Summary
Qui, presentiamo un metodo per sfruttare in modo efficiente il potenziale di differenziazione cardiache di giovane fonti di cellule staminali mesenchimali umane al fine di generare cellule funzionali, contraenti, del cardiomyocyte-come in vitro.
Abstract
Infarto miocardico e la successiva cascata ischemica causare la vasta perdita di cardiomiociti, che porta a insufficienza cardiaca congestizia, la principale causa di mortalità in tutto il mondo. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono un'opzione di promessa per le terapie basate sulle cellule sostituire tecniche attuali, invasive. MSCs possono differenziare in lignaggi mesenchymal, inclusi i tipi di cellule cardiache, ma completa differenziazione in cellule funzionali non è ancora stato raggiunto. Metodi precedenti di differenziazione sono stati basati su agenti farmacologici o fattori di crescita. Tuttavia, le strategie più fisiologicamente pertinenti anche possono abilitare MSCs per subire la trasformazione cardiomiogenici. Qui, presentiamo un metodo di differenziazione utilizzando MSC aggregati sugli strati dell'alimentatore del cardiomyocyte per produrre del cardiomyocyte-come le cellule contraenti.
Cellule perivascolari del cordone ombelicale umano (HUCPVCs) sono state indicate per avere una maggiore differenziazione potenziale più comunemente studiato tipi di MSC, quali midollo osseo (BMSC) MSCs. Come fonte di ontogeneticamente più giovane, abbiamo studiato il potenziale di cardiomiogenici di HUCPVCs di primo-acetonide (FTM) rispetto alle più vecchie fonti. HUCPVCs FTM sono una romanzo, ricca fonte di MSCs che mantengono la loro nell'utero nuova proprietà una volta coltivate in vitro. Utilizzando questo protocollo di differenziazione, FTM e termine HUCPVCs raggiunto cardiomiogenici significativamente maggiore differenziazione rispetto alle BMSCs, come indicato da aumentata espressione di marcatori dei cardiomiociti (cioè, il fattore di rinforzatore del miocita 2C, troponina cardiaca T, miosina cardiaca catena pesante, segnale proteina regolatrice α e connexin 43). Mantennero anche significativamente più bassa immunogenicità, come dimostrato dalla loro espressione di HLA-A più bassa e più alta espressione di HLA-G. L'applicazione basata su aggregazione differenziazione, FTM HUCPVCs ha mostrato formazione aumentata aggregata potenziale e generato contraenti cluster di cellule entro 1 settimana di co-coltura su livelli cardiaci alimentatore, diventando il primo tipo MSC a farlo.
I nostri risultati dimostrano che questa strategia di differenziazione può sfruttare efficacemente il potenziale cardiomiogenici di giovani cellule staminali mesenchimali, quali HUCPVCs FTM e suggerisce che in vitro pre-differenziazione potrebbe essere una strategia potenziale per aumentare la loro efficacia rigenerativa in vivo.
Introduction
Insufficienza cardiaca congestizia (CHF) persiste come delle cause principali di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Il CHF accade spesso seguendo la perdita massiccia di cardiomiociti e lo sviluppo del tessuto di cicatrice senza cellula come risultato patologico di un infarto miocardico (MI)1. Mentre il cuore è un organo parzialmente autorinnovabile, piscina di cella residente, staminali e progenitrici, responsabile per l'esecuzione di rigenerazione tissutale significativamente diminuisce in abbondanza e la funzione in pazienti invecchiati, diventando spesso insufficiente per un recupero ottimale dopo la ferita. Così, c'è grande interesse nello sviluppo di trattamenti sperimentali che coinvolgono il trapianto delle cellule del donatore sano nel miocardio danneggiato. È imperativo che le cellule del donatore non solo ripristino la struttura del tessuto, ma anche realizzare il recupero funzionale del miocardio interessato.
Cuore natale impiega cuore tessuto residenti e cellule staminali endogene del midollo osseo-originario di alberino-ferita riparazione2,3,4. Donatore-derivati rigenerativa e di cellule-host allo stesso modo, deve avere la capacità di ottenere il fenotipo appropriato e funzione nel microambiente del miocardio che ritocco, insieme alla capacità di efficienza e sicurezza sostituire le cellule perse. Metodi di differenziazione in vitro sono stati ampiamente utilizzati per realizzare dei cardiomiociti ad alta efficienza, basati su cellule staminali produzione5,6. Il profilo di espressione di marcatori di linea cardiaca viene utilizzato per definire il processo di differenziazione delle cellule staminali verso la linea cardiaca7. Marcatori di precoce differenziazione, quali NKX 2.5, fattore di rinforzatore del miocita 2C (Mef2c) e GATA48,9, può essere un'indicazione dell'inizio del processo di cardiomiogenici. Marcatori del cardiomyocyte maturo comunemente usati per valutare l'efficacia di differenziazione sono segnale proteina regolatrice α (SIRPA)10, troponina cardiaca T (cTnT)11, catena pesante della miosina cardiaca (MYH6)8,12,13e connessina 43 (Cx43)14,15,16. I metodi di utilizzo di cellule staminali embrionali (ESCs) e cellule staminali pluripotenti (PSC) sono stati accuratamente ottimizzati e discussi per quanto riguarda i dettagli di fattori induttivi, ossigeno e nutrienti gradienti e l'esatta tempistica di azione5,6,7,17,18. Ciò nonostante, tecnologie basate su ESC e PSC presentano ancora più preoccupazioni etiche e sicurezza, insieme non ottimali caratteristiche elettrofisiologiche ed immunologiche19,20. Padroni di casa trapiantati con queste cellule spesso esperienza immunorejection e richiedono l'immunosoppressione permanente. Ciò è dovuto principalmente molecole di istocompatibilità (MHC) complesse nell'ospite ed il donatore e il risultante della T-cellula risposta21di disadattamento. Mentre singoli MHC di classe I di corrispondenza è una possibile soluzione, una pratica clinica più accessibile richiederebbe una fonte di cellule che universalmente è nuova per superare la preoccupazione del rifiuto.
Come fonte alternativa cellulare per l'uso in applicazioni cliniche, MSCs e in particolare, BMSC, sono stati studiati per l'uso nella rigenerazione del tessuto dalla loro descrizione iniziale nel 199522. MSCs sono creduti per essere cellule rigenerative residenti che possono essere trovate in quasi qualsiasi tessuto vascolarizzato23. Isolamento dalla sorgente desiderata, MSCs possono essere facilmente espanse in coltura, hanno capacità estesa paracrine e possiedono spesso nuova o immunomodulatori proprietà24,25. Loro sicurezza ed efficacia hanno già dimostrati in parecchi studi pre-clinici, in particolare per la rigenerazione cardiaca3,26.
Molte strategie di differenziazione di MSC utilizzano agenti farmacologici, quali 5-azacytidine22 e DMSO27e crescita o fattori morfogenetici, come BMPs5,7,28,29 o dell'angiotensina-II30, con efficienza variabile. Queste strategie, tuttavia, non sono basate sugli ostacoli che una cella rigenerativa ingenuo è probabile incontrare dopo homing o recapitati al sito della lesione in vivo. Strategie più fisiologicamente rilevanti, mentre più difficile da definire e manipolare, si basano sulla premessa che MSC differenziazione può essere indotta attraverso segnali dal microambiente del tessuto stesso. Gli studi precedenti hanno dimostrato che l'esposizione alla cellula cardiaca lisati31 o miocardio ventricolare32,33, o diretto contatto con primaria cardiomiociti in vitro15,34, può aumentare l'espressione di marcatori cardiaci in MSCs. Gli altri hanno dimostrato cardiomiogenesi spontanea dopo trattamento di lesioni cardiache con MSCs35,36,37,38, anche se in parte, la fusione di BMSC e cardiomiociti39,40 generato il miocardio nascente. A nostra conoscenza, non sono ancora stati segnalati cardiomiociti funzionali, spontaneamente contraenti da MSCs umane (hMSCs) di qualsiasi origine di tessuto.
Il consenso corrente è che tutti i MSCs derivano da perivascolari cellule23. MSCs giovane con proprietà Pericita può essere isolato dalla regione perivascolare del cordone ombelicale umano tessuto41,42,43. Rispetto alle BMSCs, HUCPVCs possiedono una maggiore differenziazione potenziale e diversi altri vantaggi rigenerative, entrambi in vitro41,44 ed in vivo45,46,47. In particolare, la fonte che è l'interfaccia materno-fetale, HUCPVCs le immunogenicità significativamente più basso rispetto alle fonti di adulti di MSCs. La nostra ricerca si concentra sulla caratterizzazione e applicazioni pre-cliniche di FTM HUCPVCs, la fonte più giovane di MSCs studiato, che precedentemente abbiamo indicato sono aumentati multilineage proliferative e superiore capacità di differenziazione, tra cui nel lignaggio cardiomiogenici41.
Qui, presentiamo un protocollo che unisce formazione aggregata e strati dell'alimentatore primario delle cellule cardiache come forze induttive per raggiungere la differenziazione di cardiomiogenici completa di MSCs. aggregati forniscono un ambiente 3D, che modelle migliori condizioni in vivo rispetto al 2D culture aderente. Utilizzando livelli cardiaci alimentatore fornisce un ambiente che è rappresentante del sito ultimate trapianto per MSCs. Dimostriamo che più giovane fonti di cellule staminali mesenchimali isolate da cordone ombelicale pre- o post-natali hanno una maggiore capacità di formare aggregati e raggiungere il fenotipo cardiaco rispetto al BMSCs adulto, mantenendo comunque il loro privilegio immunitario. Oltre la ripida elevazione dei geni marcatori di linea cardiaca e l'espressione indotta di intracellulare (cioè, cTnT e MYH6) e proteine di superficie cellulare (vale a dire, SIRPA e Cx43) specifico per cardiomiociti, indichiamo che il potenziale di differenziazione di FTM HUCPVCs possa essere imbrigliato con questo metodo e che possono dare origine a spontaneamente contraenti del cardiomyocyte-come le cellule.
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Discussion
La differenziazione delle cellule staminali cardiaca è stato in sviluppo per oltre 2 decenni, con diverse strategie diverse, viene utilizzate per generare del cardiomyocyte-come le cellule da fonti di MSC. Molte di queste strategie, tuttavia, sono inefficienti, e le condizioni utilizzate spesso non sono rappresentative dell'ambiente trapiantate cellule incontro in vivo.
In contrasto con i metodi esistenti, il protocollo presentato qui utilizza una combinazione di strati di alimentatore cardiaco primario e formazione aggregata di MSC. Gli strati di alimentatore cardiaco primario forniscono un ambiente di differenziazione simile a quella che il hMSCs sono esposti a dopo trapianto. Gli aggregati di generano un ambiente con gradienti di ossigeno e nutrienti, che possono avere un effetto induttivo sull'avvio di un impegno di lignaggio. Strategie di differenziazione cardiache PSC ed ESC-based utilizzando il precondizionamento ipossico e formazione aggregata hanno stabilito questo effetto induttivo sulle cellule staminali5,52,53. Inoltre, una struttura 3D simile meglio la cellula--cellula collegamenti forniti in vivo. Utilizzando questo metodo, abbiamo prodotto con successo in modo sincrono contraenti hMSC aggregati-la prima volta che un tipo hMSC è stato in grado di raggiungere questo obiettivo, a nostra conoscenza. Cosa importante, solo il più giovane hMSC fonte cellulare applicata, HUCPVCs FTM, ha esibito questa capacità.
Un vantaggio significativo di usare o ingenuo o MSCs pre-differenziato rispetto al CES o sportelli unici per la rigenerazione cardiaca si trova nella loro proprietà immunomodulatorie o nuova. Tuttavia, anche nel caso di MSCs, proprietà immunomodulatorie variano con la loro età e origine54. BMSC sono stati indicati per cambiare la loro post-differenziazione proprietà immunogeniche, che conduce spesso al loro rifiuto all'impianto55. Come precedentemente descritto, MSCs dal cordone ombelicale origine possiedono speciale privilegio immune56 dovuto la loro origine nell'utero . Utilizzando il protocollo descritto in precedenza, anche dopo la differenziazione in cellule del cardiomyocyte-come, termine e FTM HUCPVCs esposti alti livelli di HLA-G (che attivamente attenua la risposta immunitaria innata) e mantenuto a bassi livelli di HLA-A (che determina la che citotossicità comunicata per cellule di T).
Questo protocollo di differenziazione ha il vantaggio di permettere convenientemente per più livelli di analisi. In primo luogo, la formazione immagine diretta di funzionale, contraenti aggregati è più fattibile di distinguere cellule singole integrato in uno strato dell'alimentatore. Come il protocollo utilizza co-colture di specie miste, umani specifici primer vengono applicati all'analisi qPCR, mentre FACS e ICC forniscono l'identificazione rapida di fenotipo-in particolare, espressione di marcatori cardiaci (Figura 2). Utilizzando il protocollo come descritto, sono stati rilevati livelli elevati di SIRPA, cTnT, MYH6, aSarc, Mef2c e Cx43. In collaborazione con ricristianizzati, è possibile identificare l'espressione di Mef2c e aSarc in hMSCs differenziato e di distinguere dal ratto dei cardiomiociti derivati alimentatore strati o cellule fuse. Mentre l'identificazione dei contraenti aggregati sul livello dell'alimentatore è relativamente facile, raccolta o la loro raccolta può rappresentare una limitazione. Dotato di un micromanipolatore microscopi possono essere impiegati per gestire questa sfida. In alternativa, le cellule umane possono essere ordinate in modo efficiente da co-colture usando gli anticorpi umani specifici anti-TRA-1-85. Mentre il co-culture presenti anche la sfida di potenziale fusione cellulare, questo troppo può essere superato utilizzando una combinazione di rivelatori nucleari e cellula-superficie umana marcatore (complementare figura 1).
Un'eventuale modifica del nostro metodo di differenziazione è quello di regolare la formazione di aggregati. I nostri risultati indicano che le dimensioni di aggregazione possono essere un parametro critico per differenziazione ottimale. Supponendo che l'aggregazione è selettivo per le cellule più adesive, può agire come un passo di pre-selezione per hMSCs CD49f-positivi. La formazione migliorata di sfera MSC è stata collegata a aumentato CD49f espressione49e CD49f inoltre è associato con più alto staminalità perché è direttamente collegato a SOX2 e OCT449. Abbiamo osservato i numeri più bassi delle cellule CD49f-positive nelle più vecchie fonti di hMSCs rispetto al HUCPVCs FTM, che potrebbe spiegare la dimensione di aggregata diminuita osservata. Abbiamo teorizzano che questa selezione può essere compensata aumentando il numero delle hMSCs per aggregato per ottenere una taglia di aggregata superiore, possibilmente aumentando così l'efficienza della differenziazione indotta su aggregazione.
Applicazioni future potrebbero richiedere modifiche al protocollo pure. È imperativo che applicazioni cliniche delle hMSCs pre-differenziato si svolgono in condizioni prive di xeno. I contraenti aggregati prodotti usando questo protocollo potrebbero essere utilizzati anche per la creazione di tessuti del muscolo cardiaco ingegnerizzato. Per produrre un prodotto clinicamente applicabile, è necessario un flusso di lavoro cGMP-compliant. Mentre il mezzo di coltura privo di xeno è disponibile per hMSCs, offrendo un livello animale senza alimentatore potrebbe essere difficile. Tuttavia, l'applicazione pre-differenziato alimentatore strati di altre fonti di cellule staminali, come iPSCs, è una possibile soluzione.
In conclusione, il metodo di differenziazione descritto può essere applicato per produrre funzionale del cardiomyocyte-come le cellule da giovane fonti di hMSCs in modo comodo e riproducibile.
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Disclosures
Dr. Clifford L. Librach è contitolare del brevetto: metodi di isolamento e di uso di cellule derivate da tessuti di cordone ombelicale primo acetonide, concessa in Canada e in Australia.
Acknowledgments
Gli autori ringraziare i seguenti membri del personale e personale per i loro contributi di ricerca: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg e Andrée Gauthier-Fisher. Questo lavoro è stato supportato dal fondo di ricerca The Ontario - l'eccellenza della ricerca (ORF-RE, Round #7) e creare programma Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation |
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For HUCPVC and BMSC culture media. |
| PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibody | Biolegend | 313612 | Integrin marker for FC |
| APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibody | R&D Systems | FAB7737A | Connexin 43 marker for FC |
| FITC-conjugated HLA-A2 antibody | Genway Biotech Inc. | GWB-66FBD2 | Immunogenicity marker for FC |
| FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibody | Abcam | ab7904 | Immunogenicity marker for FC |
| FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibody | AbD Serotec/Bio-Rad | MCA2518F | Cardiac marker for FC |
| APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195A | Human cell marker for FC and FACS |
| FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody | R&D Systems | FAB3195F | Human cell marker for FC and FACS |
| Anti-connexin 43/GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Cx43. For ICC |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21428 | For ICC |
| Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibody | Abcam | ab9465 | aSARC. For ICC |
| Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | Life Technologies | A-21426 | For ICC |
| Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody | New England BioLabs Ltd. | 5030S | For ICC |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-21206 | For ICC |
| Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibody | EMD Millipore | MAB1281 | For ICC |
| MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | For imaging aggregates. | |
| 1.5 ml centrifuge microtubes | Axygen | MCT-150-C | For staining MSCs with fluorescent dye. |
| ImageJ | Open source image processing software. | ||
| Aria II | BD | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Bone marrow mesechymal stromal cells | Lonza | PT-2501 | BMSCs |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030-100G | BSA. To prepare solutions for ICC |
| BrdU | EMD Millipore | MAB3424 | Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use. |
| Canto II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| cDNA EcoDry Premix | Clontech/Takara | 639570 | For preparation of cDNA for qPCR |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies | C7025 | Fluorescent imaging of cell cytoplasm |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | For cell counting |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | D6421 | For rat primary cardiomyocyte culture medium. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010023 | D-PBS, without Ca2+, Mg2+ |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope | |
| FACSCalibur | BD | In-house. For flow cytometry. | |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | FBS. Component of cell culture medium. |
| IDT Prime Time qPCR probes | Integrated Data Technologies | FAM fluorophore | http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers |
| Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium | ThermoScientific | TA-030-FM | For storage of cells to undergo ICC |
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Normal goat serum | Cell Signaling Technology | 5425S | NGS. Used in blocking solution for ICC |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells | Thermo Scientific Nunc | 155409 | To prepare samples for ICC |
| OmniPur Triton X-100 Surfactant | EMD Millipore | 9410-OP | As a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For fixing cells for ICC. |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Component of cell culture medium. |
| Primers | Sigma | Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μmol | CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G |
| Quorum Spinning Disk Confocal | Zeiss | SickKids Imaging Facility | |
| ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytes | ReproCell | RCD001N | Positive control for qPCR |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | To isolate RNA for qPCR |
| Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 204074 | For qPCR with master mix |
| RPMI 1640 | Gibco | A1049101 | For MSC, monocyte coculture medium. |
| TaqMan qPCR primer assays | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | For qPCR |
| Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | Staining of cells for viability and counting |
| Trypsin | Gibco | 272500108 | For cell dissociation |
| Volocity | Perkin-Elmer | Volocity 6.3 | Imaging software |
| 0.2 μm pore filter | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | For sterilizing tissue culture media |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat heart. Can use any similar forceps. |
| Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For mincing rat heart. Curved scissors recommended. |
| 50 mL tube | BD Falcon | 352070 | For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 6-well plates | Thermo Scientific Nunc | CA73520-906 | For tissue culture |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For aggregate formation |
| Axiovert 40C Microscope | Zeiss | For bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol | |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
| Triton X-100 | EMD Millipore | 9410-1L | Used in permeabilization solution for ICC |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain used during visualization of Cx43 localization |
References
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