Summary
Ett protokoll för bestämning av glasfasdensiteterna av mikro- till pico-liter-storlekar av vattenhaltiga blandningar vid kryogena temperaturer beskrivs.
Abstract
Vi demonstrerar en metod för bestämning av de kristalliska temperaturdensiteterna i glasskiktet i vattenhaltiga blandningar och andra prover som kräver snabb kylning för att framställa den önskade kryogena temperaturfasen. Mikroliter till pikoliterstorleksdroppar kyles genom projicering i en flytande kväve-argon (N2-Ar) -blandning. Droppens kryogena temperaturfas utvärderas med användning av en visuell analys som korrelerar med röntgendiffraktionsmätningar. Tätheten av den flytande N 2 -Ar-blandningen justeras genom tillsats av N2 eller Ar tills droppen blir neutralt flytande. Tätheten av denna blandning och därigenom av droppen bestäms med användning av en testmassa och Archimedes-princip. Med lämplig omhändertagning i droppberedning, hantering av gas över den flytande kryogenblandningen för att minimera isbildning och regelbunden blandning av den kryogena blandningen för att förhindra densitetsskiktning och fasseparation, densiteter som är korrekta till <0,5% droppar så små som 50 pL kanLätt fastställas. Mätningar på vattenhaltiga kryoskyddsmedelblandningar ger insikt i kryoprotektionsverkan och tillhandahåller kvantitativa data för att underlätta termisk sammandragnings matchning vid biologisk kryopreservering.
Introduction
De fysikaliska egenskaperna hos vatten och vattenhaltiga blandningar i sina olika faser är av grundläggande intresse och är viktiga för in vivo och in vitro förståelse av biologiska system. Vid modern kryobiologi och biologisk kryopreservering är de vitrösa eller amorfa faserna av vattenhaltiga kryo-skyddande blandningar av särskilt intresse 1 , 2 . Kärnbildning och tillväxt av iskristaller kan störa celler och vävnader och främja proteindetaturering och aggregering, så cryopreservationprotokoll som förglasar lösningsmedlet har blivit alltmer populära. Vid biomolekylär kristallografi stör kristalliseringen av lösningsmedel i kanalerna mellan biomolekyler kristallgitter och försämrar diffraktionsegenskaperna. Vitrifikation uppnås genom en kombination av snabbkylning, dehydratisering och tillsats av kryoskyddande lösningsmedel, såsom glycerol, etylenglykol, polyetylenglykoler (PEG),Alkoholer och salter.
Vitrifikation begränsar iskristallisation och tillväxt, men eliminerar inte all kylprovskada. Exempelvis ökar kristallmosaiciteten (ett mått på fördelningen av kristallplan orienteringar) rutinmässigt med en faktor 10 till 100 när proteinkristaller kyles till ett förglasat tillstånd 3 och efter-tina överlevnadshastigheter för förglasade spermceller och oocyter varierar mycket .
En skademekanism är differentiell sammandragning av lösningsmedel och omgivande material under kylning 3 , 4 , 5 . Ekvivalenslösningsmedels- och lösningsmedelskoncentrationerna i en kristall, cell eller vävnad är temperaturberoende och lösningsmedlet plus lösningsmedlet och omgivande material kan sammandragas med olika mängder. Snabbkylning kan förhindra återfördelning av lösningsmedel och lösningsmedel före vitrifikation och differentialkontrakt På kan leda till stora, inhomogena, icke-jämviktsbelastningar som orsakar provskador.
Rationella tillvägagångssätt för att reducera kylinducerad skada kan sålunda dra nytta av kunskapen om temperaturberoende densiteter av flytande och förglasade vattenhaltiga blandningar. Vid lösta koncentrationer över 50 viktprocent lösningsmedel till vikt av lösning (vikt / vikt) kan de mest vattenhaltiga kryoskyddande blandningarna förglasas med blygsamma kylningshastigheter av 10 K / s eller mindre, vilket möjliggör produktion av och täthetsmätningar med användning av stora glasögonprover 6 . Densiteten kan sedan bestämmas med Archimedes princip, genom att mäta provets synliga vikt när den suspenderas i en flytande kryogen som kväve. Emellertid ökar kylningshastigheten för vitrifikation snabbt, eftersom koncentrationen av lösningsmedlet minskar. Kylhastigheterna för vattenhaltiga glycerolblandningar ökar från <10 K / s vid 50 viktprocent lösningsmedel i g till volymen lösning i ml (vikt / volym) till> 1000 K / s vid 25% vikt / volymRöv = "xref"> 7. Värmeöverföring begränsas begränsat, så att uppnå större kylhastigheter kräver mindre och mindre prov 8 .
Mätningar av densiteten av rent glasat vatten och is har uppnåtts genom avsättning av droppar av mikrometer-diameter (femtoliter volym) i ett vakuum på en kryogeniskt kyld yta för att bygga upp ett makroskopiskt (grammass) prov. Tätheten för detta prov bestämdes genom kryoflotering i en flytande kväve-argonblandning, i vilken densiteten hos den kryogena vätskan justerades tills provet blev neutralt flytande 9 . Att generera stora prover från ett stort antal små droppar på ett sätt som minimerar tomrumsvolymerna - en viktig felkälla vid tidigare mätningar av glasfasdensitet - är inte trivial. För vattenhaltiga blandningar kan differentialindunstning av lösningskomponenter under aerosolisering och avsättning i vakuum leda tillVäsentliga osäkerheter i deponerade koncentrationer.
Vi har utvecklat en metod baserad på kryoflotation som tillåter noggrann densitetsbestämning av vattenhaltiga blandningar med användning av individuella droppar så små som 50 pL 10 . Dessa droppar kan kylas snabbt medan de behåller sina ursprungliga koncentrationer, och deras kryogena temperatur tillstånd (förglasad eller kristallin) kan bedömas med hjälp av en enkel visuell analys som korrelerar med röntgendiffraktionsmätningar. Denna metod är i stor utsträckning tillämplig på vattenhaltiga och icke-vattenhaltiga blandningar och kan utökas till en mängd olika biologiska prover inklusive celler (t ex stam och ägg), vävnadsprover och proteinkristaller med lågtemperaturdensiteter mellan 0,8 och 1,4 g / ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
VARNING: Vänligen se alla relevanta säkerhetsdatablad (MSDS) före användning. Använd alla lämpliga säkerhetsmetoder vid användning av komprimerade gaser, inklusive lämpliga kalibrerade gashanteringsregulatorer och ventiler och godkänd gasrör. Kontakt med flytande kryogener kan orsaka allvarlig frostskada och nekros. Använd lämplig personlig skyddsutrustning (ansiktssköld, handskar, labbrock, fulla längdbyxor, slutna tånskor), vilka alla måste vara ogenomsläppliga för flytande kväve. Förblir stående och se till att det inte finns en fri väg från apparaten när du använder flytande kryogener. Var medveten om risker för kvävning vid användning av komprimerade gaser och flytande kryogener, och arbeta i ett välventilerat område med tillräcklig sminkluft (ett avluftningsskåp eller ett högt luftomsättningshastighetsrum).
1. Framställning av vattenhaltiga lösningar för densitetsmätningar
OBS: Eftersom vikter lättare uppmäts till hög noggrannhet än volymenKoncentrationer mäts i vikt / vikt-enheter. Alla densiteter och smält- eller koktemperaturer antar ett atmosfärstryck av ~ 100 kPa. Följande steg beskriver framställningen av en 35% vikt / vikt glycerollösning. Samma procedur kan användas för andra koncentrationer och lösningsmedel.
- För varje upplösningstyp och koncentration av intresse beräknas den uppskattade lösningsmassan grovt för att erhålla den önskade slutkoncentrationen ( t.ex. mellan 25% vikt / vikt och 100% vikt / vikt) för en total lösningsvolym, V till = 10 ml lösningsvolym . Till exempel, för en 35% vikt / vikt glycerollösning ( p s = 1,26 g / ml) är lösningsmassan m s :
Där x är lösningsmedelsfraktionen (0.35) och pw = 1 g / ml är densiteten av vatten. - Placera ett 15 ml centrifugrör (eller annan volymkalibrerad vattenimpermeabel behållare) på pannanAv en analytisk mikrobalans. Dispensera den önskade massan av lösningsmedel / kryoskyddsmedel ( t.ex. 3,77 g glycerol för en 35% vikt / viktlösning) i röret och registrera den aktuella lösningsmassan.
- Lägg till hög renhet (> 18 MΩ) avjoniserat vatten för att få den totala massan upp till 10,0 g
- Virvel behållaren i 30 s (för flytande lösta ämnen) eller 5 min (för fasta lösningsmedel) tills lösningen är optiskt homogen.
- Mät och registrera lösningens slutliga massa. Täta behållaren med ett lufttätt lock och lagra vid konstant temperatur (293-298 K).
2. Framställning av provkylningskammaren
- Placera försöksapparaten som beskrivs nedan i ett hölje och flöda torr luft (> 5% relativ fuktighet (rh)) i höljet.
OBS! Skåpet kan vara en enkel metallram med dess överdel och tre sidor förseglade med klart plastark och med experimentåtkomst via en fjärde sida täckt med flexibelt plastark. ha på sigAnsiktssköldar och full kroppsöverdrag för att minimera fukt som introducerats av försökspersonen. Fuktkondensation och isbildning kan störa mätningar av kryogen temperaturdensitet på flera sätt, så det måste minimeras. - Placera en disk med neoprengummi på botten av en 4,5 L glas Dewar-kolv, för att skydda Dewar-kolven mot skador.
- Sätt försiktigt in en kolvkammare med hög värmeledningsförmåga (en ihålig cylinder med förseglad botten) i kolven tills den ligger på gummistivan. Justera strutar som skjuter ut från kammaren till Dewar-väggarna så att kammaren är centrerad och inte har någon tendens att rocka.
OBS: Dewar-kolven håller flytande kväve och den mycket mindre volymer kopparkammaren håller en flytande N 2 -Ar-blandning. Det flytande kvävet ger ett termiskt bad som håller kopparkammaren och dess innehåll vid en konstant temperatur på 77 K och reducerar koknings- och förångningsförluster i kammaren. Kammaren & #39; s små diameter undertrycker ytvågor som kan störa flytmätningar och hjälper till att isolera vätskan i kammaren från frost och isbildning som bildas någon annanstans i apparaten. - Sätt in ett gasrörs utlopp med torr N 2 gas som flyter vid ~ 2 L / min ner till botten av kopparkammaren och rena kammaren med fuktig luft.
- Häll långsamt flytande kväve i Dewar-kolven, utanför kopparkammaren, så att tiden för kväve kan koka bort.
OBS! Den slutliga fyllningsnivån, efter att kokningen har upphört, bör ligga inom ca 4 cm av kopparkammarens övre del. - Täck den yttre delen av Dewar-kolven med ett ringformigt skumisoleringslock. Ta bort det torra N 2- gasreningsröret från kopparkammaren och sätt i en matchande öppning i locket.
OBS: Kombinationen av N 2 gas från koka-off i Dewar-kolven och från renflödet utlöser all fuktig luft och förhindrar kondensering och kristallisering av oN kalla ytor. - Häll långsamt flytande kväve i kopparkammaren. Den slutliga fyllningsnivån, efter att kokningen har upphört, bör ligga inom ca 4 cm av kopparkammarens topp.
- Placera ett tunt, optiskt transparent plastark över den centrala öppningen eller ventilen i locket och minska N 2- gasflödet till ~ 0,2 l / min, vilket ger ett litet övertryck av N 2 -gas i gasutrymmena ovanför de kryogena vätskorna.
OBS! Så länge som kryogena vätskor finns i Dewar och kammaren, fortsätt att justera N 2- gasflödet efter behov för att bibehålla detta övertryck och förhindra att fukt kommer in i Dewar och bildar is.
3. Bestämning av testmassans volym och densitet vid T = 298 K och T = 77 K
- Bestäm den uppenbara massan av en ~ 1 g, 0,4 ml PTFE-provmassa ( tabell av material ) i luft vid T = 298 K genom att placera den på pannanAv en kalibrerad analytisk mikrobalans.
- Bestäm volymen V (298 K) hos testmassan vid T = 298 K med en gaspyknometer eller genom dimensionella mätningar med hjälp av kaliper. Om mätmåttet används, måste provmassan ha en enkel, exakt form (inga avsmalnande eller avrundade hörn) och volymen av genomgången (för suspensionslinjen) ska bestämmas.
- Beräkna massans massa m av testmassan genom att korrigera den uppmätta uppenbara massan för den flytkraft som utövas av luft enligt följande:
Där ρ luft = 1,23 g / L (~ 0,1% korrigering). - Placera mikrobalansen på en stabil plattform ungefär 10 cm ovanför Dewar-kolven och verifiera kalibreringen. Ställ in testmassan med hjälp av en 2 mil (50 μm) monofilamentlinje som är spänd från kroken på undersidan av mikrobalansen (konstruerad för hängande massmätningar) och throuGh ett hål i testmassan. Bestäm den uppenbara massan i luften och jämföra med mätningen i steg 3.3, korrigera efter behov för massan av linjen.
- Bestäm provviktens volym V (77 K) vid T = 77 K genom att mäta sin uppenbara massa i rent flytande kväve, m app i LN2 . Sänk provmassan i det flytande kvävet i kopparkammaren tills det är helt nedsänkt. När kokningen har upphört, mäta den uppenbara massan.
OBS! Om det flytande kvävet i kopparkammaren är lugnt och luftströmmarna mellan mikrobalans och vätskeytan är minimala, kan denna massa mätas till mer än ± 0,0002 g noggrannhet. - Uppskatta den flytande kraften på den nedsänkta delen av linjen och verifiera att den är liten jämfört med mätfel.
- Beräkna testmassans volym och densitet vid 77 K med dess kända massa m och den uppmätta uppenbara massan i LN2 vid 77 K, m app iN LN2, enligt följande:
Där p LN2 ( (77 K) = 0,807 g / ml.
4. Framställning av den ursprungliga flytande N2 -Ar-blandningen
- Flödesgas med en flödeshastighet av ~ 2 L / min genom ett spolat rör till dess utlopp. Placera det spiralformade röret ovanpå de övre strutarna som stabiliserar kopparkammarens position, precis ovanför den flytande kvävenivån och under Dewar-toppytan. Kall N 2 och Ar gas kommer att byggas upp ovanför de kryogena vätskorna, och termisk ledning, konvektion och strålning kommer att kyla röret och Ar gasen inuti.
- Efter att ha låt det spiralformade röret svalna i 5 minuter, placera rörets utlopp i kopparkammaren, minst 10 cm under vätskekvätskans yta. Däcket täcker sedan Dewar med det ringformiga locket och det genomskinliga arket.
- Justera Ar flödeshastigheten tills Ar bubblor stigerFrån rörutloppet till den övre ytan av det flytande kvävet. Därefter minskar flödeshastigheten tills bubblorna bildar sig vid utloppet men löses upp eller löses innan de bryts av den flytande kväveytan.
OBSERVERA: När Ar-koncentrationen i kopparkammaren ökar, justera periodiskt Ar-flödet vid behov för att bibehålla bubbelbildning. Om Ar-flödet är för lågt kan Ar frysa inuti röret och blockera flödet. - Tillsätt flytande kväve som behövs för att behålla sin nivå i den omgivande Dewar. Ta bort isen när den ackumuleras på kalla ytor.
- Blanda regelbundet vätskan genom att sätta i ett tunt (t ex 35 mikron) cirkulärt ark kopparfolie fäst vid en tunn isoleringsstång i kopparkammaren och långsamt förflytta den upp och ner som en kolv. Detta kommer att minska koncentrationsgradienterna och tendensen för Ar att kristallisera ur lösningen.
5. Mätning och justering av densiteten hos den inledande N 2 -Ar-mixenture
- Beräkna måldensiteten för N 2 -Ar-blandningen genom att uppskatta T = 77 K-densiteten hos provet som skall mätas, t.ex. mätningar vid högre koncentrationer av provets icke-vattenhaltiga komponent.
- Fäst provmassan med monofilamentlinjen till kroken på undersidan av mätmätaren, mät dess uppenbara massa i luft och bekräfta överensstämmelse med mätningen i steg 3.1.
- Blanda N 2 -Ar-lösningen för att eliminera koncentrations- och densitetsgradienter som i steg 4.5.
- Förkör provmassan till T = 77 K genom att sänka den i det flytande kvävet utanför kopparkammaren. Höj testmassan i det kalla lagret av kvävgas över det flytande kvävet, vänta på att kvarvarande flytande kväve förångas av provmassan och sänk sedan den kalla, torra provmassan i N 2 -Ar-blandningen tills den är helt nedsänkt och Inom 2 cm av den flytande ytan.
- Öka lösningsdensiteten genom att flöda ytterligare Ar tills önskad initialdensitet erhålles. Provdroppar som sinken kan enkelt gå vilse, så bör initialtätheten vara minst några procent högre än den förväntade provdensiteten. Provet kommer då att flyta, vilket gör det enklare att hålla reda på det, och N 2 -Ar-blandningstätheten behöver då justeras nedåt genom att tillsätta flytande N 2 .
- Ta bort Ar förkylningspolarröret och låt det värma och torka före nästa användning.
6. Kyldroppar av provlösning
- Omedelbart före droppdispensering och kylning, upprepa steg 1,5 till miX kväve / argonkryogen vätska. Var försiktig så att du inte introducerar några bubblor.
- Ta bort provrörets lufttäta lock. Använd en ren 1 ml spruta, extrahera upp till 1 ml lösning och byt ut locket. Fäst en nål på 27 till 33 g på sprutan och tryck sedan en liten mängd prov genom nålen för att utesluta luft och eventuella rester från tidigare dosering.
- Två metoder kan användas för att projicera provdroppar i N2-Ar-blandningen.
- För prov med stora koncentrationer av icke-vattenhaltig komponent (> 45% vikt / vikt) som kan förglasas med blygsamma kylhastigheter, tryck lätt på sprutan för att förskjuta en liten diameter (250 μm till 1 mm), ~ 10 nL till 1 μl droppe Som hänger från nålspetsen genom ytspänning. Tryck försiktigt på nålen för att lossa och projicera droppen mot den flytande N 2 -Ar-blandningen.
- För prov som kräver snabbare kylning för vitrifikering, placera utloppet på ett gasrör anslutet till en vakuumgeneratEller (levereras av tryckluftsluft) i gasutrymmet ovanför den flytande N 2 -Ar-blandningen och försiktigt suga bort det kalla gasskiktet som bildar. Detta ökar kylhastigheten för små prov 11 .
- Rör noggrant nålspetsen till en 25-75 μm tjock klar polymerremsa för att ge en liten volym (<10 nL motsvarande en droppdiameter <200 μm) av provet.
ANMÄRKNING: För att få de minsta, nästan sfäriska och lättast avlägsna dropparna, dra in remsan i en hydrofob beläggningslösning under 10 minuter och låt torka före provutmatning. - Ta tag i remsan med hjälp av en fast plast- eller trästång och stryk stången och remsan manuellt i den flytande N 2 -Ar-blandningen.
- När droppen har stelnat och kokningen har upphört, ta tag i remkanten motsatt stången med hjälp av pincett. Flexera remsan och håll den nedsänkt i vätskan N 2 -Ar tills provfallet dyker upp och flyter till surfeness.
- Rör noggrant nålspetsen till en 25-75 μm tjock klar polymerremsa för att ge en liten volym (<10 nL motsvarande en droppdiameter <200 μm) av provet.
7. Bedömning av provets tillstånd
- Med hjälp av ett långt arbetsavstånd (5-10 cm) kikokemikroskop och ljus, kall belysning från en LED- eller fiberoptisk belysning, undersök droppen noggrant och håll den nedsänkt i vätskan N 2 -Ar. Förglasade droppar ska vara klara 12 , 13 . Avvisa droppar som är disiga eller grumliga (sannolikt som innehåller mer än en fas) och / eller som visar optiska ofullkomligheter inklusive sprickor (som kan vara associerade med tomrum som ändrar genomsnittlig densitet).
OBS! Att måla kopparkammarens inre yta för att ge en svart bakgrund kan underlätta identifieringen av provfel.
8. Bestämning av provets densitet
- Den utmatade droppen kommer initialt att flyta, sjunka eller (sällan) vara neutralt flytande i N2-Ar-blandningen.Flytande droppar kan ibland hållas upp med ytspänning, små bubblor eller vidhäftande ispartiklar. Kontrollera hela droppytan med mikroskopet. Förskjut droppen nedåt från vätskan med en liten (2-3 mm diameter, 10 cm lång) förkyld plast eller trästång och observera dess svar.
- Om droppen sänker, ökar densiteten hos vätskan N2-Ar med proceduren i steg 4 tills droppen blir neutral flytande eller flytande.
- Om droppen flyter, minska densiteten hos vätskan N 2 -Ar genom att tillsätta flytande kväve med en 1,8 ml cryovial. Vid stora initialt blandningsdensiteter (1,2-1,3 g / ml) ger tillsats av N2 i steg om 1 ml signifikanta densitetsförändringar, men detta bör ökas mot 5 ml vid låga densiteter (0,8-0,9 g / ml). Blanda försiktigt N 2 -Ar (för att inte förlora spår av provfallet) med hjälp av det tunna perforerade kopparfoliearket upp och ner i kopparkammaren.
- Efter varje N 2 tillsats, Använd en liten förkyld stång för att försiktigt förflytta den flytande droppen neråt i vätskan och observera dess hastighet när den återgår till ytan.
- När lösningstätheten har justerats så att droppen verkar vara neutral eller uppstigning mycket långsamt (<50 μm / s säkerställer ~ 0,1% eller bättre densitetsnoggrannhet för droppar med volymer ner till 50 pL), mäta N 2 - Ar blandningsdensitet som beskrivs i steg 5. Sedan tillsätt ytterligare Vätska N2 tills droppen först börjar sakta sjunka och mät N2 -Ar-blandningstätheten igen. Dessa två mätningar kommer att ge gränser för droppdensiteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Densitetsmätningar vid T = 77 K för förglasade droppar av vattenhaltig glycerol och etylenglykol mot kryoprotektantkoncentration visas i Figur 1 A respektive Figur 1 B och motsvarande ändring i specifik volym mellan T = 298 K och 77 K, beräknat med användning tidigare Bestämda T = 298 K densiteter, visas i figur 2 . Vid höga cryoprotectantkoncentrationer sammandrags lösningarna vid kylning till förglasat tillstånd, medan rent vatten expanderar. Nära 20-25% vikt / viktlösningar av båda kryoprotektiva medel förutses inte visa någon expansion eller kontraktion. Höjden av volymförändringen mot koncentrationen har den största storleken under 40% vikt / vikt, där effekterna av ytterligare kryoskyddsmedel på vattenets tetrahedriska lågtemperaturstruktur är mest uttalade.
Figur 1: Vitrosfas T = 77 K Densitet Versus Cryoprotektantkoncentration . T = 77 K-densitet kontra koncentration för förglasade vattenhaltiga droppar innehållande ( A ) glycerol och ( B ) etylenglykol. Data presenteras som medelvärde ± SEM av tre individuella droppar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Förändring av specifikt volym vid kylning från vätska vid 298 K till vitglasfasen vid 77 K. Procentvolymförändring vid kylning från 298 K till 77 K för vattenlösningGlycerol och etylenglykol. T = 298 K lösningsdensiteter erhålles från tidigare mätningar 14 , 15 . Data presenteras som medelvärde ± SEM av tre individuella droppar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Föreliggande apparat och metoder, som utvecklats huvudsakligen av doktorander med begränsad tillgång till instrumentbyggnadsverktyg och maskiner, ger likväl höga noggranna täthetsmätningar för enskilda vätskedroppar så små som 50 pL. I koncentrationsområdet nära och över 50% vikt / vikt, där små kylhastigheter är tillräckliga för erhållande av förglasade prov, överensstämmer densiteterna med de som erhållits i tidigare mätningar på bulkprover. Extrapoleringar av nuvarande densiteter till 0% koncentration - rent vatten - överensstämmer också ganska bra med den accepterade densiteten av amorf is med låg densitet vid 77 K 9 .
Generering av de N2-Ar-blandningar som krävs mellan 30 min och 5 h Ar-flöde, beroende på den slutliga N2 -Ar-densiteten som erfordras för att göra en given droppkomposition neutralt flytande. Denna tid kan minskas genom att använda en diffusor eller flera gasrör för att öka ytan för Ar mixinG i den kryogena vätskan. Justering av N 2 -Ar-densiteten tills en droppe konstateras vara neutralt flytande kan också vara tidskrävande, speciellt för småradie ( r ) droppar som har små terminalhastigheter ( 
R 2 ) och så kräver noggrannare observationer. N 2 -Ar-blandningen tenderar att utveckla en vertikal densitet / kompositiongradient, och så måste blandningen regelbundet blandas. Följaktligen kan bestämning av en enda glasögonfasdensitetspunkt för en given lösartyp och koncentration, som kräver mätningar på minst 3-5 droppar, ta flera h.
Vid varje koncentration mäts typiskt densiteterna av två eller tre droppar. "Densitet" för varje droppe uppskattas som medelvärdet av de uppmätta övre och nedre gränserna på densiteten, som ges av den största uppmätta N 2 -Ar-densiteten som gjorde droppavloppet och den minsta densiteten som gjorde det flyta. Eftersom både ett tätt övre gränsen och ett tätt nedre gränsen - där täthet bedöms med stigningshastigheten eller nedgången av droppen - inte alltid erhålles i mätningar på en given droppe (t ex droppen kan gå förlorad vid blandning), mätningar På droppar av samma koncentration och storlek kombinerades ibland i en enda densitetsuppskattning.
För att minska experimenttiderna gjordes försök att förbereda och lagra högdensitets N 2 -Ar-blandningar i kryogena förvaringsbehållare för användning en till tre dagar senare. I alla fall kristalliserade Ar ur lösningen och vätsketätheten minskade med lagringstid. Ar-solidifiering och minskning av vätsketäthet inträffade också under droppdensitetsmätningar om vätskan N2-Ar inte blandades regelbundet.
En stor utmaning i dessa mätningar minskar frost- och isbildning. Vattenångkondensation, isbildning och isackumulering påProvkylkammare, på andra kalla ytor, i den kalla gasen över N 2 -Ar-blandningen, och i N 2 -Ar-blandningen kan man själv kontaminera prover som används i densitetsmätningar, främja iskärnbildning i dem och ändra sin uppenbara densitet. Is på provet och flytande på och i den flytande N 2 -Ar-blandningen kan göra det svårt att bedöma provets lågtemperaturtillstånd (glasögon eller polykristallin). För att minimera isbildning, inspektera regelbundet alla kalla ytor för is. Ta försiktigt bort isen mekaniskt eller använd en varm torr N 2- gas. Om is ackumuleras i kopparkammaren, ta bort den med en fin maskeringsskärm, eller ta bort, töm, torka och fyll på kammaren.
Den minsta (kritiska) kylahastigheten som krävs för att erhålla ett förglasat prov ökar med minskande koncentration av lösningsmedel, närmar sig 10 6 K / s för rent vatten 7 . Provkylningshastigheten beror på droppform och storlek (ökningAsing med minskande diameter), den hastighet med vilken droppen projiceras i den flytande kryogenen, närvaron av kall gas över vätskekryogen (som vanligtvis minskar kylhastigheter) och egenskaperna hos den flytande kryogenen. Generellt kräver kylningshastigheter större än 1000 K / s droppar med volymer (diametrar) mindre än ~ 1 nL (~ 100 μm).
Den lägsta koncentrationen av lösningsmedlet eller kryoprotektanten, för vilken glasdensiteter kan mätas, bestäms av maximala droppkylningshastigheter och av de minsta storlekarna för vilka den visuella analysen för vitrifikation kan användas på ett tillförlitligt sätt. Kylhastigheter kan ökas med en faktor på ~ 5 genom att kyla prov i flytande propan eller en flytande propan-etanblandning. Till skillnad från flytande N2 har dessa kryogena vätskor en stor separation mellan koknings- och smältemperaturer och kan så absorbera mycket mer värme utan att värmeöverföringsbegränsande yta kokar. Kylda droppar kan sedan överföras till N2-ArBlandning för densitetsmätningar. Övergången från klara droppar till dimmiga eller grumliga droppar är brått, som uppträder över ett smalt intervall av lösta koncentration (ungefär 2% vikt / vikt) och kylningshastighet och har korrelerats med utseendet av isringar i röntgendiffraktionsmönster 16 , 17 . Emellertid blir noggrannare visuell klarhetsbedömning svårare eftersom droppvolymen minskar mot 10 pL.
Det tillgängliga intervallet av provdensiteter med användning av N2-Ar-blandningar bestäms av densiteterna för de rena vätskorna, respektive 0,81 g / ml respektive 1,40 g / ml. Vätskeformiga Ar-Kr-blandningar är mottagliga för Kr-kristallisation men kan användas för att förlänga detta täthetsområde, förutsatt att vätskorna blandas konstant.
De metoder som beskrivs här är i stor utsträckning tillämpliga för bestämning av densiteter av vattenhaltiga blandningar, celler, cellaggregat, andra biologiska material och andra system där små prov ochStora kylhastigheter krävs för att uppnå den önskade lågtemperaturfasen. Dessa tätheter kommer att vara användbara vid förståelse och minimering av provskador vid kryopreservering och för att förstå vattenets beteende i vattenhaltiga lösningar och i begränsade och trånga miljöer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NSF under tilldelning MCB-1330685. DWM bekräftar partiellt stöd från Cornell Universitys Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32GM0082567).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 L/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 mL Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20X eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 mL cryovial is adequate |
References
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).
- Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).
- Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58 (3), 459-471 (2002).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311 (4), 851-862 (2001).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization. Q Rev Biophys. 37 (2), 105-119 (2004).
- Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta Cryst Sect D. 66 (4), 366-373 (2010).
- Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions. Phys Rev Lett. 110 (1), 15703 (2013).
- Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating. Acta Cryst Sect D. 59 (4), 697-708 (2003).
- Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices. J Phys Chem B. 115 (48), 14167-14175 (2011).
- Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection. Acta Cryst Sect D. 72 (6), 742-752 (2016).
- Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. Hyperquenching for protein cryocrystallography. J Appl Cryst. 39 (6), 805-811 (2006).
- McFerrin, M. B., Snell, E. H. The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images. J Appl Cryst. 35 (5), 538-545 (2002).
- Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions. J. Appl. Cryst. 38 (3), 412-419 (2005).
- Bosart, L. W., Snoddy, A. O. Specific gravity of glycerol. Ind Eng Chem. 20 (12), 1377-1379 (1928).
- Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure. J Solution Chem. 40 (11), 1863-1873 (2011).
- Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions. J Appl Cryst. 39 (2), 244-251 (2006).
- Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS. Biophys J. 104 (1), 227-236 (2013).
