Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

Published: August 9, 2017 doi: 10.3791/55757
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה יעילה לרתום את הפוטנציאל בידול הלב של מקורות צעיר של גזע mesenchymal האנושי על מנת ליצור תאים פונקציונלית, קבלנות, כמו cardiomyocyte אין ויטרו.

Abstract

אוטם שריר הלב המפל איסכמי עוקבות לגרום לאובדן נרחב של cardiomyocytes, שמוביל אי-ספיקת לב, הגורם המוביל של התמותה ברחבי העולם. גזע mesenchymal (MSCs) הם אופציה מבטיח מבוססת תא טיפולים להחליף את הנוכחי, פולשני טכניקות. MSCs יכולים להתמיין שושלות mesenchymal, כולל סוגי תאים הלב, אך התמיינות להשלים לתוך תאים פונקציונלית לא עדיין לא הושג. שיטות קודמות של בידול התבססו על סוכנים תרופתי או גורמי גדילה. עם זאת, אסטרטגיות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית ניתן גם להפעיל MSCs לעבור טרנספורמציה cardiomyogenic. כאן, אנו מציגים שיטה בידול באמצעות MSC אגרגטים בשכבות מזין cardiomyocyte לייצר תאים קבלנות, כמו cardiomyocyte.

תאים אנושיים חבל הטבור perivascular (HUCPVCs) הוכחו יש פוטנציאל מאשר הבחנה גדולה יותר נפוץ חקרו את סוגי MSC, כגון מח העצם MSCs (BMSCs). כמקור ontogenetically הצעיר, חקרנו את הפוטנציאל cardiomyogenic בטרימסטר הראשון (FTM) HUCPVCs לעומת מקורות בוגרים. FTM HUCPVCs הם מקור הרומן, עשיר של MSCs לשמור בתוך הרחם immunoprivileged המאפיינים שלהם כאשר תרבותי במבחנה. באמצעות בידול פרוטוקול זה, FTM המונח HUCPVCs מושגת בידול cardiomyogenic מוגבר באופן משמעותי בהשוואה BMSCs, כמצוין על-ידי ביטוי מוגבר של סמנים cardiomyocyte (קרי, myocyte משפר פקטור 2 ג, טרופונין לב T, שרשרת כבדה לב צולבות הקישור חוטים שרירן, אות חלבון תקינה α ו connexin 43). הם גם קיימו immunogenicity נמוך משמעותית, כפי שהוכח על ידי שלהם נמוך הלע-A ביטוי והבעה הלע-G גבוה. החלת בידול מבוססי צבירה, FTM HUCPVCs הראה היווצרות צבירה מוגבר פוטנציאלי שנוצר קבלנות תאים אשכולות בתוך שבוע אחד של תרבות משותפת בשכבות מזין לב, הופך הסוג MSC הראשון לעשות כן.

התוצאות שלנו להדגים כי אסטרטגיה זו בידול יכול ביעילות לרתום את הפוטנציאל cardiomyogenic של MSCs צעירים, כגון FTM HUCPVCs, מרמז שכי במבחנה קדם הבידול יכול להיות אסטרטגיה אפשרית כדי להגדיל את יעילות הרגנרציה שלהם בתוך vivo.

Introduction

אי-ספיקת לב (CHF) נמשכת כגורם מוביל התחלואה והתמותה ברחבי העולם. CHF מתרחשת לעיתים קרובות בעקבות אובדן מאסיבי של cardiomyocytes ופיתוח של התא ללא רקמה צלקתית כתוצאה פתולוגי של אוטם שריר הלב (MI)1. הלב הוא איבר באופן חלקי עצמי המתחדש, תושב גזע ו קדמון תא הבריכה אחראי על ביצוע התחדשות רקמות באופן משמעותי פוחתת שפע ומתפקדים בחולים בגילאי, לעתים קרובות להיות מספיק להתאוששות אופטימלית לאחר פציעה. לפיכך, יש עניין רב בפיתוח טיפולים ניסיוניים המערבות את השתלת תאי התורם בריא לתוך שריר הלב הפגוע. זה הכרחי כי תאי התורם לא רק לשחזר את המבנה של הרקמה, אלא גם להשיג התאוששות פונקציונליות של שריר הלב מושפעת.

הלב יליד מעסיקה תושב רקמת הלב ותיקון אנדוגני שמקורם במח העצם בתאי גזע עבור לאחר פציעה2,3,4. משובי תאים-מארח, התורם-נגזר כאחד-חובה יש את היכולת להשיג את פנוטיפ המתאים ואת פונקצית microenvironment של שריר הלב שיפוץ, יחד עם היכולת ביעילות ובבטחה להחליף את התאים אבוד. במבחנה בידול שיטות נעשה שימוש נרחב על מנת להשיג יעילות גבוהה, המבוססים על תאי גזע cardiomyocyte-הייצור-5,-6. לפרופיל ביטוי של סמנים השושלת הלב משמש כדי להגדיר תהליך התמיינות תאי גזע כלפי שושלת היוחסין לב7. בתחילת בידול סמנים, כגון NKX2.5, myocyte משפר פקטור 2 ג (Mef2c), ו-8,GATA49, יכול להיות אינדיקציה אתחול של תהליך cardiomyogenic. סמנים cardiomyocyte בוגר נפוץ כדי להעריך את היעילות בידול הן אות חלבון תקינה α (SIRPA)10, טרופונין לב T (cTnT)11, שרשרת כבדה לב צולבות הקישור חוטים שרירן (MYH6)8,12,13ו connexin 43 (Cx43)14,15,16. השיטות שימוש בתאי גזע עובריים (ESCs) וגזע pluripotent (מגירסה) יש כבר ביסודיות אופטימיזציה ודן לגבי הפרטים של גורמים אינדוקטיבית, חמצן ומילויים הדרגתיים מזין, ואת העיתוי המדויק של פעולה5,6,7,17,18. למרות זאת, ESC-PSC מבוססי טכנולוגיות עדיין להציג את מספר דאגות אתיות ובטיחות, יחד עם תכונות אלקטרופיזיולוגיות אימונולוגי שיוצרת19,20. המארחים מושתלים עם תאים אלה לעיתים קרובות חווים immunorejection ודורשים החיסוני קבוע. זאת בעיקר בשל mismatching תשואה histocompatibility הגדולות מורכבות (MHC) מולקולות המארח של התורם, וכתוצאה מכך T-cell תגובה21. בזמן MHC בודדים מחלקה אני התאמת הוא פתרון אפשרי, פרקטיקה קלינית נגיש יותר ידרוש מקור תא זה אוניברסלית immunoprivileged להתגבר על החשש מדחייה.

כמקור חלופי תא לשימוש ביישומים קליני, MSCs ובמיוחד, BMSCs, נחקרו לשימוש בהתחדשות רקמות מאז תיאור הראשונית שלהם בשנת 199522. MSCs מאמינים כי תושב תאים משובי שניתן למצוא כמעט בכל רקמה vascularized23. על בידוד מן המקור הרצוי, MSCs ניתן בקלות להרחיב בתרבות, יכולת paracrine נרחב, לעיתים קרובות בעלי immunoprivileged או immunomodulatory מאפיינים24,25. הבטיחות והיעילות שלהם כבר הוכחו במספר מחקרים קליניים, בפרט עבור התחדשות לב3,26.

אסטרטגיות רבות של בידול MSC לנצל סוכנים תרופתי, כגון 5-azacytidine22 , דימתיל סולפוקסיד27, ואת הצמיחה או גורמים morphogenic, כמו BMPs5,7,28,29 או אנגיוטנסין-II30, עם יעילות משתנה. אסטרטגיות אלו, עם זאת, אינם מבוססים על המכשולים תא משובי תמים סביר להניח שתיתקל לאחר שנשלחה אל האתר של פציעה או ויוו. אסטרטגיות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית, עוד יותר קשה להגדיר, לתמרן, מבוססים על ההנחה כי בידול MSC יכולה להיגרם באמצעות אותות microenvironment הרקמה עצמה. מחקרים קודמים הראו כי החשיפה לב תא lysates31 או32,חדרית שריר הלב33או ישיר קשר cardiomyocytes הראשית in vitro לקשרי15,34, באפשרותך להגדיל את הביטוי של סמני לב MSCs. אחרים הדגים cardiomyogenesis ספונטנית לאחר טיפול פציעות לב עם MSCs35,36,37,38, למרות בחלקו, היתוך גרעיני של BMSCs, cardiomyocytes39,40 שנוצר לשריר המתהווה. לידע שלנו, cardiomyocytes פונקציונלי, מתקשרת באופן ספונטני של MSCs אנושי (hMSCs) של כל מקור הרקמה לא טרם דווחו.

הקונצנזוס הנוכחי הוא כי כל MSCs נובעים תאים perivascular23. יאנג MSCs עם מאפיינים pericyte ניתן לבודד מאזור perivascular של42,41,רקמה אנושית הטבור43. בהשוואה BMSCs, HUCPVCs בעלי פוטנציאלי מוגבר בידול, מספר יתרונות משובי אחרים, שניהם במבחנה41,44 ו ויוו45,46,47. ראוי לציין, המקור להיות הממשק אמהי-עוברית, HUCPVCs יש immunogenicity נמוך משמעותית בהשוואה למבוגרים מקורות של MSCs. המחקר שלנו מתמקד אפיון ויישומים קליניים של FTM HUCPVCs, המקור הצעיר של MSCs חקירה, אשר בעבר הראינו הגבירו proliferative ומעלה multilineage הבחנה הקיבולות, כולל השושלת cardiomyogenic41.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שמשלב היווצרות צבירה ושכבות המזין העיקרי תא לב כמו אינדוקטיבית כוחות כדי להשיג את הבידול cardiomyogenic מלאה של אגרגטים MSCs. לספק סביבה תלת-ממד, כדאי מודלים תנאים ויוו לעומת תרבויות חסיד 2D. ניצול שכבות הלב מזין מספק סביבה נציג של האתר השתלת האולטימטיבי MSCs. נדגים כי מקורות הצעיר של MSCs מבודד חוטי חבל הטבור לפני או אחרי לידה יש יכולת גבוהה יותר טופס אגרגטים ולהגיע על פנוטיפ לב בהשוואה למבוגרים BMSCs, תוך שמירה על הזכות-החיסון שלהם. מלבד גובה תלול של השושלת לב סמן גנים, הביטוי המושרה תאיים (קרי, cTnT ו- MYH6) וחלבונים תא-פני (קרי, SIRPA ו Cx43) ספציפיות עבור cardiomyocytes, אנו מראים כי הפוטנציאל בידול של FTM HUCPVCs ניתן לשלוט באמצעות שיטה זו, כי הם יכולים להצמיח באופן ספונטני קבלנות תאים, כמו cardiomyocyte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הבידול הלב של תאי גזע נמצא בפיתוח במשך יותר מ 2 עשורים, עם מספר אסטרטגיות שונות בשימוש ליצירת תאים דמויי cardiomyocyte ממקורות MSC. רבים של אסטרטגיות אלו, עם זאת, הם לא יעילים, התנאים בהם נעשה שימוש לעתים קרובות לא נציג הסביבה, מושתלים תאים מפגש ויוו.

בניגוד לשיטות הקיימות, פרוטוקול המובאת כאן מנצל שילוב של ראשי מזין לב שכבות ויצירת צבירה MSC. הרבדים מזין הלב הראשי מספק סביבה בידול דומה לזה אשר hMSCs נחשפים על השתלת. מצרפי ליצור סביבה עם מעברי צבע חמצן, מזין, אשר יכולה להיות השפעה השראי על ייזום שושלת היוחסין מחויבות. PSC ESC מבוססות אסטרטגיות הבידול הלב באמצעות preconditioning חמצן ויצירת צבירה הקימו זו השפעה השראי על תאי גזע-5,-52,-53. בנוסף, מבנה תלת-ממד דומה יותר של חיבורים לתא סיפק vivo בתוך. באמצעות שיטה זו, שהפקנו בהצלחה באופן סינכרוני קבלנית hMSC אגרגטים-בפעם הראשונה שמסוג hMSC היה מסוגל לעשות זאת, לידע שלנו. חשוב, רק הצעיר hMSC תא המקור מוחל, FTM HUCPVCs, הציג יכולת זו.

יתרון משמעותי של שימוש או תמים או MSCs הבדיל מראש על ESCs או מגירסה עבור התחדשות לב טמון המאפיינים immunomodulatory או immunoprivileged שלהם. אולם, גם במקרה של MSCs, immunomodulatory תכונות משתנות עם שלהם גיל ומקור54. BMSCs הוכחו לשנות בידול שלאחר שלהם מאפיינים immunogenic, אשר מובילה לעיתים קרובות שלהם דחייה על ההשתלה55. כאמור תיאר, MSCs מן הטבור מקור בעלי הרשאה חיסוניים מיוחדת56 בשל מוצאם בתוך הרחם . באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, גם לאחר התמיינות לתאים, כמו cardiomyocyte, המונח ו- FTM HUCPVCs הציג רמות גבוהות של הלע-G (זה נחלש באופן פעיל את התגובה החיסונית מולדת) ומתוחזק רמות נמוכות של הלע-A (הקובע ש-t-cell מתווכת cytotoxicity).

פרוטוקול בידול זה יש את היתרון של נוח ומאפשר רמות מרובות של ניתוח. ראשית, ההדמיה בשידור חי של פונקציונליים, קבלנות אגרגטים הוא ריאלי יותר מאשר הבחנה תאים בודדים משולב לשכבה מזין. כמו הפרוטוקול מנצל תרבויות שיתוף מעורבות-מינים, תחל אדם ספציפי חלות ניתוח qPCR, בעוד FACS, ICC מספקים זיהוי מהיר של פנוטיפ-בפרט, ביטוי מיכשור (איור 2). באמצעות הפרוטוקול כמתואר, אותרו רמות גבוהות של SIRPA, cTnT, MYH6, aSarc, Mef2c ו- Cx43. בשילוב עם HuNu, זה אפשרי לזהות את הביטוי של Mef2c ו aSarc ב hMSCs הבדיל, להבדיל מן החולדה מזין נגזר cardiomyocyte שכבות או תאים מאוחה. בעוד הזיהוי של אגרגטים קבלנות בשכבה מזין הוא קל יחסית, איסוף או לקצור אותם יכול להוות מגבלה. מיקרוסקופים מצוידים micromanipulator יכול להיות מועסק כדי להתמודד עם האתגר הזה. לחלופין, תאים אנושיים ניתן למיין ביעילות מתרבויות שיתוף באמצעות נוגדנים anti-TRA-1-85 אדם ספציפי. בעוד התרבויות שותף גם להציג את האתגר של פיוז'ן תא פוטנציאליים, זה גם ניתן להתגבר באמצעות שילוב של סמן האנושי גרעינית, תא-פני המשדרים (משלים איור 1).

שינוי אפשרי של השיטה הבידול שלנו היא להתאים את היווצרות של אגרגטים. התוצאות שלנו מראים כי גודל צבירה יכולים להיות פרמטר קריטי עבור בידול אופטימלית. בהנחה כי צבירת היא סלקטיבית עבור תאים דביק יותר, הוא יכול להתנהג כמו צעד בחירה מראש עבור hMSCs CD49f-חיוביות. היווצרות כדור MSC משופרת נקשר גדל CD49f ביטוי49, CD49f קשורה גם stemness גבוהה יותר כי זה מחובר ישירות אל SOX2 ו- OCT449. נצפו מספר נמוך יותר של תאים CD49f-חיוביות במקורות בוגרים של hMSCs בהשוואה HUCPVCs FTM, מה שיכול להסביר את גודל צבירה מופחתת נצפתה. אנחנו הנחות כי בחירה זו יכולה להיות מפוצה על ידי הגדלת מספר hMSCs לכל צבירה כדי להשיג מידה צבירה גבוה יותר, ובכך אולי מגדילים את היעילות של בידול צבירת-induced.

יישומים עתידיים עשויים לדרוש שינויים בפרוטוקול גם כן. זה הכרחי כי יישומים קליניים של hMSCs הבדיל מראש מתקיימים בתנאים קסנו-חופשית. מצרפי קבלנות המיוצר באמצעות פרוטוקול זה יכול לשמש גם ליצירת רקמות שריר הלב מהונדסים. כדי לייצר מוצר ישימה מבחינה רפואית, הכרחי זרימת עבודה תואמי cGMP. בעוד קסנו ללא תרבות בינוני זמין עבור hMSCs, מתן רובד מזין נטול חיים עשויה להיות מאתגרת. עם זאת, החלת מזין מראש הבדיל שכבות של מקורות תאי הגזע אחרים, כגון iPSCs, הוא פתרון אפשרי.

לסיכום, ניתן להחיל בידול השיטה המתוארת לייצר תאים פונקציונלית cardiomyocyte דמוי ממקורות צעיר של hMSCs באופן נוח לשחזור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ד ר קליפורד ל' Librach הוא מחזיק משותף של הפטנט: שיטות בידוד ושימוש של תאים שמקורם ברקמות חבל הטבור בשליש הראשון, העניק קנדה ואוסטרליה.

Acknowledgments

המחברים תודה חברי הצוות הבאה ומחקר סגל על תרומתם: מתיו Librach, ליילה בית, טניה א Baretto, שלומית קניגסברג ו אנדרה גותייה-פישר. עבודה זו נתמכה על ידי אונטריו מחקר קרן - מחקר (ORF-RE, עגול #7) ומצוינות ליצור תוכנית בע מ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation
Alpha-MEM Gibco 12571071 For HUCPVC and BMSC culture media.
PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibody Biolegend 313612 Integrin marker for FC
APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibody R&D Systems FAB7737A Connexin 43 marker for FC
FITC-conjugated HLA-A2 antibody Genway Biotech Inc. GWB-66FBD2 Immunogenicity marker for FC
FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibody Abcam ab7904 Immunogenicity marker for FC
FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibody AbD Serotec/Bio-Rad MCA2518F Cardiac marker for FC
APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody R&D Systems FAB3195A Human cell marker for FC and FACS
FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody R&D Systems FAB3195F Human cell marker for FC and FACS
Anti-connexin 43/GJA1 antibody Abcam ab11370 Cx43. For ICC
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 Life Technologies A-21428 For ICC
Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibody Abcam ab9465 aSARC. For ICC
Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 Life Technologies A-21426 For ICC
Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody New England BioLabs Ltd. 5030S For ICC
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 Life Technologies A-21206 For ICC
Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibody EMD Millipore MAB1281 For ICC
MZ9.5 Stereomicroscope Leica For imaging aggregates.
1.5 ml centrifuge microtubes Axygen MCT-150-C For staining MSCs with fluorescent dye.
ImageJ Open source image processing software.
Aria II  BD UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Bone marrow mesechymal stromal cells Lonza PT-2501 BMSCs
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030-100G BSA. To prepare solutions for ICC
BrdU EMD Millipore MAB3424 Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use.
Canto II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
cDNA EcoDry Premix Clontech/Takara 639570 For preparation of cDNA for qPCR
CellTracker Green CMFDA Dye Life Technologies C7025 Fluorescent imaging of cell cytoplasm
Countess automated cell counter Invitrogen Inc. C10227 For cell counting
DMEM-F12 Sigma-Aldrich D6421 For rat primary cardiomyocyte culture medium.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 10010023 D-PBS, without Ca2+, Mg2+
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope
FACSCalibur BD In-house. For flow cytometry.
Fetal bovine serum (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 FBS. Component of cell culture medium.
IDT Prime Time qPCR probes Integrated Data Technologies FAM fluorophore http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium ThermoScientific TA-030-FM For storage of cells to undergo ICC
LSR II  BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Normal goat serum Cell Signaling Technology 5425S NGS. Used in blocking solution for ICC
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells Thermo Scientific Nunc 155409 To prepare samples for ICC
OmniPur Triton X-100 Surfactant EMD Millipore 9410-OP As a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710 For fixing cells for ICC.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Component of cell culture medium.
Primers Sigma Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μmol CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Quorum Spinning Disk Confocal Zeiss SickKids Imaging Facility
ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytes ReproCell RCD001N Positive control for qPCR
RNeasy mini kit Qiagen 74106 To isolate RNA for qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit Qiagen 204074 For qPCR with master mix
RPMI 1640 Gibco A1049101 For MSC, monocyte coculture medium.
TaqMan qPCR primer assays Thermo Fisher Scientific 4444556 For qPCR
Trypan Blue Life Technologies T10282 Staining of cells for viability and counting
Trypsin Gibco 272500108 For cell dissociation
Volocity Perkin-Elmer Volocity 6.3 Imaging software
0.2 μm pore filter Thermo Fisher Scientific 566-0020 For sterilizing tissue culture media
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat heart. Can use any similar forceps.
Scissors Fine Science Tools 14059-11 For mincing rat heart. Curved scissors recommended.
50 mL tube BD Falcon 352070 For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
6-well plates Thermo Scientific Nunc CA73520-906 For tissue culture
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For aggregate formation
Axiovert 40C Microscope Zeiss For bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting
Triton X-100 EMD Millipore 9410-1L Used in permeabilization solution for ICC
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 Stain used during visualization of Cx43 localization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
  2. Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85 (4), 1373-1416 (2005).
  3. Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (18), 10344-10349 (2001).
  4. Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 525-532 (2004).
  5. Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9 (4), 767-778 (2003).
  6. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  8. Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19 (9), 1695-1703 (2011).
  9. Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262 (2), 206-224 (2003).
  10. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  11. Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33 (3), 161-166 (2000).
  12. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  13. Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24 (1), 11-20 (2015).
  14. Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37 (1), 481-482 (2005).
  15. Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (6), 1236-1245 (2012).
  16. van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 263-270 (2003).
  17. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  18. Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45 (2), 168-171 (2008).
  19. Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 1 Suppl 72-78 (2006).
  20. Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71 (3), 419-429 (2006).
  21. Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5 (1), 1 (2014).
  22. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18 (12), 1417-1426 (1995).
  23. Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767 (2015).
  24. Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 4 (2008).
  25. Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21 (12), 2189-2203 (2012).
  26. Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 19 Suppl 247-256 (1999).
  27. Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9 (5), 139-143 (1999).
  28. Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37 (12), 1291-1299 (2013).
  29. Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60 (3), 277-284 (2005).
  30. Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360 (1-2), 279-287 (2012).
  31. Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33 (2), 170-173 (2005).
  32. Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105 (1), 93-98 (2002).
  33. Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10 (2), 304-315 (2014).
  34. Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126 (1), 124-132 (2003).
  35. Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19 (16), 2597-2604 (2012).
  36. Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107 (9), 1247-1249 (2003).
  37. Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90 (6), 634-640 (2002).
  38. Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346 (1), 5-15 (2002).
  39. Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425 (6961), 968-973 (2003).
  40. Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10 (5), 494-501 (2004).
  41. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  42. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  43. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  44. Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340 (2), 639-647 (2006).
  45. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  46. Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107 (5), 926-932 (2009).
  47. Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22 (9), 1651-1666 (2013).
  48. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  49. Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30 (5), 876-887 (2012).
  50. Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113 (4), 816-826 (2009).
  51. Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252 (2016).
  52. Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90 (4), 452-461 (2005).
  53. Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19 (11), 1397-1412 (2010).
  54. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308 (22), 2369-2379 (2012).
  55. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122 (23), 2419-2429 (2010).
  56. Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 126 בידול הלב mesenchymal גזע תאים cardiomyocytes העיקרי תאים perivascular היווצרות צבירה קבלנות cardiomyocytes
<em>במבחנה</em> הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szaraz, P., Gratch, Y. S., Iqbal,More

Szaraz, P., Gratch, Y. S., Iqbal, F., Librach, C. L. In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells. J. Vis. Exp. (126), e55757, doi:10.3791/55757 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter