Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

В пробирке Дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток человека в функциональных клетки Cardiomyocyte как

Published: August 9, 2017 doi: 10.3791/55757
Automatic Translation
*1,2, *1, 1,2, 1,2,3,4,5
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Physiology, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы представляем метод эффективно использовать потенциал сердца дифференциация молодых источников мезенхимальных стволовых клеток человека с целью создания функционального, Договаривающихся, cardiomyocyte подобных клеток в пробирке.

Abstract

Инфаркт миокарда и последующих ишемического Каскад привести к гибели кардиомиоцитов, приводит к сердечной недостаточности, ведущей причиной смертности во всем мире. Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) являются перспективным вариантом для терапии на базе ячеек для замены текущего, инвазивные методы. MSCs могут дифференцироваться в мезенхимальных линий, включая типы клеток сердца, но полная дифференциация в функциональных клетки пока не достигнуто. Предыдущие методы дифференциации были основаны на фармакологических агентов или факторы роста. Однако более физиологически соответствующие стратегии можно также включить MSCs для прохождения cardiomyogenic преобразования. Здесь мы представляем дифференциация метод, с помощью MSC агрегатов на слоях фидер cardiomyocyte производить Договаривающихся клетки cardiomyocyte как.

Человеческой пуповинной периваскулярной клетки (HUCPVCs), было показано, имеют больше потенциал, чем дифференциация обычно расследуются MSC типы, такие как костного MSCs (BMSCs). Как источник онтогенетически младший мы исследовали потенциал cardiomyogenic первого триместра (FTM) HUCPVCs по сравнению с старше источников. FTM HUCPVCs являются роман, богатым источником MSCs, которые сохраняют в утробе матери immunoprivileged свойства когда культивировали в пробирке. Используя этот протокол дифференциации, FTM и срок HUCPVCs достигнуто значительное увеличение cardiomyogenic дифференциации по сравнению с BMSCs, как указано выражением увеличение cardiomyocyte маркеров (то есть, myocyte усилитель фактор 2 C, сердечной тропонина T, тяжелой цепи миозина и сердца, сигнал регламентационный протеин α и connexin 43). Они также поддерживали значительно ниже иммуногенность, как свидетельствует их нижняя выражение HLA-A и выше выражение HLA-G. Применяя дифференциация на основе совокупности, FTM HUCPVCs показал увеличение совокупного формирования потенциал и созданные Договаривающимися кластеры клеток в течение 1 недели совместного культуры на слои сердца фидер, став первый тип MSC сделать это.

Наши результаты показывают, что эта стратегия дифференциации могут эффективно использовать потенциал cardiomyogenic молодых MSCs, таких как HUCPVCs FTM и предполагает, что в vitro предварительно дифференциация может быть потенциальной стратегии увеличить их эффективность регенерации в естественных условиях.

Introduction

Застойной сердечной недостаточности (CHF) по-прежнему является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. CHF часто происходит после гибели кардиомиоцитов и развитие свободных клеток рубцовой ткани в результате патологических инфаркт миокарда (MI)1. В то время как сердце является органом, частично самостоятельного обновления, резидентов стволовых и прогениторных клеток бассейн отвечает за выполнение регенерации тканей значительно уменьшается в изобилии и функции у пожилых больных, часто становится недостаточным для оптимального восстановления после травмы. Таким образом существует большой интерес к разработке экспериментальных методов лечения, включающие трансплантации здоровых доноров клеток в поврежденную миокарда. Важно, что клеток донора не только восстановить структуру ткани, но также достичь функциональное восстановление пострадавших миокарда.

