Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

doi: 10.3791/55756 Published: April 20, 2017

Summary

Nonlytic böcek hücresi ifade sistemleri üretim, selüler trafik / lokalizasyonu ve rekombinant protein, fonksiyonel analiz için atıl edilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen bir lepidopteran hücresi çizgilerinde ifade vektörleri ve daha sonra geçici protein sentezlenmesinin üretilmesi için yöntemleri tarif eder. Hücre içi fluoresan işaretleyici proteinleri ile Bemisia tabaci aquaporins eş yerleşimi de sunulmuştur.

Abstract

Heterolog protein ekspresyon sistemler, rekombinant proteinlerin üretimi için kullanılan, selüler trafik / lokalizasyonu yorumlanması ve alt organizma seviyesinde protein biyokimyasal fonksiyonunun belirlenmesi. bakulovirüs ifade sistemleri giderek sayısız biyoteknolojik, ilaç ve endüstriyel uygulamalar, var açık yararlar viral enfeksiyon içermeyen ama çoğu zaman göz ardı ve kullanılamayan ama nonlytic sistemlerde protein üretimi için kullanılmasına rağmen. Burada, nonlytic ekspresyon vektörleri ve geçici rekombinant protein ekspresyonunu oluşturmak için bir yöntem tarif eder. Bu protokol, rekombinant proteinlerin etkin hücresel lokalizasyonu için izin verir ve hızlı bir şekilde hücre içinde protein trafiğini ayırt etmek için kullanılabilir. Biz de, böcek Bemisia tabaci iki aquaporin proteinler de dahil olmak üzere, ticari olarak mevcut böcek hücresi hattı dört rekombinant proteinlerin ekspresyonu gösterirHücre plazma zarının spesifik hücre içi markör proteinler olarak ve hücre içi lizozomlar için. Yeniden birleştirici tüm proteinler rekombinant proteinlerin doğrudan teşhis edilmesine izin verir, karboksil terminallerinde, floresan protein işaretleri ile kimeraları üretildi. plazmidler ilgi ve bilinen bir alt hücresel markör genler için konstruktlarını barındıran hücrelerin çift transfeksiyon canlı hücre görüntüleme ve hücresel protein lokalizasyonu geliştirilmiş doğrulama sağlar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

böcek hücresi ifade sistemleri kullanılarak, rekombinant proteinlerin üretimi ökaryotik proteinlerin çalışma için sayısız avantajlar sunmaktadır. Yani, böcek hücreleri de benzer post-translasyonel modifikasyonları, işleme ve uygun biçimde katlanmış proteinler, 1, 2, 3 üretilmesi için avantajlı olan memeli hücrelerinde mevcut olanlar gibi ayırma mekanizmalara sahiptirler. Böcek hücre sistemleri, aynı zamanda, tipik olarak memeli hücre çizgileri 4, 5 den bakım için daha az kaynak ve daha az zaman ve çaba gerektirir. bakulovirüs ekspresyon sistemi, protein karakterizasyonu ve terapötik, yabancı peptidler ve aşı üretimi için viral proteinlerin imünojenik sunumu, çok sentezi için rekombinant proteinlerin üretimi de dahil olmak üzere artık birçok disiplinlerde kullanılan bir böcek hücre bazlı bir sistem, bir proteini kompleksleriVb glikosile proteinlerin üretimi. 1, 2, 4, 6. Bununla birlikte, çeşitli durum da baculovirüs ifade 3, 7 uygulanabilir olmayabilir ve nonlytic ve geçici böcek ifade sistemlerinin kullanılması daha uygun olabilir. Özellikle, geçici böcek hücresi ekspresyon rekombinant proteinin hızlı sentezi için imkanı sunar, viral-uygulanan hücre lizizi içermeyen az gelişim ve bakım gerektirir ve daha iyi bir protein sentezi 7, 8, 9 boyunca hücre hareketini incelemek için bir araç sağlar, 10.

Bu protokol kullanılarak ekspresyon vektörlerinin hızla oluşturulmasını tarif etmektedir, iki aşamalı üst üste gelen uzatma PCR ile (OE-PCR) Escherichia coli içinde plazmid DNA standart klonlama. Plazmidler, çift transfekte ticari olarak temin edilebilen Kültürlenmiş böcek hücreleri kullanılır ve temsili proteinleri üretmek için. Protokol, iki farklı floresan etiketli hücre içi işaretleme proteinleri üretim ve kullanımını tarif eder ve böcek Bemisia tabaci iki aquaporin proteinleri ile ko göstermektedir. Aşağıdaki protokol, OE-PCR, hedef proteinlerin hücresel lokalizasyon amacıyla böcek hücre bakım ve transfeksiyon, ve floresan mikroskobu için temel bir yöntem sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ifade plazmitlerinin yapımı 1. OE-PCR,

Not: OE-PCR kullanılan tüm primerler için Tablo 1'e bakınız. yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı kullanımı bütün amplifikasyonlar için tavsiye edilir. Bununla birlikte, bu enzimler, genellikle bırakmak çünkü bir 3' A, bir Taq DNA polimeraz ile kısa olmayan amplifiye inkübasyon gerçekleştirmek için gerekli olan 'A-kuyruk' PCR ürünleri bir TA böcek hücresi ekspresyon içerisine klonlanması önce vektör. Bu protokol, böcek sentezleme plasmidleri hücre içi protein işaretleyicileri (iki Bemisia tabaci aquaporin proteinlere, bu durumda) veya ilgilenilen genlerin karboksil terminine çerçeve içinde kaynaşmış floresan proteinleri ile, kimerik proteinleri barındıran oluşturmak için bir yöntemi gösterir (Şekil 1).

