Summary
Icke-lytisk insektscellexpressionssystem är underutnyttjade för tillverkning, cellulär trafficking / lokalisering, och rekombinant protein funktionell analys. Här beskriver vi metoder för att generera expressionsvektorer och efterföljande övergående proteinuttryck i kommersiellt tillgängliga ordningen fjärilar cellinjer. Co-lokalisering av Bemisia tabaci aquaporiner med subcellulära fluorescerande markörproteiner presenteras också.
Abstract
Heterologa proteinexpressionssystem används för produktion av rekombinanta proteiner, tolkningen av cellulära trafficking / lokalisering, och bestämningen av den biokemiska funktionen hos proteiner på sub-organismnivå. Även baculovirus expressionssystem används alltmer för proteinproduktion i många biotekniska, läkemedels- och industriella tillämpningar, icke-lytisk system som inte involverar virusinfektion har klara fördelar, men är ofta förbisedd och underutnyttjade. Här beskriver vi en metod för att generera icke-lytisk expressionsvektorer och transient uttryck av rekombinant protein. Detta protokoll möjliggör effektiv cellulära lokaliseringen av rekombinanta proteiner och kan användas för att snabbt urskilja protein trafficking inom cellen. Vi visar uttrycket av fyra rekombinanta proteiner i en kommersiellt tillgänglig insektscellinje, däribland två aquaporin proteiner från insekten Bemisia tabaci, samtsom subcellulära markörproteiner som är specifika för cellplasmamembranet och för intracellulära lysosomer. Alla rekombinanta proteiner producerades som chimärer med fluorescerande proteinmarkörer vid deras karboxyl-termini, vilket möjliggör direkt detektion av de rekombinanta proteinerna. Den dubbla transfektion av celler med plasmider som härbärgerar konstruktioner för generna av intresse och en känd subcellulär markör möjliggör levande cell imaging och förbättrad validering av cellulär proteinlokalisering.
Introduction
Produktionen av rekombinanta proteiner med hjälp av insektscellexpressionssystem erbjuder många fördelar för studier av eukaryota proteiner. Nämligen, insektsceller har liknande posttranslationella modifieringar, bearbetning, och sorteringsmekanismer som de som förekommer i däggdjursceller, vilket är fördelaktigt för framställning av korrekt veckade proteiner 1, 2, 3. Insektcellsystem kan ofta också kräver mindre resurser och mindre tid och ansträngning för underhåll än däggdjurscellinjer 4, 5. Baculovirusexpressionssystemet är ett sådant insektscellbaserat system som nu används i stor utsträckning i många discipliner, inklusive produktion av rekombinanta proteiner för proteinkarakterisering och terapeutika, den immunogena presentation av främmande peptider och virala proteiner för vaccinproduktion, syntesen av multi Protein komplex, Produktion av glykosylerade proteiner, osv. 1, 2, 4, 6. Det finns dock situationer där baculovirus-expressions kanske inte är tillämplig 3, 7, och användningen av icke-lytisk och transienta insektsexpressionssystem kan vara mer lämpligt. Specifikt, erbjuder transient insektscelluttryck möjligheten för snabb syntes av rekombinant protein, kräver mindre utveckling och underhåll, inte involverar virala pålagda cellys, och tillhandahåller ett medel för att bättre studera cellulärt trafficking under proteinsyntes 7, 8, 9, 10.
Detta protokoll beskriver den snabba alstringen av expressionsvektorer med användning av två steg överlappande extensions-PCR (OE-PCR) Escherichia coli. Plasmider används för att dubbel transfektera kommersiellt tillgängliga odlade insektsceller och för att framställa representativa proteiner. Protokollet beskriver produktionen och användningen av två olika fluorescensmärkta subcellulära markörproteiner och visar samlokalisering med två aquaporin proteiner från insekten Bemisia tabaci. Följande protokoll tillhandahåller den grundläggande metodiken för OE-PCR, insektscellunderhåll och transfektion och fluorescensmikroskopi för den cellulära lokaliseringen av målproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. OE-PCR för konstruktion av expressionsplasmider
Obs: Se tabell 1 för alla primers som används i OE-PCR. Användningen av en high-fidelity DNA-polymeras rekommenderas för alla förstärkningar. Men eftersom dessa enzymer ofta inte lämnar en 3' A, är det nödvändigt att utföra en kort, icke-amplifiera inkubation med ett Taq-DNA-polymeras för att 'A-svans' av PCR-produkter före kloning in dem i en TA insektscelluttryck vektor. Detta protokoll visar en metod för att generera insekts expressionsplasmider härbärge chimära proteiner, med de fluorescerande proteinerna fuserade i ram till karboxylterminalen av generna av intresse (i detta fall, till två Bemisia tabaci aquaporin proteiner) eller till subcellulära markörproteiner (Figur 1).
- Använda OE-PCR, som består av två oberoende omgångar av amplifiering, för att generera: (1) sekvenser som kodar för gener av intresse (B. tabaciaquaporin 1: BtDrip1; B. tabaci aquaporin 2: BtDrip2_v1) fuserad i ram med en grön fluorescerande protein variant kallad EGFP eller (2) de subcellulära markörer (Drosophila melanogaster kön peptidreceptor: DmSPR; Homo sapiens fosfolipas A2: HsPLA2) med mCherry kodande sekvensen. Direkt ligera de slutliga OE-PCR-produkter in i PIB / V5-His-TA-plasmiden.
- För den första omgången av OE-PCR (anges med AD och A'-D' i figur 1), använd en genspecifik sensprimer (visas i fetstil i Tabell 1) och en chimär antisensprimer (kursiverad i tabell 1) motsvarande till den slutliga 15 bp (utan stoppkodonet) hos genen av intresse / subcellulär markör och till 15 bp av 5'-änden av den önskade fluorescerande protein (EGFP eller mCherry) för att generera en produkt med en 3' överhäng.
Obs: Se tabell 2 för PCR förhållanden. - I ett separat rör, använda en gen-specific fluorescerande protein antisensprimer (visas med en understrykning i tabell 1) och en chimär senseprimer som innehåller 15 bp från 3'-änden av genen av intresse / subcellulär markör och 15 bp från 5'-änden av den önskade fluorescerande protein för att generera en produkt med en 5' överhäng.
Obs: Se tabell 2 för PCR-förhållanden. PCR-mall kan antingen vara en sekvens-validerade PCR-produkt eller, mer föredraget, plasmid-DNA som hyser den önskade sekvensen. Studien som beskrivs här använder sekvens validerade plasmider. - Separera PCR-produkter med en% agarosgelelektrofores (med användning av standardmolekyl-grade agaros).
- Punkt och rena produkterna av de förväntade storlekarna (se tabell 2) med användning av en kommersiellt tillgänglig DNA-gelextraktionskit (se tabellen av material för den specifika satsen används i detta protokoll).
- Använda gel-renade PCR-produkter från steg 1.1.4 att generera den slutliga överlappnings eXTension produkter (angivet med A '' - D '' i fig 1). Använda en genspecifik sensprimer för genen av intresse / subcellulär markör och motsvarande gen-specifik antisense primer för det fluorescerande proteinet för att generera den önskade chimära sekvensen.
Obs: Se tabell 2 för PCR-förhållanden. Det kan vara nödvändigt att empiriskt bestämma de optimala mängderna av första omgången överlappningsextensionsprodukter för att lägga till reaktionsblandningen för att ge den slutliga, fullängds-chimär PCR-produkt. - Separera de andrahands OE-PCR-produkter från en% agarosgelelektrofores. Punkt och rena de produkter med användning av en kommersiellt tillgänglig DNA-gelextraheringskit.
- Inkubera gelrenade andrahands OE-PCR-produkter med en enhet av Taq DNA-polymeras Master Mix för 10 min vid 72 ° C för att alstra de 3' adenylerade (dvs A-tailed) produkter som behövs för TA-kloning.
- Ligera de resulterande adenylerade produkterin i PIB-expressionsvektor och använda vanliga molekylärkloningstekniker för att transformera kemiskt kompetenta (värmechock) eller elektro (elektroporering) Escherichia coli-celler. Platta över natten på medium innehållande den lämpliga selektionsmarkör (dvs ampicillin eller karbenicillin).
- Utföra koloni-PCR 12 med användning av en vektor-specifik primer och en insats-specifik primer för att identifiera insert-positiva kolonier som har transformerats med expressionsplasmider som härbärgerar en insats i 5'-3'-orientering. Förbered övernattskulturer kolonier genererar PCR-produkter med de förväntade storlekarna.
- Isolera plasmid-DNA med användning av en kommersiellt tillgänglig DNA-reningskit enligt tillverkarens instruktioner (se Material Tabell för den specifika satsen används i detta protokoll). Validera sekvensen integritet varje insats genom direkt DNA-sekvensering.
- För den första omgången av OE-PCR (anges med AD och A'-D' i figur 1), använd en genspecifik sensprimer (visas i fetstil i Tabell 1) och en chimär antisensprimer (kursiverad i tabell 1) motsvarande till den slutliga 15 bp (utan stoppkodonet) hos genen av intresse / subcellulär markör och till 15 bp av 5'-änden av den önskade fluorescerande protein (EGFP eller mCherry) för att generera en produkt med en 3' överhäng.
Notera: För att upprätthålla sterila betingelser, genomföra alla cell manipulationer som kräver öppnandet av vävnadskulturkolv inom en huv med laminärt flöde. Slå på huv med laminärt flöde UV bakteriedödande lampa minst 1 h före cell manipulationer. Bära nitrilhandskar och dekontaminera ytan på bänken, pipetter, redskap, rör och kolvar med 70% etanol före deras användning. Kännedom om grundläggande cellodlingsteknik rekommenderas 13.
- Använda TNI-celler (en etablerad cellkultur linje härledd från Trichoplusia ni äggstocksvävnad) som är anpassade till serumfritt medium och upprätthålla dem som en vidhäftande monoskiktkultur i serumfritt insektsmedium vid 28 ° C i T25-vävnadsodlingskolvar.
- Upprätthålla Sf9-celler (en etablerad cellkulturlinje härledd från Spodoptera frugiperda äggstocksvävnad) på liknande sätt men med användning av TNM-FH-insektskulturmedium kompletteraed med 10% fetalt bovint serum (FBS).
- Ympa den initiala kulturen från frysta Sf9 eller TNI celler genom att avlägsna lagerflaskor från -80 ° C och låta dem tina i ett 37 ° C vattenbad. Sanera flaskorna med 70% etanol efter upptining och placera dem på is.
- Lägg 4 ml insektscellmedium till en ny T25-kolv och överföring 1 ml av den tinade insektscellsuspension. Placera kolven i ett 28 ° C, icke-fuktad inkubator och låta cellerna fästa under 30-45 min.
- Ersätta sådd medium med 5 ml av det lämpliga mediet och överföra kolvarna till en 28 ° C icke-fuktad inkubator. Övervaka cell sammanflödet dagligen. Passage cellerna när de når 90% konfluens.
Notera: Fullständig bevakning av T25-kolv motsvarar ~ 5 x 10 6 celler. - Insektscellpassage.
- Till passagen cellerna först bort det förbrukade mediet från kolven innehållande konfluenta celler med användning av en steril 5 ml serologisk pipett.Luta kolven så att mediet strömmar till ett hörn, bort från cellmonoskiktet. Försiktigt bort mediet med användning av en pipett utan att störa cellerna.
- Rubba de TNI cellerna genom att försiktigt skölja T25-kolvar innehållande konfluenta monolagret med 4 ml av serumfritt insektsmedium med användning av ny, steril, 5 ml serologisk pipett. Flytta pipettspetsen tvärsöver kolven och långsamt bevattna att avlägsna celler löst fästa till kolven botten.
- Kontrollera om adekvat avlossning av celler genom att ta bort all media, vrida kolven över och observera att botten av flaskan är klar.
- För Sf9-celler, vilka vidhäftar mer tätt, tillsätt 4 ml färsk TNM-FH-medium och använda en cellskrapa för att driva bort de vidhäftade cellerna. Använd en 5 ml serologisk pipett att blanda försiktigt och minska cellklumpning.
- Använda en automatiserad cellräknare för att uppskatta antalet viabla insektsceller per volym medium. Överföra 0,1 ml av cell / mediumblandningen till en 1,5-mlmikrofugrör. I ett separat 0,5 ml mikrofugrör, tillsätt 10 | il av cell / mediumblandningen till 10 mikroliter av trypanblått.
- Ta bort en cellräknare kammarobjektglas ur förpackningen och lägga 10 mikroliter av cell / medium / trypanblått blandningen till varje sida av räkningsliden. Infoga sliden in i cellräknaren och bestämma celldensiteten och viabilitet.
- Med användning av celldensiteten, beräkna och lägga till den korrekta volymen av insektscellmedium (upp till 5 ml) för att nya, sterila T25-kolvar.
- Överföra ungefär 1-1,5 x 10 6 celler till T25-kolvar med färskt medium; märka kolvarna med cellinjen, datum, medium som används, antalet celler sattes och passagenummer (P n + 1 generationen, där P n är passagen numret för den tidigare generationen av celler); och placera kolvarna i en 28 ° C inkubator under upp till 72 h.
Notera: Insektsceller kan kontinuerligt fortplantas, även om celler kan vara mindre mottagliga för transfektion och / eller heterologproteinexpression efter 30 passager. Behandla Helt kasserad celler / media med 10% blekmedelslösning och autoklavera engångsplastartiklar före bortskaffande.
3. Insect Cell Transfektion
- Ympa en T25-kolv med upp till 1 x 10 6 TNI eller Sf9-celler i ett lämpligt insektscellmedium (serumfritt insektsmedium för TNI och TNM-FH för Sf9) och växa till sammanflytning under 72 timmar vid 28 ° C.
- Ta bort och kasta det gamla mediet och lösgöra cellerna med 4 ml färskt serumfritt insektsmedium (se steg 2.6.2 och 2.6.3, ovan).
- Uppskatta celldensitet med användning av en automatiserad cellräknare (se steg 2.6.4, ovan).
- Lägga till cirka 7 x 10 5 celler till enskilda 35 mm glasbottnade skålar och låta cellerna fästa under 20-25 min vid 28 ° C.
- För varje transfektion, tillsätt 2 ^ g av plasmid-DNA (antingen från en plasmid för enkel transfektioner eller 2 ^ g från vardera av de två plasmiderna för görls ö transfektioner) och 0,1 ml av serumfritt insektsmedium (utan FBS för både Sf9 och TNI transfektioner) i ett sterilt 1,5 ml mikrofugrör.
- I ett separat rör, blanda 8 mikroliter av transfektionsreagens med 0,1 ml serumfritt insektsmedium och sedan överföra denna lösning till röret innehållande plasmid-DNA av intresse. Lätt virvel och inkubera vid RT under 20 - 30 min.
- Späda plasmiden-transfektion blandningen från steg 3.5 och 3,6 med 0,8 ml serumfritt insektsmedium så att den totala volymen är lika med 1 ml.
- Försiktigt bort media från glasskålar innehållande vidhäftade celler. Överlagra de bifogade cellerna med den utspädda plasmiden-transfektion medium.
- Inkubera cellerna vid 28 ° C under 5 h.
Notera: Betingelserna för transfektion kräver empirisk optimering för maximal transfektionseffektivitet (t ex över natten transfektion snarare än 5 h, mängden plasmid-DNA som användes, kemin hos transfektionsreagensbegagnade, osv.). - Ta bort och kasta transfektionsmediet och försiktigt tvätta cellerna med 1 ml av serumfritt insektsmedium, försiktigt så att inte rubba cellerna.
- Lägg 2 ml färskt insektscellmedium (serumfritt insektsmedium för TNI och TNM-FH för Sf9) och inkubera vid 28 ° C under 48-72 h.
Obs: Återigen, förhållanden kräver empirisk optimering för maximal heterologt proteinuttryck.
4. Confocal fluorescensmikroskopi
- Vid 48-72 h efter transfektion, tvätta cellerna en gång med 1 ml IPL-41 insektsmedium och sedan täcka med 2 ml IPL-41 för avbildning.
Notera: Detta tvättningssteg minskar bakgrunds auto-fluorescens observeras med insekt-cellmedium som används i normal cellunderhåll. - Lägg 4 droppar Hoechst levande-cellfärgning reagens (se tabellen av material för specifik nukleär färgning som används i detta protokoll) till mediet och inkubera vid 28 ° C under 20-25 min.
Obs: Ytterligare nuclear fläckar kan vara substituerad, fastän färgämnet bör ha en fluorescensprofil unik från EGFP och mCherry. - Placera en 35 mm skål i den självinneslutna laserskanning konfokalmikroskop (se tabellen av material för det specifika instrument som används i detta protokoll).
- Justera mikroskopet för Hoechst, EGFP, och mCherry observationsförhållanden: Hoechst excitation / emission - 359/461 nm; EGFP excitation / emission - 489/510 nm; mCherry excitation / emission - 580/610 nm.
- Utför en initial avsökning med användning av ett 10x objektiv för att bekräfta fluorescerande uttryck och sedan växla till avsökningsmod med användning av ett 60X faskontrast vattenimmersionsobjektiv.
- Justera lasereffekten (5-7%), detektorkänslighet (47-49%), avsökningshastighet, Z-axeldjup, och digital zoom för att optimera bildkontrast och upplösning. Bild cellerna vid 1,5X digital zoom för att ge totalt 90X förstärkning.
Obs: Mikroskop parametrar kräver empirisk justering för optimalbildsamling och kan vara specifika för instrumentet i bruk. - Exportera rådata som TIFF bildfiler och ändra (grödor och overlay) för siffra generation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OE-PCR
OE-PCR medger syntes av chimära DNA-produkter som, när insatt i en expressionsvektor, möjliggör produktion av rekombinanta chimära proteiner som motsvarar något test genen av intresse och fluorescerande markörprotein. Figur 1 representerar ett allmänt schema för framställning av PIB expressionsvektorer innehållande B. tabaci aquaporin kodande sekvenser (BtDrip1 och BtDrip2_v1) i-ram med den fluorescerande proteinmarkör EGFP. I detta scenario ades två BtDrip chimära proteiner innehållande EGFP vid sina karboxylgrupper termini produceras. Detta protokoll visade också metoder för utveckling av två insekts subcellulära markörproteiner, DmSPR och PLA2G15 (Figur 1), framställda såsom chimärer med mCherry vid deras karboxylterminalerna. EGFP och mCherry valdes eftersom deras emissionsspektra är tillräckligt divergenta, vilket möjliggör than oberoende detektering och samlokalisering av signaler från testproteiner (t ex., BtDrip-EGFP) och DmSPR- och PLA2G15-mCherry-märkta markörproteiner. Alla PCR-reaktioner producerade band av den förväntade storlekar och framgångsrikt klonades in i PIB. Alla plasmider bekräftades genom DNA-sekvensering för att innehålla de lämpliga insatserna i korrekt orientering och i ram med fluorescerande proteinmarkörer.
Transient uttryck av rekombinant protein i insektscellodling
Efter konstruktionen av expressionsvektorer som motsvarar PIB / BtDrip1-EGFP, PIB / BtDrip2_v1-EGFP, PIB / DmSPR-mCherry, och PIB / PLA2G15-mCherry transfekterades celler och uttrycket av rekombinanta proteiner i levande celler visualiserades med användning av konfokal fluorescens mikroskopi (Figur 2). Framgångsrik transfektion och uttryck av rekombinant BtDrip1-EGFP är uppenbart by närvaron av grön fluorescens på ytan av TNI-celler (Figur 2B, 2F). Grön fluorescens observeras inom TNI celler transfekterade med BtDrip2_v1-EGFP (Figur 2J, 2N), vilket indikerar den intracellulära expressionen av BtDrip2_v1. Likaledes, TNI celler transfekterade med PIB / DmSPR-mCherry (Figur 2C, 2K) eller PIB / PLA2G15-mCherry (figur 2G, 2O) visar röd fluorescens, vilket indikerar uttryck av de respektive chimärer.
Samlokalisering av rekombinanta BtDrip proteiner och subcellulära markörer
Den dubbla transfektion av TNI celler möjliggör samtidigt uttryck av två fluorescensmärkta proteiner. Överlagrade bilder av transfekterade TNI celler som är orange / gul indikerar att celler hyser plasmider som producerar både EGFP och mCherry och antyder att proteinerna samar lokaliserade inom samma subcellular strukturer (figur 2D, 2H, 2L & 2P). Detta bekräftar tidigare resultat som BtDrip1 och DmSPR uttrycks på cellytan 14, 15, 16. En överlagring av TNI celler dubbel transfekterade med PIB / BtDrip1-EGFP och PIB / DmSPR-mCherry visar överlappning av de gröna och röda fluorescenssignaler (Figur 2D), vilket tyder på samlokalisering av BtDrip1-EGFP och DmSPR-mCherry på cellytan . Tidigare, Maroniche et al. 17 visade att PLA2G15 är en markör för intercellulära lysosomer när de uttrycks i Sf9-celler som en chimär med mCherry. Även om det förutspåddes att den rekombinanta BtDrip2_v1-EGFP-proteinet skulle translokera till cellytan, visade det tidigare visats att det chimära proteinet primärt lokaliserat intracellulärt inom transfekterade TNI-celler 15. Till stöd för detta, det var lite EvidENCE för samlokalisering av gröna och röda fluorescerande signaler när BtDrip2_v1-EGFP samuttrycktes med PIB / DmSPR-mCherry (fig 2L). I kontrast, samuttrycket av PIB / BtDrip2_v1-EGFP och PIB / PLA2G15-mCherry resulterade i en betydande överlappning i de cytoplasmatiska gröna och röda fluorescerande signaler (Figur 2P), vilket starkt antyder att BtDrip2_v1 är sannolikt trafikerad till intracellulära lysosomer.
Figur 1: Schematisk för att bygga uttryckskonstruktioner med användning av överlappande extensions-PCR (OE-PCR). OE-PCR används för att bygga PIB expressionsvektorer innehållande Bemisia tabaci aquaporin-1 / EGFP (BtDrip1-EGFP), B. tabaci aquaporin-2_variant 1 / EGFP (BtDrip2_v1-EGFP), Drosophila melanogaster kön peptidreceptor / mCherry (DmSPR- mCherry) och Homo sapiens fosfolipas-A2 / mCherry(HsPLA2G15-mCherry) produkter. Den första omgången av OE-PCR genererar fragment motsvarande de hellånga cDNA av intresse, BtDrip1 (A), BtDrip2_v1 (B), DmSPR (C), och HsPLA2G15 (D), innehållande en liten 3' överlappande region som motsvarar den 5'-änden av antingen EGFP eller mCherry fluorescerande markörproteiner. Samtidigt, hellånga cDNA från EGFP och mCherry är PCR-amplifierade och innehåller en liten 5' överlappande region som motsvarar 3'-ändarna av BtDrip1 (A '), BtDrip2_v1 (B'), DmSPR (C'), eller HsPLA2G15 ( D'). Notera att alla primrar som användes för att amplifiera cDNA: n av intresse (dvs. BtDrip1, BtDrip2_v1, DmSPR och HsPLA2G15) i den första omgången av OE-PCR saknar stoppkodon som normalt finns vid 3'-änden av varje kodande sekvens. Alla första omgången OE-PCR-produkter förstärks, separerades genom agarosgel utvaldarophoresis, och gelrenades. Den andra omgången av OE-PCR använder sammanslagna par av de gelrenade PCR-produkterna från den första omgången av OE-PCR som templat för amplifiering av fullängds chimära produkter. För varje reaktion, motsvarar sense-primern till 5'-änden av cDNA: t av intresse kodande sekvenserna och antisense-primern är komplementär till 3'-änden av EGFP eller mCherry, med dess stoppkodon intakt (A '', B' ', C' och D ''). De fyra andrahands OE-PCR-produkter är gelrenades, adenylerad med Taq-polymeras, och ligerades in i PIB / V5-His-expressionsvektor. Plasmider propageras i E. coli och renade plasmid-DNA används för att transfektera insektsceller. B. tabaci aquaporiner BtDrip1 och BtDrip2_v1 visas i mörkblått och cyan, respektive, och de subcellulära markörer DmSPR och PLA2G15 visas i orange och rosa, respektive. EGFP är shegen i grönt och mCherry är i rött. Färgade pilarna anger riktningen (senseprimers i riktning framåt och antisense-primrar i den motsatta riktningen) och placering av genspecifika primrar (färgen på en primer indikerar källan för primersekvensen). Se tabell 1 för primer detaljer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Live avbildning av Double-transfekterade TNI celler som uttrycker rekombinant BtDrip1-EGFP, BtDrip2_v1-EGFP, DmSPR-mCherry och PLA2G15-mCherry proteiner. Trichoplusia ni (TNI) -celler dubbel transfekterades med PIB / BtDrip1-EGFP och PIB / DmSPR-mCherry (AD), PIB / BtDrip1-EGFP och PIB / PLA2G15-mCherry (EH), PIB / BtDrip2_v1-EGFP och PIB / DmSPR -mCherry (<strong> IL), eller PIB / BtDrip2_v1-EGFP och PIB / PLA2G15-mCherry (MP). Bilder fångades med en laserskanning konfokalmikroskop med användning av ett 60X faskontrast vatten-immersionsobjektiv (NA 1,2) vid 90X amplifiering. De Hoechst fälten visar representativa levande cellbilder av färgade cellkärnor (ex / em = 359/461 nm). EGFP panelerna visar fluorescens expression av celler transfekterade med EGFP chimärer (ex / em = 489/510 nm). De mCherry panelerna visar fluorescens expression av celler transfekterade med mCherry chimärer (ex / em = 580/610 nm). Sammanfogningen panelen visar överlagringen av alla tre fluorescerande kanaler (dvs Hoechst, EGFP, och mCherry). Scale bar = 10 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heterologa proteinexpressionssystem är viktiga verktyg för produktion av rekombinanta proteiner som används i talrika nedströms tillämpningar 4. Att välja från de olika uttryckssystem tillgängliga beror på slutmålet för proteinet av intresse. Flera insektscellexpressionssystem finns tillgängliga som erbjuder flexibla alternativ till prokaryota och eukaryota celler expressionssystem 5, 6. Insekts system som kräver bakulovirusinfektion att driva proteinuttryck är den överlägset mest populära och mest använda insektssystem, med många sådana proteiner som används i forskning och terapeutiska tillämpningar 1, 2, 3. Baculovirus expressions har dock har begränsningar, inklusive att: 1) den virala livscykeln innefattar lys av värdcellen; 2) De värdceller som lyseras frisätter typiskt hög amoUNTS av nedbrytande enzymer; 3) genereringen av stabila cellinjer är tidskrävande och kan inte vara möjligt för cytotoxiska proteiner; 4) diskontinuerlig uttryck kräver frekvent underhåll; 5) vektor generering kräver ofta multipla kloningssteg; 6) insekts celltätheter är ofta omvänt proportionell mot viral infektion; och 7) rekombinanta proteiner är i första hand trafikerade vid höga nivåer till cellytan eller utsöndras 3, 7, 9, 10. Icke-lytisk transient genexpression baserat på insektscell transfektion med plasmid-DNA erbjuder en alternativ teknik för produktion av rekombinanta proteiner, utan några av de unika utmaningar som är förknippade med baculovirus 7, 8. Nämligen, erbjuder transient insektscelluttryck kortare vändning på vektorkonstruktion och proteinsyntes, undviker challeng es associerade med viral infektion och cellys, och tillhandahåller en robust organ för att observera den cellulära handel med proteiner.
Här gjordes två validerade expressionskonstruktioner används för att bestämma den subcellulära lokaliseringen av B. tabaci aquaporin proteiner BtDrip1 och BtDrip2_v1. DmSPR-mCherry är en markör för plasmacellmembranet 16, och PLA2G15-mCherry lokaliseras inom cellulära lysosomer 17. Figur 2 visar värdet av sådana markörer för att bedöma platserna för proteiner av intresse, i det här fallet, samlokalisering av BtDrip1-EGFP med DmSPR-mCherry vid cellytan och BtDrip2_v1-EGFP med PLA2G15-mCherry inom lysosomer. Därför, såsom visas här och i tidigare undersökningar 14, 15, 16, 18, 19,ass = "xref"> 20, kan denna metod användas för att snabbt fastställa protein trafficking inom insektsceller. Även om proteinexpression och trafficking inom TNI celler visas här (fig 2), är det viktigt att notera att protokollet kan optimeras och tillämpas lika bra till andra insektscellinjer (Sf9, Sf21, BM-N, S2, etc.) .
Liksom alla heterologa proteinexpressionssystem, det finns begränsningar för övergående proteinproduktion inom odlade insektsceller. Nämligen, är den procentuella andelen celler som var positiva för plasmid-härledda expressionen typiskt lägre än den som uppnås från bakulovirus eller från att använda stabila cellinjer. Sålunda, mängden av rekombinant protein (er) som produceras kan vara lägre i ett transient system, emellertid kan användningen av olika promotorer och inkorporeringen av genetiska förstärkare vinna denna potentiella begränsning 7, 21, 22. Thans protokoll demonstrerar samtransfektion av TNI celler med två PIB vektorer, var och en hysande annat protein-kodande sekvenser (figur 2). Även om liknande transfektionseffektiviteter observerades för alla fyra expressionsvektorer som används för att transfektera TNI celler (data ej visade), är detta inte alltid möjligt. Följaktligen kan experiment med sådana transienta expressionsvektorer kräva omfattande empirisk optimering (t ex variation i mängden av varje vektor, transfektion tid, transfektionsreagens kemi, etc.) för att uppnå likvärdiga transfektionseffektiviteter och / eller nivåer av rekombinant proteinexpression. Vidare är det möjligt att tillsatsen av ett fluorescerande protein kan påverka eller begränsa subcellulär trafficking av protein riktar 23, 24. Identifieringen av den subcellulära samlokalisering av två proteiner genom observation av fluorescens med markörproteiner inte necessarily indikerar direkta protein-protein interaktioner mellan proteiner av intresse 24, 25. Därför krävs försiktighet vid tolkningen av sådana samlokalisering resultat.
Transient genuttryck inte erbjuder flera fördelar jämfört med för närvarande tillgängliga baculovirus expressionssystem. Transient uttryck kräver mindre tid och arbete för att bygga vektorer och för syntes av rekombinanta proteiner, inte övergående uttryck inte innebär cellysering i samband med patogena livscykel baculovirus, och övergående uttryck kan ge en bättre studiesystem för subcellulära handel med proteiner 3, 7, 9. Detta protokoll belyser den lätthet och snabbhet av bygg konstruktioner genom direkt inkorporering av en gen av intresse in i PIB-expressionsvektor med användning av överlappande extensions-PCR (Figur 1 26. Vidare, även EGFP 27 och mCherry 28 inkorporerades här på karboxylterminalerna av två B. tabaci aquaporin proteiner, kunde OE-PCR också användas för att placera många andra variant fluorescerande markörproteiner 26 vid aminoterminalen av dessa proteiner. Det kan noteras att, förutom talrika expressionsplasmider byggda med OE-PCR, många traditionella expressionskloningskassetter ställas och kan användas för att framställa praktiskt taget vilket som helst protein av intresse i ram med de fluorescerande proteinerna EGFP, Venus, och mCherry, smält vid antingen amino- eller terminala ändarna. Sådana uttryckskassetter är tillgängliga på begäran.
En tid präglad av "genomics" har gett en oöverträffad volym av och tillgång till meningsfull data. Fortsätter emellertid gapet att vidgas mellan genupptäckt och tilldelningen av funktion till genprodukter; Således är ytterligare empiriska verktyg desperat behövs för att accelerera funktionsgenomik. Medan, gen-redigering och andra in vivo genmanipulation system kan slutligen ge kvintessensen tillvägagångssätt för tilldelning av genfunktion, kommer heterologa proteinexpressionssystem sannolikt förblir viktigt för biomanufacture av värdefulla proteiner och för att dechiffrera proteinstruktur och funktion. Detta protokoll beskriver en metod för den förbättrade konstruktionen av expressionsplasmider och transient uttryck av rekombinanta proteiner i insektsceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Lynn Forlow-Jech och Dannialle LeRoy för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av bas CRIS finansiering USDA ARS, nationella programmet 304 - Crop Protection och karantän [Project # 2020-22620-022-00D] till JAF och JJH Omnämnandet av firmanamn eller kommersiella produkter i denna artikel är endast i syfte att ge specifik information och innebär inte någon rekommendation från US Department of Agriculture. USDA är en lika möjligheter leverantör och arbetsgivare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
References
- Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).
- Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).
- Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
- Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).
- Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. , Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).
- Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
- Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).
- Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
- Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).
- Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).
- Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).
- Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific. Available from: http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0 (2014).
- Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).
- Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
- Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).
- Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).
- Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).
- Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).
- Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
- Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
- Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).