Родной сердце занято сердце ткани резидентов и эндогенных стволовых клеток костного мозга-возникла для после травмы ремонт2,3,4. Регенеративной клетки хост - и доноров получены так должны имеют возможности для получения соответствующих фенотипа и функции в микроокружения ремоделирования миокарда, наряду с возможностью эффективно и безопасно заменить потерянные клеток. В vitro методы дифференциации широко использовались для достижения высокой эффективности, основанные на стволовые клетки cardiomyocyte производства5,6. Профиль выражения сердечной lineage маркеров используется для определения процесса дифференцировки стволовых клеток к сердечной линии7. Ранних дифференциация маркеров, такие как NKX2.5, myocyte усилитель фактор 2 C (Mef2c) и GATA48,9, может быть признаком начала процесса cardiomyogenic. Зрелые cardiomyocyte маркеров широко используется для оценки эффективности дифференциация являются сигнала регламентационный протеин α (СИРПА)10, сердечной тропонина T (cTnT)11, тяжелой цепи миозина сердца (MYH6)8,12,13и connexin 43 (Cx43)14,,1516. Методы с использованием эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и плюрипотентных стволовых клеток (Чок) были тщательно оптимизированы и обсудили детали индуктивные факторы, кислорода и питательных веществ градиенты, и точные сроки действий5,6,7,17,18. Тем не менее ESC - и PSC-технологий по-прежнему представляют несколько проблемы этики и безопасности, наряду с неоптимальной электрофизиологических и иммунологические особенности19,20. Хозяева, пересаженные с эти клетки часто опыт immunorejection и требуют постоянного иммунодепрессией. Это объясняется главным образом рассогласовывать гистосовместимости (MHC) сложных молекул в принимающих стран и доноров и в результате Т-клеточный ответ21. Хотя отдельные MHC класса I соответствия является одним из возможных решений, более доступным клинической практике потребует ячейку источник, который является универсально immunoprivileged преодолеть беспокойство отказ.

Как источник альтернативной клеток для клинического применения, MSCs и в частности, BMSCs, были расследованы для использования в регенерации тканей после их первоначального описания в 1995 году22. MSCs считается резидентом регенерации клеток, которые можно найти в почти любой васкуляризированной ткани23. После изоляции от нужного источника MSCs может быть легко расширена в культуре, имеют обширные паракринными потенциала и часто имеют immunoprivileged или иммуномодулирующих свойств24,25. Их безопасность и эффективность уже были показаны в нескольких доклинические исследования, в частности для сердца регенерации3,26.

Многие стратегии дифференциации MSC используют фармакологических агентов, таких как 5-azacytidine22 и27ДМСО и роста или морфообразующих факторы, такие как BMP5,7,,2829 или ангиотензина II30, с различной эффективности. Однако, эти стратегии, не основаны на тех препятствий, которые наивно регенеративной ячейке может столкнуться после самонаведения или доставляются к месту травмы в vivo. Более физиологически соответствующих стратегий, в то время как более трудно определить и манипулировать, основаны на той предпосылке, что MSC дифференциация может быть вызван через сигналы от микроокружения ткани, сам. Предыдущие исследования показали, что воздействие сердечной клетки лизатов31 или миокарда желудочков32,33, или прямой контакт с первичной кардиомиоцитов в vitro15,34, может увеличить выражения сердечной маркеров в MSCs. Другие продемонстрировали спонтанное cardiomyogenesis после лечения сердца травмы с MSCs35,,3637,38, хотя частично, слияние BMSCs и кардиомиоцитов39,40 сгенерированный зарождающейся миокарда. К нашему знанию функциональных, спонтанно Договаривающихся кардиомиоцитов из человека MSCs (использования) любого источника ткани пока не сообщалось.

Текущий консенсус в том, что все MSCs возникают из клеток периваскулярной23. Молодые MSCs с перицит свойства могут быть изолированы от регионе периваскулярной человеческой пуповинной ткани41,,4243. По сравнению с BMSCs HUCPVCs обладают рост дифференциации потенциал и несколько других восстановительных преимущества, как в vitro41,44 и в естественных условиях45,46,47. Примечательно источник, будучи интерфейсе матери и плода, HUCPVCs имеют значительно ниже иммуногенность, по сравнению с взрослых источники MSCs. Наши исследования посвящена характеристика и доклинические приложений FTM HUCPVCs, младший источник MSCs расследование, который мы показали ранее увеличились пролиферативных и выше multilineage дифференциация потенциала, в том числе в родословной cardiomyogenic41.

Здесь мы представляем протокол, который сочетает в себе совокупного образования и первичной сердечной клетки фидера слои как индукционные силы для достижения полного cardiomyogenic дифференциация агрегатов MSCs. обеспечивают 3D окружающей среды, которая лучше моделирует условия в естественных условиях по сравнению с 2D адэрентных культур. Использование слоев сердца фидер предоставляет среду, которая является представителем конечной трансплантации сайта для MSCs. Мы продемонстрировать, что младший источники MSCs, изолированных от пуповины до или после родов имеют высокий потенциал формы агрегатов и достичь сердца фенотип, по сравнению с взрослых BMSCs, сохраняя при этом их иммунная привилегия. Помимо крутой высоты сердечной линии маркерных генов и индуцированных выражение внутриклеточных (то есть, cTnT и MYH6) и поверхности клетки белки (т.е., СИРПА и Cx43) специфически для кардиомиоцитов, мы показываем, что дифференциация потенциал FTM HUCPVCs могут быть использованы с этим методом, и что они могут привести к спонтанно Договаривающихся клетки cardiomyocyte как.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Сердца дифференцировки стволовых клеток был стадии разработки более 2 десятилетий, с несколько различных стратегий, которые используются для создания клетки cardiomyocyte как из источников MSC. Многие из этих стратегий, однако, являются неэффективными, и условия, используемые часто не являются репрезентативными окружающей среды пересаженные клетки встреча в естественных условиях.

В отличие от существующих методов протокола, представленные здесь использует комбинацию первичных сердца фидер слои и MSC совокупных формирования. Основная сердца фидер слои обеспечивают среде дифференциации, аналогичный тому, который использования подвергаются после трансплантации. Агрегатов создания среды с градиентами кислорода и питательных веществ, которые могут иметь индуктивный эффект на инициирование приверженность линии. PSC - и ESC-стратегии на основе сердца дифференциации с помощью гипоксического Литраж и совокупного образования создали этот индуктивный эффект на стволовые клетки5,52,53. Кроме того 3D структура лучше напоминает соединения к ячейке предоставляется в естественных условиях. С помощью этого метода, мы успешно производит синхронно Договаривающихся МСК агрегатов первый раз, когда тип МСК был в состоянии достичь этой цели, чтобы наши знания. Важно отметить, что только молодым МСК клеток источник применяется, FTM HUCPVCs, выставлены этой способности.

Значительное преимущество с помощью наивно или предварительно дифференцированной MSCs ЭСК или PSC для регенерации сердца заключается в их свойства иммуномодулирующих или immunoprivileged. Однако даже в случае MSCs, иммуномодулирующие свойства зависят от их возраста и исходного54. BMSCs было показано, чтобы изменить их иммуногенные свойства после дифференциации, что часто приводит к их отказ после имплантации55. Как описано ранее, MSCs из пуповины происхождения обладают особой привилегией иммунитета56 из-за их происхождения в утробе матери . Используя протокол описанных выше, даже после того, как дифференциация в клетки cardiomyocyte как, срок и FTM HUCPVCs выставлены высокий уровень HLA-G (который активно смягчает врожденный иммунный ответ) и поддерживать низкий уровень HLA-A (которые определяет, что Т-клеток опосредованная цитотоксичность).

Эта дифференциация протокол имеет то преимущество, позволяя удобно для нескольких уровней анализа. Во-первых живой изображений функционального, Договаривающихся агрегатов является более реальным, чем различать отдельные клетки интегрированы в слой фидер. Протокол использует смешанных видов сотрудничества культур, человека специфические праймеры применяются для ПЦР-анализа, в то время как СУИМ и ICC обеспечивают быстрое определение фенотипа-в частности, сердечной маркер выражения (рис. 2). Используя протокол, как описано, были обнаружены повышенные уровни СИРПА cTnT, MYH6, aSarc, Mef2c и Cx43. В сочетании с HuNu можно определить выражение Mef2c и aSarc в дифференцированных использования и отличить от крыс cardiomyocyte производные фидер слои или расплавленный клетки. В то время как выявление Договаривающихся агрегатов на фидер слой является относительно легко, сбор или жать их может создать ограничение. Микроскопы оснащены микроманипулятор могут быть использованы для обработки этой задачи. Кроме того клетки человека могут быть эффективно отсортированы от совместного культур с помощью человека специфические антитела анти TRA-1-85. В то время как сопредседатель культур также представляют проблему потенциального слияния клеток, это тоже могут быть преодолены с помощью сочетания ядерной и клетк поверхности человека маркер Трейсеры (дополнительный рис. 1).

Возможного изменения нашего метода дифференциации является настроить формирование агрегатов. Наши результаты показывают, что совокупный размер может быть критический параметр для оптимального дифференциации. Предполагая, что агрегации селективный для более клей клетки, он может выступать в качестве предварительного отбора шага для использования CD49f-позитивных. Расширение сферы формирования MSC связан с увеличилась CD49f выражение49, и CD49f связано также с более высокой stemness, потому что это непосредственно связано с SOX2 и OCT449. Мы наблюдали меньшее количество CD49f-положительных клеток в старых источников использования по сравнению с HUCPVCs FTM, который мог бы объяснить наблюдается снижение совокупный размер. Мы теоретизировать, что этот выбор можно компенсировать путем увеличения числа использования в совокупности для достижения выше совокупный размер, таким образом, возможно повышение эффективности индуцированной агрегации дифференциации.

