, а цифровое масштабирование, чтобы оптимизировать контрастность и разрешение изображения. Изображение клетки при 1.5X цифрового зума, чтобы дать в общей сложности 90x усиления.
Примечание: Параметры микроскопов требуют эмпирической регулировки для оптимальнойколлекции изображений и могут быть специфическими для инструмента в использовании. - Экспорт необработанных данных в виде файлов изображений TIFF и изменять (растениеводство и накладку) для генерации фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ОЕ-ПЦР
ЫЙ-ПЦР позволяет для синтеза химерных продуктов ДНК, которые, как только вставленного в вектор экспрессии, позволяют для производства рекомбинантных химерных белков, соответствующих какого-либо тест интересующего гена и маркерного флуоресцентного белка. Рисунок 1 представляет собой общую схему для получения векторов экспрессии , содержащих PIB B. tabaci аквапорина кодирующих последовательностей (BtDrip1 и BtDrip2_v1) в рамке считывания с флуоресцентным маркером EGFP белка. В этом случае, два BtDrip химерных белков, содержащие EGFP на их концах карбоксильных были произведены. Этот протокол также продемонстрировал способы разработки два насекомых субклеточных маркера белков, DmSPR и PLA2G15 (рисунок 1), полученные , как химеры с mCherry в их карбоксильных концах. EGFP и mCherry были выбраны потому, что их спектры эмиссии достаточно расходящиеся, что позволяет тон не зависит обнаружение и совместная локализация сигналов от исследуемых белков (например., BtDrip-EGFP) , а также DmSPR- и PLA2G15-mCherry-меченых белков - маркеров. Все реакции ПЦР производства полос ожидаемых размеров и успешно клонированы в ПИБ. Все плазмиды были подтверждены секвенирование ДНК содержат соответствующие вставки в правильной ориентации и в рамке считывания с флуоресцентными маркерами белка.
Переходные экспрессии рекомбинантного белка в культуре клеток насекомых
После конструирования экспрессирующих векторов, соответствующих ПИБЫ / BtDrip1-EGFP, PIB / BtDrip2_v1-EGFP, PIB / DmSPR-mCherry и PIB / PLA2G15-mCherry, клетки трансфицировали и экспрессия рекомбинантных белков в живых клетках визуализировали с использованием конфокальной флуоресценции микроскопия (рисунок 2). Успешная трансфекция и экспрессии рекомбинантного BtDrip1-EGFP очевидно, бу наличие зеленой флуоресценции на поверхности ВСИ клеток (фигура 2В, 2F). Зеленый флуоресценции наблюдается в ВСИ клетках , трансфицированных BtDrip2_v1-EGFP (рис 2J, 2н), что указывает на внутриклеточную экспрессию BtDrip2_v1. Точно так же, ВСИ клетки , трансфицированные ПИБ / DmSPR-mCherry (рис 2С, 2K) или PIB / PLA2G15-mCherry (рис 2G, 2O) показывают красную флуоресценцию, что указывает на экспрессию соответствующих химер.
Со-локализация рекомбинантных белков BtDrip и субклеточных маркеров
Двойной трансфекции клеток ВСИ позволяет совместной экспрессии двух флуоресцентных-меченых белков. Наложенные изображения трансфицированных клеток ВСИТЕ, которые являются оранжевыми / желтым показывают, что клетки, продуцирующие укрывают плазмиды как EGFP и mCherry и предполагают, что белки совместно локализованы в пределах одной и тот же суbcellular структуры (фигура 2D, 2H, 2L & 2P). Это подтверждает , что предыдущие результаты BtDrip1 и DmSPR выражены на клеточной поверхности 14, 15, 16. Наложение ВСИ клеток дважды трансфицированных ПИБ / BtDrip1-EGFP и PIB / DmSPR-mCherry показывает перекрытие зеленого и красного сигналов флуоресценции (рис 2D), предполагая совместной локализации BtDrip1-EGFP и DmSPR-mCherry на поверхности клетки , Ранее Maroniche и соавт. 17 показано , что PLA2G15 является маркером межклеточных лизосом при экспрессии в клетках Sf9 , как химеры с mCherry. Несмотря на то, что было предсказано , что рекомбинантный белок BtDrip2_v1-EGFP бы транслоцироваться к клеточной поверхности, ранее было показано , что химерный белок , в основном локализованы внутриклеточно в пределах трансфицированных клеток ВСИ 15. В поддержку этого было мало EVIDENCE для совместной локализации зеленого и красного сигналов люминесцентных , когда BtDrip2_v1-EGFP , ко-экспрессировали с ПИБ / DmSPR-mCherry (рис 2 л). В противоположность этому , совместная экспрессия ПИБ / BtDrip2_v1-EGFP и PIB / PLA2G15-mCherry привело к значительному перекрытию в цитоплазматических зеленого и красного сигналов люминесцентных (рис 2P), предполагая , что сильно BtDrip2_v1, вероятно , продают в внутриклеточные лизосомы.
