Summary
Bu iletişim kuralı tendon allojeneik trombosit zengin plazma (PRP) ya da tuzlu Çözümle Aşil tendonu parçası çıkardıktan sonra enjekte edilmiş Sıçanlarda şifa değerlendirme işlemini açıklar. Tendon şifa ilerlemesini analizleri farklı türleri kullanarak birkaç saat noktalarda değerlendirilir.
Abstract
Bu makalede, PRP olumlu tendon şifa etkileyebilir Eğer gözlemlemek için kullanılan deneysel yordamlar açıklanır. İzlenmesi gereken 4 ana adım vardır: Aşil tendonu; bir lezyon teşvik PRP hazırlamak ve bu (veya tuzlu çözüm); tendon Kaldır; ve biyomekanik, moleküler ve histolojik değerlendirme gerçekleştirmek. Her adımda, kolayca yeniden olabilir bu yüzden usul ve yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Aşil tendon 5 mm uzun bölümünün ameliyatla kesitli (kaldırma) olmuştur. Daha sonra PRP ya da tuzlu çözüm PRP tendon şifa üzerinde olumlu bir etkisi olup olmadığını incelemek için enjekte ettiler. Üç grup (bir toplam 120 sıçan bu çalışmada kullanılmıştır) 40 hayvanların 2 alt gruplar alt: PRP enjeksiyon grubu ve tuzlu bir enjeksiyon kontrol grubu. Fareler zaman puan (Grup A: 5 gün; artırmaya kurban edildi Grup B: 15 gün; C: 30 gün grup) ve tendon çıkarıldı. 90 tendonları biyomekanik transcriptomic analiz yapmadan önce test uygulandı ve 30 kalan tendon histolojik analizi için sunuldu.
Introduction
Koagülasyon, inflamatuar süreç ve trombosit bağışıklık modülasyonu rollerini iyi bilinen1vardır. Son zamanlarda, onlar da şifalı özellikleri2,3var kanıtlanmıştır. Gerçekten de, çeşitli faktörler sitokinler ve büyüme (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-ı ve HGF) trombosit tarafından degranulation sırasında serbest bırakılır. Bu büyüme faktörleri anjiogenezi, doku remodeling ve yara iyileşme (kemik, deri, kas, tendon)2teşvik. Otolog kan centrifuging izolasyon yöntemine bağlı olarak yüksek trombosit konsantrasyonları içeren trombosit zengin plazma (PRP) üretir (3 arasında ve 10 kez kan baseline konsantrasyonu). Gerçekten de, çeşitli PRP hazırlama teknikleri özdeş bir nihai ürün sağlayamaz. Şimdiye kadar bu konuda uluslararası genel anlaşma oldu. Genel olarak, PRP Kronik kas-iskelet, tendinopathy, plantar Fasiit, Osteoartrit ve sendikasız4gibi tedavi için çekici bir tedavi seçeneği olabilir. Bu ilk defa oral Cerrahi ve İmplantoloji4 bir diş implantı koyduktan sonra şifa kemik hızlandırmak ve geliştirmek için kullanıldı. Bu çalışmada, PRP edinme hayvan deney4için sağlar bir tekrarlanabilir yöntemi açıklanmaktadır.
Lezyonlar tendonların sporcular ve fiziksel işçiler sık sık gözlenir beri büyük ilgi5/ geliştirilmesi süreci şifa ve böylece azaltmak belgili tanımlık zaman kurtarma için vardır. Kez gelişmekte olan yeni tedavi yöntemleri büyüme faktörlerinin kullanımı dahil ve endojen büyüme faktörleri4bir karışımı teslim etmek için basit ve minimal invaziv bir şekilde PRP bir ilçedir.
Biyolojik arabulucu, serbest bırakarak trombosit, yüksek düzeyde içeren plazma yönetim biyolojik arabulucu6 serbest bırakarak tendon ve bağ onarım teşvik edebilirsiniz çeşitli vitro veya hayvan çalışmaları göstermiştir ,7,8,9. Ayrıca, diğer çalışmalar PRP ben ve tendon III kollajen sentezinde hücreleri9,10,11türü teşvik edebilirsiniz göstermiştir. Ayrıca PRP matriks metalloproteinazların (MMPs) aktivasyonu azaltmak ve bu nedenle matrix bozulması azaltmak sürülmüştür. İltihap sürecinde söz konusu hücre doku iltihabı12tarafından indüklenen remodeling (fizyolojik ve patolojik) bir rol oynar MMP-9 üretebilir.
Sıçan bir tek PRP enjeksiyon kesitli Aşil tendon içine kurtarma işlemi ve tamir doku mekanik gücünü geliştirmek olabilir ki bu bilgilere dayanarak, biz onaylanmadığına karar. Bu kurtarma işlemi sırasında şifa tendonları biyomekanik özellikleri ölçme ve histolojik ve moleküler analizler remodeling yeni kurulan dokusunda kollajen değerlendirmek için performans test edilir. Çalışmanın amacı allojeneik PRP tek bir enjeksiyon kesitli Aşil tendon şifa etkisi gözlemlemek oldu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bakım ve taşıma hayvanların Bakım Kılavuzu uygun olarak gerçekleştirilen ve kullanım laboratuvar hayvanlarının Ulusal Bilimler Akademisi tarafından hazırlanan ve ulusal kurumları, Sağlık (ABD tarafından) yayınlandı. Avrupa ve ulusal mevzuat dikkatle takip.
1. hayvan hazırlık
- 132 2 - ay yaşlı erkek Sprague-Dawley rats vezin 320-450 g (120 sıçanlara deney) ve kan örnekleme, şekil 112 sıçanlara kullanın. Dell13üzerinde bağlı olarak, her grup için 15 sıçan 0,8 (belirtilen etkisi varsa istatistiksel anlamlılık, bulmak % 80 şans) bir güç için yeterli oldu.
- Klasik kafesler değişen bir istasyon ile donatılmış bir geleneksel tesiste yalıtım koşullar altında tüm rats ev. Bir IVC (tek tek havalandırılmış cage) raf ıslah özellikle satın SPF (belirli patojen ücretsiz) fareler ile tahrik.
- Aşağıdaki konut koşullarını kullanın: sıcaklığı 19-24 ° c; Bağıl nem oranı: % 40-60; Havalandırma: Hava yenileme sıklığı: 10-15-h; Açık/koyu döngüsü: 12 h - 12 h.
- Tüm caging ekipman sterilize ve ışınlanmış yatak kullanın. Sistemik kafes zenginleştirme steril karton tepsiler ve havlu içinde kafes yerleştirerek uygulamak.
- Bölge sınırlı koşullar altında erişmesine izin vermek: yeni laboratuvar mont, maske, eldiven, Ayakkabı ve saç başlık girişinde.
- Geleneksel İmkanları için Felasa14 öneriler göre yıllık bazda kirli yatak üzerinde yer alan nöbetçi hayvanlar üzerinde koloni sağlık izleme dışarı taşımak. 4-5 hayvanlar ile ışınlanmış uygun kafes başına diyet ve sağlamak tutmak su ad libitumacidified. Her gün izlemek.
- 2s ameliyat öncesi cerrahi Odalar için üst kafesleri filtreleme içinde cerrahi müdahale için seçilen fareler aktarın.
2. cerrahi müdahale
- Cerrahi aletler hazırlamak: ince makas, bir kelepçe, iki kan durdurucu sargı kelepçeler ve bir iğne bağı. Tüm işlemler sırasında eldiven, maske, bir başlık ve bir laboratuar önlüğü giy.
- Rastgele fareler (PRP ve tuzlu çözüm) iki gruba ayırın.
- Fareyi onun kafes dışına almak ve tartmak. Numaralı kulak Etiketler fareler tanımlamak için kullanın. Kuruma gözleri önlemek için kornea üzerinde waterdrops yerleştirin.
- Fareyle intraperitoneally xylazine (10 mg/kg vücut ağırlığı) ve ketamin (80 mg/kg vücut ağırlığı) anestezi. Anesthetization onaylamak için kardiyo solunum izleme ve kontrol için herhangi bir göz refleksleri altında hayvanlar koyun.
- Buprenorfin 50 µL subkutan enjekte (0,01-0,05 mg/kg her 8-12 h) ağrı kesici olarak boyun bölgesinde.
- Bir Elektrikli tıraş makinesi ile sol arka bacak tıraş, scrubs ISO-betadin/alkol (seyreltilmiş 1:10) çözüm alternatif 3 ile dezenfekte ve bir sıcak yastık (20 ° C) bir diseksiyon mikroskop altında üzerinde fare yer. Fareyi üzerinde üstün bir konumda ameliyat olmak için bacak ile yanal dekübitus yerleştirin. Pençe cerrahi Forseps ile tutun.
- Makas kullanarak, küçük yan kesi (20-25 mm) sol Aşil tendonu çevresinde cilt içinde yapmak ve Aşil tendonu karmaşık (şekil 2a) ortaya çıkarmak için iyi makas kullanarak fasya incelemek.
- Plantaris tendon makas (şekil 2b) bir çift ile kaldırın.
- Aşil tendonu transversally 5 mm proksimal Kalkaneal onun ekleme için kesmek ve makas kullanarak bir 5mm uzun bölümü kaldırın. Tendon (Şekil 2 c, 2d) dikiş değil.
- Fasya ve cilt overjet bir dikiş (sürekli dikiş) yapıyor tekrar Emilebilen iplik ile dikiş. Monofilament dikiş cilt cerrahi kesi içine üzerinden esneklik önlemek için de kullanılabilir.
- Fareyi bir Isıtma lambası kadar uyanık altında yerleştirin ve sonra fareyi bir kafes (58 x 38 cm) geri içinde yer (Nota bene: yok immobilizasyon uygulanmaktadır).
3. PRP hazırlık15
- Xylazine (10 mg/kg vücut ağırlığı) ve ketamin (80 mg/kg vücut ağırlığı) donör farelerle mayi enjeksiyonu ile anestezi. PRP enjeksiyon dışarı 2 h postoperatively herhangi bir re-anestezi olmadan yapılır.
- Buprenorfin 50 µL subkutan ağrı kesici enjekte et.
- Tam kan toplamak (fare, başına 20 mL son kanama) sodyum sitrat arabelleğe % 3.2 içeren steril tüpler içine kalp ponksiyon tarafından (0.109 M, antikoagülan). Sonra fare İntrakardiyak enjeksiyonu ile ötenazi.
- PRP elde etmek için kan vasıl 150 x g ve oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi. Bu ilk düşük hızlı Santrifüjü adım iki ayrı aşamada verimleri: kırmızı kan hücrelerinin toplam hacminin yaklaşık % 80-90 hesapları (RBCs) oluşan bir alt aşaması ve trombosit açısından zengin plazma (PRP) (genellikle % 10-20 kan oluşan bir üst aşama örnek).
- Yavaşça bir plastik transfer pipet kullanarak ikincil bir plastik tüp PRP (üst aşama) toplamak. PRP ve kırmızı kan hücreleri arasında arayüz çok gevşek olduğu için çok yakın arabirime pipet değil. Doğru şekilde işlediğinden, PRP RBCs kirletici 103 hücreleri x 0,05 aşağıda olmalıdır / µL. atmak kalan alt aşaması ve birincil kan toplama tüp.
- Toplanan PRP hacmi belirlemek ve Hematoloji Çözümleyicisi üzerinde trombosit sayısı ölçmek. Bu değerler hesaplamalar trombosit konsantrasyon sonraki adımda ayarlamak için gereklidir. Küre sayısı da RBCs ile potansiyel kirlilik değerlendirmek yararlı ve bu aşamada PRP WBCs. trombosit konsantrasyon genellikle 1 – 1,5 x106/µL.
- 1000 x g ve oda sıcaklığında 10 dakika için PRP ikinci bir aralıklarla gerçekleştirmek. Bu yüksek hızlı Santrifüjü adım gevşek trombosit Pelet ve Otolog trombosit-yoksul plazma (PPP) oluşan bir süpernatant verir. Adım 3.6, belirlenen değerleri kullanarak hesaplamak PRP konsantre ve 2.5 son bir konsantrasyon ulaşmak için atılacak süpernatant hacmi x106/µL.
- Yavaşça süpernatant (PPP) 3.7 adımda hesaplanan son hacim üçte bırakarak bir plastik transfer pipet kullanarak ikincil bir plastik tüp toplamak. Pelet gevşek olduğu için PPP atılır, bu nedenle potansiyel olarak son istenen konsantrasyon azaltarak trombosit önemli bir miktar kaybolur.
- Dikkatle kalan süpernatant ile trombosit Pelet nazik tekrarlanan pipetting tarafından resuspend. Bu konsantre PRP üzerinde trombosit sayısı ölçmek. Gerekirse, son hedef toplama ulaşmak için Otolog PPP uygun hacmi ekleyin.
Not: PRP 3 h hazırlık içinde kullanın. - 50 µL CaCl2 eklemek (11 mEq 10 mL) trombosit etkinleştirmek için PRP mL başına.
- Taze PRP veya tuzlu çözüm 50 µL 21 G iğne ile doğrudan dikilmiş işlemi site ile yaklaşık 1 saat sonra hazırlık enjekte et. Bu süre boyunca, PRP oda sıcaklığında tutmak.
- Fareler fonksiyonel iyileşme sırasında gün ameliyat sonrası ve Aşil tendonu kaldırılmasını önce yakından izleriz.
4. kaldırma Aşil tendonu ve biyomekanik test16
- 5, 15 veya 30 gün sonra5, tartmak iri fare. O zaman, xylazine (10 mg/kg vücut ağırlığı) ve ketamin (80 mg/kg vücut ağırlığı) ile mayi enjeksiyonu ile anestezi.
- Buprenorfin 50 µL subkutan ağrı kesici enjekte et. Tendon fizyolojik şartlarda mümkün olduğunca uzun süre tutmak için hayvan ödün önce kaldırın.
- Sol arka bacak tıraş ve fareyi diseksiyon mikroskop altında yerleştirin. Fareyi üzerinde üstün bir konumda ameliyat olmak için bacak ile yanal dekübitus yerleştirin. Pençe parmak ile tutun.
- Önceki işlemi site içinde küçük bir insizyon attım (10 mm) yapmak ve triceps suralis maruz kadar genişletir.
- Şifa Aşil tendonu kaldırmak için Kalkaneal Kemik transversally 5-10 mm distal, Aşil tendonu eki kesti. O zaman Achilles tendon (şekil 3b) bağlı triceps suralis bir parçası incelemek. Kas parçası cryo-çene (şekil 3 c-d) sığmayacak kadar büyük olmalı. Örnek hemen cryo-çene içine yerleştirin forseps (şekil 3e) kullanarak.
- Kas-tendon-kemik karmaşık kaldırdıktan sonra fare tedavisiydi (200 mg/kg) ile İntrakardiyak enjeksiyonla ötenazi. Ölüm kalp ritmi ve solunum 15dk için yokluğunda değerlendirmek tarafından onaylayın.
- Kas birim üst çene (şekil 3e) yerleştirin, kapatın ve makine test evrensel dikey olarak yerleştirin (106.2 kN, şekil 3a). O zaman kemik arasında (şekil 3f) makinenin alt kelepçeler saptamak.
- Bu bir büyüklük tendon sert ve çekme testi sırasında deforme değil kas dondurmak için üst çene havzaları her ikisi de içine sıvı azot ekleyin.
- Dondurucu bölge metal kelepçe sınıra ulaştığında, tendon yapısını korur bu yüzden çekme testi başlatın. Makine Motor hacmi oranı 1 mm/s sabit bir hızda rüptürü kadar ayarla. Son Newton (N) bir bilgisayara verilen çekme dayanımı (UTS) kaydedin.
- Kesit alanı hesaplamak için Eliptik bir şekli oluşturan iki kamera birbirlerine dik yerleştirin ve fotoğraf çekmek.
- Şifa ve tendonların kesit alanı arasındaki farkı hesaba katan doku tarafından tecrübeli mekanik stres temsil eden birim alana milimetre kare başına (N), UTS normalleştirmek.
5. histolojik analizi
Not: her grubunun 15 tendon histolojik analizi uygulandı.
- Onun kaldırıldıktan sonra Aşil tendonu yapısını korumak için hemen % 4 paraformaldehyde içinde daldırın (doku 1 mm Sabit saat için böylece fiksasyon zaman tendon boyutuna bağlı olarak değişir).
- Paraformaldehyde % 70 etanol tarafından değiştirin ve bu çözüm içinde en az bir gece için örnek bırakın.
- Tendon delikli küçük bir plastik konteyner yerleştirin ve 1 h için taze bir % 70 etanol çözüm konteyner yer.
- Yer % 95 etanol için 1 h. kapsayıcısında yineleyin.
- Yer 1 h. için % 100 etanol kapsayıcısında yineleyin.
- Yer 1 h. için % 100 Ksilen kapsayıcısında yineleyin.
- Şimdi tendon içerir, plastik kap Sıvı parafin (56 ° C) yerleştirin ve gece bırakın.
- Bir gömme istasyonu (erimiş mum, elektrikli Ocak ve soğuk bir tabak ile donatılmış) kullanarak, en uygun doku örneği bir metal kalıp seçin ve Bankası kaplı küçük bir sıvı parafin ile doldurun.
Not: dikey bölümleri microtome elde etmek için örnek yönlendirmek. - Örnek doğru şekilde konumlandırıldığında, Sıvı parafin ile kalıp doldurmak ve soğutucu makine yerleştirin. En az 15 dakikadır aşağı soğumaya bırakın.
- Parafin blok kaldırmak ve buz için en az 30 dakika yerleştirin.
- Birkaç temiz cam slayt hazırlamak ve bazı deiyonize su damlacıkları koy.
- Microtome adlı bölümlerde bloklarını 5 mikron (yalnızca kullanım bölümler tendon orta kısmından) keser ve bir slayt üzerinde bölümüne yerleştirir.
- Parafin sadece cama doku bond için erimeye başlar slaytları 65 ° C birkaç dakika, Isıtma fırında yerleştirin.
- Parafin bölüm bir dilim tutucu içeren slaytlar yerleştirin.
- Şimdi deparaffinize ve doku aşağıdaki ardışık banyolarında yerleştirerek rehydrate:
Ksilen (banyo 1) 8 dk
Ksilen (banyo 2) 4 dk
% 100 etanol içinde 2 dk
% 95 etanol içinde 2 dk
% 70 etanol içinde 2 dk
deiyonize su 2 dk - Hematoksilen-Eozin için boyama, doku aşağıdaki çözümleri yerleştirin.
- Doku Hematoksilen çözüm (1 g Hematoksilen monohidrat, 0.2 g KIO3, 50 gr AIK (SO4)2.12H2O; 200 mL gliserin; 1 L için distile su ile ayarlamak) 8 dakika bırakın.
- Doku altında musluk suyu çalışan 8 min için bırakın.
- Doku 30 bırakın Eozin çözüm (içeren su katılmamış asetik asitin 200 µL distile su 100 ml % 0.25 Eozin) s.
- Doku altında musluk suyu çalışan 2 min için bırakın.
- Masson'ın Trichrome boyama için aşağıdaki adımları izleyin.
- Rehidratasyon sonra bölümleri demir şap (0.5 g (NH4) Fe (SO4)2.12H2O 10 mL H2O) içeren bir kapsayıcı yerleştirin ve konteyner kapatın. 280 W mikrodalga, 3 dk kadar ısı.
- Bir dakikalığına sakin olun ve sonra deiyonize suyla durulayın edelim.
- Regaud'ın Hematoksilen çözüm ile kapalı bir kapta bölümleri yerleştirin (50 mL H2O 50 ° C'de içinde çözünmüş 0.5 g Hematoksilen sonra ekleyin 5 mL % 95 etanol ve 5 mL gliserin), 90 için ısı W. 280 s
- Deiyonize su ile durulayın.
- 3 dk. (metanol doygunluk), Pikrik asit çözüm bölümleri yer, musluk suyu çalışan altında 5 min için durulama ve sonra bir kaç saniye deiyonize suyla yerleştirin.
- Şimdi bölümleri asit fuchsin (50 mL H2O su katılmamış Asetik asit 0.25 mL içeren 0.5 g) 5 s ve durulama için yer altında musluk suyu çalışan boya kaybolana kadar.
- Phosphomolybdic asit solüsyonu (0.5 g 50 mL H2O) 5 min için bölümlerde kuluçkaya, deiyonize suyla bir kaç saniyeliğine yerleştirin.
- Başka bir 5 min için açık yeşil (50 mL H2O su katılmamış Asetik asit 0.25 mL içeren 0.5 g) çözüm bölümleri yerleştirin ve boya kaybolana kadar musluk suyu akan altında yerleştirin.
- Şimdi doku tekrar kurutmak.
- Bölüm 1 dk % 70 etanol için bırakın.
- Bölüm 1 dk % 95 etanol için bırakın.
- Bölüm 1 dk içinde % 100 etanol için bırakın.
- Ksilen (banyo 1) 1 min için bir bölüm bırakın.
- Ksilen (banyo 2) 1 min için bir bölüm bırakın.
- Çok fazla Ksilen kaldırmadan bölümleri çıkarın ve örnek üzerinde bir damla montaj orta koydu.
- Bir coverslip (herhangi bir kabarcıklar provoke olmadan) dökeyim ve en az 2 h sertleşmesine izin verin.
- 5 histolojik bölümlerini (her biri farklı bir tendon) 6 N HCl 3 h için her grupta hidrolize ve 5 günahı µm bölümlerindeki dizin olarak hidroksiprolin ölçerek kollajen konsantrasyonu belirlemek.
- Sonuçlarına göre üreticinin yazılımını kullanarak bölümü alanı normalleştirmek.
- Bazı bölümleri ile görselleştirmek ve bilgisayar destekli analiz tarafından fibriler kollajen ölçmek için yeşil ışık leke leke.
- Bölümleri inceden inceye gözden geçirmek ve nüansları IrfanView yazılımını kullanarak gri resimlerde dönüştürmek. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı (örneğin, bir miktar) yarı miktar için kullanın.
6. moleküler değerlendirme
- Mekanik test sırasında oluşan tendon yırtığı sonra örnekleri al, ek onları sıvı azot içinde dondurma ve-80 ° C (PRP ve tuzlu çözüm)17, depolayabilirsiniz.
- Toplam RNA17yalıtmak için ticari bir toplam RNA setini kullanın.
- Ifade kollajen ölçmek (Col ben ve Col III), matriks metalloproteinazların (MMP-2, MMP-3 ve MMP-9) ve tenomodulin (TNMD) tarafından RT-PCR17,18.
- MRNA ifade düzeyleri düzeyleri 28S19ile normalleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sonuçlar ortalama ortalama ± standart sapması ifade edilir ve Varyans analizi ile (ANOVA) karşılaştırıldı. Bir iki yönlü ANOVA ve post hoc de Scheffé, hangi bir parametrik test, kullanılan test.
Nihai sıçan sigara yaralı Aşil tendon rüptürü kışkırtmak için gerekli dayanımı (UTS) yapıldı 42.0 ± 5,7 N (n = 10). Çekme dayanımı önemli ölçüde arttı (p < 0.0001) 5 gün sonra her iki grupta. Her iki grup karşılaştırarak, UTS PRP grubunda daha yüksek, özellikle gün 15 ve 30 ölçülen herhangi bir zamanda. Biyomekanik değerlendirme (11,4 ± 5.5 mm2 sigara yaralı tendon için) geçiren daha önce kaldırılan tendonlar kesiti ölçerek, bu gün 5, serum fizyolojik tedavi grubunda büyük bulundu. Ama bu miktar serum fizyolojik tedavi grubu için (şekil 4 ve şekil 5) karşılaştırıldığında daha fazla değişken olmasına rağmen 15 ve 30 gün kesit alanı PRP grubunda daha büyük.
Hematoksilen-Eozin boyama, kullanma ve tendonların histolojik değerlendirme yüksek cellularity gün 5, hangi daha sonra azalma gösterdi (anlamlı bir fark tuzlu çözüm ve PRP grubu arasında kutlanan). Masson'ın Trichrome fibriler kollajen PRP grubunda daha yüksek bir varlığı 5 ve 15 gün gösterdi boyama. Ancak boyama yoğunluğu içinde her ikisi de benzer 30 gün sonra enjeksiyon (şekil 6) gruplar. Açık yeşil örnekleriyle boyama tarafından elde edilen yarı miktar gösterdi ki gün 5 ve 15, yoğunluğu (istatistiksel olarak anlamlı) PRP grubunda daha yüksek ama 30 gün iki grup arasında gözlenen fark vardı.
Verileri bir amino asit, hidroksiprolin, histolojik yarı miktar teyit kollajen için belirli miktarını ölçerek normalleştirilmiş (5. gün: PRP grubunda daha büyük bir değer). Kollajen konsantrasyon PRP grubunda istikrarlı değildi ama iki grup 30 günde, stabilize. Kallus hacmi ölçüldü ve iyileşme sürecinin ilk aşamalarında PRP tedavi hayvanlarda önemli ölçüde daha büyük olduğu anlaşıldı. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar PRP enjeksiyon yaralı tendon içine yatırmak fibriler kollajen önemli bir miktar neden olmaktadır.
Sigara yaralı tendon, Col III ve TNMD gösterdi ki birkaç moleküllerinin ifade seviyesi ölçümü edildi şimdiki zamanda daha az miktar (2.5 - 3.0 kez) daha da tendon gün 15 şifa, ancak vardı Col hiçbir fark ben ifade gruplar arasında. MMPs şifa tendon 12-fold daha yüksek konsantrasyon de hazır bulundu. Buna ek olarak, günde 30, COL1A1 önemli bir artış PRP grubunda yapıldı ve COL1A1 ifade ve UTS arasında pozitif bir korelasyon bulundu. Her iki grup (her iki grup için aynı) azalma önce Col III 1 günden güne 14, kadar yüksek bir miktar ifade edildi bulundu. MMP-9 konsantrasyon her iki gruplar halinde değişmedi ama MMP-2 ve MMP-3 iyileşme döneminde daha yüksek konsantrasyonlarda bulundu. Gün 5, TNDM daha yüksek bir miktar PRP içinde ifade edildi (p < 0,03) ama 15 ve 30 gün arasında azalmıştır.
Şekil 1: deneysel tasarım çalışma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Cerrahi müdahale.
(a) tendon çevreleyen fasya çıkarıldıktan sonra karmaşık.
(b) kaldırma plantaris tendon,.
Aşil tendonu bölümünün (c) kaldırma.
(d) kaldırdık be The 2 tendonlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Biyomekanik test
(a) Universal test makine (106.2 kN).
(b) cryo-çene içine sabit kas-tendon-kemik kompleks.
(c) üst ve alt cryo çene
(d) üst ve alt cryo-çene
(e) karmaşık cryo çene içine koymak
(f) kapalı cryo-makinenin içine sabit kas-tendon-kemik kompleksi içeren çene. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Biyomekanik test sonuçları
Çekme dayanımı Newton (N) denetim ve PRP grupları farklı zaman noktalarda ameliyattan sonra ifade. UTS anlamlı olarak daha yüksek değerler, 15 ve 30 gün ameliyat sonrası gösterilen PRP grubu ile zaman içinde bir artış her iki gruplar halinde yapıldı.
Hata çubuğu standart sapma (SD) tanımlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Biyomekanik test sonuçları
Kare milimetre (mm2) ifade tendon enine alanı. Kesit alanı 15 güne kadar PRP grubunda önemli ölçüde daha fazla. Daha sonra bölümün her iki grupta benzerdi.
Hata çubuğu standart sapma (SD) tanımlar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: Histolojik sonuçları
Boyuna bölümlerini temsilcisi: Aşil tendonu kontrol ve PRP grupları, Masson'ın Trichrome ile lekeli. Ölçek çubuğu 100 µm =. Bir daha güçlü yeşil PRP grup tendon gün 5 boyama vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trombosit süreci şifa tendon erken enflamatuar faz için gereklidir. Ne zaman bu trombosit doku veya koagülasyon teşvik faktörler bağlama için maruz kalan, α granül stocked vardır büyüme faktörleri yayınlayacak. Bu etkileşim nedeniyle Mezenkimal hücrelerin prolifere ve hücre dışı matriks oluştururlar synthetized vardır. Trombosit kemotaktik etkinlik progenitör hücrelerinin angiogenez artırılması ve hücresel başkalaşım6,20uyarıcı kan dolaşımını da mevcuttur.
Biyomekanik test yapıldı ex vivo gerilme fareler15Aşil tendonu test için özel yapılmış bir sıkma aygıtı kullanma. Cryo-çene kas dondurulması sıvı azot ekleyerek sağlar ve örnek alt parçası olan Kalkaneal Kemik doğrudan makineye sabittir. Kas tamamen katı ama tendon hala esnek çekme testi başlatmak çok önemlidir. Bu teknik doku hasarı önler ve mekanik bütünlüğünü korur. Ayrıca çeşitli çalışmalarda bu yöntem4,15kullanılmış gibi bu tekniği basit, güvenli, basınç ve demonstrably tekrarlanabilir.
Mekanik sonuçları desteklemek için bazı tendonlar histolojik değerlendirme yapıldı. Hematoksilen-Eozin boyama iyileşmiş doku büyük bir dökümünü gösterir ve hücreleri ve kollajen mevcut miktarı hakkında genel bilgi verir. Ayrıca, hydroxyprolin ölçümü sadece kollajen bulunan bir amino asit olduğu gibi yararlı ve histolojik verilerin objectivation sağlar. Ancak, ifade ve kolajen lifleri4konsantrasyon hakkında çok daha ayrıntılı bilgi gösterildiği gibi bir Masson'ın Trichrome boyama, yapmak gereklidir.
Kollajen düzeyini PRP III mRNA tedavi rağmen tendon değil altered gün 30 yaralı tendon PRP ile tedavi daha yüksek bir konsantrasyon mevcut Col mRNA. Daha önce bu PRP makrofajlar yayılması ve IL-121böylece iyileşme süreci11erken aşamalarında bir aşırı inflamatuar reaksiyon önlemek olabilir, üretimi engelleyen gösterilmiştir. PRP yayılması, metabolik yollar aktivasyonu ve Mezenkimal hücreler dönüşmenin etkin olan tenocytes uyarır mümkündür.
Yüksek konsantrasyonlarda PRP grup tendon TNDM, eklenen moleküller hücreleri kan akışında dolaşan çekmek ve ayırt etme tenocyte fenotip11doğru neden gösterir. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar PRP tek bir enjeksiyon içine rüptüre Aşil tendonu erken iyileşme aşamasında üzerinde olumlu bir etkiye sahiptir ve yüksek mekanik dayanıklılık için yol göstermektedir.
Birkaç önceden klinik çalışmalar zaten PRP iyileşme süreci geliştirir ve farklı büyüme faktörleri belirli eylemleri sırasında bu süreci22var göstermiştir. Mazzocca ve ekibi PRP hücre çoğalması kaslar, kemikler ve tendon uyarır gösterilmiştir. Farklı hazırlıklar dışında herhangi bir beyaz kan hücreleri olmadan güçlü konsantre PRP en etkili tedavi23kanıtladı. McCarrell ve ark. PRP PRP ve beyaz kan hücreleri farklı konsantrasyonları at tendonlar üzerinde içeren birkaç hazırlıkları test benzer bir deney yaptı. Trombosit ara bir konsantrasyon ve beyaz kan hücreleri yüksek konsantrasyon içeren hazırlıklar IL-1ß ve TNFa ve alt kollajen sentezi gibi pro-inflamatuar sitokinlerin daha yüksek bir sürümü yol açtı. Trombosit ve beyaz kan hücreleri yüksek bir konsantrasyon ile karışımları da inflamatuar sitokinlerin ama Inhibe kollajen sentezi bir artış yol açtı. Sonuç olarak bu trombosit konsantrasyonu çok yüksek ise, kollajen sentezi ve hücre metabolizması yavaşladı bu24anlamına gelir. Boswell ve ark. Bu bulgular25doğruladı. En etkili PRP hazırlık böylece 106 trombosit/µL ve hiçbir beyaz kan hücreleri düşük trombosit konsantrasyonu içerir.
PRP kullanımının büyük bir avantaj autogenity sağlıyor. Her ne kadar bizim çalışmada, allojeneik PRP donör fareler feda ederek kan yeterli miktarda sevişirdik. Ayrıca, kan işletilen sıçanlarından emir alarak onları çok fazla zayıflatır. Bu çalışmanın başka sınırlama tendonlar kez nedeniyle önceki dejenerasyon rüptürü gibi tüm yırtığı olan her zaman insanlar içinde durum böyle değil akut ve sağlıklı tendonlar üzerinde gerçekleştirilen olmasıdır. Bu model üzerinde keskin tendon yaralanmalarının dayalı olarak, kesin sonuca dejeneratif tendinopathies için çizilebilir.
Bu yöntemi kullanarak, unutma, ilki kadar tekrarlanabilir olmalıdır PRP hazırlanması mümkün olduğunca olmak için bazı önemli adımlar vardır. Başka bir önemli adım cerrahi işlemdir: kaldırma tendon ve kas-tendon karmaşık herhangi bir önyargı önlemek için tekrarlanabilir bir şekilde yapılmalıdır. Son olarak, biyomekanik test hazırlığı: sıvı azot kas dondurmak için eklenir ve önyargılı sonuçlara yol açabilir, çünkü tendon sertlik değiştirilmesi gibi tendon bu süreçte donuk değil olduğunu oldukça önemlidir. Tendon'ın elastikiyet değişmedi emin olmak için standart bir protokol yok olduğundan bu da bir çalışmada, kısıtlamasıdır.
Virchenko ve arktarafından geliştirilen yöntem bizim yöntem dayalı. 26, ama cryo-jaw tendon kelepçeler tarafından indüklenen dış saldırganlıklara karşı koruyan kullanarak uyarlanmış. Bu yöntemin en büyük avantajı değil henüz standartlaştırılmıştır olsa bile bu tekrarlanabilir olmasıdır. Deney fareleri ile her zaman insan yaralanmaları tedavi için tercüme yok olsa nasıl tendon yaralanmalarının insanlarda, tedavi hakkında bir fikir verir. Bu yöntem adapte bir sürümü bu yaralanmalar içinde belgili tanımlık gelecek, aslında bu, kullanımı kolay nispeten düşük maliyetli vardır ve diğer yöntemlerden daha az invaziv tarafından desteklenen tedavisinde yararlı olabilir muhtemeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışmada standart de Liège tarafından desteklenen ve Leon Frédéricq fonların Lejeune - Chien verir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
References
- Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
- Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
- Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
- Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin. Sports Med. 22, 675-692 (2003).
- Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
- Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
- Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
- Zhang, J., Wang, J. H. -C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R. Sample size determination. ILAR J. 43, 207-213 (2002).
- Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Kaux, J. -F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
- Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
- Kaux, J. -F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
- Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
- Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. Platelets and wound healing. Front. Biosci. 13, 3532-3548 (2008).
- Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
- Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
- Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
- McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).
- Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
- Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).