Будущие приложения могут потребовать изменения к протоколу, а также. Важно, что клинические приложения предварительно дифференцированной использования проходить в условиях xeno бесплатно. Договаривающиеся агрегатов производится, используя этот протокол также может использоваться для создания инженерии сердца мышечных тканей. Производить клинически применимых продуктов, необходима цГМФ совместимые рабочего процесса. Хотя xeno свободной культуры среднего доступен для использования, предоставляя бесплатные животных питатель слой может быть сложным. Однако применение предварительно дифференцированной фидер слои других источников стволовых клеток, таких как iPSCs, является возможное решение.

В заключение дифференциация метод, описанный может применяться для производства функциональных клетки cardiomyocyte как из молодых источников использования удобной и воспроизводимые образом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Доктор Клиффорд л Librach является совместное держателем патента: методы изоляции и использования клеток, полученных от первого триместра ткани пуповины, предоставлены в Канаде и Австралии.

Acknowledgments

Авторы поблагодарить следующих сотрудников и исследования сотрудников за их вклад: Мэтью Librach, Лейла Maghen, Таня A. Baretto, Шломит Кенигсберг и Andrée Готье-Фишер. Эта работа была поддержана Онтарио исследовательский фонд - передовых научных исследований (ORF-ре, раунд #7) и создать программы инк