Рисунок 1: Схема для строительства экспрессирующих конструкций с использованием ПЦР Перекрытия Extension (ЫЙ-ПЦР). ОЕ-ПЦР используется для построения векторов экспрессии , содержащих их ПИБ Bemisia tabaci аквапорин-1 / EGFP (BtDrip1-EGFP), Б. tabaci аквапорин-2_variant 1 / EGFP (BtDrip2_v1-EGFP), дрозофилы секс пептид рецептора / mCherry (DmSPR- mCherry), а гомо сапиенс фосфолипазы А2-/ mCherry(HsPLA2G15-mCherry) продукции. Первый раунд OE-ПЦР генерирует фрагменты , соответствующие полной длины кДНК , представляющих интерес, BtDrip1 (А), BtDrip2_v1 (В), DmSPR (С) и HsPLA2G15 (D), содержащий небольшое 3' перекрывающиеся области , соответствующей 5'-конец либо EGFP или mCherry флуоресцирующих белков-маркеров. Одновременно с этим во всю длину от кДНК EGFP и mCherry являются ПЦР - амплификации и содержат небольшое 5' перекрывающийся участок , соответствующий 3'-концам BtDrip1 (А «), BtDrip2_v1 (В»), DmSPR (С»), или HsPLA2G15 ( D»). Обратите внимание , что все праймеры , используемые для амплификации кДНК интереса (т.е. BtDrip1, BtDrip2_v1, DmSPR и HsPLA2G15) в первом раунде OE-PCR отсутствие стоп - кодон обычно находятся на 3'-конце каждой кодирующей последовательности. Все первый-круглые продукты ОГО-ПЦР амплифицирует, разделенный в агарозном геле избранногоrophoresis и очищали на геле. Второй раунд OE-PCR использует объединенные пары гелевых очищенные ПЦР-продукты от первого раунда OE-ПЦР в качестве матриц для амплификации полной длиной химерных продуктов. Для каждой реакции смыслового праймер соответствует 5'-концу кДНКа кодирующих последовательностей процентов и антисмысловый праймер является дополнением к 3'-концу EGFP или mCherry, с его стоп - кодона нетронутого (A «», B» 'С'»и D ''). Четыре второго круглых продуктов ОЕ-ПЦР очищали на геле, adenylated с Taq-полимеразой и лигировали в вектор экспрессии ПИБ / V5-Гиса. Плазмиды размножали в E.coli и очищали плазмидную ДНК использовали для трансфекции клеток насекомых. Б. tabaci аквапорины BtDrip1 и BtDrip2_v1 показаны в темно - синем и голубом цвете, соответственно, и субклеточный маркеры DmSPR и PLA2G15 показаны в оранжевом и розовом, соответственно. EGFP является шсамостоятельно в зеленый и mCherry в красном цвете. Цветные стрелки указывают направление (смысловые праймеры в прямом направлении и антисмысловых праймеров в обратном направлении) и расположение праймеров ген-специфические (цвет грунтовки указывает источник последовательности праймера). Приведены в таблице 1 для деталей праймера. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Живая съемка Double-трансфецировали клетки ВСИ экспрессирующие рекомбинантный BtDrip1-EGFP, BtDrip2_v1-EGFP, DmSPR-mCherry и PLA2G15-mCherry белки. Trichoplusia Ni (ВСИ) клетки были дважды трансфицированы ПИБ / BtDrip1-EGFP и PIB / DmSPR-mCherry (AD), PIB / BtDrip1-EGFP и PIB / PLA2G15-mCherry (EH), PIB / BtDrip2_v1-EGFP и PIB / DmSPR -mCherry (<сильный> IL), или ПИБ / BtDrip2_v1-EGFP и ПИБ / PLA2G15-mCherry (MP). Изображения были получены с помощью лазерного сканирующего микроскопа с использованием конфокальной контрастное воды погружения в цель 60X фазы (NA 1.2) при 90X-амплификации. Панели Hoechst показывают репрезентативные изображения живой клетки окрашенных клеточных ядер (ех / ет = 359/461 нм). На EGFP панели показывают экспрессию флуоресценции клеток, трансфицированных EGFP химер (ех / ет = 489/510 нм). Панели mCherry показывают экспрессию флуоресценции клеток, трансфицированных mCherry химер (ех / ет = 580/610 нм). Панель слияния показывает наложение всех трех флуоресцентных каналов (т.е. Hoechst, EGFP и mCherry). Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гетерологичные системы экспрессии белка являются важными инструментами для получения рекомбинантных белков , используемых во многих последующих применениях 4. Выбор из различных систем экспрессии, доступных в зависимости от конечной цели для интересующего белка. Несколько систем экспрессии клеток насекомых доступны , которые предлагают гибкие альтернативы прокариотических и эукариотических клеток экспрессирующих систем 5, 6. Насекомые системы , требующие бакуловируса инфекции для управления экспрессией белка являются на сегодняшний день наиболее популярной и широко используемой системы насекомых, с множеством таких белков , используемых в исследованиях и терапевтических применений 1, 2, 3. Бакуловирус выражение, тем не менее, имеет ограничение, в том числе: 1) вирусный жизненный цикл включает лизис клетки-хозяина; 2) клетки-хозяева, которые, как правило, лизированные освободить высокую АМОунц деградационных ферментов; 3) образование стабильных клеточных линий, отнимает много времени и не может быть возможным для цитотоксических белков; 4) разрывное выражение требует частого технического обслуживания; 5) вектор генерация часто требует несколько стадий клонирования; 6) плотность клеток насекомых часто обратно пропорциональна вирусной инфекции; и 7) рекомбинантные белки, в основном продает на высоких уровнях на поверхность клетки или секретируются 3, 7, 9, 10. Nonlytic переходной экспрессии генов на основе клеток насекомых трансфекции плазмидной ДНК предлагает альтернативный метод для получения рекомбинантных белков, без некоторых из уникальных проблем , связанных с бакуловирусами 7, 8. В частности, выражение переходных клеток насекомых предлагает короткий поворот вокруг на конструкции вектора и синтезе белка, избегает CHALLENG ES, связанный с вирусной инфекцией и лизисом клеток, а также обеспечивает надежное средство для наблюдения клеточного оборота белков.
Здесь, два проверенные экспрессирующие конструкции были использованы для определения внутриклеточной локализации B. tabaci аквапориным белок BtDrip1 и BtDrip2_v1. DmSPR-mCherry является маркером для плазменной клеточной мембраны 16, и PLA2G15-mCherry локализуется в пределах клеточных лизосом 17. На рисунке 2 показано значение таких маркеров для оценки местоположения белков , представляющих интерес, в данном случае, со-локализация BtDrip1-EGFP с DmSPR-mCherry на клеточной поверхности и BtDrip2_v1-EGFP с PLA2G15-mCherry внутри лизосом. Поэтому, как показано здесь и в предыдущих исследованиях 14, 15, 16, 18, 19,осел = «Xref»> 20, эта методика может быть использована для быстрого выяснения торговли белком в клетках насекомых. Хотя экспрессия белка и оборот в пределах ВСИ клеток показан здесь (рисунок 2), важно отметить , что протокол может быть оптимизирован и применяется одинаково хорошо к другим насекомым клеточных линий (Sf9, Sf21, БМ-N, S2, и т.д.) ,
Как и все гетерологичных системы экспрессии белка, существует ограничение переходного производства белка в пределах культивируемых клеток насекомых. А именно, процент клеток, позитивных в отношении экспрессии плазмиды происхождения, как правило, ниже, чем достигается от бакуловирус или с использованием стабильных клеточных линий. Таким образом, количество рекомбинантного белка (ов), полученного может быть ниже, в переходном системе; Однако, использование различных промоторов и включение генетических усилителей могут преодолеть это потенциальное ограничение 7, 21, 22. Tего протокол демонстрирует котрансфекции клеток ВСИ с двумя векторами ПИБ, каждый укрывает отличается белок-кодирующих последовательностей (фигура 2). Хотя подобная эффективность трансфекции наблюдалась для всех четырех векторов экспрессии, используемых для трансфекции клеток ВСИТЕ (данные не показан), это не всегда возможно. Следовательно, эксперименты с такими переходными экспрессирующими векторами могут потребовать обширную эмпирическую оптимизации (например, изменения в количестве каждого вектора, время трансфекции, химия реагента трансфекции и т.д.) для достижения эквивалентной эффективности трансфекции и / или уровней экспрессии рекомбинантного белка. Кроме того, вполне возможно , что добавление флуоресцентного белка может повлиять или ограничить внутриклеточный оборот белковых мишеней 23, 24. Идентификация субклеточной совместной локализации двух белков по наблюдению флуоресценции с маркерными белками не necessarilу указывают на прямое взаимодействие белок-белок между белками , представляющим интерес 24, 25. Следовательно, необходима осторожность при интерпретации таких результатов совместной локализации.
Кратковременная экспрессия гена действительно предлагает несколько преимуществ по сравнению с имеющимися в настоящее время систем бакуловируса выражения. Кратковременная экспрессия требует меньше времени и труда для конструирования векторов и для синтеза рекомбинантных белков, кратковременная экспрессия не включает в себя лизис клеток, связанный с патогенным жизненным циклом бакуловируса, и переходное выражение может обеспечить лучшую систему исследования для субклеточных торговель белки 3, 7, 9. Этот протокол подчеркивает простоту и скорость строительных конструкций путем непосредственного введения представляющего интерес гена в вектор экспрессии с использованием PIB расширения перекрытия ПЦР (Рисунок 1 26 белков. Кроме того, хотя EGFP 27 и 28 mCherry были включены здесь в карбоксильных концах двух аквапориных белков B. tabaci, ЫЙ-ПЦР может быть также использован , чтобы поместить много других варианты флуоресцентных маркерных белков 26 на аминых - концах этих белков. Следует отметить, что, в дополнение к многочисленным плазмид экспрессии, построенных с использованием OE-PCR, многие традиционные экспрессии клонирования кассеты были подготовлены и могут быть использованы для получения практически любой белок, представляющий интерес в рамке считывания с флуоресцирующих белков EGFP, Венеры и mCherry, плавленый либо на амино- или концевых. Такие кассеты экспрессии могут быть предоставлены по запросу.
Эра «геномика» обеспечила беспрецедентный объем и доступ к значимому гата. Тем не менее, этот разрыв продолжает увеличиваться между открытием гена и назначением функции к генным продуктам; Таким образом, дополнительные эмпирические инструменты крайне необходимы для ускорения функциональной геномики. Принимая во внимание, ген-редактирование и другие в системах манипуляции генов виво могут в конечном счете , обеспечивают наиболее существенные подходы для назначения функции гена, гетерологичные системы экспрессии белка, вероятно , останутся важными для biomanufacture ценных белков и для расшифровки структуры и функции белков. Этот протокол описан способ усиленной конструкции плазмид экспрессии и временной экспрессии рекомбинантных белков в клетках насекомых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Линн Forlow-Jech и Данниол Лерой для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана базой ЦИРИ финансирования для USDA ARS, Национальная программа 304 - Средства защиты растений и карантина [Проект № 2020-22620-022-00D] к JAF и JJH Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов в этой статье является исключительно для целей предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендацию или одобрение со стороны Министерства сельского хозяйства США. Министерство сельского хозяйства США равные возможности и работодателем.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
References
- Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).
- Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).
- Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
- Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).
- Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. , Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).
- Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
- Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).
- Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
- Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).
- Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).
- Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).
- Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific. Available from: http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0 (2014).
- Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).
- Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
- Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).
- Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).
- Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).
- Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).
- Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
- Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
- Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).
