Summary
Hier präsentieren wir eine Methode, um effizient die kardialen Differenzierung junge Quellen humaner mesenchymaler Stammzellen um funktionelle, Auftraggeber, Cardiomyocyte-wie Zellen erzeugen Potenzial in-vitro-.
Abstract
Myokardinfarkt und der anschließenden ischämischen Kaskade führen zu den umfangreichen Verlust von Kardiomyozyten, führt zu Herzinsuffizienz, die führende Todesursache weltweit. Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) sind eine vielversprechende Option für zellbasierte Therapien, aktuelle, invasive Techniken zu ersetzen. MSCs mesenchymalen Abstammungen, kardiale Zelltypen, einschließlich differenzieren können, aber vollständige Differenzierung in funktionellen Zellen noch nicht erreicht. Bisherige Methoden der Differenzierung beruhten auf pharmakologische Wirkstoffe oder Wachstumsfaktoren. Mehr physiologisch relevante Strategien ermöglichen jedoch auch MSCs Cardiomyogenic Transformation unterziehen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Differenzierung-Methode mit MSC Aggregate auf Cardiomyocyte Feeder Schichten, um Cardiomyocyte-wie auftraggebende Zellen zu produzieren.
Menschlichen Nabelschnur perivaskuläre Zellen (HUCPVCs) haben gezeigt, dass eine größere Differenzierung als potenzielle haben häufig untersucht MSC-Typen, z. B. Knochenmark MSCs (BMSCs). Als ontogenetisch jüngere Quelle untersuchten wir das Cardiomyogenic Potential des Ersttrimester-(FTM) HUCPVCs im Vergleich zu älteren Quellen. FTM HUCPVCs sind eine neuartige, reiche Quelle von MSCs, die ihre in Utero Immunabwehr Eigenschaften beim kultivierten behalten in Vitro. Mit dieser Differenzierung Protokoll, FTM und Begriff erreicht HUCPVCs deutlich erhöhte Cardiomyogenic Differenzierung im Vergleich zu BMSCs, wie durch die erhöhte Expression von Cardiomyocyte Marker (d. h. Myozyten Enhancer Faktor 2 C, kardiale Troponin T schwere Kette kardialen Myosin, Signal regulatorischen Protein α und Connexin 43) angegeben. Sie behielten auch deutlich geringer Immunogenität, wie durch ihren niedrigeren HLA-A Ausdruck und höheren Ausdruck von HLA-G. Aggregat-basierte Differenzierung anwenden, zeigte FTM HUCPVCs erhöhte Aggregatbildung Potenzial und generierten contracting Zellen Cluster innerhalb 1 Woche nach Kokultur auf kardiale Feeder Schichten, immer die erste MSC-Art, dies zu tun.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass diese Differenzierungsstrategie effektiv das Cardiomyogenic Potential des jungen MSCs wie FTM HUCPVCs nutzen kann und deutet darauf hin, dass in-vitro- Pre-Differenzierung könnte eine mögliche Strategie, um ihre regenerativen Wirksamkeit in Vivozu erhöhen.
Introduction
Herzinsuffizienz (CHF) bleibt als eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. CHF tritt häufig nach den massiven Verlust von Kardiomyozyten und die Entwicklung der zellfreien Narbengewebe als pathologische Ergebnis ein Myokardinfarkt (MI)1. Während das Herz ein teilweise selbst erneuernde Organ ist, verringert sich residente Stamm- und Vorläuferzellen Zelle Pool verantwortlich für die Regeneration des Gewebes deutlich Ausführung in Hülle und Fülle und Funktion bei gealterten Patienten oft nicht ausreichend für optimale Erholung nach einer Verletzung zu. So gibt es großes Interesse an der Entwicklung von experimentellen Behandlungen, bei denen die Transplantation von gesunden Spenderzellen in den Geschädigten Myokard. Es ist zwingend notwendig, dass die Spenderzellen nicht nur die Struktur des Gewebes wiederherzustellen, sondern auch die funktionelle Wiederherstellung der betroffenen Myokard.
Die native Herz beschäftigt Herz Gewebe-Resident und endogenen Knochenmark stammen Stammzellen zur posttraumatischen reparieren2,3,4. Regenerative Zellen-Host und Spender abgeleitet gleichermaßen muss haben die Fähigkeit, die entsprechenden Phänotyp und Funktion in der Mikroumgebung umgestaltet Myokard, sowie die Fähigkeit, effizient und sicher die verlorenen Zellen ersetzen zu erhalten. In Vitro Differenzierung Methoden sind weitgehend benutzt, um eine hocheffiziente, stammzellbasierte Cardiomyocyte Produktion5,6zu erreichen. Expressionsprofil kardiale Linie Marker wird verwendet, um den Prozess der Stammzell-Differenzierung in der kardialen Linie7Richtung zu definieren. Frühe Differenzierung Marker wie NKX2.5, Myozyten Enhancer Faktor 2 C (Mef2c) und GATA48,9, kann einen Hinweis über die Einleitung des Cardiomyogenic Prozesses. Reife Cardiomyocyte Marker häufig verwendet, um Differenzierung Wirksamkeit zu beurteilen sind Signal regulatorischen Protein α (SIRPA)10, kardiale Troponin T (cTnT)11, schwere Kette kardialen Myosin (MYH6)8,12,13und Connexin 43 (Cx43)14,15,16. Die Methoden, die Verwendung von embryonalen Stammzellen (WSR) und pluripotenten Stammzellen (EAP) wurden sorgfältig optimiert und diskutiert über die Details der induktive Faktoren, Sauerstoff und Nährstoff Steigungen und der genaue Zeitpunkt der Aktion5,6,7,17,18. Dennoch präsentieren ESC und PSC-basierten Technologien noch mehrere Sicherheit und ethische Bedenken zusammen mit suboptimalen elektrophysiologische und immunologischen Funktionen19,20. Gastgeber, die oft mit diesen Zellen transplantiert erleben Immunorejection und erfordern ständige Immunsuppression. Dies ist vor allem auf großen Histocompatibility Komplexes (MHC) Moleküle in dem Host und dem Spender und der daraus resultierenden T-Zell Antwort21Fehlanpassungen. Während einzelne MHC Klasse I matching ist eine mögliche Lösung, eine zugänglichere klinische Praxis würde benötigen eine Zelle, die allgemein die Immunabwehr, die Sorge der Ablehnung zu überwinden ist.
Als alternative Zelle Quelle für den Einsatz in der klinischen Anwendung, MSCs und insbesondere BMSCs, wurden für den Einsatz in Geweberegeneration seit ihrer Erstbeschreibung im Jahr 199522untersucht. MSCs werden geglaubt, um Wohnsitz regenerativen Zellen, die in nahezu jedem vaskularisierte Gewebe23gesucht werden kann. Bei der Isolierung von der gewünschten Quelle MSCs können leicht erweitert werden, in der Kultur, haben umfangreiche parakrine Kapazität und oft besitzen Immunabwehr oder immunmodulatorische Eigenschaften24,25. Ihre Sicherheit und Wirksamkeit wurden bereits in mehreren präklinischen Studien, insbesondere zur kardialen Regeneration3,26gezeigt.
Viele MSC Differenzierungsstrategien nutzen pharmakologische Wirkstoffe, wie z. B. 5-Azacytidine22 und DMSO27, und Wachstum oder morphogenetische Faktoren wie BMPs5,7,28,29 oder Angiotensin-II30, mit Variablen Wirkungsgrad. Diese Strategien basieren jedoch nicht auf die Hindernisse, die eine naiven regenerative Zelle nach Homing oder an der Stelle der Verletzung auftreten dürfte in-vivo. Mehr physiologisch relevante Strategien zwar schwieriger zu definieren und zu manipulieren, basieren auf der Prämisse, dass MSC Differenzierung durch Signale aus dem Gewebe Mikroumgebung selbst induziert werden kann. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Exposition gegenüber der Herzmuskelzellen Lysates31 oder Linksventrikuläres Myokard32,33, oder direkt Kontakt mit primären Kardiomyozyten in-vitro-15,34, den Ausdruck der kardialen Marker im MSCs erhöhen kann. Andere zeigten spontane Cardiomyogenesis nach Behandlung von kardialen Verletzungen mit MSCs35,36,37,38, zwar einerseits die Verschmelzung von BMSCs und Herzzellen39,40 der im Entstehen begriffenen Myokard generiert. Nach unserem Kenntnisstand haben funktionelle, spontan Auftraggeber Herzzellen von menschlichen MSCs (hMSCs) von einer beliebigen Quelle Gewebe noch nicht gemeldet.
Der aktuelle Konsens ist, dass alle MSCs aus perivaskuläre Zellen23entstehen. Young-MSCs mit Pericyte Eigenschaften können aus der perivaskuläre Region der menschlichen Nabelschnur Gewebe41,42,43isoliert werden. Im Vergleich zu BMSCs besitzen HUCPVCs erhöhte Differenzierungspotenzial und einige andere regenerative Vorteile, sowohl in-vitro-41,44 und in Vivo45,46,47. Insbesondere habe die Quelle als mütterlich fötalen Schnittstelle, HUCPVCs deutlich geringer im Vergleich zu Erwachsenen Quellen von MSCs Immunogenität. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Charakterisierung und prä-klinischen Anwendungen von FTM HUCPVCs, die jüngste Quelle der MSCs untersucht, die wir zuvor gezeigt haben, proliferative und höhere Multilineage gestiegen Differenzierung Kapazitäten, namentlich auf der Cardiomyogenic Linie41.
Hier präsentieren wir eine Protokoll, die Aggregatbildung und primäre kardiale Zellschichten Feeder verbindet wie induktive Kräfte, die komplette Cardiomyogenic Differenzierung von MSCs. Aggregate zu erreichen eine 3D Umgebung bieten die besseren Bedingungen in Vivo im Vergleich zu 2D anhaftende Kulturen Modelle. Verwendung von kardialen Feeder Schichten bietet eine Umgebung, die repräsentativ für die ultimative Transplantation-Website für die MSCs ist. Wir zeigen, dass jüngere Quellen von MSCs isoliert vor oder nach der Geburt die Nabelschnur eine höhere Kapazität, Form Aggregate und den kardialen Phänotyp im Vergleich zu Erwachsenen BMSCs haben, unter Beibehaltung ihrer immun-Privileg zu erreichen. Neben der steilen Höhe des kardialen Linie Marker-Gene und die induzierte Expression von intrazellulären (d. h. cTnT und MYH6) und Zelle-Oberfläche Proteine (z.B. SIRPA und Cx43) speziell für Kardiomyozyten, wir zeigen, dass die Differenzierung Potenzial von FTM HUCPVCs kann, mit dieser Methode genutzt werden und sie spontan Infizierung Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen hervorrufen können.
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Discussion
Die kardialen Differenzierung von Stammzellen wird mit mehreren unterschiedlichen Strategien genutzt, um Cardiomyocyte-wie Zellen aus MSC Quellen erzeugen seit über 2 Jahrzehnten entwickelt. Viele dieser Strategien sind jedoch ineffizient und die Bedingungen sind oft nicht repräsentativ für die Umwelt transplantierten Zellen Begegnung in Vivo.
Im Gegensatz zu bestehenden Verfahren nutzt das Protokoll hier vorgestellten eine Kombination von primären kardiale Feeder Schichten und MSC Aggregatbildung. Die primäre kardiale Feeder Schichten bieten eine Differenzierung Umgebung ähnelt dem der hMSCs nach Transplantation ausgesetzt sind. Die Aggregate erzeugen eine Umgebung mit Sauerstoff und Nährstoff-Gradienten, die induktive auf Linie Engagement initiieren auswirken können. PSC und ESC-basierten kardiale Differenzierungsstrategien mit hypoxischen Vorkonditionierung und Aggregatbildung haben diese induktive Wirkung auf Stammzellen5,52,53etabliert. Darüber hinaus gleicht eine 3D-Struktur besser die Zell-Zell-Verbindungen zur Verfügung gestellt in Vivo. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich produziert synchron Auftraggeber Stammzellenreserve Aggregate-das erste Mal war eine Art Stammzellenreserve in der Lage, dies zu erreichen, um unser Wissen. Nur die jüngste Stammzellenreserve Zelle Quelle angewendet, FTM HUCPVCs ausgestellt wichtig ist, diese Fähigkeit.
Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung von entweder naiv oder bereits differenzierte MSCs über WSR oder EAP zur kardialen Regeneration liegt in ihrer immunmodulatorischen oder Immunabwehr Eigenschaften. Immunmodulatorische Eigenschaften variieren jedoch auch im Falle von MSCs, mit ihrem Alter und Quelle54. BMSCs haben gezeigt, dass ihre Post-Differenzierung von immunogenen Eigenschaften ändern führt oft zu ihrer Ablehnung nach Implantation55. Wie zuvor beschrieben, MSCs aus der Nabelschnur Herkunft besitzen immun Sonderberechtigung56 aufgrund ihrer Herkunft in Utero . Mit dem Protokoll beschriebenen, auch nach der Differenzierung in Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen, Laufzeit und FTM HUCPVCs hohes Maß an HLA-G ausgestellt (das aktiv der angeborenen Immunantwort schwächt) und niedrigen Niveau von HLA-A (, der bestimmt, dass T-Zell vermittelten Zytotoxizität) gepflegt.
Diese Differenzierung Protokoll hat den Vorteil bequem für mehrere Ebenen der Analyse. Erstens ist die live Darstellung der funktionalen, contracting Aggregate eher möglich als Unterscheidung einzelne Zellen in einem Feeder-Layer integriert. Da das Protokoll gemischt-Arten Ko-Kulturen nutzt, Mensch-spezifische Primer gelten für qPCR Analyse, während FACS und ICC sorgen für die schnelle Identifizierung des Phänotyps-insbesondere kardialen Marker Ausdruck (Abbildung 2). Verwenden das Protokoll, wie beschrieben, wurden erhöhte Konzentrationen von SIRPA, cTnT, MYH6, aSarc, Mef2c und Cx43 erkannt. In Verbindung mit HuNu ist es möglich, den Ausdruck von Mef2c und aSarc in differenzierten hMSCs zu erkennen und zu unterscheiden, die Ratte Cardiomyocyte stammenden Anleger Schichten oder verschmolzenen Zellen. Während die Identifizierung der Vertragspartei Aggregate auf dem Zubringer-Layer relativ einfach ist, kann sammeln oder Arbeit mit der Ernte eine Einschränkung darstellen. Mikroskope mit einem Mikromanipulator ausgestattet können eingesetzt werden, um diese Herausforderung zu bewältigen. Alternativ können menschliche Zellen effizient von Ko-Kulturen mit Mensch-spezifische Anti-TRA-1-85 Antikörpern sortiert werden. Während der Ko-Kulturen auch die Herausforderung der potenziellen Zellfusion präsentieren, kann dies auch mit einer Kombination aus nuklearen und Zelloberfläche menschlichen Marker Tracer (ergänzende Abbildung1) überwunden werden.
Eine mögliche Änderung unserer Differenzierung-Methode ist die Anpassung der Bildung von Aggregaten. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass aggregierte Größe ein kritischer Parameter für eine optimale Differenzierung sein kann. Unter der Annahme, dass Aggregation für mehr Klebstoff Zellen selektiv ist, kann es als Vorauswahl Schritt für CD49f-Positive hMSCs zu handeln. Verbesserte MSC Bereich Bildung erhöht CD49f Ausdruck49verknüpft wurde, und CD49f ist auch mit höheren Stemness verbunden, da es direkt mit SOX2 und OCT449verbunden ist. Wir beobachteten niedrigere Zahlen CD49f-positiven Zellen in den älteren Quellen der hMSCs im Vergleich zu FTM HUCPVCs, was, die verminderte aggregierte Größe beobachtet erklären könnte. Wir vermuten, dass diese Auswahl kompensiert werden kann, durch die Erhöhung der Anzahl der hMSCs pro Aggregat eine höhere aggregierte Größe erreichen somit möglicherweise erhöht die Effizienz der Aggregation-induzierte Differenzierung.
Zukünftige Anwendungen erfordern Änderungen des Protokolls sowie. Es ist unerlässlich, dass klinische Anwendungen der Pre-differenzierte hMSCs in Xeno-freien Bedingungen stattfinden. Die Vertragschließenden Aggregate produziert unter Verwendung dieses Protokolls könnte auch für die Erstellung von technischen Herz Muskelgewebe verwendet werden. Um ein klinisch einsetzbaren Produkt zu produzieren, ist ein cGMP-konforme Workflow erforderlich. Während Xeno-freien Kulturmedium für hMSCs verfügbar ist, könnte es schwierig sein, bietet eine tierversuchsfreie Feeder-Schicht. Pre-differenzierte Feeder Schichten Stammzell-Quellen, wie z. B. iPSCs, ist jedoch eine mögliche Lösung.
Zusammenfassend kann die beschriebene Differenzierung-Methode angewendet werden, um funktionelle Cardiomyocyte-wie Zellen aus jungen hMSCs in einer bequemen und reproduzierbaren Weise zu produzieren.
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Disclosures
Dr. Clifford L. Librach ist Mitinhaber des Patents: Methoden der Isolation und der Verwendung von Zellen aus ersten Trimester Nabelschnur Gewebe, in Kanada und Australien gewährt.
Acknowledgments
Die Autoren danken den folgenden Mitarbeiter und Forschung Personal für ihre Beiträge: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg und Andrée Gauthier-Fisher. Diese Arbeit wurde von der Ontario Research Fund - Research Excellence (ORF-RE, Runde #7) und erstellen Programm Inc. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation |
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For HUCPVC and BMSC culture media. |
| PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibody | Biolegend | 313612 | Integrin marker for FC |
| APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibody | R&D Systems | FAB7737A | Connexin 43 marker for FC |
| FITC-conjugated HLA-A2 antibody | Genway Biotech Inc. | GWB-66FBD2 | Immunogenicity marker for FC |
| FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibody | Abcam | ab7904 | Immunogenicity marker for FC |
| FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibody | AbD Serotec/Bio-Rad | MCA2518F | Cardiac marker for FC |
| APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195A | Human cell marker for FC and FACS |
| FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195F | Human cell marker for FC and FACS |
| Anti-connexin 43/GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Cx43. For ICC |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21428 | For ICC |
| Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibody | Abcam | ab9465 | aSARC. For ICC |
| Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21426 | For ICC |
| Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody | New England BioLabs Ltd. | 5030S | For ICC |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-21206 | For ICC |
| Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibody | EMD Millipore | MAB1281 | For ICC |
| MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | For imaging aggregates. | |
| 1.5 ml centrifuge microtubes | Axygen | MCT-150-C | For staining MSCs with fluorescent dye. |
| ImageJ | Open source image processing software. | ||
| Aria II | BD | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Bone marrow mesechymal stromal cells | Lonza | PT-2501 | BMSCs |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030-100G | BSA. To prepare solutions for ICC |
| BrdU | EMD Millipore | MAB3424 | Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use. |
| Canto II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| cDNA EcoDry Premix | Clontech/Takara | 639570 | For preparation of cDNA for qPCR |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies | C7025 | Fluorescent imaging of cell cytoplasm |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | For cell counting |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | D6421 | For rat primary cardiomyocyte culture medium. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010023 | D-PBS, without Ca2+, Mg2+ |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope | |
| FACSCalibur | BD | In-house. For flow cytometry. | |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | FBS. Component of cell culture medium. |
| IDT Prime Time qPCR probes | Integrated Data Technologies | FAM fluorophore | http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers |
| Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium | ThermoScientific | TA-030-FM | For storage of cells to undergo ICC |
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Normal goat serum | Cell Signaling Technology | 5425S | NGS. Used in blocking solution for ICC |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells | Thermo Scientific Nunc | 155409 | To prepare samples for ICC |
| OmniPur Triton X-100 Surfactant | EMD Millipore | 9410-OP | As a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For fixing cells for ICC. |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Component of cell culture medium. |
| Primers | Sigma | Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μmol | CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G |
| Quorum Spinning Disk Confocal | Zeiss | SickKids Imaging Facility | |
| ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytes | ReproCell | RCD001N | Positive control for qPCR |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | To isolate RNA for qPCR |
| Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | For qPCR with master mix |
| RPMI 1640 | Gibco | A1049101 | For MSC, monocyte coculture medium. |
| TaqMan qPCR primer assays | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | For qPCR |
| Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | Staining of cells for viability and counting |
| Trypsin | Gibco | 272500108 | For cell dissociation |
| Volocity | Perkin-Elmer | Volocity 6.3 | Imaging software |
| 0.2 μm pore filter | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | For sterilizing tissue culture media |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat heart. Can use any similar forceps. |
| Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For mincing rat heart. Curved scissors recommended. |
| 50 mL tube | BD Falcon | 352070 | For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 6-well plates | Thermo Scientific Nunc | CA73520-906 | For tissue culture |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For aggregate formation |
| Axiovert 40C Microscope | Zeiss | For bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol | |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
| Triton X-100 | EMD Millipore | 9410-1L | Used in permeabilization solution for ICC |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain used during visualization of Cx43 localization |
References
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