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation
Alpha-MEM Gibco 12571071 For HUCPVC and BMSC culture media.
PE-conjugated anti-human/mouse CD49f antibody Biolegend 313612 Integrin marker for FC
APC-conjugated human Cx43/GJA1 antibody R&D Systems FAB7737A Connexin 43 marker for FC
FITC-conjugated HLA-A2 antibody Genway Biotech Inc. GWB-66FBD2 Immunogenicity marker for FC
FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] antibody Abcam ab7904 Immunogenicity marker for FC
FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a antibody AbD Serotec/Bio-Rad MCA2518F Cardiac marker for FC
APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody R&D Systems FAB3195A Human cell marker for FC and FACS
FITC-conjugated human TRA-1-85/CD147 antibody R&D Systems FAB3195F Human cell marker for FC and FACS
Anti-connexin 43/GJA1 antibody Abcam ab11370 Cx43. For ICC
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 Life Technologies A-21428 For ICC
Anti-sarcomeric alpha actinin [EA-53] antibody Abcam ab9465 aSARC. For ICC
Goat anti-mouse IgM heavy chain cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 Life Technologies A-21426 For ICC
Mef2C (D80C1) XP rabbit antibody New England BioLabs Ltd. 5030S For ICC
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 Life Technologies A-21206 For ICC
Anti-nuclei (HuNu) (clone 235-1) antibody EMD Millipore MAB1281 For ICC
MZ9.5 Stereomicroscope Leica For imaging aggregates.
1.5 ml centrifuge microtubes Axygen MCT-150-C For staining MSCs with fluorescent dye.
ImageJ Open source image processing software.
Aria II  BD UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Bone marrow mesechymal stromal cells Lonza PT-2501 BMSCs
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7030-100G BSA. To prepare solutions for ICC
BrdU EMD Millipore MAB3424 Caution: BrdU is a strong teratogen and suspected mutagen. Please ensure proper training and refer to the SDS before use.
Canto II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
cDNA EcoDry Premix Clontech/Takara 639570 For preparation of cDNA for qPCR
CellTracker Green CMFDA Dye Life Technologies C7025 Fluorescent imaging of cell cytoplasm
Countess automated cell counter Invitrogen Inc. C10227 For cell counting
DMEM-F12 Sigma-Aldrich D6421 For rat primary cardiomyocyte culture medium.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 10010023 D-PBS, without Ca2+, Mg2+
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope
FACSCalibur BD In-house. For flow cytometry.
Fetal bovine serum (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 FBS. Component of cell culture medium.
IDT Prime Time qPCR probes Integrated Data Technologies FAM fluorophore http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor Aqueous Mounting Medium ThermoScientific TA-030-FM For storage of cells to undergo ICC
LSR II  BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Normal goat serum Cell Signaling Technology 5425S NGS. Used in blocking solution for ICC
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-wells Thermo Scientific Nunc 155409 To prepare samples for ICC
OmniPur Triton X-100 Surfactant EMD Millipore 9410-OP As a component of permeabilizing solution when preparing cells for ICC
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710 For fixing cells for ICC.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Component of cell culture medium.
Primers Sigma Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μmol CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Quorum Spinning Disk Confocal Zeiss SickKids Imaging Facility
ReproCardio hiPS cell derived cardiomyocytes ReproCell RCD001N Positive control for qPCR
RNeasy mini kit Qiagen 74106 To isolate RNA for qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit Qiagen 204074 For qPCR with master mix
RPMI 1640 Gibco A1049101 For MSC, monocyte coculture medium.
TaqMan qPCR primer assays Thermo Fisher Scientific 4444556 For qPCR
Trypan Blue Life Technologies T10282 Staining of cells for viability and counting
Trypsin Gibco 272500108 For cell dissociation
Volocity Perkin-Elmer Volocity 6.3 Imaging software
0.2 μm pore filter Thermo Fisher Scientific 566-0020 For sterilizing tissue culture media
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat heart. Can use any similar forceps.
Scissors Fine Science Tools 14059-11 For mincing rat heart. Curved scissors recommended.
50 mL tube BD Falcon 352070 For collection during cardiomyocyte collection and general tissue culture procedures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
6-well plates Thermo Scientific Nunc CA73520-906 For tissue culture
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For aggregate formation
Axiovert 40C Microscope Zeiss For bright-field imaging through out tissue culture and the rest of the protocol
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting
Triton X-100 EMD Millipore 9410-1L Used in permeabilization solution for ICC
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 Stain used during visualization of Cx43 localization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
  2. Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85 (4), 1373-1416 (2005).
  3. Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (18), 10344-10349 (2001).
  4. Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 525-532 (2004).
  5. Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9 (4), 767-778 (2003).
  6. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  8. Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19 (9), 1695-1703 (2011).
  9. Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262 (2), 206-224 (2003).
  10. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  11. Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33 (3), 161-166 (2000).
  12. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  13. Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24 (1), 11-20 (2015).
  14. Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37 (1), 481-482 (2005).
  15. Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (6), 1236-1245 (2012).
  16. van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 263-270 (2003).
  17. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  18. Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45 (2), 168-171 (2008).
  19. Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 1 Suppl 72-78 (2006).
  20. Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71 (3), 419-429 (2006).
  21. Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5 (1), 1 (2014).
  22. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18 (12), 1417-1426 (1995).
  23. Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767 (2015).
  24. Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 4 (2008).
  25. Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21 (12), 2189-2203 (2012).
  26. Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 19 Suppl 247-256 (1999).
  27. Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9 (5), 139-143 (1999).
  28. Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37 (12), 1291-1299 (2013).
  29. Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60 (3), 277-284 (2005).
  30. Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360 (1-2), 279-287 (2012).
  31. Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33 (2), 170-173 (2005).
  32. Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105 (1), 93-98 (2002).
  33. Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10 (2), 304-315 (2014).
  34. Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126 (1), 124-132 (2003).
  35. Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19 (16), 2597-2604 (2012).
  36. Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107 (9), 1247-1249 (2003).
  37. Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90 (6), 634-640 (2002).
  38. Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346 (1), 5-15 (2002).
  39. Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425 (6961), 968-973 (2003).
  40. Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10 (5), 494-501 (2004).
  41. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  42. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  43. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  44. Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340 (2), 639-647 (2006).
  45. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  46. Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107 (5), 926-932 (2009).
  47. Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22 (9), 1651-1666 (2013).
  48. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  49. Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30 (5), 876-887 (2012).
  50. Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113 (4), 816-826 (2009).
  51. Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252 (2016).
  52. Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90 (4), 452-461 (2005).
  53. Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19 (11), 1397-1412 (2010).
  54. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308 (22), 2369-2379 (2012).
  55. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122 (23), 2419-2429 (2010).
  56. Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).

Tags

Биология развития выпуск 126 сердечная дифференциации мезенхимальные стволовые клетки первичный кардиомиоцитов периваскулярной клетки совокупный формирования Договаривающиеся кардиомиоцитов
<em>В пробирке</em> Дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток человека в функциональных клетки Cardiomyocyte как
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szaraz, P., Gratch, Y. S., Iqbal,… More

Szaraz, P., Gratch, Y. S., Iqbal, F., Librach, C. L. In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells. J. Vis. Exp. (126), e55757, doi:10.3791/55757 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter