Summary
Een protocol voor de bepaling van de glasvezeldichtheden van micro- tot pico-liter-grootte druppels waterige mengsels bij cryogene temperaturen wordt beschreven.
Abstract
Wij tonen een methode voor het bepalen van de cryogene temperatuurdichtheid van de vitreousfase van waterige mengsels en andere monsters die snelle koeling vereisen, om de gewenste cryogene temperatuurfase te bereiden. Microliter naar picoliter-grootte druppels worden door projectie afgekoeld in een vloeibaar stikstof-argon (N2-Ar) mengsel. De cryogene temperatuurfase van de druppel wordt geëvalueerd met behulp van een visuele analyse die correleert met röntgendiffractiemetingen. De dichtheid van het vloeibare N 2 -Ar mengsel wordt aangepast door N 2 of Ar toe te voegen tot de druppel neutraal vloeibaar wordt. De dichtheid van dit mengsel en dus van de druppel wordt bepaald met behulp van een testmassa en Archimedes-principe. Met gepaste zorg in druppelbereiding, het beheer van gas boven het vloeibare cryogeenmengsel om ijsvorming te minimaliseren en regelmatig mengen van het cryogene mengsel om dichtheidsstratificatie en fasescheiding te voorkomen, dichtheden nauwkeurig op <0,5% druppels zo klein als 50 pL kanGemakkelijk te bepalen. Metingen op waterige cryoprotectantmengsels zorgen voor inzicht in cryoprotectantwerking, en bieden kwantitatieve data om thermische samentrekking bij biologische cryopreservering te vergemakkelijken.
Introduction
De fysieke eigenschappen van water en waterige mengsels in hun verschillende fasen zijn van fundamenteel belang en zijn belangrijk voor in vivo en in vitro begrip van biologische systemen. In de hedendaagse cryobiologie en biologische cryopreservering zijn de glazen of amorfe fasen van waterige cryoprotectantmengsels van bijzonder belang 1 , 2 . Nucleatie en groei van ijskristallen kunnen cellen en weefsels verstoren, en eiwit denaturatie en aggregatie bevorderen, zodat cryopreserverprotocollen die het oplosmiddel vertonen zijn steeds populairder geworden. Bij biomoleculaire kristallografie verstoort de kristallisatie van oplosmiddel in de kanalen tussen biomoleculen kristalroosters en verlaagt diffractie-eigenschappen. Vitrificatie wordt bereikt door middel van een combinatie van snelle koeling, uitdroging en toevoeging van cryoprotectieve opgeloste stoffen, zoals glycerol, ethyleenglycol, polyethyleenglycolen (PEG's),Alcoholen en zouten.
Vitrificatie beperkt ijskristallisatie en -groei, maar elimineert niet alle koelverwante steekproeven. Bijvoorbeeld, kristalmozaïciteit (een maat van de verdeling van kristalvlak-oriëntaties) verhoogt routinematig met een factor van 10 tot 100 wanneer eiwitkristallen in een verglaasde toestand 3 worden gekoeld en de overlevingssnelheden van versterkte spermacellen en oocyten verschillen na het ontdooien .
Een schademechanisme is een differentiële samentrekking van oplosmiddel en omringend materiaal tijdens koeling 3 , 4 , 5 . De evenwichtsoplosmiddel en oplosmiddelconcentraties in een kristal, cel of weefsel zijn afhankelijk van de temperatuur, en het oplosmiddel plus het opgeloste materiaal en het omringende materiaal kunnen door verschillende hoeveelheden contracteren. Snelle afkoeling kan voorkomen dat oplosmiddel en opgeloste stof opnieuw worden verdeeld voor vitrificatie en differentiële contractie Op kan leiden tot grote, onomogene, niet-evenwichtige stressen die leiden tot monsterschade.
Rationele benaderingen om de door koel geïnduceerde schade te verminderen kunnen derhalve profiteren van de kennis van temperatuurafhankelijke dichtheden van vloeibare en verglaasde waterige mengsels. Bij oplosbare concentraties boven 50 gew.% Opgeloste stof tot gewichtsoplossing (w / w) kunnen de meeste waterige cryoprotectantmengsels vergiftigd worden met bescheiden koelsnelheden van 10 K / s of minder, waardoor productie van en dichtheidsmetingen met behulp van grote glasachtige monsters 6 mogelijk wordt gemaakt . Dichtheid kan dan bepaald worden met Archimedes 'principe, door het schijnbare gewicht van het monster te meten wanneer het in een vloeibaar cryogeen zoals stikstof wordt gesuspendeerd. Aangezien de opgeloste concentratie afneemt, stijgen de koelsnelheden die nodig zijn voor vitrificatie snel toe: Koelhoeveelheden voor waterige glycerolmengsels verhogen van <10 K / s bij 50% gewicht opgelost in g tot volume oplossing in ml (w / v) tot> 1.000 K / s bij 25% w / vAss = "xref"> 7. Warmteoverdracht wordt grenslaag beperkt, zodat het bereiken van grotere koelsnelheden minder en kleinere monsters vereist 8 .
Metingen van de dichtheid van zuiver glasachtig water en ijs zijn bereikt door druppels van micrometer-diameter (femtoliter volume) in een vacuüm op een cryogeen afgekoeld oppervlak te deponeren teneinde een macroscopische (grammassa) monster op te bouwen. De dichtheid van dit monster werd bepaald door cryoflotatie in een vloeibaar stikstof-argon mengsel waarin de dichtheid van de cryogene vloeistof werd aangepast totdat het monster neutraal vloeibaar werd 9 . Het genereren van grote monsters uit een groot aantal kleine druppels op een manier die de leegtevolumes minimaliseert - een belangrijke bron van fout in de vorige metingen van de glasvezeldichtheid - is niet triviaal. Voor waterige mengsels kan differentiële verdamping van oplosmiddelcomponenten tijdens aerosolisatie en afzetting in een vacuüm leiden totAanzienlijke onzekerheden in gedeponeerde concentraties.
We hebben een methode ontwikkeld op basis van cryoflotatie, waarmee nauwkeurige dichtheidsbepaling van waterige mengsels met behulp van individuele druppels zo klein mogelijk is als 50 pL 10 . Deze druppels kunnen snel afgekoeld worden, terwijl hun oorspronkelijke concentraties behouden worden, en hun cryogene temperatuurstoestand (verglaasd of kristallijn) kan worden beoordeeld aan de hand van een eenvoudige visuele analyse die correleert met röntgendiffractiemetingen. Deze methode is brede toepasbaar op waterige en niet-waterige mengsels en kan uitgebreid worden naar een verscheidenheid aan biologische monsters, waaronder cellen ( bijv . Stam en ei), weefselmonsters en eiwitkristallen met een lage temperatuurdichtheid tussen 0,8 en 1,4 g / ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
VOORZICHTIG: Raadpleeg al de relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) voor gebruik. Gebruik alstublieft alle passende veiligheidspraktijken bij het gebruik van gecomprimeerde gassen, met inbegrip van geschikte, gecalibreerde gasbeheersingsregelaars en kleppen en goedgekeurde gasbuisjes. Contact met vloeibare cryogenen kan ernstige bevroren en nekrose veroorzaken. Gebruik geschikte persoonlijke beschermende uitrusting (gezichtsschild, handschoenen, laboratoriumjas, broek met volledige lengte, gesloten-schoenen), die allemaal ondoordringbaar zijn voor vloeibaar stikstof. Blijf staand en zorg voor een onbelemmerde uitgangspad van het apparaat bij het gebruik van vloeibare cryogenen. Wees bewust van verstoringsgevaar bij het gebruik van gecomprimeerde gassen en vloeibare cryogenen, en werk in een goed geventileerde ruimte met een adequate make-uplucht (een afzuigkap of een hoge luchtomschakelingskamer).
1. Bereiding van waterige oplossingen voor dichtheidsmetingen
OPMERKING: Omdat gewichten gemeterd worden met een hoge nauwkeurigheid dan volConcentraties, worden de concentraties in massa gemeten. Alle dichtheden en smelt- of kooktemperatuur nemen een atmosferische druk van ~ 100 kPa in. De volgende stappen beschrijven de bereiding van een 35% w / w glyceroloplossing. Dezelfde procedure kan gebruikt worden voor andere concentraties en opgeloste stoffen.
- Voor elk opgelost type en de belangenconcentratie schatten u de benodigde opgeloste massa grondig om de gewenste uiteindelijke concentratie te verkrijgen ( bijvoorbeeld tussen 25% w / w en 100% w / w) voor een totaal oplossing volume, V tot = 10 ml oplossing volume . Bijvoorbeeld, voor een 35% w / w glyceroloplossing ( p s = 1,26 g / ml) is de opgeloste massa ms:
Waar x de opgeloste massa-fractie (0,35) en ρw = 1 g / ml is de dichtheid van water. - Plaats een 15 ml centrifugebuis (of een andere volumekalibreerde water-doorlaatbare houder) op de panVan een analytische microbalans. Spuit de gewenste massa van opgeloste stof / cryoprotectant ( bijv . 3,77 g glycerol voor een oplossing van 35% w / w) in de buis op en teken de werkelijke opgeloste massa op.
- Voeg hoge zuiverheid (> 18 MΩ) gedeïoniseerd water toe om de totale massa tot 10,0 g te brengen
- Vortex de container gedurende 30 s (voor vloeibare opgeloste stoffen) of 5 min (voor vaste oplosmiddelen), tot de oplossing optisch homogeen is.
- Meet en teken de uiteindelijke massa van de oplossing op. Verzegel de container met een luchtdichte dop en houd deze bij een constante temperatuur (293-298 K).
2. Bereiding van de monster koelkamer
- Plaats de onderstaande experimentele apparaten in een omhulling en laat de droge lucht stroomt (> 5% relatieve vochtigheid (rh)) in de behuizing.
OPMERKING: De behuizing kan een eenvoudig metalen frame zijn met de bovenste en drie zijden afgesloten met een helder plastic vel en met toegang tot het experiment via een vierde zijde bedekt met flexibel plastic vel. SlijtageGezichtsschilden en volledige lichaamsbedekking om het vocht dat door de experimentator wordt geïntroduceerd te minimaliseren. Vochtcondensatie en ijsvorming kunnen op verschillende manieren met cryogene temperatuurdichtheidsmetingen storen en daarom moet het worden geminimaliseerd. - Plaats een schijf van neopreenrubber op de bodem van een 4,5 L glazen Dewar-fles om de Dewar-fles te beschermen tegen schade.
- Zet een koperkamer met hoge warmtegeleidingsvermogen (een holle cilinder met verzegelde bodem) zorgvuldig in de fles totdat deze op de rubberen schijf rust. Verstel stutten uitwaarts vanuit de kamer naar de Dewar muren, zodat de kamer centraal staat en geen neiging heeft om te rotsen.
OPMERKING: De Dewar-fles zal vloeibaar stikstof bevatten, en de veel kleiner volume koperkamer bevat een vloeibaar N 2 -Ar mengsel. De vloeibare stikstof zorgt voor een thermisch bad dat de koperkamer en de inhoud ervan bij een constante temperatuur van 77 K handhaaft en kokende en verdampingsverliezen in de kamer vermindert. De Kamer' s kleine diameter onderdrukt oppervlakgolven die de drijfmetingen kunnen verstoren en helpt de vloeistof in de kamer te isoleren tegen vorst en ijs elders in de inrichting. - Steek de uitlaat van een gasbuis in met een droog N 2- gas dat bij ~ 2 L / min stroomt tot de bodem van de koperkamer en maak de kamer van vochtige lucht schoon.
- Giet vloeibare stikstof langzaam in de Dewar-fles, buiten de koperkamer, zodat de tijd voor stikstof afkoelt.
OPMERKING: Het uiteindelijke vulniveau, na het koken, is gestopt, moet binnen ongeveer 4 cm van de bovenkant van de koperkamer liggen. - Bedek het buitenste gedeelte van de Dewar-fles met een ringvormige schuimisolerende deksel. Verwijder de droge N 2- gaszuiveringsbuis uit de koperkamer en plaats in een bijpassende opening in het deksel.
OPMERKING: De combinatie van N 2- gas van afkoeling in de Dewar-fles en van de zuiveringsstroom verontreinigt elke vochtige lucht en voorkomt dat het condenseert en kristaliseert oN koude oppervlakken. - Giet vloeibare stikstof langzaam in de koperkamer. Het uiteindelijke vulniveau, na het koken, is gestopt, moet binnen ongeveer 4 cm van de bovenkant van de koperkamer liggen.
- Plaats een dun, optisch transparant plastic vel over de centrale opening of deksel in de deksel en verminder de N 2- gasstroomsnelheid tot ~ 0,2 L / min, waardoor een weinig overdruk van N 2- gas binnen de gasruimten boven de cryogene vloeistoffen wordt gelaten.
OPMERKING: Zolang er cryogene vloeistoffen aanwezig zijn in de Dewar en de kamer, moet u de N 2- gasstroom verder aanpassen om dit overdruk te behouden en voorkomen dat vocht in de Dewar komt en ijs vormt.
3. Bepaling van het volume en de dichtheid van de testmassa bij T = 298 K en T = 77 K
- Bepaal de schijnbare massa van een ~ 1 g, 0,4 ml PTFE-testmassa ( Tabel ) in de lucht bij T = 298 K door het op de pan te plaatsenVan een gekalibreerde analytische microbalans.
- Bepaal het volume V (298 K) van de testmassa bij T = 298 K met behulp van een gas pycnometer, of door middel van dimensionale metingen met behulp van calipers. Bij gebruik van dimensionale metingen moet de testmassa een simpele, precieze vorm hebben (geen tapers of afgeronde hoeken) en het volume van het doorgaande gat (voor de ophangende lijn) moet worden bepaald.
- Bereken de massa m van de testmassa door de gemeten schijnbare massa te corrigeren voor de door lucht uitgeoefende drijfkracht volgens het volgende:
Waar ρ lucht = 1,23 g / L (~ 0,1% correctie). - Plaats de microbalans op een stabiel platform ongeveer 10 cm boven de Dewar-fles en controleer de kalibratie ervan. Suspenseer de testmassa met behulp van een monofilamentlijn van 2 mil (50 μm) van de haak op de onderkant van de microbalans (ontworpen voor hangende massametingen) en throuEen gat in de testmassa. Bepaal de schijnbare massa in de lucht en vergelijk met de meting in stap 3.3, corrigeer als nodig voor de massa van de lijn.
- Bepaal het volume V (77 K) van de testmassa bij T = 77 K door de schijnbare massa in zuivere vloeibare stikstof, m app in LN2 , te meten. Zet de testmassa in de vloeibare stikstof in de koperkamer tot het volledig ondergedompeld is. Wanneer het koken is gestopt, meet de schijnbare massa.
OPMERKING: als de vloeibare stikstof in de koperkamer rustig is en de luchtstromen tussen de microbalans en het vloeibare oppervlak minimaal zijn, kan deze massa worden gemeten op meer dan ± 0,0002 g nauwkeurigheid. - Schat de drijfkracht op het ondergedompelde gedeelte van de lijn en controleer of het klein is in vergelijking met meetfouten.
- Bereken het volume en de dichtheid van de testmassa bij 77 K met behulp van de bekende massa m en de gemeten schijnbare massa in LN2 bij 77 K, m app iN LN2, volgens het volgende:
Waar ρ LN2 ( (77 K) = 0,807 g / ml.
4. Bereiding van het initiële vloeibare N2 -Ar mengsel
- Flow Ar gas met een stromingssnelheid van ~ 2 L / min via een opgerolde buis naar zijn uitlaat. Plaats de gerolde buis bovenop de bovenste steunen die de positie van de koperkamer stabiliseren, net boven het vloeibare stikstofniveau en onder het bovenoppervlak van de Dewar. Koud N 2 en Ar gas zullen boven de cryogene vloeistoffen opbouwen, en thermische geleidingen, convectie en straling zullen de buizen en het Ar-gas afkoelen.
- Zet de afvoer van de buis in de koperkamer, tenminste 10 cm onder het oppervlak van de vloeibare stikstof, nadat u de wikkelbuis 5 minuten afkoelt. Dan bedek de Dewar met het ringvormige deksel en het transparante vel.
- Stel de Ar-stromingssnelheid in tot Ar-bellen stijgenVan de buisuitlaat naar het bovenoppervlak van de vloeibare stikstof. Verminder dan de stromingssnelheid tot de belletjes bij de uitlaat vormen, maar ontbind of vloeibaar net voordat u het vloeibaar stikstofoppervlak breekt.
OPMERKING: Aangezien de Ar-concentratie in de koperkamer toeneemt, moet u de Ar-stromingssnelheid regelmatig aanpassen om de belvorming te behouden. Als de Ar-stroming te laag is, kan de Ar in de buis bevriezen en de stroom blokkeren. - Voeg zo nodig vloeibare stikstof toe om het niveau in de omliggende Dewar te behouden. Verwijder ijs als het op koude oppervlakken ophoopt.
- Meng de vloeistof periodiek door een dun ( bijv . 35 micron) cirkelblad koperfolie aan een dunne isolerende staaf in de koperkamer te plaatsen en langzaam op en neer als een zuiger te verplaatsen. Dit vermindert de concentratiegradiënten en de neiging om Ar uit de oplossing te kristalliseren.
5. Meten en aanpassen van de dichtheid van de initiële N 2 -Ar Mixtuur
- Bereken de doeldichtheid voor het N 2 -Ar-mengsel door de T = 77 K dichtheid van het te meten monster te meten, bijvoorbeeld metingen bij hogere concentraties van het niet-waterige bestanddeel van het monster.
- Bevestig de testmassa met behulp van de monofilamentlijn aan de haak op de onderkant van de microbalans meetpan, meet de zichtbare massa in de lucht en bevestig de overeenkomst met de meting in stap 3.1.
- Meng de N 2 -Ar oplossing om concentratie- en dichtheidsgradienten te elimineren zoals in stap 4.5.
- Voorbereiding van de testmassa op T = 77 K door het in de vloeibare stikstof buiten de koperkamer te verlagen. Verhoog de testmassa in de koude laag stikstofgas boven de vloeibare stikstof, wacht op de resterende vloeibare stikstof om de testmassa af te dampen en laat de koude, droge testmassa in het N 2 -Ar-mengsel verlagen totdat het volledig ondergedompeld is en Binnen 2 cm van het vloeibare oppervlak.
- Verhoog de oplossingsdichtheid door extra Ar te stromen tot de gewenste initiële dichtheid is verkregen. Sample druppels die zink kunnen gemakkelijk verloren gaan, dus de initiële dichtheid moet ten minste een paar procent hoger zijn dan de verwachte steekproefdichtheid. Het monster zal dan drijven, waardoor het makkelijker kan worden gevolgd en de N 2 -Ar-dichtheid van het mengsel zal dan alleen naar beneden moeten worden aangepast door vloeistof N 2 te voegen.
- Verwijder de Ar voorverpoelende wikkelbuis en laat het warm en droog voor het volgende gebruik.
6. Afkoelen druppels monster oplossing
- Onmiddellijk voorafgaand aan het laten vallen en afkoelen, herhaal stap 1.5 tot miX de stikstof / argon cryogene vloeistof. Wees voorzichtig om geen bellen in te voeren.
- Verwijder de luchtdichte dop van de monsterbuis. Uittreksel tot 1 ml oplossing met een schone 1 ml spuit, en vervang de kap. Bevestig een 27 tot 33 G-naald op de spuit en druk dan een kleine hoeveelheid monster door de naald om lucht en resten uit de vorige afgifte uit te schakelen.
- Er kunnen twee methoden worden gebruikt om monsterdruppels in het N 2 -Ar-mengsel te projecteren.
- Voor monsters met grote niet-waterige componentenconcentraties (> 45% w / w) die met bescheiden koelsnelheden kunnen worden vergist, druk de injectiespuit licht om een kleine diameter van 250 μm tot 1 mm te verplaatsen, ~ 10 nL tot 1 μl druppel Dat hangt van de naaldpunt door oppervlaktespanning. Trek de naald voorzichtig om los te maken en de druppel naar het vloeibare N 2 -Ar mengsel te projecteren.
- Voor monsters die sneller afkoelen voor vitrificatie, plaats de uitlaat van een gasbuis aangesloten op een vacuümgeneratieOf (geleverd door laboratoriumdruklucht) in de gasruimte boven het vloeibare N 2 -Ar-mengsel en voorzichtig zuig de koude gaslaag die er uit vormt, af. Dit verhoogt de koerssnelheden voor kleine monsters 11 .
- Raak de naaldtip voorzichtig aan op een 25-75 μm dikke, heldere polymere strook om een klein volume (<10 nL, overeenkomend met een druppeldiameter <200 μm) van het monster af te geven.
OPMERKING: Om de kleinste, bijna bijna sferische en gemakkelijkst verwijderd druppels te verkrijgen, week de strip in een hydrofobe bekledingsoplossing gedurende 10 minuten en laten drogen voor het afleveren van het monster. - Pak de strip met een bijgevoegde plastic of houten staaf en duw de stang plus de strip handmatig in het vloeibare N 2 -Ar mengsel.
- Zodra de druppel is gestolven en kookt is gestopt, pak de striprand tegenover de staaf met een pincet. Flex de strip, houd het onderdompeld in de vloeibare N 2 -Ar, tot de monsterdruppel uitkomt en drijft naar de brandingaas.
- Raak de naaldtip voorzichtig aan op een 25-75 μm dikke, heldere polymere strook om een klein volume (<10 nL, overeenkomend met een druppeldiameter <200 μm) van het monster af te geven.
7. Beoordeling van de staat van de steekproef
- Gebruik een binoculaire microscoop met een lange werkafstand (5-10 cm) en heldere, koele verlichting van een LED- of glasvezelverlichting. Controleer de druppel zorgvuldig door, terwijl het in de vloeibare N 2 -Ar wordt gedompeld. Gegrilde druppels dienen duidelijk te zijn 12 , 13 . Weigeren druppels die wazig of bewolkt zijn (waarschijnlijk meer dan één fase bevatten) en / of die optische onvolkomenheden met inbegrip van scheuren laten zien (die kunnen worden geassocieerd met holtes die de gemiddelde dichtheid veranderen).
OPMERKING: het schilderen van het binnenoppervlak van de koperkamer om een zwarte achtergrond te geven kan de identificatie van steekproeven imperfecties vergemakkelijken.
8. Bepaling van de dichtheid van de steekproef
- De gedoseerde druppel zal aanvankelijk drijven, zinken of (zelden) neutraal stijvend zijn in het N 2 -Ar mengsel.Drijvende druppels kunnen soms door oppervlaktespanning, kleine bubbels of gehandhaafde ijsdeeltjes worden opgehouden. Controleer het gehele druppeloppervlak met de microscoop. Verplaats de druppel naar beneden van het vloeibare oppervlak door gebruik te maken van een kleine (2-3 mm diameter, 10 cm lange) voorgekoelde plastic of houten staaf en let op zijn reactie.
- Als de druppel zinkt, vermeerder de dichtheid van de vloeistof N 2 -Ar met behulp van de procedure in stap 4 tot de druppel neutraal stijvend of drijft.
- Als de druppel drijft, verlaag de dichtheid van de vloeibare N 2 -Ar door vloeibaar stikstof toe te voegen met behulp van een 1,8 ml cryovial. Bij grote initiële mengdichtheden (1,2-1,3 g / ml) geeft het toevoegen van N 2 in stappen van 1 ml significante dichtheidsveranderingen, maar dit moet worden verhoogd naar 5 ml bij lage dichtheden (0,8-0,9 g / ml). Meng de N 2 -Ar voorzichtig (om niet te missen van de monsterdruppel) met behulp van het dunne geperforeerde koperen folieblad omhoog en omlaag in de koperkamer.
- Na elke N 2 toevoeging, Gebruik een kleine voorgekoelde stang om de drijvende druppel naar beneden in de vloeistof te verplaatsen en houd de snelheid in acht als het terugkomt naar het oppervlak.
- Wanneer de oplossingsdichtheid is aangepast, zodat de druppel neutraal stijgt of langzaam stijgt (<50 μm / s zorgt voor 0,1% of betere dichtheidsnauwkeurigheid voor druppels met volumes tot 50 pL), meet de N 2 - De mengdichtheid van het mengsel zoals beschreven in stap 5. Voeg vervolgens extra vloeistof N 2 toe totdat de druppel eerst begint te zinken en meet de N 2 -Ar-dichtheid opnieuw. Deze twee metingen geven grenzen aan de druppeldichtheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dichtheidsmetingen bij T = 77 K voor verglaasde druppels waterige glycerol en ethyleenglycol versus cryoprotectantconcentratie worden weergegeven in respectievelijk Figuur 1A en Figuur 1B en de overeenkomstige verandering in specifiek volume tussen T = 298 K en 77 K, berekend met gebruikmaking van eerder Bepaalde T = 298 K dichtheden, is weergegeven in Figuur 2 . Bij hoge cryoprotectant concentraties, contracten de oplossingen op koeling naar de verglaasde toestand, terwijl zuiver water uitstrekt. Bijna 20-25% w / w oplossingen van beide cryoprotectants worden voorspeld dat er geen netto-expansie of samentrekking optreedt. De helling van de volumeverandering versus de concentratie heeft de grootste grootte onder 40% w / w, waarbij de effecten van extra cryoprotectant op de tetrahedrale lage temperatuurstructuur van het water het meest uitgesproken zijn.
Figuur 1: Vitreuze fase T = 77 K Densiteit Versus Cryoprotectant Concentratie . T = 77 K dichtheid versus concentratie voor verglaasde waterige druppels die ( A ) glycerol en ( B ) ethyleenglycol bevatten. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van drie individuele druppels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Verandering in specifiek volume bij afkoeling van vloeibaar bij 298 K naar de vitale fase bij 77 K. Percentage volumeverandering bij koeling van 298 K tot 77 K voor waterige oplossingOns van glycerol en ethyleenglycol. De T = 298 K oplossingsdichtheden worden verkregen uit eerdere metingen 14 , 15 . Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van drie individuele druppels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige apparatuur en methoden, die voornamelijk door ondergraduates ontwikkeld zijn, hebben beperkte toegang tot instrumenten en instrumenten, maar leveren nog steeds nauwkeurige dichtheidsmetingen voor individuele vloeibare druppels tot 50 pL. In het concentratiebereik bijna 50% w / w, waar kleine koershoeveelheden voldoende zijn om verglaasde monsters te verkrijgen, komen de dichtheden overeen met die verkregen bij eerdere metingen op bulkmonsters. Extrapolaties van de huidige dichtheden tot 0% concentratie - zuiver water - komen ook goed overeen met de aanvaarde dichtheid van amorf ijs met een lage dichtheid bij 77 K 9 .
Het genereren van de N 2 -Ar mengsels die nodig zijn tussen 30 min en 5 uur Ar-stroom, afhankelijk van de uiteindelijke N 2 -Ar dichtheid die nodig is om een gegeven druppelsamenstelling neutraal vloeibaar te maken. Deze tijd kan worden verminderd door gebruik te maken van een diffuser of meerdere gasbuisjes om het oppervlak voor Ar mixin te verhogenG in de cryogene vloeistof. Het aanpassen van de N 2 -Ar dichtheid tot een druppel wordt vastgesteld dat het neutraal vloeibaar is, kan ook tijdrovend zijn, met name voor kleine straaltjes ( r ) druppels die kleine eindsnelheden hebben ( 
R 2 ) en dus meer voorzichtige waarnemingen nodig hebben. Het N 2 -Ar mengsel heeft de neiging om een verticale dichtheid / compositiegradiënt te ontwikkelen en moet daarom regelmatig gemengd worden. Bijgevolg kan het bepalen van een enkelvoudig vitreousfase dichtheidspunt voor een gegeven opgeloste type en concentratie, waarbij metingen worden uitgevoerd op ten minste 3-5 druppels, een aantal h kunnen nemen.
Bij elke concentratie worden de dichtheden van twee of drie druppels typisch gemeten. De 'dichtheid' van elke druppel wordt geschat als het gemiddelde van de gemeten boven- en ondergrens op de dichtheid, gegeven door de grootste gemeten N 2 -Ar-dichtheid die de druppelsink gemaakt en de kleinste dichtheid die het dreef. Aangezien zowel een strak bovenbodem als een strakke ondergrens - waar de dichtheid wordt beoordeeld door de snelheid van de stijging of afname van de druppel - worden niet altijd in metingen op een gegeven druppel verkregen ( bijv . Kan de druppel tijdens het mengen verloren gaan), metingen Op druppels van dezelfde concentratie en grootte werden soms gecombineerd tot een enkele dichtheidsschatting.
Om de experimenttijden te verminderen, werden pogingen gedaan om een hoge-dichtheid N 2 -Ar mengsels in cryogene opslagcontainers voor te bereiden en op te slaan, één tot drie dagen later. In alle gevallen kristalliseerde Ar uit de oplossing en de vloeibare dichtheid daalde met opslagtijd. Arstolling en afname van vloeibare dichtheid vonden ook plaats tijdens druppeldichtheidsmetingen als de vloeibare N2-Ar niet regelmatig werd gemengd.
Een grote uitdaging in deze metingen minimaliseert vorst- en ijsvorming. Waterdampcondensatie, ijsvorming en ijsopbouw op deMonster koelkamer op andere koude oppervlakken in het koude gas boven het N 2 -Ar mengsel, en in het N 2 -Ar mengsel zelf kunnen de monsters die gebruikt worden in dichtheidsmetingen, ijskernen binnen hen bevorderen en hun schijnbare dichtheid veranderen. Ijs op het monster en drijvend op en in het vloeibare N 2 -Ar-mengsel kan de lage temperatuurstoestand van het monster (glas- of polykristallijne) moeilijk beoordelen. Om ijsvorming te minimaliseren, inspecteer regelmatig alle koude oppervlakken voor ijs. Verwijder ieder ijzer mechanisch of gebruik warm droog N 2 gas. Als er ijs ophoopt in de koperkamer, verwijder het met een fijnmazelscherm, anders verwijder, leeg, droog en vul de kamer.
De minimale (kritieke) koelsnelheid die nodig is om een verglaasd monster te verkrijgen neemt toe met een dalende opgeloste concentratie, naderen 10 6 K / s voor zuiver water 7 . Voorbeeld koeling tarieven zijn afhankelijk van druppelvorm en grootte (increAdemend met afnemende diameter), de snelheid waarmee de druppel in het vloeibare cryogeen geprojecteerd wordt, de aanwezigheid van koud gas boven het vloeibare cryogeen (dat meestal afkoelsnelheden afneemt) en de eigenschappen van het vloeibare cryogeen. Over het algemeen hebben de koelsnelheden groter dan 1000 K / s druppels met volumes (diameters) kleiner dan ~ 1 nL (~ 100 μm).
De laagste concentratie van opgeloste of cryoprotectant waaruit de glasdichtheid kan worden gemeten, wordt bepaald door de maximale druppelkoelrente en door de kleinste afmetingen die de visuele test voor vitrificatie betrouwbaar kunnen gebruiken. Koelkoersen kunnen met een factor van 5 worden verhoogd door monsters in vloeibare propaan of een vloeibaar propaan-ethaan mengsel te koelen. In tegenstelling tot vloeibare N 2 hebben deze cryogene vloeistoffen een grote scheiding tussen kook- en smelttemperaturen en kunnen dus veel meer warmte absorberen zonder warmteoverdrachtsbeperkende oppervlakkoken. Koelde druppels kunnen dan overgebracht worden naar de N 2 -ArMengsel voor dichtheidsmetingen. De overgang van heldere druppels tot onduidelijk of bewolkt druppels is abrupt, die zich voordoet over een beperkt bereik van opgeloste concentratie (ongeveer 2% w / w) en koelsnelheid en is gecorreleerd met de uitstraling van ijsringen in röntgendiffractiepatronen 16 , 17 . Echter, een nauwkeurige visuele duidelijkheidsbeoordeling wordt moeilijker aangezien de druppelvolumes afnemen naar 10 pL.
Het toegankelijke bereik van steekproefdichtheden met behulp van N2-Ar mengsels wordt bepaald door respectievelijk de dichtheden van de zuivere vloeistoffen, respectievelijk 0,81 g / ml en 1,40 g / ml. Vloeibare Ar-Kr mengsels zijn vatbaar voor Kr-kristallisatie, maar kan gebruikt worden om dit dichtheidsbereik te verlengen, mits de vloeistoffen constant worden gemengd.
De hier beschreven methoden zijn in grote mate van toepassing op het bepalen van dichtheden van waterige mengsels, cellen, celaggregaten, andere biologische materialen en andere systemen waar kleine monsters enGrote koelkoersen zijn nodig om de gewenste lage temperatuurfase te bereiken. Deze dichtheden zullen nuttig zijn bij het begrijpen en minimaliseren van monsterschade bij cryopreservation, en in het begrijpen van het gedrag van water in waterige oplossingen en in beperkte en drukke omgevingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de NSF onder prijs MCB-1330685. DWM erkent gedeeltelijke steun van de Cornell University's Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32GM0082567).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 L/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 mL Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20X eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 mL cryovial is adequate |
References
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).
- Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).
- Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58 (3), 459-471 (2002).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311 (4), 851-862 (2001).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization. Q Rev Biophys. 37 (2), 105-119 (2004).
- Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta Cryst Sect D. 66 (4), 366-373 (2010).
- Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions. Phys Rev Lett. 110 (1), 15703 (2013).
- Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating. Acta Cryst Sect D. 59 (4), 697-708 (2003).
- Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices. J Phys Chem B. 115 (48), 14167-14175 (2011).
- Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection. Acta Cryst Sect D. 72 (6), 742-752 (2016).
- Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. Hyperquenching for protein cryocrystallography. J Appl Cryst. 39 (6), 805-811 (2006).
- McFerrin, M. B., Snell, E. H. The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images. J Appl Cryst. 35 (5), 538-545 (2002).
- Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions. J. Appl. Cryst. 38 (3), 412-419 (2005).
- Bosart, L. W., Snoddy, A. O. Specific gravity of glycerol. Ind Eng Chem. 20 (12), 1377-1379 (1928).
- Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure. J Solution Chem. 40 (11), 1863-1873 (2011).
- Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions. J Appl Cryst. 39 (2), 244-251 (2006).
- Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS. Biophys J. 104 (1), 227-236 (2013).
