Summary
ويرد وصف بروتوكول لتحديد كثافة المرحلة الزجاجية من قطرات حجم الصغير إلى بيكو لتر من مخاليط مائي في درجات الحرارة المبردة.
Abstract
علينا أن نظهر طريقة لتحديد المرحلة الزجاجية الكثافة المبردة درجات الحرارة من المخاليط المائية، وغيرها من العينات التي تتطلب التبريد السريع، لإعداد المرحلة درجة الحرارة المبردة المطلوبة. يتم تبريد ميكروليتر إلى قطرات بيكوليتر حجم الإسقاط في السائل النيتروجين الأرجون (N 2 -Ar) خليط. يتم تقييم المرحلة درجة الحرارة المبردة من انخفاض باستخدام مقايسة البصرية التي ترتبط مع قياسات حيود الأشعة السينية. يتم ضبط كثافة السائل N 2 -Ar خليط بإضافة N 2 أو أر حتى يصبح قطرة مزدهرة محايدة. يتم تحديد كثافة هذا الخليط وبالتالي من انخفاض باستخدام كتلة اختبار ومبدأ أرخميدس. مع الرعاية المناسبة في إعداد الإسقاط، وإدارة الغاز فوق خليط المبردة السائل للحد من الجليد، والخلط المنتظم للخليط المبردة لمنع الكثافة الطبقية وفصل المرحلة والكثافة دقيقة ل <0.5٪ من قطرات صغيرة مثل 50 بل يمكنبسهولة. القياسات على مخاليط كريوبروتكتانت المائية توفر نظرة ثاقبة العمل كريوبروتكتانت، وتوفير البيانات الكمية لتسهيل التوافق الحراري الانكماش في الحفظ بالتبريد البيولوجي.
Introduction
والخصائص الفيزيائية للمخاليط المائية والمائية في مراحلها المختلفة ذات أهمية أساسية، وهي مهمة في الجسم الحي وفي الفهم المختبري للنظم البيولوجية. في كريوبيولوغي المعاصرة والحفاظ على الحفظ بالتبريد البيولوجي، والمراحل الزجاجية أو غير متبلور من مخاليط كريوبروتكتانت المائية ذات أهمية خاصة 1 ، 2 . يمكن لنوى ونمو بلورات الثلج تعطيل الخلايا والأنسجة، وتعزيز تمسخ البروتين والتجميع، لذلك بروتوكولات الحفظ بالتبريد التي تزجج المذيبات أصبحت شعبية متزايدة. في البلورات الجزيئية البيولوجية، تبلور المذيبات في القنوات بين الجزيئات الحيوية يعطل المشابك الكريستال ويحلل خصائص الحيود. ويتحقق التزجيج من خلال مزيج من التبريد السريع، والجفاف، وإضافة المذيبات كريوبروتكتيف مثل الجلسرين، جلايكول الإيثيلين، جليكول البولي إثيلين (بيج)،والكحول، والأملاح.
التزجيج يحد من تبلور الجليد والنمو، ولكن لا يزيل جميع الأضرار عينة ذات الصلة التبريد. على سبيل المثال، فسيفساء الكريستال (مقياس لتوزيع التوجهات الطائرة الكريستال) يزيد بشكل روتيني بعامل من 10 إلى 100 عندما يتم تبريد بلورات البروتين إلى حالة مزججة 3 ، ومعدلات البقاء بعد الذوبان من الخلايا المنوية المزروعة والبويضات تختلف على نطاق واسع .
آلية الضرر واحد هو انكماش التفاضلي من المذيبات والمواد المحيطة بها أثناء التبريد 3 ، 4 ، 5 . إن توازن المذيبات وتركيزات المذاب داخل البلورة أو الخلية أو الأنسجة تعتمد على درجة الحرارة، وقد يتعاقد المذيب بالإضافة إلى المذاب والمواد المحيطة بكميات مختلفة. التبريد السريع قد يمنع المذيبات وإعادة المذيبات قبل التزجيج، و كونتراكتيونال كونتراكتي على قد يؤدي إلى كبير، غير متجانسة، وعدم وجود الضغوط التي تسبب تلف العينة.
ومن ثم يمكن أن تستفيد النهج المنطقية للحد من الأضرار الناجمة عن التبريد من معرفة كثافة تعتمد على درجة الحرارة من الخلائط المائية السائل والمزجج. في تركيزات المذابة فوق 50٪ من وزن المذاب إلى وزن الحل (ث / ث)، يمكن مزج معظم مخاليط كريوبروتكتانت المائية مع معدلات التبريد متواضعة من 10 K / ثانية أو أقل، مما يسمح لإنتاج وكثافة القياسات باستخدام عينات زجاجية كبيرة 6 . ويمكن بعد ذلك تحديد الكثافة باستخدام مبدأ أرخميدس، من خلال قياس الوزن الظاهري للعينة عند تعليقها في السائل المبردة مثل النيتروجين. ومع ذلك، ومع انخفاض تركيز المذيبات، تزداد معدلات التبريد المطلوبة للتزجيج بسرعة: تزداد معدلات تبريد مخاليط الغليسيرول المائية من <10 ك / ث عند وزن 50٪ من المذيبات في g إلى حجم المحلول بالمل / ث / إلى <1،000 K / s عند 25٪ ث / vأس = "كريف"> 7. يصبح نقل الحرارة حدود طبقة محدودة، بحيث تحقيق أكبر معدلات التبريد يتطلب أصغر وأصغر عينات 8 .
تم تحقيق قياسات كثافة الماء الزجاجي النقي والجليد بإيداع قطرات ميكروميتر (حجم الفمتولتر) في فراغ على سطح تبريد المبردة من أجل بناء عينة (كتلة غرامية) العيانية. تم تحديد كثافة هذه العينة عن طريق التسميد بالريوفلوتاتيون في خليط من النيتروجين - الأرجون السائل، حيث تم تعديل كثافة السائل المبرد حتى أصبحت العينة مزدهرة محايدة 9 . ومع ذلك، توليد عينات كبيرة من عدد كبير من قطرات صغيرة بطريقة يقلل من أحجام الفراغ - مصدرا هاما للخطأ في قياسات كثافة المرحلة الزجاجية السابقة - هو غير تافهة. بالنسبة للمخاليط المائية، يمكن أن يؤدي التبخر التفاضلي لمكونات المحلول أثناء الترسيب والترسب في الفراغ إلىشكوك كبيرة في تركيزات المودعة.
قمنا بتطوير طريقة، على أساس كريوفلوتاتيون، الذي يسمح تحديد كثافة دقيقة من مخاليط مائي باستخدام قطرات الفردية صغيرة مثل 50 بل 10 . ويمكن تبريد هذه القطرات بسرعة مع الحفاظ على تركيزاتها الأصلية، ويمكن تقييم حالة درجة الحرارة المبردة (المزججة أو البلورية) باستخدام مقايسة بصرية بسيطة ترتبط بقياسات حيود الأشعة السينية. هذه الطريقة تنطبق بشكل عام على المخاليط المائية وغير المائية، ويمكن أن تمتد إلى مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية بما في ذلك الخلايا (على سبيل المثال ، الجذعية والبيض)، وعينات الأنسجة، وبلورات البروتين وجود كثافة درجات الحرارة المنخفضة بين 0.8 و 1.4 غرام / مل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تنبیھ: یرجی الرجوع إلی جمیع أوراق بیانات سلامة المواد ذات الصلة (مسس) قبل الاستخدام. يرجى استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند استخدام الغازات المضغوطة، بما في ذلك المنظمين المناسبين مناولة الغاز والصمامات، وأنابيب الغاز المعتمدة. الاتصال مع السائل البرد يمكن أن يسبب قضمة الصقيع الشديد ونخر. استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة (الوجه درع، قفازات، معطف المختبر، كامل طول السراويل، مغلقة اصبع القدم الأحذية)، وكلها يجب أن تكون كتيمة إلى النيتروجين السائل. تبقى واقفا وضمان مسار الخروج دون عائق من الجهاز عند استخدام كريوجنس السائل. كن على علم بمخاطر الاختناق عند استخدام الغازات المضغوطة والمبردات السائلة، والعمل في منطقة جيدة التهوية مع الهواء المكيف المناسب (غطاء الدخان أو غرفة معدل دوران الهواء العالي).
1. إعداد حلول مائي لقياس الكثافة
ملاحظة: لأن الأوزان هي أكثر سهولة قياسها إلى دقة عالية من المجلديتم قياس تركيزات الحل في وحدات ث / ث. كل كثافة وذوبان أو درجة حرارة الغليان يفترض أن الضغط الجوي من ~ 100 كيلو باسكال. الخطوات التالية تصف إعداد محلول غليسيرول w / w 35٪. ويمكن استخدام نفس الإجراء لتركيزات أخرى والمذيبات.
- لكل نوع من أنواع المذاب وتركيز الاهتمام، يقدر تقريبا الكتلة المذابة المطلوبة للحصول على التركيز النهائي المطلوب (على سبيل المثال ، بين 25٪ ث / ث و 100٪ ث / ث) لحجم إجمالي الحل، V توت = 10 مل حجم الحل . على سبيل المثال، بالنسبة إلى محلول غليسيرول W / w 35٪ ( ρ s = 1.26 g / مل)، الكتلة المذابة، m s هي:
حيث x هو جزء الكتلة المذابة (0.35) و ρ w = 1 g / مل هو كثافة الماء. - وضع أنبوب الطرد المركزي 15 مل (أو غيرها من حجم معايرة حاوية المياه غير منفذة) على عموممن التوازن الجزئي التحليلي. التخلص من كتلة المطلوب من المذاب / كريوبروتكتانت (على سبيل المثال ، 3.77 غ الجلسرين عن 35٪ ث / حل W) في الأنبوب، وتسجيل كتلة المذاب الفعلية.
- إضافة عالية النقاء (> 18 MΩ) منزوع الأيونات الماء لجلب الكتلة الإجمالية تصل إلى 10.0 غرام
- دوامة الحاوية لمدة 30 ثانية (للذوبان السائل) أو 5 دقائق (للذوبان الصلبة)، حتى يكون الحل متجانسة بصريا.
- قياس وتسجيل الكتلة النهائية من الحل. ختم الحاوية مع غطاء محكم وتخزينها في درجة حرارة ثابتة (293-298 K).
2. إعداد غرفة التبريد العينة
- وضع الجهاز التجريبي وصفها أدناه في الضميمة وتدفق الهواء الجاف (> 5٪ الرطوبة النسبية (ر)) في العلبة.
ملاحظة: العلبة قد يكون إطار معدني بسيط مع أعلى وثلاثة الجانبين مختومة مع ورقة من البلاستيك واضحة ومع وصول التجربة عبر الجانب الرابع مغطاة ورقة من البلاستيك المرن. البس، ارتداءوجه الدروع وكامل الجسم تغطي للحد من الرطوبة التي أدخلتها المجرب. ويمكن أن يتداخل تكاثف الرطوبة وتكوين الجليد مع قياسات كثافة درجات الحرارة المبردة بعدة طرق، ولذلك يجب التقليل منه. - وضع قرص من المطاط النيوبرين على الجزء السفلي من 4.5 لتر الزجاج قارورة ديوار، لحماية قارورة ديوار من التلف.
- إدراج بعناية غرفة النحاس التوصيل الحراري عالية (اسطوانة جوفاء مع أسفل مختوم) في قارورة حتى أنها تقع على القرص المطاطي. ضبط الدعامات إسقاط الخارج من الغرفة إلى جدران ديوار بحيث تتمحور الغرفة وليس لديها ميل إلى الصخور.
ملاحظة: سوف قارورة ديوار عقد النيتروجين السائل، وحجم أصغر بكثير غرفة النحاس عقد السائل N 2 -Ar خليط. يوفر النيتروجين السائل حمام حراري يحافظ على غرفة النحاس ومحتوياته عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 77 كيلوواط ويقلل من الغليان والخسائر التبخرية في الغرفة. الغرفة'. ق قطر صغير يقمع موجات السطح التي يمكن أن تتداخل مع القياسات الطفو، ويساعد على عزل السائل داخل الغرفة من الصقيع والجليد شكلت في مكان آخر من الجهاز. - إدراج منفذ من أنبوب الغاز مع جاف N 2 الغاز المتدفقة في ~ 2 لتر / دقيقة وصولا الى الجزء السفلي من الغرفة النحاس، وتطهير غرفة الهواء الرطب.
- ببطء صب النيتروجين السائل في قارورة ديوار، خارج غرفة النحاس، مما يتيح الوقت للنيتروجين يغلي قبالة.
ملاحظة: يجب أن يكون مستوى التعبئة النهائية، بعد الغليان، في حدود 4 سم تقريبا من أعلى غرفة النحاس. - تغطية الجزء الخارجي من قارورة ديوار مع غطاء حلقي رغوة العازلة. إزالة أنبوب إزالة الغاز N 2 الجافة من غرفة النحاس وإدراجها في فتح مطابقة في الغطاء.
ملاحظة: مزيج من غاز N 2 من الغليان في قارورة ديوار ومن تدفق تطهير يطرد أي هواء رطب ويمنعها من التكثيف وبلورسة سn الأسطح الباردة. - ببطء صب النيتروجين السائل في غرفة النحاس. يجب أن يكون مستوى التعبئة النهائية، بعد الغليان، في حدود 4 سم تقريبا من أعلى غرفة النحاس.
- وضع ورقة بلاستيكية رقيقة شفافة بصريا على الافتتاح المركزي أو تنفيس في الغطاء، والحد من معدل تدفق الغاز N 2 إلى ~ 0.2 لتر / دقيقة، وترك الضغط الزائد طفيف من غاز N 2 داخل مساحات الغاز فوق السوائل المبردة.
ملاحظة: طالما السوائل المبردة موجودة في ديوار والحجرة، والاستمرار في ضبط تدفق الغاز N 2 حسب الحاجة للحفاظ على هذا الضغط الزائد ومنع الرطوبة من الدخول في ديوار وتشكيل الجليد.
3. تحديد حجم وكثافة كتلة الاختبار في T = 298 K و T = 77 K
- تحديد كتلة واضحة من ~ 1 غرام، ~ 0.4 مل بتف اختبار كتلة ( جدول المواد ) في الهواء في T = 298 K عن طريق وضعها على مقلاةمن ميكروبلانس التحليلية معايرة.
- تحديد حجم V (298 K) من كتلة الاختبار في T = 298 K باستخدام مقياس بيكنوميتر الغاز، أو عن طريق القياسات الأبعاد باستخدام الفرجار. في حالة استخدام القياسات البعدية، يجب أن تكون كتلة الاختبار ذات شكل بسيط ودقيق (لا يوجد أي تناقص أو زوايا مستديرة) ويجب تحديد حجم الحفرة المائلة (لخط التعليق).
- حساب الكتلة م من كتلة الاختبار عن طريق تصحيح الكتلة الظاهرية المقاسة للقوة المزدهرة التي تمارسها الهواء وفقا لما يلي:
حيث ρ الهواء = 1.23 جم / لتر (~ 0.1٪ التصحيح). - وضع التوازن الجزئي على منصة مستقرة ما يقرب من 10 سم فوق قارورة ديوار والتحقق من معايرة لها. تعليق كتلة الاختبار باستخدام 2 مل (50 ميكرون) خط حيدة مربوطة من هوك على الجانب السفلي من التوازن الجزئي (مصممة لتعليق القياسات الشامل) و ثروغ ثقب في كتلة الاختبار. تحديد كتلة واضحة في الهواء، ومقارنتها مع القياس في الخطوة 3.3، وتصحيح حسب الحاجة لكتلة الخط.
- تحديد حجم V (77 K) من كتلة الاختبار في T = 77 K عن طريق قياس كتلة واضحة في النيتروجين السائل النقي، م التطبيق في LN2 . خفض كتلة الاختبار في النيتروجين السائل داخل غرفة النحاس حتى يتم المغمورة تماما. وعندما يتوقف الغليان، يقيس الكتلة الظاهرة.
ملاحظة: إذا النيتروجين السائل في غرفة النحاس هو هادئة والهواء التيارات بين التوازن الجزئي والسطح السائل هي الحد الأدنى، ويمكن قياس هذه الكتلة إلى أكبر من ± 0.0002 غرام من الدقة. - تقدير قوة مزدهرة على الجزء المغمور من الخط، والتحقق من أنها صغيرة مقارنة مع أخطاء القياس.
- حساب حجم وكثافة كتلة الاختبار في 77 K باستخدام كتلتها المعروفة م والكتلة الظاهرة قياس في LN2 في 77 K، م التطبيق طn LN2، وفقا لما يلي:
حيث ρ LN2 ( (77 K) = 0.807 جم / مل.
4. إعداد السائل الأولي N 2 -Ar خليط
- تدفق الغاز أر بمعدل تدفق ~ 2 لتر / دقيقة من خلال أنبوب ملفوف إلى منفذ لها. وضع أنبوب ملفوف على رأس الدعامات العليا التي استقرار موقف غرفة النحاس، فقط فوق مستوى النيتروجين السائل وأقل من السطح العلوي من ديوار. سوف الباردة N 2 والغاز أر بناء فوق السوائل المبردة، والتوصيل الحراري، الحمل الحراري، والإشعاع سوف تبرد الأنابيب والغاز أر داخل.
- بعد السماح للأنبوب ملفوف لتبرد لمدة 5 دقائق، ووضع منفذ من الأنبوب في غرفة النحاس، لا يقل عن 10 سم تحت سطح النيتروجين السائل. ثم تغطية ديوار مع غطاء حلقي وشفافة ورقة.
- ضبط معدل تدفق أر حتى ارتفاع فقاعات أرمن منفذ أنبوب إلى السطح العلوي من النيتروجين السائل. ثم خفض معدل التدفق حتى تشكل الفقاعات في منفذ ولكن تذوب أو تسييل قبل كسر سطح النيتروجين السائل.
ملاحظة: كما يزيد تركيز أر في غرفة النحاس، وضبط دوري معدل تدفق أر حسب الحاجة للحفاظ على تشكيل فقاعة. إذا كان معدل تدفق أر منخفض جدا، قد أر تجميد داخل الأنبوب ومنع التدفق. - إضافة النيتروجين السائل حسب الحاجة للحفاظ على مستواه في ديوار المحيطة بها. إزالة الجليد لأنها تتراكم على الأسطح الباردة.
- تخلط السائل بشكل دوري عن طريق إدخال رقيقة (على سبيل المثال ، 35 ميكرون)، ورقة دائرية من رقائق النحاس تعلق على قضيب العازلة رقيقة في غرفة النحاس، وتحريك ببطء صعودا وهبوطا مثل المكبس. وهذا سوف يقلل التدرجات تركيز والميل ل أر لبلورة من الحل.
5. قياس وضبط كثافة الأولي N 2 -Ar ميكستلح
- احسب الكثافة المستهدفة للمزيج N 2 -A من خلال تقدير الكثافة T = 77 K للعينة المراد قياسها، على سبيل المثال ، القياسات عند تركيزات أعلى للمكون غير المائي للعينة.
- إرفاق كتلة الاختبار باستخدام خط حيدة إلى خطاف على الجانب السفلي من قياس قياس الجزئي، وقياس كتلة واضحة في الهواء، وتأكيد اتفاق مع القياس في الخطوة 3.1.
- خلط الحل N 2 -Ar للقضاء على تركيز وكثافة التدرجات كما هو الحال في الخطوة 4.5.
- بريكول كتلة الاختبار إلى T = 77 K عن طريق خفضه إلى النيتروجين السائل خارج غرفة النحاس. رفع كتلة الاختبار في الطبقة الباردة من غاز النيتروجين فوق النيتروجين السائل، والانتظار المتبقية من النيتروجين السائل لتبخر من كتلة الاختبار، ومن ثم خفض البرد، كتلة اختبار الجافة في N 2 -Ar خليط حتى يتم المغمورة تماما و ضمن 2 سم من سطح السائل.
- زيادة كثافة الحل عن طريق تدفق إضافية أر حتى يتم الحصول على الكثافة الأولية المطلوبة. قطرات العينة التي يمكن بسهولة أن تغرق بالوعة، وبالتالي يجب أن تكون الكثافة الأولية على الأقل أعلى بنسبة مئوية أعلى من كثافة العينة المتوقعة. ثم سوف تطفو العينة، مما يجعل من الاسهل لتتبع ذلك، وكثافة N2 -Ar الخليط ثم تحتاج فقط إلى تعديلها لأسفل بإضافة السائل N 2 .
- إزالة أر بريكولينغ أنبوب ملفوف والسماح للحرارة والجافة قبل الاستخدام المقبل.
6. قطرات التبريد من نموذج الحل
- مباشرة قبل إسقاط الاستغناء والتبريد، كرر الخطوة 1.5 إلى ميلx النيتروجين / الأرجون السائل المبردة. يجب الحرص على عدم إدخال أي فقاعات.
- إزالة غطاء أنبوب أنبوب محكم. باستخدام حقنة نظيفة 1 مل، استخراج ما يصل إلى 1 مل من محلول، واستبدال الغطاء. إرفاق 27 إلى 33 G إبرة على حقنة، ومن ثم دفع كمية صغيرة من العينة من خلال إبرة لطرد الهواء وأي مخلفات من الاستغناء السابقة.
- ويمكن استخدام طريقتين لمشروع عينة قطرات في N 2 -Ar خليط.
- بالنسبة للعينات ذات التركيزات الكبيرة غير المائية (> 45٪ ث / ث) التي يمكن مزجها مع معدلات تبريد متواضعة، اضغط برفق على المحقنة لتهجير قطر صغير (250 ميكرون إلى 1 ملم)، ~ 10 نل إلى 1 ميكرولتر قطرة أن يعلق من طرف الإبرة عن طريق التوتر السطحي. اضغط برفق على الإبرة لفصل ومشروع قطرة نحو السائل N 2 -Ar خليط.
- للعينات التي تتطلب تبريد أسرع للتزجيج، ضع مخرج أنبوب الغاز متصلا جينيرات فراغأو (الموردة من قبل مختبر الهواء المضغوط) في مساحة الغاز فوق السائل N 2 -Ar خليط، وشفط بلطف طبقة الغاز البارد الذي يشكل. وهذا يزيد من معدلات التبريد للعينات الصغيرة 11 .
- تلمس بعناية طرف إبرة إلى 25-75 ميكرون الشريط البوليمر سميكة سميكة للاستغناء عن حجم صغير (<10 نل، الموافق قطرة قطرها <200 ميكرون) من العينة.
ملاحظة: للحصول على أصغر، معظم ما يقرب من كروية، وأكثر سهولة إزالة قطرات، نقع الشريط في حل طلاء مسعور لمدة 10 دقيقة والسماح الجافة قبل العينة الاستغناء. - الاستيلاء على الشريط باستخدام البلاستيك المرفقة أو قضيب الخشب، ويغرق يدويا قضيب بالإضافة إلى الشريط في السائل N 2 -Ar خليط.
- مرة واحدة وقد عززت قطرة والغليان قد توقف، والاستيلاء على حافة الشريط مقابل قضيب باستخدام ملاقط. فليكس الشريط، وحفظه مغمورة في السائل N 2 -Ar، حتى قطرة العينة ينبثق ويطفو إلى تصفحأجاد.
- تلمس بعناية طرف إبرة إلى 25-75 ميكرون الشريط البوليمر سميكة سميكة للاستغناء عن حجم صغير (<10 نل، الموافق قطرة قطرها <200 ميكرون) من العينة.
7 - تقييم حالة العينة
- باستخدام مسافة عمل طويلة (5-10 سم) مجهر مجهر ومشرق، والإضاءة بارد من ليد أو الألياف البصرية المنور، ودراسة بعناية قطرة مع الحفاظ عليه مغمورة في السائل N 2 -Ar. يجب أن تظهر قطرات مزججة واضحة 12 ، 13 . رفض قطرات التي هي ضبابي أو غائم (يحتمل أن تحتوي على أكثر من مرحلة واحدة) و / أو التي تظهر عيوب بصرية بما في ذلك الشقوق (التي قد تترافق مع الفراغات التي تغير متوسط الكثافة).
ملاحظة: اللوحة السطح الداخلي للغرفة النحاس لتوفير خلفية سوداء يمكن أن تسهل تحديد عيوب العينة.
8. تحديد كثافة العينة
- سوف تطفو قطرة الاستغناء في البداية، بالوعة، أو (نادرا) تكون مزدهرة محايدة في خليط N 2 -Ar.يمكن أن تقف قطرات العائمة في بعض الأحيان عن طريق التوتر السطحي، فقاعات صغيرة، أو جزيئات الجليد انضمت. فحص سطح قطرة كامل مع المجهر. قم بتهجير الهبوط لأسفل من سطح السائل باستخدام قضبان بلاستيكية صغيرة أو قضبان خشبية صغيرة (قطرها 2-3 مم، 10 سم)، ومراقبة ردها.
- إذا قطرات المصارف، وزيادة كثافة السائل N 2 -Ar باستخدام الإجراء في الخطوة 4 حتى يصبح قطرة مزدهرة محايدة أو يطفو.
- إذا كان يطفو قطرة، وانخفاض كثافة السائل N 2 -Ar عن طريق إضافة النيتروجين السائل باستخدام 1.8 مل كريوفيال. في كثافات الخليط الأولية الكبيرة (1.2-1.3 جم / مل)، إضافة N 2 في 1 مل الزيادات يعطي تغيرات كبيرة في الكثافة، ولكن ينبغي زيادة هذا نحو 5 مل بكثافات منخفضة (0.8-0.9 ز / مل). خلط بلطف N 2 -Ar (حتى لا تفقد المسار من قطرة العينة) باستخدام رقيقة رقيقة ورقة النحاس مثقوبة صعودا وهبوطا في غرفة النحاس.
- بعد كل N 2 بالإضافة، استخدم قضيب صغير مبرد مسبقا لتهجير العائمة العائمة لأسفل في السائل بلطف، ومراقبة سرعتها عند عودتها إلى السطح.
- عندما يتم تعديل كثافة الحل بحيث يبدو أن الانحدار مزدهر بشكل محايد أو يصعد ببطء شديد (أقل من 50 ميكرون / ثانية سيضمن دقة 0.1٪ أو أفضل كثافة للقطرات مع وحدات التخزين وصولا إلى 50 ليرة لبنانية)، وقياس N 2 - أر كثافة الخليط كما هو موضح في الخطوة 5. ثم إضافة سائل إضافي N 2 حتى يبدأ قطرة الأولى بالوعة ببطء، وقياس كثافة N 2 -Ar خليط مرة أخرى. وسوف توفر هذه القياسات اثنين من الحدود على كثافة الانخفاض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتظهر قياسات الكثافة عند T = 77 K للقطرات المزججة من الجلسرين المائي و جلايكول الإيثيلين مقابل تركيز كريوبروتكتانت في الشكل 1 A والشكل 1 B على التوالي، والتغير المقابل في حجم معين بين T = 298 K و 77 K، محسوبة باستخدام سابقا تحدد T = 298 K الكثافة، هو مبين في الشكل 2 . في تركيزات عالية كريوبروتكتانت، وعقد الحلول على التبريد إلى حالة المزجج، في حين توسع المياه النقية. من المتوقع أن تظهر 20-25٪ ث / ث الحلول من كلا كريوبروتكتانتس لا تظهر أي توسع صافي أو انكماش. انحدار تغير الحجم مقابل التركيز له أكبر حجم أقل من 40٪ ث / ث، حيث آثار كريوبروتكتانت إضافية على هيكل درجة حرارة منخفضة رباعي السطوح المياه هي الأكثر وضوحا.
الشكل 1: المرحلة الزجاجية T = 77 K الكثافة مقابل تركيز كريوبروتكتانت . T = 77 K كثافة مقابل تركيز قطرات مائية مزججة تحتوي على ( A ) الجلسرين و ( B ) جلايكول الإيثيلين. يتم عرض البيانات كما يعني ± سيم من ثلاث قطرات الفردية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التغير في حجم معين على التبريد من السائل عند 298 كيلو فولت إلى المرحلة الزجاجية عند 77 K. نسبة التغير في حجم التبريد من 298 K إلى 77 K ل سولوتي مائيمن الجلسرين والإيثيلين جلايكول. ويتم الحصول على الكثافات الحاملة T = 298 K من القياسات السابقة 14،15. يتم عرض البيانات كما يعني ± سيم من ثلاث قطرات الفردية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجهاز الحالي والأساليب، التي وضعت في المقام الأول من قبل الطلاب الجامعيين مع محدودية الوصول إلى أدوات بناء الآلات والآلات، ومع ذلك يسلم قياسات الكثافة دقيقة للغاية للقطرات السائل الفردية صغيرة مثل 50 بل. في نطاق التركيز القريب وفوق 50٪ ث / ث، حيث معدلات التبريد الصغيرة كافية للحصول على عينات المزجج، والكثافة تتفق مع تلك التي تم الحصول عليها في القياسات السابقة على عينات السائبة. استقراء الكثافات الحالية إلى تركيز 0٪ - المياه النقية - يتفق أيضا بشكل جيد جدا مع كثافة مقبولة من الجليد غير متبلور منخفض الكثافة في 77 K 9 .
توليد N2 -Ar مخاليط المطلوبة بين 30 دقيقة و 5 ساعة من تدفق أر، اعتمادا على النهائي N 2 -Ar الكثافة اللازمة لتقديم تكوين قطرة معينة مزدهرة محايد. ويمكن تخفيض هذه المرة باستخدام الناشر أو أنابيب الغاز متعددة لزيادة مساحة السطح ل أر ميكسينز في السائل المبردة. ضبط كثافة N 2 -Ar حتى يتم التأكد من قطرة لتكون مزدهرة محايدة يمكن أيضا أن تكون مضيعة للوقت، وخاصة بالنسبة قطرات صغيرة ( ص ) قطرات التي لديها سرعات محطة صغيرة ( 
r 2 ) وبالتالي تتطلب ملاحظات أكثر حذرا. يميل الخليط N 2 -A إلى تطوير كثافة عمودية / تكوين التدرج، وبالتالي يجب أن تكون مختلطة بانتظام. وبناء على ذلك، وتحديد نقطة واحدة كثافة الجسم الزجاجي لنوع المذاب معين والتركيز، والتي تتطلب قياسات على الأقل 3-5 قطرات، يمكن أن يستغرق عدة ح.
في كل تركيز، وكثافة من قطرات اثنين أو ثلاث تقاس عادة. وتقدر "كثافة" كل قطرة كمتوسط للحد الأعلى والسفلي المقاسة على الكثافة، نظرا لأكبر كثافة N 2 -A التي تم قياسها والتي جعلت بالوعة قطرة وأصغر كثافة جعلت من تعويم. وبما أن كلا من الحدود العلوية الضيقة والحد الأدنى الضيق - حيث يتم تقييم الضيق من خلال سرعة الصعود أو النسب للقطرة - لا يتم الحصول عليها دائما في القياسات على قطرة معينة (على سبيل المثال ، قد يتم فقدان الهبوط أثناء الخلط)، والقياسات على قطرات من نفس التركيز والحجم في بعض الأحيان جنبا إلى جنب في تقدير كثافة واحدة.
لتقليل مرات التجربة، بذلت محاولات لإعداد وتخزين مخاليط عالية الكثافة N 2 -Ar في حاويات التخزين المبردة للاستخدام بعد يوم واحد أو ثلاثة أيام. في جميع الحالات، أر تبلور من الحل وكثافة السائل انخفضت مع وقت التخزين. كما حدث انخفاض في نسبة التصلب وكثافة السائل أثناء قياسات كثافة الانخفاض إذا لم يكن السائل N 2 -Ar مختلطا بانتظام.
ومن التحديات الرئيسية في هذه القياسات تقليل الصقيع وتكوين الجليد. تكاثف بخار الماء، وتكوين الجليد، وتراكم الجليد علىغرفة التبريد العينة، على الأسطح الباردة الأخرى، في الغاز البارد فوق N2 -Ar خليط، وفي N2 -Ar خليط نفسها يمكن أن تلوث العينات المستخدمة في قياسات الكثافة، وتعزيز نواة الجليد داخلها، وتغيير الكثافة الظاهرية. الجليد على العينة وتطفو على وفي السائل N 2 -Ar خليط يمكن أن تجعل تقييم حالة درجة حرارة منخفضة في العينة (زجاجي أو الكريستالات) صعبة. لتقليل تكوين الجليد، تفقد بانتظام جميع الأسطح الباردة للجليد. إزالة بعناية أي الجليد ميكانيكيا أو باستخدام دافئ N2 الغاز الجاف. إذا تراكم الجليد في غرفة النحاس، وإزالته باستخدام شاشة شبكة غرامة، وإلا إزالة، فارغة، جافة، وإعادة ملء الغرفة.
الحد الأدنى (الحرج) معدل التبريد المطلوبة للحصول على عينة المزجج يزيد مع انخفاض تركيز المذاب، تقترب 10 6 K / ثانية للمياه النقية 7 . تعتمد معدلات التبريد النموذجية على شكل وحجم الانخفاض (زيادةمع انخفاض قطرها)، والسرعة التي من المتوقع إسقاط في المبردة السائل، وجود الغاز البارد فوق المبردة السائل (والتي عادة ما يقلل من معدلات التبريد)، وخصائص السائل المبردة. عموما، معدلات التبريد أكبر من 1،000 ك / ث تتطلب قطرات مع أحجام (أقطار) أصغر من ~ 1 نل (~ 100 ميكرون).
إن أدنى تركيز للذوبان أو البرد الذي يمكن قياس الكثافات الزجاجية له هو الحد الأقصى لمعدلات التبريد، وبأصغر حجم قطرات يمكن استخدام المقياس البصري للتزجيج بشكل موثوق به. ويمكن زيادة معدلات التبريد بعامل ~ 5 بواسطة عينات التبريد في البروبان السائل أو خليط البروبان الإيثان السائل. خلافا للسائل N 2 ، هذه السوائل المبردة لديها فصل كبير بين درجة حرارة الغليان وذوبان وهكذا يمكن أن تمتص المزيد من الحرارة أكثر من الحرارة-- نقل-- الحد من سطح الغليان. ويمكن بعد ذلك نقل قطرات تبريد إلى N 2 -Arخليط لقياس الكثافة. الانتقال من قطرات واضحة إلى قطرات ضبابي أو غائم هو مفاجئ، التي تحدث على نطاق ضيق من تركيز المذاب (حوالي 2٪ ث / ث) ومعدل التبريد، وكان مرتبطا مع حلقات الجليد المظهر في أنماط حيود الأشعة السينية 16 ، 17 - ومع ذلك، يصبح تقييم وضوح بصري دقيق أكثر صعوبة مع انخفاض حجم الانخفاضات نحو 10 بل.
يتم تحديد مدى الوصول للكثافات عينة باستخدام مخاليط N2 -A من كثافات السوائل النقية، 0.81 غرام / مل و 1.40 غرام / مل، على التوالي. مخاليط أر-كر السائلة هي عرضة للتبلور كر، ولكن يمكن أن تستخدم لتوسيع نطاق الكثافة بشرط أن السوائل كانت مختلطة باستمرار.
الطرق الموصوفة هنا قابلة للتطبيق على نطاق واسع لتحديد كثافة المخاليط المائية والخلايا ومجمعات الخلايا، والمواد البيولوجية الأخرى، وغيرها من النظم حيث عينات صغيرة وهناك حاجة لمعدلات تبريد كبيرة لتحقيق مرحلة الحرارة المنخفضة المطلوبة. وهذه الكثافات تكون مفيدة في فهم وتقليل الضرر عينة في الحفظ بالتبريد، وفهم سلوك المياه في المحاليل المائية وفي البيئات المحصورة والمزدحمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني تحت منح مسب-1330685. وتعترف دوم بدعم جزئي من منحة التدريب الجزيئي للفيزياء الحيوية لجامعة كورنيل (نيه T32GM0082567).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 L/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 mL Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20X eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 mL cryovial is adequate |
References
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).
- Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).
- Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58 (3), 459-471 (2002).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311 (4), 851-862 (2001).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization. Q Rev Biophys. 37 (2), 105-119 (2004).
- Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta Cryst Sect D. 66 (4), 366-373 (2010).
- Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions. Phys Rev Lett. 110 (1), 15703 (2013).
- Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating. Acta Cryst Sect D. 59 (4), 697-708 (2003).
- Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices. J Phys Chem B. 115 (48), 14167-14175 (2011).
- Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection. Acta Cryst Sect D. 72 (6), 742-752 (2016).
- Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. Hyperquenching for protein cryocrystallography. J Appl Cryst. 39 (6), 805-811 (2006).
- McFerrin, M. B., Snell, E. H. The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images. J Appl Cryst. 35 (5), 538-545 (2002).
- Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions. J. Appl. Cryst. 38 (3), 412-419 (2005).
- Bosart, L. W., Snoddy, A. O. Specific gravity of glycerol. Ind Eng Chem. 20 (12), 1377-1379 (1928).
- Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure. J Solution Chem. 40 (11), 1863-1873 (2011).
- Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions. J Appl Cryst. 39 (2), 244-251 (2006).
- Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS. Biophys J. 104 (1), 227-236 (2013).
