Summary
Kriyojenik sıcaklıklarda sulu karışımların mikro-piko-litre büyüklüğündeki damlacıklarının camsı faz yoğunluklarını belirlemek için bir protokol tarif edilmiştir.
Abstract
İstenen kriyojenik sıcaklık fazını hazırlamak için sulu karışımların ve hızlı soğutma gerektiren diğer numunelerin camsı faz kriyojenik sıcaklık yoğunluklarının saptanması için bir yöntem gösteriyoruz. Mikro litreden pikolit boyutundaki düşüşler, bir sıvı nitrojen-argon (N2-Ar) karışımı içine projeksiyonla soğutulur. Damlamanın kriyojenik sıcaklık fazı, X-ışını difraksiyon ölçümleri ile korele olan görsel bir test kullanılarak değerlendirilir. Sıvı N2-Ar karışımının yoğunluğu, damla nötr olarak yüzmesine değene kadar N2 veya Ar eklenerek ayarlanır. Bu karışımın yoğunluğu ve dolayısıyla damla, bir test kütlesi ve Arşimet prensibi kullanılarak belirlenir. Damla preparasyonunda uygun önlemle, buzlanma en aza indirgemek için sıvı kriyojen karışımının üstünde gaz yönetimi ve yoğunluk katmanlaşması ve faz ayrımını önlemek için kriyojenik karışımı düzenli olarak karıştırarak yoğunlukları 50 pL kadar küçük damlaların <% 0.5'i doğru olabilirKolayca tespit edilebilir. Sulu kriyoprotektan karışımlarındaki ölçümler, kriyoprotektan hareketi hakkında bilgi verir ve biyolojik kriyoprezervasyonda termal kontraksiyonu eşleştirmeyi kolaylaştırmak için nicel veri sağlar.
Introduction
Su ve sulu karışımların çeşitli evrelerindeki fiziksel özellikleri büyük önem taşımaktadır ve biyolojik sistemlerin in vivo ve in vitro anlaşılmasında önemlidir. Çağdaş kriyobiyoloji ve biyolojik kriyoprezervasyonda, sulu kriyoprotektan karışımlarının vitröz veya amorf fazları, 1 , 2'ye özel ilgi gösterir. Nükleasyon ve buz kristallerinin büyümesi, hücre ve dokuları bozabilir ve protein denatürasyonunu ve toplanmasını destekleyebilir; bu nedenle, çözücüyü vitrifiye eden kriyoprezervasyon protokolleri gittikçe daha popüler hale geldi. Biyomoleküler kristalografide, biyomoleküller arasındaki kanallardaki çözücünün kristalleştirilmesi, kristal kafesleri bozarak kırınım özelliklerini düşürür. Vitrifikasyon, hızlı soğutma, dehidrasyon ve gliserol, etilen glikol, polietilen glikoller (PEG'ler) gibi kriyoprotektif solütlerin eklenmesiyle sağlanır;Alkoller ve tuzlar.
Vitrifikasyon buz kristalleşmesini ve büyümesini sınırlar, ancak soğutma ile ilgili tüm numune hasarını ortadan kaldırmaz. Örneğin, kristal mozaikliği (kristal düzlem yönelimlerinin dağılım ölçütü), protein kristalleri vitrifiye hale getirildiğinde rutin olarak 10'dan 100'e artar ve vitrifiye sperm hücreleri ve oositlerin çözülme sonrası sağkalım oranları değişir .
Bir hasar mekanizması soğutma sırasında çözücünün ve çevredeki maddenin diferansiyel daralmasıdır ( 3 , 4 , 5) . Bir kristal, hücre veya dokudaki denge çözücüsü ve çözünen madde konsantrasyonları sıcaklığa bağlıdır ve çözücü artı çözünen madde ve çevreleyen malzeme farklı miktarlarda küçülebilir. Hızlı soğutma, çözülmeyi önleyebilir ve vitrifikasyondan önce yeniden dağıtılabilir ve diferansiyel kontratları Üzerinde, örnek hasarına neden olan büyük, homojen olmayan dengesizlik streslerine neden olabilir.
Dolayısıyla, soğutmadan kaynaklı hasarın azaltılmasına yönelik akılcı yaklaşımlar, sıvı ve vitrifiye sulu karışımların sıcaklığa bağlı yoğunluklarının bilgisinden yararlanabilir. Çözeltinin ağırlığına göre ağırlıkça% 50'nin üzerinde olan çözünen konsantrasyonlarda (w / w), çoğu sulu kriyoprotektan karışımı 10 K / s veya daha düşük mütevazi soğutma hızlarıyla vitrifiye edilebilir ve büyük vitröz numuneleri 6 kullanarak yoğunluk ölçümleri yapılabilir. Yoğunluk daha sonra azot gibi bir sıvı kriyojen içine asıldığı zaman numunenin görünür ağırlığını ölçerek Archimedes'in prensibi kullanılarak tespit edilebilir. Bununla birlikte, çözünen madde konsantrasyonu düştükçe, vitrifikasyon için gerekli soğutma hızları hızla artar: Sulu gliserol karışımları için soğutma oranları, g cinsinden çözünmüş haldeki çözeltinin ağırlığının% 50'sinde <10 K / s'den mL'nin (w / v) çözeltinin hacminin> 1000'e yükselir K / s% 25 w / v'deAss = "xref"> 7. Isı transferi sınır katmanıyla sınırlı hale gelir, böylece daha büyük soğutma hızlarına ulaşmak küçük ve küçük numuneler gerektirir 8 .
Saf cam suyu ve buz yoğunluğunun ölçülmesi, bir makroskopik (gram kütlesi) numune oluşturmak üzere kriyojenik olarak soğutulmuş bir yüzeye bir vakumda mikrometre çapında (femtoliter hacim) damlalar bırakılarak elde edilmiştir. Bu numunenin yoğunluğu, sıvı nitrojen-argon karışımı içinde kriyoflotlama ile belirlendi, burada kriyojenik sıvının yoğunluğu, numune nötr olarak yüzen hale gelene kadar ayarlandı 9 . Bununla birlikte, daha önceki vitröz faz yoğunluğu ölçümlerinde önemli bir hata kaynağı olan boşluk hacimlerini en aza indirecek şekilde çok sayıda küçük damladan büyük numuneler üretmek önemsiz değildir. Sulu karışımlar için, aerosol haline getirme ve vakumda biriktirme sırasında çözelti bileşenlerinin diferansiyel buharlaştırılması,Birikmiş konsantrasyonlarda önemli belirsizlikler.
Kriyoflotasyona dayanan ve 50 pL 10 gibi küçük damlalar kullanarak sulu karışımların doğru yoğunluk tayini için bir yöntem geliştirdik. Bu damlalar, orijinal konsantrasyonlarını koruyarak hızla soğutulabilir ve kriyojenik sıcaklık durumu (vitrifiye veya kristal), X-ışını kırınım ölçümleri ile korele olan basit bir görsel analiz kullanılarak değerlendirilebilir. Bu yöntem, sulu ve sulu olmayan karışımlar için geniş çapta uygulanabilir ve hücreler ( örneğin , gövde ve yumurta), doku numuneleri ve düşük sıcaklık yoğunlukları 0.8 ila 1.4 g / cm2 olan protein kristalleri dahil çeşitli biyolojik örneklere kadar uzatılabilir. ml.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DİKKAT: Lütfen kullanmadan önce ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarına (MSDS) başvurun. Uygun kalibre edilmiş gaz kontrol valfleri ve valfleri ve onaylanmış gaz tüpleri de dahil olmak üzere sıkıştırılmış gazları kullanırken lütfen tüm uygun güvenlik yöntemlerini kullanın. Sıvı kriyojenlerle temas şiddetli donma ve nekroza neden olabilir. Sıvı azota karşı geçirimsiz olması gereken uygun kişisel koruyucu ekipmanı (yüz siperi, eldiven, laboratuar ceketi, paçalık pantolon, kapalı ayakkabı) kullanın. Sıvı kriyojenleri kullanırken ayakta kalın ve cihazdan engelsiz bir çıkış yolu oluşturun. Sıkıştırılmış gazlar ve sıvı kriyojenleri kullanırken boğulma tehlikelerine dikkat edin ve yeterli makyaj havası ile iyi havalandırılan bir bölgede çalışın (tuvalet kağıdına veya yüksek hava devir hızı odasına.)
1. Yoğunluk Ölçümleri İçin Sulu Çözeltilerin Hazırlanması
NOT: Ağırlıklar hacimden daha yüksek doğrulukla daha kolay ölçülürUmes, çözelti konsantrasyonları w / w birimleri cinsinden ölçülür. Tüm yoğunluklar ve erime veya kaynama sıcaklıkları, ~ 100 kPa'lık bir atmosferik basıncı varsayar. Aşağıdaki adımlar,% 35 a / a gliserol solüsyonunun hazırlanmasını açıklamaktadır. Aynı prosedür, diğer konsantrasyonlar ve çözünen maddeler için de kullanılabilir.
- Toplam çözünürlük hacmi için arzu edilen son konsantrasyonu elde etmek için ( örn. ,% 25 w / w ile% 100 w / w arasında) gerekli çözünen kütlenin kabaca hesaplanması, V tot = 10 mL çözelti hacmi . Örneğin,% 35 a / a gliserol solüsyonu ( ρ s = 1.26 g / mL) için, çözünen kütle, m s :
Burada x , çözünen kütle fraksiyonu (0.35) ve ρ w = 1 g / mL suyun yoğunluğudur. - Tencereye 15 mL santrifüj tüpü (veya hacimce kalibre edilmiş suya geçirimsiz konteynır) yerleştirinAnalitik bir mikro dengesizlik. İstenen katı / kriyoprotektan kütlesini ( örneğin ,% 35 w / w'lik bir solüsyon için 3.77 g gliserol) tübün içine boşaltın ve gerçek katı kütlesini kaydedin.
- Toplam saflığı 10.0 g'a çıkarmak için yüksek saflıkta (> 18 MΩ) deiyonize su ekleyin
- Çözelti optik olarak homojen olana kadar kap 30saat (sıvı çözeltiler için) veya 5 dakika (katı çözeltiler için) vorteksleyin.
- Çözümün son kütlesini ölçün ve kaydedin. Kabı hava geçirmez bir kapak ile sızdırmaz tutun ve sabit sıcaklıkta (293-298 K) saklayın.
2. Numune Soğutma Odası'nın Hazırlanması
- Aşağıda açıklanan deney cihazını bir muhafaza içine yerleştirin ve kuru hava (>% 5 bağıl nem (rh)) muhafaza içine akın.
NOT: Muhafaza, üst ve üç tarafı şeffaf plastik tabaka ile mühürlenmiş basit bir metal çerçeve ve dördüncü tarafı esnek plastik tabaka ile kaplanmış deney erişimi ile olabilir. GiyinmekDeneyci tarafından getirilen nemi en aza indirgemek için yüz kalkanları ve tam gövde kaplaması. Nem yoğuşması ve buz oluşumu, kriyojenik sıcaklık yoğunluğu ölçümlerine çeşitli şekillerde müdahale edebilir ve bu nedenle en aza indirgenmelidir. - Dewar şişesini hasardan korumak için 4.5 L cam Dewar şişesinin altına neopren kauçuk bir disk koyun.
- Kauçuk disk üzerine oturana kadar şişeye dikkatle yüksek ısı iletken bakır hazne (tıkalı bir tabandan içi boş bir silindir) yerleştirin. Odacık merkezden dışarıya çıkıntı yapan dikmeleri Dewar duvarlarına ayarlayın, böylece odanın ortalanması ve kayma eğilimi olmaz.
NOT: Dewar şişesi sıvı azotu tutacak ve daha küçük hacimli bakır bölmesi sıvı bir N2-Ar karışımı tutacaktır. Sıvı azot, bakır haznesini ve içeriğini 77 K'lık sabit bir sıcaklıkta tutan bir termal banyo sağlar ve haznedeki kaynama ve buharlaşma kayıplarını azaltır. Oda & #39 küçük çapı yüzme dalgalarını bastırır ve bu da yüzdürme ölçümlerine müdahale edebilir ve bölmedeki sıvının cihazın herhangi bir yerinde oluşan don ve buzdan uzaklaşmasına yardımcı olur. - Yaklaşık 2 L / dak akan kuru N2 gazı ile bir gaz borusunun çıkışını bakır haznesinin altına yerleştirin ve nemli havayı boşaltın.
- Sıvı azotu yavaşça bakır haznesinin dışındaki Dewar şişesine boşaltıp nitrojen kaynaması için zaman bırakın.
NOT: Kaynama bittikten sonra son dolum seviyesi bakır haznesinin üstünden yaklaşık 4 cm uzaklıkta olmalıdır. - Dewar şişesinin dış kısmını halkalı bir köpük yalıtımlı kapakla örtün. Kuru N 2 gaz boşaltma tüpünü bakır haznesinden çıkartın ve kapağın eşleşen bir deliğine sokun.
NOT: Dewar şişesinde ve kaynatma akışındaki kaynama noktasındaki N2 gazı kombinasyonu, herhangi bir nemli havayı dışarı atar ve yoğunlaşmasına ve kristalleşmesine engel olur.N soğuk yüzeyler. - Bakır haznesine yavaşça sıvı azot dökün. Kaynama bittikten sonra son dolum seviyesi, bakır haznesinin üstünden yaklaşık 4 cm uzaklıkta olmalıdır.
- Kriyojenik sıvılar üzerindeki gaz alanlarında hafif bir N2 gazı basıncına maruz bırakarak, orta deliğin veya havalandırma deliğinin üzerine ince, optik olarak şeffaf bir plastik tabaka yerleştirin ve N2 gaz akış oranını ~ 0.2 L / dk'ya düşürün.
NOT: Dewar ve odacıkta kriyojenik sıvılar mevcut olduğu sürece, bu aşırı basıncı korumak ve nemin Dewar'a ve şekillendirme buzuna girmesini önlemek için N2 gaz akışını ayarlamaya devam edin.
3. T = 298 K ve T = 77 K'de Test Kütlesinin Hacim ve Yoğunluğunun Belirlenmesi
- T = 298 K havadaki ~ 1 g, ~ 0.4 mL PTFE test kütlesinin ( Malzeme Tablosu ) görünür kütlesini tencereye yerleştirerek belirleyinizKalibre edilmiş bir analitik mikro denge.
- Bir gaz piknometre kullanarak T = 298 K'de test kütlesinin V (298 K) hacmini veya pergelleri kullanarak boyutsal ölçümleri belirleyin. Boyut ölçümleri kullanılıyorsa, test kütlesi basit, kesin bir şekle sahip olmalıdır (şeritler veya yuvarlak köşeler yok) ve delik hacmi (asma hattı için) belirlenmelidir.
- Hava ile uygulanan yüzen kuvvetin ölçülen görünür kütlesini aşağıdakilere göre düzelterek test kütlesinin kütlesini hesaplayınız:
Burada ρ air = 1.23 g / L (~% 0.1 düzeltme). - Mikro dengeyi, Dewar şişesinin kabaca 10 cm üzerinde sabit bir platforma yerleştirin ve kalibrasyonunu doğrulayın. Mikro dengenin altındaki kancadan (kitle ölçümleri asmak için tasarlanmış) ve boğazdan tutturulmuş 2 mil (50 μm) monofilament hattı kullanarak test kütlesini askıya alınızTest kütlesinde bir delik var. Havadaki görünür kütlesi belirleyin ve adım 3.3'te ölçülen ile karşılaştırarak hattın kütlesi için gerektiği gibi düzeltin.
- T = 77 K'de test kütlesinin V (77 K) hacmini LN2'deki saf sıvı azot, m uygulamasındaki görünür kütlesini ölçerek belirleyin. Test kütlesini, tamamen suya batıncaya kadar bakır bölmesindeki sıvı nitrojene indirin. Kaynama sona erdiğinde görünür kütlesi ölçün.
NOT: Bakır haznesindeki sıvı azot durgun ise ve mikro denge ile sıvı yüzeyi arasındaki hava akımları az ise, bu kütle ± 0.0002 g doğruluğundan daha büyük ölçülebilir. - Hattın batık kısmı üzerindeki çekme kuvvetini tahmin edin ve ölçüm hatalarıyla karşılaştırıldığında küçük olduğunu doğrulayın.
- 77 K'de bilinen kütle m ve 77 K'de LN2'de ölçülen görünür kütle kullanılarak test kütlesinin hacmini ve yoğunluğunu hesaplayın, m app iN LN2, aşağıdakilere göre:
Burada ρ LN2 ( (77 K) = 0.807 g / mL'dir.
4. Başlangıç Sıvı N 2 -Ar Karışımının Hazırlanması
- Yaklaşık 2 L / dk'lık bir akış hızında, sargılı bir tüp aracılığıyla çıkışa akan gaz. Bobinli boruyu, sıvı azot seviyesinin hemen üstünde ve Dewar'ın üst yüzeyinin altındaki bakır haznesinin konumunu dengeleyen üst dikmelerin üzerine yerleştirin. Soğuk N 2 ve Ar gazı kriyojenik sıvıların üzerine çıkacak ve ısı iletimi, konveksiyon ve radyasyon boruları ve içindeki Ar gazı soğutacaktır.
- Sargı tüpünü 5 dakika soğumaya bıraktıktan sonra, tüpün çıkışını sıvı azot yüzeyinin en az 10 cm altındaki bakır bölmesine yerleştirin. Daha sonra Dewar'ı dairesel kapak ve şeffaf tabaka ile örtün.
- Ar kabarcıkları yükselene kadar Ar akış oranını ayarlayınBoru çıkışından sıvı azotun üst yüzeyine kadar uzanır. Ardından, çıkıştaki kabarcıklar oluşana kadar akış oranını düşürünüz, ancak sıvı azot yüzeyi kırılmadan önce çözülür veya sıvılaşır.
NOT: Bakır haznesindeki Ar konsantrasyonu arttıkça, kabarcık oluşumunu korumak için ar akış oranını periyodik olarak ayarlayın. Ar akış hızı çok düşükse, Ar tüp içinde donabilir ve akışını engelleyebilir. - Çevredeki Dewar'daki seviyesini korumak için gerektiğinde sıvı azot ekleyin. Soğuk yüzeylerde biriken buzu alın.
- İnce bir izolasyon çubuğuna bakır folyoya ince bir ( örneğin 35 mikron) dairesel bakır levha takarak ve periyodik bir şekilde yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirerek sıvıyı periyodik olarak karıştırın. Bu, konsantrasyon değişimlerini ve Ar'ın çözeltiden kristalleşme eğilimini azaltacaktır.
5. Başlangıçtaki N2-Ar Karışımının Yoğunluğunun Ölçülmesi ve AyarlanmasıTure
- Ölçülecek olan numunenin T = 77 K yoğunluğunu, örn ., Numunenin sulu olmayan bileşeninin daha yüksek konsantrasyonlarındaki ölçümleri tahmin ederek N 2 -Ar karışımı için hedef yoğunluğunu hesaplayın.
- Monofilament çizgisini kullanarak test kütlesini mikrobalans ölçme kabının alt kısmındaki kancaya takın, havadaki görünür kütlesini ölçün ve adım 3.1'deki ölçümle anlaşmayı onaylayın.
- Adım 4.5'te olduğu gibi konsantrasyon ve yoğunluk gradyentlerini ortadan kaldırmak için N 2 -Ar solüsyonunu karıştırın.
- Test kütlesini bakır haznesinin dışındaki sıvı azota indirgeyerek T = 77 K'ye önceden soğutun. Test kütlesini azot azot gazının üstündeki sıvı azot tabakasına yükseltin, kalan sıvı azotun test kütlesinin buharlaşmasını bekleyin ve daha sonra soğuk, kuru test kütlesi N 2 -Ar karışımına tamamen suya batıncaya kadar indirin ve Sıvı yüzeyden 2 cm içeride.
- İstenen başlangıç yoğunluğu elde edilinceye kadar ilave Ar akılarak çözelti yoğunluğunu arttırın. Bu lavabo numuneleri kolayca kaybedilebilir, bu nedenle başlangıç yoğunluğu beklenen numune yoğunluğundan en azından birkaç yüzde daha yüksek olmalıdır. Numune daha sonra takip etmeyi kolaylaştıran yüzer ve N 2 -Ar karışım yoğunluğunun yalnızca sıvı N 2 ilavesiyle aşağı doğru ayarlanması gerekir.
- Ar ön soğutma sargılı tüpü çıkarın ve bir dahaki kullanımdan önce sıcak ve kuru olmasına izin verin.
6. Numune Solüsyonunun Soğutma Damlaları
- Dağıtım ve soğutmayı bırakmadan hemen önce adım 1.5 ila mi'yi tekrarlayınX azot / argon kriyojenik sıvı. Kabarcıklar vermemeye dikkat edin.
- Numune tüpünün hava geçirmez kapağını çıkartın. Temiz 1 mL'lik bir şırınga kullanarak, 1 mL'ye kadar çözelti çıkarıp kapağı değiştirin. 27 ila 33 G iğneyi şırınga üzerine takın ve havayı ve önceki dağıtmadan kaynaklanan kalıntıları dışarı atmak için iğne ile küçük bir miktarda numune itin.
- N 2 -Ar karışımına numune damlalarını yansıtmak için iki yöntem kullanılabilir.
- Mütevazı soğutma hızlarıyla vitrifiye edilebilen büyük sulu olmayan bileşen konsantrasyonlarına (>% 45 w / w) sahip örnekler için şırıngaya hafifçe hafifçe basarak küçük (250 μm ila 1 mm) çap, ~ 10 nL ila 1 uL damla Yüzey gerilimi ile iğne ucundan asılı durur. Ayırmak ve damlayı sıvı N 2 -Ar karışımına doğru yansıtmak için iğneye hafifçe vurun.
- Vitrifikasyon için daha hızlı soğutma gerektiren numuneler için bir vakum jeneratöre bağlı bir gaz tüpünün çıkışını yerleştirinVeya (laboratuvar basınçlı hava ile tedarik edilen) sıvı N2-Ar karışımının üzerindeki gaz alanına yerleştirin ve oluşturan soğuk gaz tabakasını hafifçe emer. Bu küçük numuneler için soğutma oranlarını arttırır 11 .
- Küçük bir hacim (<10 nL, damla çapı <200 μm) olan numuneyi dağıtmak için iğne ucunu dikkatli bir şekilde 25-75 μm kalınlığında berrak bir polimer şeridine dokundurun.
NOT: En küçük, en küresel, en kolay şekilde çıkarılan damlaları elde etmek için şeridi 10 dakika boyunca hidrofobik bir kaplama çözeltisi içine batırın ve örnek vermeden önce kurumaya bırakın. - Şeridi, ekli bir plastik veya tahta çubuk kullanarak tutun ve çubuğu artı şeridi sıvı N 2 -Ar karışımına elle daldırın.
- Damla sertleştikten ve kaynama durduktan sonra cımbız kullanarak çubuğun karşısındaki şerit kenarını tutun. Şeridi, numune damlası çıkıp sörf yapmaya yüzene kadar sıvı N 2 -Ar'e batırarak tutunace.
- Küçük bir hacim (<10 nL, damla çapı <200 μm) olan numuneyi dağıtmak için iğne ucunu dikkatli bir şekilde 25-75 μm kalınlığında berrak bir polimer şeridine dokundurun.
7. Numune Devletinin Değerlendirilmesi
- Uzun bir çalışma mesafesi (5-10 cm) binoküler mikroskop ve bir LED veya fiber optik aydınlatıcıdan gelen parlak, serin aydınlatma kullanarak suyun sıvı N2-Ar'e batırılmış halde dikkatlice inceleyin. Vitrifiye damlacıklar açık, 12 , 13 görünmelidir. Bulanık veya bulutlu (muhtemelen birden fazla faz içeren) ve / veya çatlaklar dahil olmak üzere optik kusurları (ortalama yoğunluğu değiştiren boşluklarla ilişkili olabilir) gösteren damlaları reddet.
NOT: Siyah bir arka plan sağlamak için bakır haznesinin iç yüzeyinin boyanması numune kusurlarının tanımlanmasını kolaylaştırabilir.
8. Numunenin Yoğunluğunun Belirlenmesi
- Dağıtılmış damla başlangıçta N 2 -Ar karışımında yüzer, batacak veya nadiren yüzen olacaktır (nadiren).Yüzen damlalar bazen yüzey gerilimi, küçük kabarcıklar veya yapışmış buz parçacıkları tarafından engellenebilir. Tüm düşme yüzeyini mikroskopta muayene edin. Damlasını, küçük (2-3 mm çapında, 10 cm uzunluğunda) önceden soğutulmuş bir plastik veya ahşap çubuk kullanarak sıvı yüzeyden aşağıya yerleştirin ve tepki gözlemleyin.
- Damla batarysa damla damla nötr olarak yüzen veya yüzen hale gelene kadar adım 4'teki prosedürü kullanarak sıvı N2-Ar yoğunluğunu arttırın.
- Düşme yüzerse, 1.8 mL cryovial kullanarak sıvı azot ekleyerek sıvı N2-Ar yoğunluğunu azaltın. Başlangıç karışım yoğunlukları (1.2-1.3 g / mL) büyük olduğunda, N2'yi 1 mL'lik artışlarla eklemek önemli yoğunluk değişiklikleri sağlar, ancak düşük yoğunluklarda (0.8-0.9 g / mL) 5 mL'ye doğru arttırılmalıdır. Bakır haznesinde ince delikli bakır folyo tabakasını yukarı-aşağı kullanarak nazikçe N2-Ar'ı karıştırın (numune damlasını kaybetmemek için).
- Her N2 eklemesinden sonra, Kaygan düşümü sıvıya doğru yavaşça yerinden oynatmak için önceden soğutulmuş küçük bir çubuk kullanın ve yüzeyine dönerken hızını izleyin.
- Çözelti yoğunluğu, düşmenin nötr olarak yüzmesine veya çok yavaş yükselmesine neden olacak şekilde ayarlandığında (<50 μm / s, ~ 50 pL'ye kadar olan hacimlerde damlalar için ~% 0.1 veya daha iyi yoğunluk doğruluğunu garanti eder), N 2 - Ar karışım yoğunluğu adım 5'te anlatıldığı gibi ekleyin. Daha sonra ilk damla yavaşça batmaya başlayana kadar ilave sıvı N2 ilave edin ve N2-Ar karışım yoğunluğunu tekrar ölçün. Bu iki ölçüm düşme yoğunluğunu sınırlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sferik gliserol ve etilen glikol ile kriyoprotektan konsantrasyonunun vitrifiye edilmiş damlaları için T = 77 K'de yoğunluk ölçümleri sırasıyla Şekil 1A ve Şekil 1B'de ve daha önce kullanılarak hesaplanan T = 298 K ve 77 K arasındaki spesifik hacimdeki karşılık gelen değişim Belirlenen T = 298 K yoğunlukları, Şekil 2'de gösterilmektedir. Yüksek kriyoprotektan konsantrasyonlarında, çözeltiler, saflaştınlan halde soğumada kalarak, saf su genişler. Her iki kriyojen koruma maddesinin yaklaşık% 20-25'lik solüsyonlarının net genişleme veya daralma göstermediği tahmin edilmektedir. Konsantrasyona karşı hacim değişikliğinin eğimi, suyun tetrahedral düşük sıcaklık yapısı üzerindeki ilave kriyoprotektan etkilerinin en belirgin olduğu% 40 w / w'nin altında en büyük büyüklüğe sahiptir.
Şekil 1: Vitreus Faz T = 77 K Yoğunluk ve Kriyoprotektan Konsantrasyonu . T = 77 K yoğunluğu ( A ) gliserol ve ( B ) etilen glikol içeren vitrifiye sulu damlalar için konsantrasyona karşı. Veriler, üç tek damla ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: 298 K'lık Sıvıdan 77 K'ta Vitreous Faza Soğutma Özgül Hacimdeki Değişim. Sulu çözelti için 298 K'den 77 K'ye soğutma üzerine yüzde hacim değişikliğiGliserol ve etilen glikol. T = 298 K özüm yoğunlukları önceki ölçümlerden 14 , 15 elde edilir. Veriler, üç tek damla ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Öncelikle alet yapım araçlarına ve makinelere sınırlı erişimi olan lisans öğrencileri tarafından geliştirilen mevcut cihaz ve yöntemler, 50 pL kadar küçük bireysel sıvı damlaları için son derece hassas yoğunluk ölçümleri sunar. Küçük soğutma hızlarının vitrifiye numuneleri elde etmek için yeterli olduğu konsantrasyon aralığının% 50'den yakınında ve yoğunluğunda, yoğunluklar, toplu numuneler üzerindeki daha önceki ölçümlerde elde edilen konsantrasyonlarla aynıdır. Mevcut yoğunlukların% 0 konsantrasyona - saf suya - uygulanması, 77 K 9'da kabul edilen düşük yoğunluklu amorf buz yoğunluğu ile oldukça iyi bir uyum içindedir.
Belirli bir damla bileşimini nötr olarak yüzen hale getirmek için gereken N2-Ar yoğunluğuna bağlı olarak, 30 dakika ila 5 saat Ar akışı arasında N2-Ar karışımlarının üretilmesi gerekir. Ar mixin için yüzey alanını arttırmak için bir difüzör veya çoklu gaz tüpleri kullanarak bu süre azaltılabilirG kriyojenik sıvı içinde. N 2- Ar yoğunluğunu, nötr olarak çekici olduğu kesinleşene kadar ayarlamak, özellikle terminal hızları küçük olan küçük yarıçaplı ( r ) damlalar için zaman alıcı olabilir ( 
R 2 ) ve daha dikkatli gözlemler gerektirir. N2-Ar karışımı dikey bir yoğunluk / bileşim gradyanı oluşturma eğilimi gösterir ve bu nedenle düzenli olarak karıştırılmalıdır. Sonuç olarak, verilen bir çözünen madde türü ve konsantrasyonu için en az 3-5 damla ölçüm gerektiren tek bir camsı faz yoğunluk noktasının belirlenmesi birkaç saat sürebilir.
Her bir konsantrasyonda, genellikle iki veya üç damla yoğunluğu ölçülür. Her düşüşün "yoğunluğu", yoğunluk üzerindeki ölçülen üst ve alt sınırların ortalama olarak hesaplanır ve en düşük ölçülen N 2 -Ar yoğunluğu damla lavaboya ve en küçük yoğunluğa göre yüzer hale getirilir. Sızdırmazlığın düşme hızının veya iniş hızıyla değerlendirildiği sıkı bir üst sınır ve sıkı bir alt sınırın belirli bir damla ölçümlerde her zaman elde edilemediği ( örneğin , damla damla karıştırma sırasında düşebilir) ölçülmediği için Aynı konsantrasyon ve boyuttaki damlalarda bazen tek bir yoğunluk tahmini ile birleştirildi.
Deney sürelerini azaltmak için, bir ila üç gün sonra kullanmak üzere kriyojenik saklama kaplarında yüksek yoğunluklu N2-Ar karışımları hazırlamak ve depolamak için girişimlerde bulunuldu. Her durumda, Ar çözeltiden kristalleşti ve sıvı yoğunluğu depolama süresi ile azaldı. Sıvı N2-Ar düzenli olarak karıştırılmadıysa, damla yoğunluğu ölçümleri sırasında Ar katılaşma ve sıvı yoğunluğu azalmaları da meydana geldi.
Bu ölçümlerde büyük bir zorluk buzlanma ve buz oluşumunu en aza indirgemektir. Su buharı yoğuşması, buz oluşumu ve buz birikimiN2-Ar karışımının üzerindeki soğuk gazda, diğer soğuk yüzeylerde, örnek soğutma hücresinde ve yoğunluk ölçümlerinde kullanılan numuneleri kirletebilir, içinde buz çekirdeğini geliştirir ve görünür yoğunluklarını değiştirebilir. Numunedeki buz ve sıvı N 2 -Ar karışımı üzerinde yüzen ve yüzen numunenin düşük sıcaklık durumunun (vitröz ya da polikristalin) değerlendirilmesini zorlaştırabilir. Buz oluşumunu en aza indirgemek için, tüm soğuk yüzeylerin buz olup olmadığını düzenli olarak kontrol edin. Herhangi bir buzu mekanik olarak dikkatli bir şekilde veya sıcak kuru N 2 gazı kullanarak çıkarın. Bakır haznesinde buz birikirse, ince bir örgülü ekran kullanarak çıkarın veya bölmeyi çıkarın, boşaltın, kurutun ve hazneyi tekrar doldurun.
Vitrifiye edilmiş bir numune elde etmek için gereken minimum (kritik) soğutma hızı, saf su için 10 6 K / s'ye yaklaşan çözünen madde konsantrasyonunda azalma ile artar 7 . Örnek soğutma oranları damla şekline ve boyutuna bağlıdır (artarDüşen çapa bağlı olarak), düşmenin sıvı kriyojen içine ne kadar yansıyacağı hızı, sıvı kriyojen üzerinde soğuk gaz varlığı (genellikle soğutma hızını azaltır) ve sıvı kriyojenin özellikleri. Genellikle 1000 K / s'den daha büyük soğutma oranları hacimlerde (çaplar) yaklaşık 1 nL'den (~ 100 μm) daha düşük düşmelere ihtiyaç duyar.
Vitreus yoğunluklarının ölçülebileceği en düşük çözünen veya kriyoprotektan konsantrasyonu, maksimum damla soğutma hızlarıyla ve vitrifikasyon için görsel analizin güvenilir şekilde kullanılabileceği en küçük boyut damlaları ile belirlenir. Soğutma oranları, sıvı propan veya bir sıvı propan-etan karışımı içindeki numuneleri soğutarak ~ 5 faktöre kadar arttırılabilir. Sıvı N 2'den farklı olarak, bu kriyojenik sıvılar, kaynama sıcaklığı ile erime sıcaklığı arasında büyük bir ayrıma sahiptir ve bu nedenle, ısı aktarımını sınırlayan yüzeyli kaynama olmadan çok daha fazla ısıyı emebilirler. Soğutulan damlalar daha sonra N2-ArYoğunluk ölçümleri için karışım. Net damlalardan bulanık veya bulutlu damlalara geçiş, dar bir eriyik konsantrasyon (kabaca% 2 w / w) aralığında ve soğuma hızında ortaya çıkmaktadır ve X-ışını difraksiyon modellerinde 16 , 17 . Bununla birlikte, damla hacimleri 10 pL'ye doğru düştükçe doğru görsel netlik değerlendirmesi daha zor hale gelir.
N2-Ar karışımlarını kullanarak erişilebilen numune yoğunluk aralığı, sırasıyla 0.81 g / mL ve 1.40 g / mL saf sıvılar yoğunlukları ile belirlenir. Sıvı Ar-Kr karışımları, Kr kristalleşmesine duyarlıdır, ancak sıvılar sürekli karıştırıldıklarında bu yoğunluk aralığını genişletmek için kullanılabilir.
Burada açıklanan yöntemler, sulu karışımların, hücrelerin, hücre agregalarının, diğer biyolojik materyallerin yoğunluğunun ve küçük numunelerin veIstenen düşük sıcaklık fazını elde etmek için büyük soğutma hızlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Bu yoğunluklar, kriyoprezervasyonda örnek hasarın anlaşılması ve en aza indirgenmesinde ve sulu solüsyonlarda ve kapalı ve kalabalık ortamlarda suyun davranışının anlaşılmasında faydalı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, NSF tarafından MCB-1330685 ödülü ile desteklenmiştir. DWM, Cornell Üniversitesi Moleküler Biyofizik Eğitimi Grant'ının kısmi desteğini onayladı (NIH T32GM0082567).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 L/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 mL Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20X eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 mL cryovial is adequate |
References
- Fahy, G. M., Wowk, B. Principles of Cryopreservation by Vitrification. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , 21-82 (2015).
- Nagy, Z. P., Nel-Themaat, L., Chang, C. -C., Shapiro, D. B., Berna, D. P. Cryopreservation of eggs. Human Fertility: Methods and Protocols. , 439-454 (2014).
- Kriminski, S., Caylor, C. L., Nonato, M. C., Finkelstein, K. D., Thorne, R. E. Flash cooling and annealing of protein crystals. Acta Cryst Sect D. 58 (3), 459-471 (2002).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Reversible lattice repacking illustrates the temperature dependence of macromolecular interactions. J Mol Biol. 311 (4), 851-862 (2001).
- Juers, D. H., Matthews, B. W. Cryo-cooling in macromolecular crystallography: advantages, disadvantages and optimization. Q Rev Biophys. 37 (2), 105-119 (2004).
- Alcorn, T., Juers, D. H. Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography. Acta Cryst Sect D. 66 (4), 366-373 (2010).
- Warkentin, M., Sethna, J., Thorne, R. Critical Droplet Theory Explains the Glass Formability of Aqueous Solutions. Phys Rev Lett. 110 (1), 15703 (2013).
- Kriminski, S., Kazmierczak, M., Thorne, R. E. Heat transfer from protein crystals: implications for flash-cooling and X-ray beam heating. Acta Cryst Sect D. 59 (4), 697-708 (2003).
- Loerting, T., Bauer, M., Kohl, I., Watschinger, K., Winkel, K., Mayer, E. Cryoflotation: Densities of amorphous and crystalline ices. J Phys Chem B. 115 (48), 14167-14175 (2011).
- Shen, C., Julius, E. F., Tyree, T. J., Moreau, D. W., Thorne, R. E. Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection Thermal contraction of aqueous glycerol and ethylene glycol solutions for optimized protein-crystal cryoprotection. Acta Cryst Sect D. 72 (6), 742-752 (2016).
- Warkentin, M., Berejnov, V., Husseini, N. S., Thorne, R. E. Hyperquenching for protein cryocrystallography. J Appl Cryst. 39 (6), 805-811 (2006).
- McFerrin, M. B., Snell, E. H. The development and application of a method to quantify the quality of cryoprotectant solutions using standard area-detector X-ray images. J Appl Cryst. 35 (5), 538-545 (2002).
- Chinte, U., Shah, B., DeWitt, K., Kirschbaum, K., Pinkerton, A. A., Schall, C. Sample size: An important parameter in flash-cooling macromolecular crystallization solutions. J. Appl. Cryst. 38 (3), 412-419 (2005).
- Bosart, L. W., Snoddy, A. O. Specific gravity of glycerol. Ind Eng Chem. 20 (12), 1377-1379 (1928).
- Rodrigues, M., Francesconi, A. Z. Experimental study of the excess molar volumes of binary and ternary mixtures containing water + (1,2-ethanediol, or 1,2-propanediol, or 1,3-propanediol, or 1,2-butanediol) + (1-n-butyl-3-methylimidazolium bromide) at 298.15 K and atmospheric pressure. J Solution Chem. 40 (11), 1863-1873 (2011).
- Berejnov, V., Husseini, N. S., Alsaied, O. A., Thorne, R. E. Effects of cryoprotectant concentration and cooling rate on vitrification of aqueous solutions. J Appl Cryst. 39 (2), 244-251 (2006).
- Meisburger, S. P., Warkentin, M., et al. Breaking the Radiation Damage Limit with Cryo-SAXS. Biophys J. 104 (1), 227-236 (2013).