  1. Amplifikasyon iki bağımsız tur oluşur OE-PCR, kullanın oluşturmak için: (1) ilgi konusu genlerin kodlayan dizileri (B. tabaciaquaporin 1: BtDrip1; B. tabaci aquaporin 2: BtDrip2_v1) EGFP ya da (2) alt hücresel markerler (Drosophila melanogaster cinsiyet peptid reseptör olarak adlandırılan yeşil floresan protein varyantı ile çerçeve kaynaşık: DmSPR Homo sapiens fosfolipaz A2: HsPLA2) MCherry kodlama dizisi ile. Doğrudan pIB / V5-His-ta plazmidine son OE-PCR ürünlerini bağlayacaktır.
    1. OE-PCR ilk kez için, (Tablo 1 'de kalın karakterlerle gösterilmiştir), gene özgü bir sens primeri ve bir kimerik antisens primeri (AD ve A'-D Şekil 1' de' ile gösterilen), karşılık gelen (Tablo 1' de italik) İlgi / hücre içi işaretleyici genin (durma kodunu ile veya olmaksızın) son 15 bp ve istenen floresan protein ve 5'-ucunun 15 bp (EGFP ya da mCherry) bir 3' çıkıntı ile bir ürün üretmek için.
      Not: PCR, aşağıdaki koşullar için Tablo 2'ye bakın.
    2. Ayrı bir tüp içinde, bir gen-özel kullanımıİstenen floresan 5'-ucundan çıkar / hücre içi işaretleyici genin 3 'ucunda 15 bp, 15 bp içerir ve bir kimerik sens primer (Tablo 1' de, bir alt çizgi ile gösterilir) ic floresan protein antisens primeri protein, bir 5' çıkıntı ile bir ürün üretmek için.
      Not: PCR, aşağıdaki koşullar için Tablo 2'ye bakın. PCR şablonu, daha çok tercihen, plazmid DNA, istenen dizisini barındıran bir dizi-doğrulanmış PCR ürünü, ya da olabilir,. Burada tarif edilen bir çalışma sekansı geçerliliği plazmidler kullanır.
    3. (Standart moleküler dereceli agaroz kullanılarak)% 1 agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünleri ayırın.
    4. Tüketim ve ticari olarak mevcut bir DNA jel ekstre etme kiti kullanılarak beklenen boyutları (bakınız Tablo 2) 'de elde saflaştırmak (Bu protokolde kullanılan özel kit için malzeme tabloya bakınız).
    5. Nihai örtüşme e oluşturmak için adım 1.1.4 elde edilen jel-saflaştırılmış PCR ürünleri kullanınxtension ürünleri (A 'ile gösterilen' - D '' Şekil 1 'de). İlgi / hücre içi işaretleyici gen ve istenen kimerik dizisi üretmek için flüoresan protein için karşılık gelen gen-spesifik antisens primer için bir gen spesifik sens primer kullanın.
      Not: PCR, aşağıdaki koşullar için Tablo 2'ye bakın. Deneysel son, tam uzunluktaki kimerik PCR ürünü elde etmek için reaksiyon karışımına ekleyin birinci tur örtüşme uzatma ürünlerinin uygun miktarlarını belirlemek için gerekli olabilir.
    6. % 1 agaroz jel elektroforezi ile ikinci tur OE-PCR ürünleri ayırın. Tüketim bir ticari olarak temin edilebilir DNA jel ekstre etme kiti kullanılarak ürünler arındırmak ve.
    7. TA klonlama için gerekli olan 3' adenillenmiş (yani bir kuyruklu) ürünleri üretmek için 72 ° C 'de 10 dakika boyunca Taq DNA polimeraz ana karışımı 1 birim jel-saflaştırılmış ikinci tur OE-PCR ürünleri inkübe edin.
    8. Elde edilen adenylated ürünlerini bağlayacaktırpIB ekspresyon vektörüne ve kimyasal olarak kompetan (ısı şoku) ya da elektro (elektroporasyon) Escherichia coli hücrelerini dönüştürmek için standart molekül klonlama teknikleri kullanımı. Uygun seçim işaretleyici (örn, ampisilin veya karbenisilin) içeren ortamda Plaka gece boyunca karıştırıldı.
    9. Sentezleme plasmidleri, 5'-3' yönünde bir ek barındıran transforme edilmiş uç pozitif kolonileri tanımlamak için bir vektör-spesifik primer ve bir sokma özgü primer kullanılarak koloni PCR 12 gerçekleştirin. Beklenen boyuttaki PCR ürünlerini üreten kolonilerin gecelik kültürler hazırlayın.
    10. Üreticinin talimatlarına göre bir ticari olarak temin edilebilir DNA saflaştırma kiti (Bu protokolde kullanılan özel kit için malzemeler Tablo) kullanılarak plazmid DNA izole edilir. doğrudan DNA dizileme ile her bir parçanın dizisi bütünlüğünü doğrulamak.

Not: steril koşulların muhafaza bir laminer akış başlığı içinde doku kültürü şişesi açılmasını gerektirmeyen tüm hücre manipülasyonlar yapmak. daha önceki bir hücre manipülasyonlar laminer akış dedantörü UV mikrop öldürücü lambasını en az 1 saat çevirin. nitril eldivenleri giymeli ve kullanılmadan önce% 70 etanol ile tezgah, pipetler, mutfak eşyaları, tüpler, ve şişe yüzeyi dezenfekte. Temel hücre kültürü teknikleri ile aşinalık 13 önerilir.

  1. Serumsuz ortama uyarlanmıştır TnI hücreleri (Trichoplusia ni yumurtalık dokudan alınan bir yerleşik hücre kültürü hat) kullanarak ve 28 ° C T25 doku kültürü şişelerinde serum içermeyen böcek ortamı içinde yapışkan bir tek tabakalı kültürü olarak muhafaza.
  2. Sf9 hücrelerinin (Spodoptera frugiperda yumurtalık dokudan alınan bir yerleşik hücre kültürü hat), benzer fakat TNM-FH böcek kültür ortamı takviyesi bakımı% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile ed.
  3. -80 ° C ila stok şişeler çıkarılması ve bunların 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde erimesine izin dondurulmuş Sf9 veya TnI hücrelerden başlangıç ​​kültürü Seed. çözdürme sonrası% 70 etanol ile şişeleri dekontamine ve buz üzerine koyun.
  4. Yeni bir T25 şişesi ve transfer çözülmüş böcek hücre süspansiyonu 1 ml böcek hücresi ortamında 4 mL ekleyin. bir 28 ° C olmayan nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içine yerleştirilir ve hücreler, 30-45 dakika boyunca birleşmeye izin verir.
  5. Uygun ortamın 5 mL'si ile tohumlama ortamı yerini ve bir 28 ° C olmayan nemlendirilmiş inkübatör döküm kalıplarının transferi. Günlük hücre izdiham izleyin. Passage hücreleri% 90 birleşik duruma ulaştılar zaman.
    Not: T25 şişesi tam kapsama ~ 5 x 10 6 hücre karşılık gelir.
  6. Böcek hücre geçit.
    1. hücrelerin geçişi için, ilk olarak 5 ml steril bir serolojik pipet kullanılarak konfluent hücreler içeren şişeden bitmiş orta çıkarın.orta uzağa hücre tek tabaka, bir köşesinde akar, böylece şişeyi eğin. Dikkatle hücreleri bozmadan pipet kullanarak orta kaldırmak.
    2. hafifçe yeni, steril, 5 ml serolojik pipet kullanarak serumsuz böcek ortamı 4 mL konfluent tek tabaka içeren T25 şişeleri durulanarak TnI hücreleri çıkarmak. şişeye boyunca pipet getirin ve yavaş yavaş gevşek şişe tabanına bağlanmış hücreler uzaklaştırılmıştır yıkayınız.
      1. Tüm medyayı çıkarmadan üzerinde şişeyi çevirerek ve şişenin alt açıktır ki gözlemleyerek hücrelerin yeterli dekolmanı kontrol edin.
    3. daha sıkı bir şekilde yapışır Sf9 hücreleri için, taze TNM-FH ortamında 4 ml eklemek ve ekli hücreleri çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanılır. nazikçe karıştırın ve hücre topaklanma azaltmak için 5 ml serolojik pipet kullanın.
    4. ortamın hacmi başına canlı böcek hücrelerinin sayısını tahmin etmek için otomatik hücre sayacını kullanın. 1.5 mL hücre / orta karışımı 0.1 mL aktarmamikrofüj tüpü. Ayrı bir 0.5 ml mikrofüj tüpe olarak, tripan mavisi 10 uL hücre / orta karışımın 10 uL ekleyin.
    5. paketinden bir hücre sayacı odasına slayt çıkarın ve sayma sürgünün her iki yanında hücre / orta / tripan mavisi karışımın 10 uL ekleyin. Hücre tezgahın içine slayt takın ve hücre yoğunluğu ve canlılığı belirler.
    6. Hücre yoğunluğu kullanılarak, hesaplamak ve yeni, steril T25 balonlarına böcek hücre ortamında (en fazla 5 mL) uygun hacim ekleyin.
    7. Taze ortam ile T25 şişeleri, yaklaşık 11.5 x 10 6 hücre transferi; (Pn hücrelerinin, önceki nesil için geçit sayısı Pn + 1 üretimi,) hücre kullanılan çizgi, tarih, orta, ilave edilen hücrelerin sayısı ve kanal adedi ile şişeler etiket; ve en fazla 72 saat için 28 ° C inkübatör şişeler yerleştirin.
      Not: Böcek hücreleri sürekli olarak yayılabilir hücreler transfeksiyon ve / veya heterolog daha az açık olabilir, ancak30 geçişten sonra protein ekspresyonu. % 10 çamaşır suyu solüsyonu ile çıkartılan tüm hücre / ortamı tedavi ve atılmadan önce tek kullanımlık plastik eşya otoklav.

3. Böcek hücre transfeksiyonu

  1. Bir T25 şişesi tohum kadar, 1 x 10 uygun bir böcek hücresi ortamında 6 TnI veya Sf9 hücreleri (Sf9 için TnI ve TNM-FH serumsuz böcek ortamı) ve 28 ° C 'de 72 saat boyunca birleşme oluşacak.
  2. Çıkarın ve eski orta atmak ve taze serumsuz böcek orta 4 mL hücreleri çıkarmak (adımlar yukarıda 2.6.2 ve 2.6.3, bakınız).
  3. otomatik bir hücre sayacı (yukarıdaki adım 2.6.4 bakınız) kullanılarak hücre yoğunluğu tahmin.
  4. Tek tek 35 mm cam-alt yemekler için yaklaşık olarak 7 x 10 5 hücre ilave edin ve hücreleri, 28 ° C'de 20-25 dakika boyunca birleşmeye izin verir.
  5. Her transfeksiyon için plazmid DNA 2 ug ilave (ya da do iki plazmid her birinden gelen tek Transfeksiyonlar için bir plazmid ya da 2 ug1,5 mL steril bir mikrofüj tüpüne Sf9 ve TnI transfeksiyonlar) her ikisi için de FBS'siz serumsuz böcek ortamı (0.1 mL uble transfeksiyon).
  6. Ayrı bir tüp içinde, serumsuz böcek ortamı 0.1 mL transfeksiyon reaktifi 8 uL karıştırmak ve daha sonra ilgilenilen plazmid DNA içeren tüp bu çözümü aktarın. Hafif girdap ve 20 için oda sıcaklığında inkübe edin - 30 dakika.
  7. toplam hacim 1 mL eşit olacak şekilde, serum içermeyen böcek ortamı, 0.8 mL plazmid transfeksiyon adımları 3.5 karışımın ve 3.6 seyreltin.
  8. Dikkatle ekli hücreleri içeren cam yemekleri medya kaldırmak. seyreltilmiş plazmid transfeksiyon ortamı ile bağlanmış hücreler Yerleşimi.
  9. 5 saat boyunca 28 ° C'de inkübe hücreleri.
    Not: Transfeksiyon için koşullar maksimal transfeksiyon verimi (ampirik optimizasyon gerektirebilir, örneğin, bir gece boyunca transfeksiyon yerine 5 saat, kullanılan plazmid DNA'nın miktarı transfeksiyon reaktifi kimyasıikinci, vb.).
  10. Çıkarın ve transfeksiyon ortamı atılır ve yavaşça hücreleri çıkarmak için dikkatli olmak, serumsuz böcek orta 1 mL yıkama hücreleri.
  11. Taze böcek hücresi ortamı (Sf9 için TnI ve TNM-FH serumsuz böcek ortamı) 2 mL ekleyin ve 48-72 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
    Not: Yine, koşullar en fazla heterolog protein ekspresyonu için ampirik optimizasyon gerektirir.

4. Konfokal floresan mikroskobu

  1. 48-72 saat sonra, transfeksiyon de IPL-41 böcek ortamın bir kez 1 mL yıkama hücreleri ve daha sonra 2 mL IPL-41 görüntüleme ile kaplayın.
    Not: Bu yıkama aşaması, normal hücre bakımında kullanılan böcek hücre ortam maddesi ile gözlenen arka otomatik floresan azaltır.
  2. Hoechst canlı hücre boyama reaktifi 4 damla ekleyin ortamına (Bu protokolde kullanılan spesifik nükleer boya için malzeme tabloya bakınız) ve 20-25 dakika süreyle 28 ° C'de inkübe edin.
    Not: Ek nükboya EGFP ve mCherry benzersiz bir floresan profile sahip olmalıdır, ancak emizle lekeleri, ikame edilebilir.
  3. kendi içinde kapalı bir lazer konfokal mikroskop içine 35 mm tabak (Bu protokolde kullanılan özel cihaz için malzeme tabloya bakınız) yerleştirin.
  4. Hoechst, EGFP ve MCherry gözlem koşulları için mikroskop ayarlama: Hoechst uyarma / emisyon - 359/461 nm; EGFP uyarım / emisyon - 489/510 nm; MCherry uyarım / emisyon - 580/610 nm.
  5. Floresan ifadesini doğrulamak ve daha sonra bir 60X faz kontrast su daldırma objektif kullanarak tarama moduna geçmek için bir 10x objektif kullanarak bir başlangıç ​​tarama gerçekleştirin.
  6. Görüntü kontrastı ve çözünürlüğü optimize etmek için lazer gücü (% 5-7), detektör duyarlılık (47-49%), tarama hızı, Z ekseni derinliği ve dijital zum ayarlayın. Görüntü 1.5x dijital zoom hücreler 90X büyütmesi toplam vermek.
    Not: Mikroskop parametreleri optimum için ampirik ayarlama yapılmasıve görüntü toplama kullanımda araca özgü olabilir.
  7. TIFF resim dosyaları olarak ham veri aktarın ve şekil nesil için (kırpma ve bindirme) değiştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OE-PCR,

OE-PCR, bir kez çıkar ve floresan markör proteinin herhangi bir test genine karşılık gelen rekombinant kimerik proteinlerin üretimi için izin bir ekspresyon vektörüne yerleştirilir, kimerik DNA ürünleri sentezine izin verir. Şekil 1, floresan protein markör EGFP ile çerçeve dizileri (BtDrip1 ve BtDrip2_v1) kodlama B. tabaci aquaporin içeren pIB ifade vektörlerinin üretimi için genel bir şema göstermektedir. Bu senaryoda, karboksil terminalinde EGFP ihtiva eden iki BtDrip kimerik proteinler üretildi. Bu protokol, aynı zamanda, karboksil terminallerinde mCherry ile kimeraları üretilmiş, iki böcek hücre içi işaretleyici proteinleri, DmSPR ve PLA2G15 (Şekil 1), geliştirmek için yöntemler gösterdi. emisyon spektrumu yeterince farklı olduğu için EGFP ve MCherry t izin seçilmiştiro bağımsız algılama ve test proteinleri gelen sinyallerin eş yerleşimi (örn., BtDrip EGFP) ve DmSPR- ve markör proteinler PLA2G15 mCherry etiketli. Tüm PCR reaksiyonları beklenen boyutlardaki bantlar üretilebilir ve başarılı bir şekilde PIB klonlanmıştır. Bütün plasmidler doğru yönde ve çerçeve içinde floresan protein işaretleri ile ilgili uçlar içeren DNA dizilemesi ile doğrulanmıştır.

Böcek hücre kültüründe geçici rekombinant protein ekspresyonu

pIB / BtDrip1-EGFP, pIB / BtDrip2_v1-EGFP, pIB / DmSPR-mCherry ve pIB / PLA2G15-mCherry tekabül eden ekspresyon vektörlerinin inşa edilmesi ardından, hücreler transfekte edildi ve canlı hücrelerde rekombinan proteinlerin ekspresyonu konfokal floresan kullanılarak görselleştirilmiştir mikroskobu (Şekil 2). Başarılı transfeksiyon ve rekombinant BtDrip1-EGFP ekspresyonu belirgin bY TnI hücreleri (Şekil 2B, 2F) yüzeyi üzerinde yeşil floresan varlığı. Yeşil floresan BtDrip2_v1 hücre içi ekspresyonunu gösteren, BtDrip2_v1-EGFP (Şekil 2J, 2N) ile transfekte TnI hücreler içinde gözlenmiştir. Benzer şekilde, pIB / DmSPR-mCherry (Şekil 2C, 2H) veya pIB / PLA2G15-mCherry (Şekil 2G, 2O) ile transfekte TnI hücreler, ilgili kimera ekspresyonunu gösteren kırmızı floresans göstermektedir.

Rekombinant BtDrip proteinler ve hücre içi belirteçlerin eş yerleşimi

TnI hücrelerin çift transfeksiyon, iki floresan-etiketli proteinler ko-ekspresyonu için izin verir. Sarı / turuncu transfekte TnI hücrelerinin bindirilmiş görüntü hücreleri EGFP ve mCherry ve her ikisi de üretim plasmitler proteinler, aynı SU içinde ko-lokalize olduğunu düşündürmektedir göstermektedirbcellular yapılar (Şekil 2D, 2H, 2 L ve 2P). Bu BtDrip1 ve DmSPR hücre yüzeyi 14, 15, 16 olarak ifade edilen, önceki sonuçları doğrulamaktadır. PIB / BtDrip1-EGFP ve pIB / DmSPR-mCherry çift transfekte TnI hücrelerin bir bindirme hücre yüzeyi üzerinde BtDrip1-EGFP ve DmSPR-mCherry ko-lokalizasyonunu göstermektedir, yeşil ve kırmızı flüoresans sinyallerinin (Şekil 2D), üst üste binmesini gösterir . Daha önce, Maroniche ve diğ. 17 mCherry bir kimera Sf9 hücrelerinde ifade edildiği zaman PLA2G15 arası lizozomlar bir göstergesi olduğunu göstermiştir. Rekombinant BtDrip2_v1 EGFP proteininin, hücre yüzeyinde transloke olacağını tahmin olmasına rağmen, daha önce kimerik protein, öncelikle transfekte TnI hücre 15 içinde hücre içinde lokalize olduğu gösterilmiştir. Buna destek olarak, küçük Evid yoktuBtDrip2_v1 EGFP pIB / DmSPR-mCherry (Şekil 2 L) ile birlikte eksprese edilmiştir, yeşil ve kırmızı flüoresan sinyalleri eş-lokalizasyonu için ence. Bunun aksine, pIB / BtDrip2_v1-EGFP ve pIB / PLA2G15-mCherry eş ifadesi, BtDrip2_v1 olasılıkla hücre içi lızozomlara trafiğe düşündüren, sitoplazmik yeşil ve kırmızı flüoresan sinyalleri (Şekil 2P) önemli bir üst üste binme ile sonuçlanmıştır.

Şekil 1
Şekil 1: üste gelen uzantı PCR (OE-PCR) kullanılarak ekspresyon yapılarını yapı şematiği. OE-PCR, ihtiva eden, pIB ifade vektörlerini oluşturmak için kullanılan Bemisia tabaci aquaporin 1 / EGFP (BtDrip1 EGFP), B. tabaci aquaporin 2_variant 1 / EGFP (BtDrip2_v1 EGFP), Drosophila melanogaster seks peptid reseptör / MCherry (DmSPR- mCherry) ve Homo sapiens fosfolipaz-A2 / mCherry(HsPLA2G15 mCherry) ürünleri. OE-PCR ilk tur ilgili tam-uzunlukta cDNA'lar tekabül eden parçacıkları oluşturur, BtDrip1 (A) BtDrip2_v1 karşılık gelen küçük bir 3' üst üste binen bölge ihtiva eden (B) DmSPR (C) ve HsPLA2G15 (D) EGFP ya da mCherry floresan markör protein ya 5'-ucu. Eş zamanlı olarak, EGFP ve mCherry tam boyda cDNA lar, PCR amplifikasyonunu ((, BtDrip2_v1 (B '), DmSPR (C'), veya HsPLA2G15 küçük 5' BtDrip1 A), 3'-ucuna karşılık gelen örtüşen bölge' içeren olan D'). OE-PCR 'nin ilk olarak ilgi konusu cDNA'ları (örneğin, BtDrip1, BtDrip2_v1, DmSPR ve HsPLA2G15) amplifiye etmek için kullanılan tüm primerler, normal olarak, her bir kodlama sekansının 3'-ucunda bulunan durdurma kodonu yoksun unutmayın. Tüm birinci yuvarlak OE-PCR ürünleri agaroz jel seçilmişler ile ayrılmış, güçlendirilirrophoresis ve jelle saflaştırılmıştır. OE-PCR ikinci boyunca tam uzunluklu kimerik ürünlerin amplifikasyonu için gerekli şablonlar olarak OE-PCR 'nin ilk elde edilen jel-saflaştırılmış PCR ürünleri havuzlanmış çiftleri kullanır. Her bir reaksiyon için, duyarlı primer İlgi kodlama dizilerinin cDNA, 5'-ucuna karşı gelen ve anti duyu primeri sağlam kodon dayanağa (A ', B' ile, EGFP ya da mCherry 3'-ucunu tamamlayıcıdır; , C' ve D ''). Dört ikinci tur OE-PCR ürünleri jel saflaştırılmış Taq polimeraz ile adenillenmiş ve pIB / V5-His-sentezleme vektörüne lige bulunmaktadır. Plazmidler, E. coli içinde yayılır ve saflaştırılmış plazmid DNA böcek hücrelerini transfekte etmek için kullanılır. B. tabaci BtDrip1 ve BtDrip2_v1 sırasıyla koyu mavi ve mavi gösterilmiştir su kanallarının ve hücre içi belirteçler DmSPR ve PLA2G15 sırasıyla turuncu ve pembe gösterilmiştir. EGFP shyeşil ve mCherry içinde kendi kırmızı renktedir. Renkli oklar yönünde (ters yönde ileri yönde ve antisens primerler olarak sens primerler) ve gene özgü primerler yerini göstermektedir (bir primer renk primer dizisinin kaynağı belirtir). astar detayları için Tablo 1'e bakınız. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

şekil 2
Şekil 2: Rekombinant BtDrip1-EGFP, BtDrip2_v1-EGFP, DmSPR-mCherry ve PLA2G15 mCherry proteinlerini ifade çift transfekte TnI Hücrelerinin Canlı Görüntüleme. Trichoplusia ni (TnI) hücreleri, pIB / BtDrip1-EGFP ve pIB / DmSPR-mCherry (AD), pIB / BtDrip1-EGFP ve pIB / PLA2G15 mCherry (EH), pIB / BtDrip2_v1-EGFP ve pIB / DmSPR çift-transfekte edilmiştir -mCherry (<Güçlü> İL) ya da pIB / BtDrip2_v1 EGFP ve pIB / PLA2G15 mCherry (MP). Görüntüler, bir lazer tarama konfokal mikroskop 90X büyütme ile 60X faz kontrast su daldırma objektif (NA 1.2) kullanılarak yakalanmıştır. Hoechst panelleri lekeli hücre çekirdekleri (ex / em 359/461 nm =) temsili canlı hücre görüntüleri gösterir. EGFP panelleri EGFP kimeralar (örn / em 489/510 nm =) ile transfekte hücrelerin floresans ifadesi olduğunu gösterir. MCherry panelleri MCherry kimeraları (örn / em 580/610 nm =) ile transfekte hücrelerin floresans ifadesi olduğunu gösterir. Birleştirme paneli tüm üç flüoresan kanallar (örneğin, Hoechst, EGFP ve mCherry) arasında kaplamasını göstermektedir. Ölçek çubuğu 10 um =. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Heterolog protein ekspresyon sistemleri çok sayıda alt uygulamalarda 4'te kullanılan rekombinant proteinlerin üretimi için önemli bir araçtır. Mevcut çeşitli ifade sistemlerinden seçme ilgi protein için nihai hedef bağlıdır. Çeşitli böcek hücresi ifade sistemleri prokaryotik ve ökaryotik hücre ekspresyon sistemleri 5, 6 esnek alternatifler sunan mevcuttur. Protein ifadesini sürmek için bakulovirüs enfeksiyonu gerektiren Böcek sistemleri araştırma ve terapötik uygulamalar 1, 2, 3 kullanılan bu tür birçok proteinlerle, uzak en popüler ve yaygın olarak kullanılan böcek sistemiyle vardır. Bakulovirüs sentezleme, ancak, bu dahil olmak üzere, sınırlamalarını var: 1), viral yaşam döngüsü, konakçı hücrenin eritilmesini içerir; 2) lizlenir konakçı hücreler, tipik olarak yüksek bir amo serbestparçalayıcı enzimlerin unts; 3) stabil hücre çizgilerinin üretimi zaman alıcı ve sitotoksik proteinler için uygun olmayabilir olduğu; 4) kesikli ifade sık bakım gerektirir; 5) vektör üretimi sıklıkla çoklu klonlama adımları gerektirir; 6) böcek hücre yoğunlukları genellikle viral enfeksiyona karşı ters orantılıdır; ve 7) biraraya getiren proteinler birincil olarak hücre yüzeyinde yüksek düzeyde trafik işlemleri ya da 3, 7, 9, 10 salgılanır. Plazmid DNA'sı ile böcek hücresi transfeksiyon göre Nonlytic geçici gen ekspresyon bakulovirüslerin 7, 8 ile ilişkili benzeri olmayan bazı zorlukları olmadan rekombinant proteinlerin üretimi için alternatif bir teknik sunmaktadır. Yani, geçici böcek hücresi ifade daha kısa dönüş-around sunmaktadır vektör yapımı ve protein sentezi üzerine, challeng önler es viral enfeksiyon ve hücre lizizi ile bağlantılı, ve proteinlerin hücre hareketini gözlemlemek için güçlü bir yol temin etmektedir.

Burada, iki doğrulanmış sentezleme konstruktları proteinler BtDrip1 ve BtDrip2_v1 aquaporin B. tabaci hücre içi lokalizasyonu belirlemek için kullanıldı. DmSPR mCherry plazma hücre membranı 16 için bir markör ve PLA2G15 mCherry hücresel lizozomlar 17 içinde lokalize eder. Şekil 2, proteinlerinin konumlarının tespit edilmesi için bu tür belirteçlerin değerini gösterir ilgi, bu durumda, lizozomlannda PLA2G15-mCherry ile hücre yüzeyinde DmSPR-mCherry ve BtDrip2_v1-EGFP BtDrip1-EGFP eş yerleşimi. Bu nedenle, burada gösterildiği gibi, daha önce yapılmış 14, 15, 16, 18, 19,eşek = "xref"> 20, bu metodoloji hızla böcek hücreleri içinde protein trafiğini tespit etmek için kullanılabilir. TnI hücreler içinde protein ekspresyonu ve trafik burada (Şekil 2) gösterilmiş olmasına rağmen, protokol için optimize edilmiş ve diğer böcek hücre çizgileri (Sf9 Sf21 BM-N, S2, vs.) için de eşit ölçüde uygulanabilir olduğuna dikkat etmek önemlidir .

tüm heterolog protein ifade sistemleri gibi, kültürlü böcek hücreleri içinde geçici protein üretimine sınırlamalar vardır. Yani, plasmid türevli ifadesi için pozitif hücrelerin yüzdesi bakülovirüs ya da stabil hücre hatları kullanarak elde edilenden tipik olarak daha düşüktür. Bu durumda, geçici bir sistemde daha düşük olabilir üretilen rekombinant protein (ler) in miktarı; Bununla birlikte, farklı promoterlerin kullanımı ve genetik arttırıcılar dahil Bu sınırlandırmayı 7, 21, 22 üstesinden gelebilir. TOnun protokol iki pIB vektörleri, her barındıran farklı protein-kodlama dizileri (Şekil 2) ile TnI hücrelerinin ko-transfeksiyon gösterir. Benzer transfeksiyon verimliliği TnI hücreler (veriler gösterilmemiştir) transfekte etmek için kullanılan tüm dört ekspresyon vektörleri için gözlendi, ancak bu her zaman mümkün değildir. Dolayısıyla, bu tür geçici ekspresyon vektörleri ile deneyler kapsamlı deneysel optimizasyon gerektirebilir (örneğin, her vektörü, transfeksiyon süresinin transfeksiyon reaktifi kimya, vb miktarındaki farklılaşma) eş transfeksiyon verimi ve / veya rekombinant protein ekspresyonu seviyeleri elde etmek. Ayrıca, bir floresan protein ilavesi etkileyen veya protein 23 hedef bölgesinin 24 alt hücresel kaçakçılığı sınırlandırabilir mümkündür. İşaretleme proteinlerinin ile floresan gözlemlenmesi ile iki proteinin hücre içi eş-lokalizasyonu kimlik necessaril etmezY ilgi 24, 25 proteinleri arasındaki direkt protein-protein etkileşimlerini gösterir. Bu tür eş-lokalizasyonu sonuçları değerlendirilirken Bu nedenle, dikkatli olunmalıdır.

Geçici gen ifadesi mevcut bakulovirüs sistemleri göre bazı avantajlar sunduğuna gelmez. Geçici ekspresyon vektörlerinin yapımı için daha az zaman ve emek gerektirir ve rekombinant proteinlerin sentezi için, geçici sentezleme bakülovirüs patojenik ömrü ile bağlantılı hücre lizizi içermez, ve geçici ifade alt hücresel ticareti için daha iyi bir çalışma sistemi sağlayabilir proteinler, 3, 7, 9. Bu protokol, üst üste gelen uzatma PCR (Şekil 1 kullanarak, pIB ekspresyon vektörü, söz konusu bir genin doğrudan dahil edilmesi yoluyla kolay ve bina yapılarının hızını vurgulamaktadır 26 geniş bir yelpazesi için izin verir. Ayrıca, EGFP 27 ve mCherry 28 birlikte, iki B. tabaci aquaporin proteinlerin karboksil terminallerinde de burada dahil edilmiştir, OE-PCR, ayrıca bu proteinlerin amino uçlarında çok sayıda başka varyant floresan markör proteinler 26 yerleştirmek için kullanılabilir. OE-PCR kullanılarak inşa çeşitli ekspresyon plazmidleri ek olarak, pek çok geleneksel ifade klonlama kasetleri hazırlanır ve floresan proteinleri EGFP, Venüs ve MCherry ile çerçeve ilgi hemen hemen herhangi bir protein üretilmesi için kullanılabilir, kaynaşık, dikkate değerdir amino ya da terminal uçlarında ya en. Bu ekspresyon kasetleri isteğe bağlı olarak mevcuttur.

"Genomik" dönemi anlamlı d görülmemiş hacmini ve erişimi sağlamıştırata. Bununla birlikte, boşluk gen keşfi ve gen ürünlerine fonksiyon ataması arasındaki genişlemeye devam eder; Böylece, ek ampirik araçları umutsuzca işlevsel genomik hızlandırmak için gereklidir. Oysa, gen düzenleme ve in vivo gen manipülasyonu sistemlerinde diğer sonuçta gen fonksiyonu atamak için özlü yaklaşımlar sağlayabilir, heterolog protein ifade sistemleri muhtemelen değerli proteinlerin biomanufacture için ve protein yapısı ve fonksiyonu deşifre edilmesi için önemli olmaya devam edecektir. Bu protokol, ekspresyon plazmidlerinin gelişmiş yapı ve böcek hücrelerinde rekombinan proteinlerin kısa süreli bırakılması için bir yöntemi tarif etmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Acknowledgments

Biz teknik yardım için Lynn forlow-JECH ve Dannialle LeRoy teşekkür ederim. Bu makale amacıyla sadece bir ticaret adları veya ticari ürünlerin JAF ve JJH Mansiyon için Bitki Koruma ve Karantina [Proje # 2020-22620-022-00D] - Bu çalışma USDA ARS taban -CRIS fon, Ulusal Program 304 tarafından desteklenmiştir spesifik bilgi sağlama ve ABD Tarım Bakanlığı tarafından tavsiye veya onaylandığı anlamına gelmez. USDA bir fırsat eşitliği sağlayıcı ve işverendir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD DNA Polymerase EMD Millipore 71085-3 High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA Polymerase TaKaRa-Clontech RR001B DNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix Lucigen 30033-1 DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler Biometra/LABRepCo 070-851
Agarose LE Benchmark Scientific A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit EMD Millipore LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit ThermoFisher K89020 Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep Kit Qiagen 27104
QIAcube Robotic Workstation Qiagen 9001292
Purifier Vertical Clean Bench Labconco 3970401
Tni cultured insect cell Line Allele Biotech ABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell Line Allele Biotech ABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture Medium Allele Biotech ABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture Medium Allele Biotech ABP-MED-10001
IPL-41 Insect Medium ThermoFisher 11405081
Cellfectin II Transfection Reagent ThermoFisher 10362100
16 cm Disposable Cell Scrapers Sarstedt 83.1832 Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps Life Science Products CT-229331
Transfer Pipets Fisher 1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes Life Science Products CT-229475
PipetteBoy VWR 14222-180
5 mL Serological Pipettes Sarstedt 86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes Fisher 14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags Fisher 01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes Matsunami Glass D35-14-1.5-U 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510E VWR 35823-961
Countess II FL Cell Counter ThermoFisher AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent ThermoFisher C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope Olympus FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA transOMIC Technologies TCH1303
pmCherry Vector Clontech 632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) ThermoFisher R37605

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, (5), 567-575 (2005).
  2. van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96, (1), 6-23 (2015).
  3. Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30, (1), 1-18 (2014).
  4. Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40, (1), 1-22 (2005).
  5. Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9, (3), 255-271 (2013).
  6. Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).
  7. Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
  8. Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88, (1), 134-142 (2013).
  9. Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
  10. Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6, (2), 189-194 (2005).
  11. Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12, (9), 653-657 (1998).
  12. Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9, (3), 1-6 (2008).
  13. Cell Culture Basics Handbook. ThermoFisher Scientific. Available from: http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0 (2014).
  14. Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41, (3), 178-190 (2011).
  15. Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
  16. Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23, (3), 301-319 (2014).
  17. Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20, (5), 675-685 (2011).
  18. Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81, (4), 179-198 (2012).
  19. Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3, (6), 1-12 (2012).
  20. Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
  21. Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
  22. Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
  23. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
  24. Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
  25. Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
  26. Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  27. Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, (5148), 802-805 (1994).
  28. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22, (12), 1567-1572 (2004).
Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fabrick, J. A., Hull, J. J. Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells. J. Vis. Exp. (122), e55756, doi:10.3791/55756 (2017).More

Fabrick, J. A., Hull, J. J. Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells. J. Vis. Exp. (122), e55756, doi:10.3791/55756 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter