Summary
Hier presenteren we een methode voor het efficiënt benutten van het potentieel van de cardiale differentiatie van jonge bronnen van menselijke mesenchymale stamcellen om te genereren van functionele, aanbestedende, cardiomyocyte-achtige cellen in vitro.
Abstract
Myocardinfarct en de daaropvolgende ischemische cascade resulteren in de uitgebreide verlies van cardiomyocytes, wat leidt tot congestief hartfalen, de belangrijkste oorzaak van kindersterfte wereldwijd. Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn een veelbelovende optie voor cel-gebaseerde therapieën ter vervanging van de huidige, invasieve technieken. MSCs kunnen onderscheiden in mesenchymale lineages, met inbegrip van de soorten van de cardiale cellen, maar volledige differentiatie in functionele cellen nog niet is bereikt. Vorige methoden van differentiatie waren gebaseerd op farmacologische agenten of groeifactoren. Meer fysiologisch relevante strategieën kunnen echter ook MSCs cardiomyogenic transformatie ondergaan. Hier presenteren we een methode van de differentiatie met MSC aggregaten op cardiomyocyte feeder lagen cardiomyocyte-achtige aanbestedende cellen produceren.
Menselijke navelstreng gerelateerde cellen (HUCPVCs) is gebleken dat een grotere differentiatie potentiële dan vaak onderzocht MSC typen, zoals beenmerg MSCs (BMSCs). Als een ontogenetisch jongere bron onderzochten we de mogelijkheden van de cardiomyogenic van eerste-trimester (FTM) HUCPVCs in vergelijking met oudere bronnen. FTM HUCPVCs zijn een roman, rijke bron van MSCs die hun in utero immunoprivileged eigenschappen behouden wanneer gekweekt in vitro. Met behulp van dit protocol van de differentiatie, de FTM en de term bereikt HUCPVCs aanzienlijk verhoogde cardiomyogenic differentiatie ten opzichte van BMSCs, zoals aangegeven door de verhoogde expressie van cardiomyocyte markers (dat wil zeggen, myocyte versterker factor 2 C, cardiale troponine T, zware ketting cardiale myosin, signaal regelgevende proteïne α en connexin 43). Ze onderhouden ook aanzienlijk lager immunogeniciteit, zoals blijkt door hun lagere HLA-A expressie en hogere HLA-G expressie. Toepassing van differentiatie aggregaat gebaseerde, toonde FTM HUCPVCs verhoogde totale vorming potentiële en gegenereerde verdragsluitende cellen clusters binnen 1 week na co cultuur op cardiale feeder lagen, steeds de eerste MSC-type te doen.
Onze resultaten tonen aan dat deze strategie van de differentiatie effectief van het potentieel van de cardiomyogenic van jonge MSCs, zoals FTM HUCPVCs benutten kan, en dat in vitro pre differentiatie zou een mogelijke strategie suggereert te vergroten hun regeneratieve werkzaamheid in vivo.
Introduction
Congestief hartfalen (CHF) blijft bestaan als een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. CHF treedt vaak op na het massale verlies van cardiomyocytes en de ontwikkeling van cel-vrije littekenweefsel als gevolg van een myocardinfarct (MI)1pathologische. Terwijl het hart een gedeeltelijk zichzelf vernieuwende orgaan is, vermindert de resident stam en progenitor cel pool verantwoordelijk voor de uitvoering van weefselregeneratie aanzienlijk in overvloed en functie in leeftijd patiënten, vaak steeds onvoldoende voor optimaal herstel na blessure. Er is dus grote belangstelling bij de ontwikkeling van experimentele behandelingen waarbij de transplantatie van cellen van de gezonde donor in het beschadigde myocardium. Het is noodzakelijk dat de donor cellen niet alleen de structuur van het weefsel herstellen, maar ook het bereiken van het functionele herstel van de getroffen myocard.
De inheemse hart hart weefsel-ingezetene werkzaam en endogene afkomstig is van het beenmerg cellen van de stam voor na letsel herstellen2,3,4. Regeneratieve cellen-host - en donor-afgeleide gelijk moet hebben de capaciteit om het verkrijgen van de juiste fenotype en functie in de communicatie van de remodelleert myocard, samen met het vermogen om efficiënt en veilig de verloren cellen vervangen. In vitro differentiatie methoden hebben is gebruikt uitgebreid tot hoogrenderende, stamcel gebaseerde cardiomyocyte productie5,6. Het profiel van de expressie van cardiale lineage markers wordt gebruikt voor het definiëren van het proces van differentiatie van de stamcel naar de cardiale lineage7. Vroege differentiatie markers, zoals NKX2.5, myocyte versterker factor 2 C (Mef2c), en GATA48,9, kunnen een indicatie van de opening van het cardiomyogenic-proces. Volwassen cardiomyocyte markeringen gebruikte om differentiatie effectiviteit te beoordelen zijn signaal regelgevende proteïne α (SIRPA)10, cardiale troponine T (cTnT)11, zware ketting cardiale myosin (MYH6),8,,12,13en connexin 43 (Cx43)14,15,16. De methoden gebruiken van embryonale stamcellen (SER's) en pluripotente stamcellen (PSC's) zijn grondig geoptimaliseerd en besproken met betrekking tot de details van de inductieve factoren, zuurstof en voedingsstoffen verlopen, en de exacte timing van actie5,6,7,17,18. ESC - en PVC-gebaseerde technologieën presenteren echter nog steeds meerdere ethische en veiligheid zorgen, samen met suboptimaal elektrofysiologische en immunologische functies19,20. Hosts getransplanteerde met deze cellen vaak ervaren immunorejection en permanente immuunsuppressie vereisen. Dit is voornamelijk te wijten aan de grote histocompatibility complex (MHC) moleculen in de gastheer en de donor en de resulterende T-cel reactie21mismatching. Terwijl individuele MHC klasse I matching is een mogelijke oplossing, een toegankelijker klinische praktijk zou vereisen een cel bron die universeel immunoprivileged te overwinnen van de bezorgdheid van de afwijzing.
Als een bron van alternatieve cel voor gebruik in klinische toepassingen, MSCs en in het bijzonder, BMSCs, zijn onderzocht voor gebruik in weefselregeneratie sinds hun initiële beschrijving in 199522. MSCs worden verondersteld om ingezetene regeneratieve cellen die worden in bijna elke gevacuoliseerd weefsel23 gevonden kunnen. Bij isolatie van de gewenste bron, MSCs kunnen gemakkelijk worden uitgebreid in cultuur, hebben uitgebreide paracrine capaciteit, en vaak immunoprivileged of immunomodulerende eigenschappen24,25te bezitten. Hun veiligheid en de werkzaamheid hebben reeds te zien in verscheidene pre-klinische studies, met name voor cardiale regeneratie3,26.
Veel MSC differentiatie strategieën gebruik maken van farmacologische stoffen, zoals 5-azacytidine22 en DMSO27, en groei of morfogenisch factoren, zoals BMP's5,7,28,29 of angiotensine-II30, met variabele efficiëntie. Deze strategieën, zijn echter niet gebaseerd op de obstakels die een naïeve regeneratieve cel is waarschijnlijk tegenkomen na homing of wordt geleverd aan de site van letsel in vivo. Meer fysiologisch relevante strategieën, terwijl moeilijker te definiëren en manipuleren, zijn gebaseerd op de vooronderstelling dat MSC differentiatie kan worden opgewekt door middel van signalen uit het weefsel communicatie zelf. Eerdere studies hebben aangetoond dat de blootstelling aan de cardiale cel lysates31 of ventriculaire myocard32,33, of rechtstreeks contact met primaire cardiomyocytes in vitro15,34, kan de expressie van cardiale markers in MSCs verhogen. Anderen hebben aangetoond dat spontane cardiomyogenesis na behandeling van cardiale letsel met MSCs35,36,,37,38, hoewel gedeeltelijk, de fusie van BMSCs en cardiomyocytes39,40 het ontluikende myocardium gegenereerd. Om onze kennis, hebben functionele, spontaan aanbestedende cardiomyocytes van menselijke MSCs (hMSCs) van elke bron weefsel nog niet is gerapporteerd.
De huidige consensus is dat alle MSCs uit gerelateerde cellen23 voortvloeien. Young MSCs met pericyte eigenschappen kunnen worden geïsoleerd uit de regio gerelateerde van menselijke navelstreng weefsel41,42,43. In vergelijking met BMSCs bezitten HUCPVCs meer differentiatie potentiële en verschillende andere regeneratieve voordelen, zowel in vitro41,44 en in vivo45,46,47. Met name hebben de bron wordt de moeders-foetale interface, HUCPVCs aanzienlijk lager immunogeniciteit in vergelijking met volwassen bronnen van MSCs. Ons onderzoek richt zich op de karakterisering en de pre-klinische toepassingen van FTM HUCPVCs, de jongste bron van MSCs onderzocht, die wij hebben eerder getoond te zijn toegenomen proliferatieve en hogere multilineage differentiatie capaciteiten, met inbegrip van de cardiomyogenic afstamming41.
Hier presenteren we een protocol die totale vorming en primaire cardiale cel feeder lagen combineert zoals inductieve krachten te bereiken van de differentiatie van de volledige cardiomyogenic van MSCs. aggregaten leveren een 3D-omgeving, die beter voorwaarden in vivo in vergelijking met 2D aanhangend culturen modellen. Met behulp van cardiale feeder lagen biedt een omgeving die representatief is voor de site van de ultieme transplantatie voor de MSCs. We laten zien dat jongere bronnen van MSCs geïsoleerd van pre- of postnatale umbilical koorden een hogere capaciteit formulier aggregaten en hebben te bereiken van de cardiale fenotype in vergelijking met volwassen BMSCs, terwijl nog het handhaven van hun immuun-voorrecht. Naast de steile verhoging van markers van cardiale bloedlijn en de geïnduceerde expressie van intracellulaire (dat wil zeggen, cTnT en MYH6) en celoppervlak eiwitten (dat wil zeggen, SIRPA en Cx43) specifiek voor cardiomyocytes, we laten zien dat het potentieel van de differentiatie van FTM HUCPVCs met deze methode kan worden aangewend en dat zij aanleiding geven kunnen tot spontaan verdragsluitende cardiomyocyte-achtige cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De cardiale differentiatie van stamcellen is in ontwikkeling voor meer dan 2 decennia, met meerdere verschillende strategieën wordt gebruikt voor het genereren van cardiomyocyte-achtige cellen uit MSC bronnen. Veel van deze strategieën, echter zijn inefficiënt, en de voorwaarden gebruikt zijn vaak niet representatief voor het milieu getransplanteerde cellen ontmoeting in vivo.
In tegenstelling tot de bestaande methoden, het hier gepresenteerde protocol maakt gebruik van een combinatie van primaire cardiale feeder lagen en MSC statistische vorming. De primaire cardiale feeder lagen zorgen voor een differentiatie omgeving vergelijkbaar met die waarin de hMSCs worden blootgesteld aan na transplantatie. De aggregaten genereren een omgeving met zuurstof en voedingsstoffen hellingen, die een inductieve effect hebben kan op initiëren lineage inzet. PVC en ESC-gebaseerde cardiale differentiatie strategieën door middel van hypoxische conditionering en statistische vorming hebben dit inductieve effect op cellen van de stam5,52,53opgericht. Bovendien lijkt een 3D-structuur beter op de cel-naar-cel verbindingen die in vivo. Met behulp van deze methode, wij met succes geproduceerd synchroon aanbestedende hMSC aggregaten-de eerste keer die een hMSC type was in staat om dit te bereiken, om onze kennis. Nog belangrijker is, tentoongesteld alleen de jongste hMSC cel bron toegepast, FTM HUCPVCs, dit vermogen.
Een belangrijk voordeel van het gebruik van ofwel naïef of vooraf gedifferentieerde MSCs over sociaal-economische raden of PSC voor cardiale regeneratie ligt in hun immunomodulerende of immunoprivileged eigenschappen. Nochtans, zelfs in het geval van MSCs, immunomodulerende eigenschappen variëren met hun leeftijd en bron54. BMSCs hebben aangetoond dat hun immunogene eigenschappen na differentiatie, die vaak tot hun afwijzing na implantatie55 leidtwijzigen. Zoals hiervoor is beschreven, MSCs afkomstig uit de navelstreng oorsprong bezitten speciale immuun privilege56 als gevolg van hun oorsprong in utero . Met behulp van het protocol beschreven hierboven, zelfs nadat de differentiatie in de cardiomyocyte-achtige cellen, termijn en FTM HUCPVCs tentoongesteld hoge niveaus van HLA-G (die actief verzwakt de aangeboren immuunrespons) en lage niveaus van HLA-A (dat bepaalt dat t-cel gemedieerde cytotoxiciteit) gehandhaafd.
Dit protocol differentiatie heeft het voordeel van een gunstige waardoor meerdere niveaus van analyse. Ten eerste, de levende beeldvorming van functionele, aanbestedende aggregaten is meer haalbaar dan onderscheiden van afzonderlijke cellen geïntegreerd in een feeder-laag. Als het protocol maakt gebruik van gemengd-soorten co culturen, mens-specifieke primers worden toegepast op de qPCR analyse, terwijl FACS en ICC de snelle identificatie van fenotype-specifiek bieden, cardiale marker expressie (Figuur 2). Met het protocol zoals beschreven, werden verhoogde niveaus van SIRPA, cTnT, MYH6, aSarc, Mef2c en Cx43 ontdekt. In combinatie met HuNu is het mogelijk om te identificeren van de uitdrukking van Mef2c en aSarc in gedifferentieerde hMSCs en het te onderscheiden van de rat cardiomyocyte afkomstige feeder lagen gesmolten cellen. Terwijl de identificatie van aanbestedende aggregaten op de feeder laag relatief eenvoudig is, kan verzamelen of te oogsten hen een beperking vormen. Microscopen uitgerust met een micromanipulator kunnen worden ingezet om deze uitdaging. Als alternatief, menselijke cellen kunnen worden efficiënt gesorteerd uit co culturen met mens-specifieke anti-TRA-1-85 antilichamen. Terwijl de co culturen ook de uitdaging van potentiële celfusie vormen, kan dit ook worden overwonnen met behulp van een combinatie van nucleaire en celoppervlak menselijke marker traceurs (aanvullende figuur 1).
Een eventuele wijziging van onze differentiatie methode is om de vorming van aggregaten. Onze resultaten suggereren dat de totale omvang een kritieke parameter voor optimale differentiatie kan zijn. Ervan uitgaande dat aggregatie selectieve voor meer zelfklevende cellen, kan het fungeren als een pre-selectie stap voor CD49f-positieve hMSCs. Verbeterde MSC bol vorming is gekoppeld aan de toegenomen CD49f expressie49en CD49f wordt ook geassocieerd met hogere stemness omdat het rechtstreeks met SOX2 en OCT449 verbonden is. We waargenomen lagere aantallen CD49f-positieve cellen in oudere bronnen van hMSCs ten opzichte van FTM HUCPVCs, die de verminderde totale omvang waargenomen verklaren kon. We theoretiseren dat deze selectie kan worden gecompenseerd door het verhogen van het aantal hMSCs per aggregaat tot een hogere totale omvang, waardoor de efficiëntie van aggregatie-geïnduceerde differentiatie mogelijk.
Toekomstige toepassingen wellicht wijzigingen in het protocol ook. Het is noodzakelijk dat de klinische toepassingen van vooraf gedifferentieerde hMSCs in xeno-vrij voorwaarden plaatsvinden. De aanbestedende aggregaten geproduceerd met behulp van dit protocol kunnen ook worden gebruikt voor de creatie van gemanipuleerde hart spierweefsels. Voor de productie van een klinisch toepasselijke product, is een cGMP-compatibele workflow noodzakelijk. Terwijl kweekmedium xeno-gratis beschikbaar voor hMSCs is, kan het verstrekken van een dier-vrije feeder laag lastig zijn. Echter, het toepassen van vooraf gedifferentieerde feeder lagen van andere bronnen van de cel van de stam, zoals iPSCs, is een mogelijke oplossing.
Kortom, kan de differentiatie beschreven methode worden toegepast voor de productie van functionele cardiomyocyte-achtige cellen uit jonge bronnen van hMSCs in een handige en reproduceerbare manier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Clifford L. Librach is medehouder van het octrooi: methoden van isolatie en het gebruik van cellen die zijn afgeleid van de eerste trimester navelstreng weefsel, verleend in Canada en Australië.
Acknowledgments
De auteurs danken de volgende personeelsleden en onderzoek personeel voor hun bijdragen: Matthew Librach, Leila Maghen Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg en Andrée Gauthier-Fisher. Dit werk werd gesteund door de The Ontario Fonds voor onderzoek inzake - Research Excellence (ORF-RE, ronde #7) en maken programma Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation |
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For HUCPVC and BMSC culture media. |
| PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibody | Biolegend | 313612 | Integrin marker for FC |
| APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibody | R&D Systems | FAB7737A | Connexin 43 marker for FC |
| FITC-conjugated HLA-A2 antibody | Genway Biotech Inc. | GWB-66FBD2 | Immunogenicity marker for FC |
| FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibody | Abcam | ab7904 | Immunogenicity marker for FC |
| FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibody | AbD Serotec/Bio-Rad | MCA2518F | Cardiac marker for FC |
| APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195A | Human cell marker for FC and FACS |
| FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195F | Human cell marker for FC and FACS |
| Anti-connexin 43/GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Cx43. For ICC |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21428 | For ICC |
| Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibody | Abcam | ab9465 | aSARC. For ICC |
| Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21426 | For ICC |
| Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody | New England BioLabs Ltd. | 5030S | For ICC |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-21206 | For ICC |
| Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibody | EMD Millipore | MAB1281 | For ICC |
| MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | For imaging aggregates. | |
| 1.5 ml centrifuge microtubes | Axygen | MCT-150-C | For staining MSCs with fluorescent dye. |
| ImageJ | Open source image processing software. | ||
| Aria II | BD | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Bone marrow mesechymal stromal cells | Lonza | PT-2501 | BMSCs |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030-100G | BSA. To prepare solutions for ICC |
| BrdU | EMD Millipore | MAB3424 | Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use. |
| Canto II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| cDNA EcoDry Premix | Clontech/Takara | 639570 | For preparation of cDNA for qPCR |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies | C7025 | Fluorescent imaging of cell cytoplasm |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | For cell counting |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | D6421 | For rat primary cardiomyocyte culture medium. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010023 | D-PBS, without Ca2+, Mg2+ |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope | |
| FACSCalibur | BD | In-house. For flow cytometry. | |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | FBS. Component of cell culture medium. |
| IDT Prime Time qPCR probes | Integrated Data Technologies | FAM fluorophore | http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers |
| Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium | ThermoScientific | TA-030-FM | For storage of cells to undergo ICC |
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Normal goat serum | Cell Signaling Technology | 5425S | NGS. Used in blocking solution for ICC |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells | Thermo Scientific Nunc | 155409 | To prepare samples for ICC |
| OmniPur Triton X-100 Surfactant | EMD Millipore | 9410-OP | As a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For fixing cells for ICC. |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Component of cell culture medium. |
| Primers | Sigma | Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μmol | CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G |
| Quorum Spinning Disk Confocal | Zeiss | SickKids Imaging Facility | |
| ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytes | ReproCell | RCD001N | Positive control for qPCR |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | To isolate RNA for qPCR |
| Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | For qPCR with master mix |
| RPMI 1640 | Gibco | A1049101 | For MSC, monocyte coculture medium. |
| TaqMan qPCR primer assays | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | For qPCR |
| Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | Staining of cells for viability and counting |
| Trypsin | Gibco | 272500108 | For cell dissociation |
| Volocity | Perkin-Elmer | Volocity 6.3 | Imaging software |
| 0.2 μm pore filter | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | For sterilizing tissue culture media |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat heart. Can use any similar forceps. |
| Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For mincing rat heart. Curved scissors recommended. |
| 50 mL tube | BD Falcon | 352070 | For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 6-well plates | Thermo Scientific Nunc | CA73520-906 | For tissue culture |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For aggregate formation |
| Axiovert 40C Microscope | Zeiss | For bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol | |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
| Triton X-100 | EMD Millipore | 9410-1L | Used in permeabilization solution for ICC |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain used during visualization of Cx43 localization |
References
- Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85 (4), 1373-1416 (2005).
- Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (18), 10344-10349 (2001).
- Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 525-532 (2004).
- Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9 (4), 767-778 (2003).
- Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91 (3), 189-201 (2002).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19 (9), 1695-1703 (2011).
- Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262 (2), 206-224 (2003).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
- Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33 (3), 161-166 (2000).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24 (1), 11-20 (2015).
- Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37 (1), 481-482 (2005).
- Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (6), 1236-1245 (2012).
- van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 263-270 (2003).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
- Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45 (2), 168-171 (2008).
- Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 1 Suppl 72-78 (2006).
- Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71 (3), 419-429 (2006).
- Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5 (1), 1 (2014).
- Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18 (12), 1417-1426 (1995).
- Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767 (2015).
- Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 4 (2008).
- Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21 (12), 2189-2203 (2012).
- Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 19 Suppl 247-256 (1999).
- Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9 (5), 139-143 (1999).
- Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37 (12), 1291-1299 (2013).
- Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60 (3), 277-284 (2005).
- Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360 (1-2), 279-287 (2012).
- Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33 (2), 170-173 (2005).
- Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105 (1), 93-98 (2002).
- Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10 (2), 304-315 (2014).
- Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126 (1), 124-132 (2003).
- Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19 (16), 2597-2604 (2012).
- Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107 (9), 1247-1249 (2003).
- Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90 (6), 634-640 (2002).
- Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346 (1), 5-15 (2002).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425 (6961), 968-973 (2003).
- Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10 (5), 494-501 (2004).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340 (2), 639-647 (2006).
- Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
- Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107 (5), 926-932 (2009).
- Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22 (9), 1651-1666 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30 (5), 876-887 (2012).
- Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113 (4), 816-826 (2009).
- Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252 (2016).
- Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90 (4), 452-461 (2005).
- Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19 (11), 1397-1412 (2010).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308 (22), 2369-2379 (2012).
- Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122 (23), 2419-2429 (2010).
- Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
