Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

İnsan Mitral Valfinden Proteinlerin Çıkarılması İçin Optimize Edilmiş Protokol

doi: 10.3791/55762 Published: June 14, 2017

Summary

İnsan mitral kapağının protein kompozisyonu halen kısmen bilinmemektedir, çünkü analizi düşük selülarite ve dolayısıyla düşük protein biyosentezi ile karmaşıktır. Bu çalışma, mitral kapak proteomunun analizi için verimli bir şekilde protein çıkarmak için bir protokol sağlar.

Abstract

Hücresel proteomun analizi, karmaşık biyolojik sistemlerde bulunan proteinlerin büyük ölçekli tanımlanmasına ve nicelenmesine olanak tanıyan teknolojilerin geliştirilmesine bağlı olarak, hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına yardımcı olabilir. Proteomik bir yaklaşımla edinilen bilgiler potansiyel olarak bir Hastalıkların altında yatan patojenik mekanizmaların daha iyi anlaşılması, yeni tanısal ve prognostik hastalık belirteçlerinin ve umutla terapötik hedeflerin tanımlanmasına izin verilmesi. Bununla birlikte, kardiyak mitral kapak, proteoglikan ve kollajene zenginleştirilmiş hücre dışı matriste düşük sellülariteden dolayı proteomik analiz için çok zor bir örnek oluşturmaktadır. Bu, küresel bir proteomik analiz için proteinlerin çıkarılmasını zorlaştırıyor. Bu çalışma, niceliksel proteomik ve imünoblotlama gibi daha sonraki protein analizleriyle uyumlu bir protokolü açıklamaktadır. Bu, veri endeksinin korelasyonuna izin verebilirG protein ekspresyonu ile kantitatif mRNA ekspresyonu ve kantitatif olmayan immünhistokimyasal analiz verileri. Gerçekten de, bu yaklaşımlar birlikte uygulandığında, mRNA'dan translasyon sonrası proteinin modifikasyonuna kadar hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaların daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına yol açacaktır. Bu nedenle, bu yöntem kardiyak kapak fizyopatolojisi çalışması ile ilgilenen araştırmacılarla alakalı olabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yeni kanıtlar, mRNA sentezinden sonra ortaya çıkan birçok düzenleyici mekanizmanın rollerinin anlaşılmasını değiştirmiştir. Gerçekten de translasyonel, post-transkripsiyonel ve proteolitik süreçler protein bolluğunu ve fonksiyonunu düzenleyebilir. MRNA konsantrasyonlarının mütekabil proteinlerin yakınlıkları olduğunu söyleyen dogma, transkript seviyelerinin protein bolluğunun ana belirleyicisi olduğu varsayılarak kısmen revize edildi. Gerçekten de, transkript seviyeleri sadece protein bolluğunu kısmen tahmin ederek transkripsiyon sonrası olayların kısmen öngörülmesini sağladı. Hücrelerdeki proteinleri regüle etmek için meydana gelir 1 , 2 .

Dahası, proteinler sonuçta hücrenin işleyişini dikte eder ve bu nedenle otokrin, parakrin ve endokrin faktörlere yanıt olarak dinamik değişikliklere uğrayabilen fenotipini dikte eder; Kan yoluyla alınan arabulucular; sıcaklık; İlaç tedavisi; Ve hastalık gelişirve etkin kılar. Bu nedenle, protein seviyesine odaklanmış bir ifade analizi proteomu karakterize etmek ve hastalık patogenezinin bir parçası olarak meydana gelen kritik değişiklikleri çözmek için faydalıdır 3 .

Bu nedenle, mevcut teknolojik zorluklara rağmen, proteomiklerin sağlık ve hastalık koşullarını netleştirmek için sunduğu imkanlar çok zorludur. Proteomiklerin katkıda bulunabileceği özellikle umut verici araştırma alanları: değişen protein ekspresyonunun herhangi bir seviyede tanımlanması ( yani tüm hücreler veya doku, hücre altı bölmeleri ve biyolojik sıvılar); Hastalığın teşhisi ve prognozu için yararlı olan yeni biyolojik belirteçlerin tanımlanması, doğrulanması ve geçerliliği; Ve umarım, ilaçların etkinliği ve toksisitesinin değerlendirilmesi için olduğu kadar, terapötik amaçlar için de kullanılabilen yeni protein hedeflerinin belirlenmesi 4 .

Karmaşıklığını yakalamakProteom teknolojik zorluğu temsil eder. Mevcut proteomik araçlar, değişen protein seviyelerinin tanımlanması, nicelendirilmesi ve geçerliliği için büyük ölçekli, yüksek verimli analiz gerçekleştirme fırsatı sunar. Buna ek olarak, en bol proteinlerin neden olduğu parazitlenmeyi önlemeyi amaçlayan fraksiyonlama ve zenginleştirme tekniklerinin uygulanması, en az miktarda protein içeren protein tanımlamasını geliştirmiştir. Son olarak, proteomik, protein fonksiyonunun önemli modülatörleri olarak giderek artan translasyon sonrası modifikasyonların analizi ile tamamlanmaktadır.

Bununla birlikte, analiz altındaki biyolojik numunelerde numune hazırlama ve protein geri kazanımı hala proteomik iş akışındaki sınırlayıcı adımlardır ve muhtemel tuzaklar için potansiyel arttırır 5 . Gerçekten de, optimize edilmesi gereken moleküler biyoloji tekniklerinin çoğunda, ilk adımlar doku homojenizasyonuIyon ve hücre lizisi, özellikle amplifıkasyon yöntemleri bulunmayan düşük bolluklu proteinlerin analizi sırasında. Buna ek olarak, proteinlerin kimyasal yapısı kendi iyileşmelerini de etkileyebilir. Örneğin, çok hidrofobik proteinlerin analizi çok zordur, çünkü trans-membran proteinleri neredeyse çözünmezken, izoelektrik odaklama esnasında kolayca çökelirler (Referans 5'te incelenmiştir). Dahası, doku bileşimi değişkenliği evrensel bir ekstraksiyon yönteminin geliştirilmesi için önemli bir engel oluşturmaktadır. Son olarak, klinik örneklerin neredeyse tamamı sınırlı miktarda olduğundan, az miktarda numune miktarından maksimum düzeyde iyileşme ve tekrarlanabilirliğe sahip protein hazırlamayı sağlamak çok önemlidir 6 .

Bu çalışma, proteomik analiz için çok zor bir numuneyi temsil eden normal insan kalp kapakçık kapağından protein ekstraksiyonu için optimize edilmiş bir protokolü açıklamaktadır. Normal mitral kapak bir komp.Lex yapısı sol atrium ve kalbin sol ventrikül arasında yatıyor ( Şekil 1 ). Atriyumdan ventriküle doğru kan akışının kontrolünde önemli bir rol oynar, böylece geri akış engellenir ve tüm vücuda doğru oksijen tedariki düzeyi sağlanır, böylece yeterli bir kalp debisi sağlanır. Bununla birlikte, çoğunlukla ekstrasellüler matristeki, düşük sellülarite ve birkaç bileşen içeren, "aktif olmayan" bir doku olarak kabul edilir. Bunun nedeni, normal şartlarda yerleşik valvüler interstisyel hücreler (VIC'ler), düşük bir protein biyosentez oranına sahip sessiz bir fenotiptir.

Bununla birlikte, patolojik bir durumda, spongiosa'daki VIC sayısı arttığı ve protein sentezinin diğer fonksiyonel ve fenotipik değişikliklerle birlikte aktive edildiği gösterilmiştir 8 . Bu nedenle, şurada bulunan en düşük verininLiteratürde aktif VIC'lerin artan sayısı nispeten yüksek tanımlanan proteinleri açıklayabilecek patolojik mitral kapakçıkların 9 , 10 analizine odaklanmıştır.

Sonuç olarak, bu protokol, mitral kapak proteini bileşenleri çalışması yoluyla mitral kapak hastalıklarına neden olan patojenik mekanizmaların anlaşılmasını geliştirmeye hizmet edebilir. Aslında, altta yatan patolojik süreçlerin daha iyi anlaşılması, mevcut müdahale endikasyonları büyük ölçüde hemodinamik kaygılarla yüklü olan kapak hastalıklarının klinik yönetimini iyileştirmeye yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokolde, organ kalpleri normal ekokardiyografik parametrelere rağmen teknik veya işlevsel nedenlerle organ naklinden dışlanan çoklu organ donörlerinden çoklu organ explantasyonu (4-12 saat soğuk iskemi süresi, ortalama ± ± 2 saat) sırasında toplanır. Aortik ve pulmoner kapakçıkların bankacılığı için Milan Kardiyovasküler Doku Bankasına, Monzino Kardiyoloji Merkezi'ne (Milano, İtalya) gönderilirler. Mitral posterior broşürler klinik amaçla kullanılmaz, bu nedenle donorların akrabalarından bilgilendirilmiş onam alındığında aortik ve pulmoner kapak izolasyonu sırasında toplanırlar. Transplantasyon ve araştırma dokusu sadece ebeveynlerin izninden sonra toplanır; Izin belgesinde, insan klinik kullanımına ( yani, mikrobiyolojik, fonksiyonel ve serolojik sorunlar) uygun değilse, kardiyak doku kullanımını araştırma için etik komitesinin talimatlarını izleyen (veya değil)Monzino Kardiyoloji Merkezi.

1. Mitral kapak hazırlığı

  1. Organ eksplantasyonundan sonra mümkün olduğunca çabuk insan mitral kapağını hasat edin (4-12 saat soğuk iskemi süresi).
  2. Temiz bir odada kalbi, soğuk (4 ° C) bir solüsyonu ( örn. Tuzlu su çözeltisi veya dengeli orta Eurocollins veya Wisconsin) içeren taşıma çantasından çıkarın. Vantuz hazırlığına geçmek için bir kovaya koyun ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin (biyolojik tehlike sınıfı A, İyi Üretim Uygulamaları (GMP) sınıflandırması).
  3. Kalbi dolabın içindeki steril tek kullanımlık bir örtünün üzerine koyun. Steril tek kullanımlık bir neşter kullanarak, kalbi tam eksene dik olarak, apsisden yaklaşık 4 cm uzaktaki sol ve sağ ventrikler seviyesinde kesin.
  4. Sol atrium çatısını görüntülemek için, yükselen aorta ve pulmoner arteri hareket ettirin.
  5. Steril otoklavlanabilir forseps ve toplar ile sol kulakçığı kesipMitral kapağı görünür hale getirir ve büyük mitral yaprakçık (anterior) ve küçük mitral yaprak posteri (posterior) tanımlanmasına izin verir.
    NOT: Antero-lateral ve posterior medial komissürler, ön yaprakçık ve posterior alanın sınırını tanımlar.
  6. Steril otoklavlanabilir makas ve travmatik olmayan forseps kullanarak, tüm sol ventrikül kapağının çevresi etrafında sol atrium ve ventrikül duvar kalınlığını inceleyin .
  7. Mitro-aort kapak sürekliliğini belirleyin.
    NOT: Sol ventrikül bütün mitral kapak ve akorları içerir.
  8. Posterior mitral kapakçık leğeninden ön mitral kapakçık broşürünü ayırın ve posterior broşürü ventrikülle sokma (komissür) ile kesme.
  9. Salin solüsyonundaki posterior broşürü yıkayın. Broşürünü küçük parçalara (<1 cm2) kesin ve aluminyum folyoya ayrı ayrı sarın. Sıvı azot ile çalkalamayın.
    Dikkat: Sıvı azot kullanırken organizasyonel güvenlik prosedürlerini takip edin.
    1. İşlemin sonunda kabininin masasını% 70 izopropil alkol solüsyonu ve% 6 hidrojen peroksit solüsyonuyla haşlayın.

2. Protein ekstraksiyonu

  1. Sıvı azot içinde depolanan numuneyi almak için forseps kullanın ve alüminyum folyoya sarılı haldeyken derhal kuru buz üzerine koyun. Herhangi bir transfer sırasında numuneyi çözmeye bırakmayın.
  2. Öğütmeden önce, sıvı azotu (~ 500 mL) içeren bir Dewar şişeye koyarak numuneyle birlikte bir öğütücü sisteminin porselen / zirkon harcı ve havucu suyunu ( örn. CryoGrinder) soğutun.
    Dikkat: Sıvı azot kullanırken organizasyonel güvenlik prosedürlerini takip edin.
  3. Harcı ve havaneleri kuru buz içeren bir polistiren kutusuna koyun. Numuneyi alüminyum folyodan çıkarın ve harç içine koyun.
  4. ÖğütHarç karşı 15-20 kez büyük harç ile örnek, tornavida kullanarak havaneli döndürmek için. Öğütme işlemi sırasında, önceden soğutulmuş bir spatula ucu ile numuneyi karıştırın.
    1. Küçük havaneli ile tekrarlayın.
  5. Öğütülmüş numuneyi, tüp ters çevrilerek, harç üzerine yerleştirilerek ve tüpün içine götürmek üzere birlikte ters çevirerek daha önceden tartılmış bir tüpe ( örn., 15 mL santrifüj tüpüne) aktarın. Harca ait tüm malzemeleri geri kazanmak için önceden soğutulmuş bir spatula kullanın.
    1. Transfer esnasında örnek çözülmesini önlemek için, boruyu numuneyle kuru buzda tutun.
  6. Numunenin net ağırlığını hesaplayın.
  7. Her numuneden sonra harç ve kalıntıları temizleyin ve otoklavlayarak veya 200 ° C'de 2 saat ısıtılarak dekontamine ediniz.
  8. Toz haline getirilmiş numuneyi, ters çevirerek bir homojenleştiricinin cam tübüne santrifüj tüpünden aktarın.
  9. Filtrelenmiş üre büfesi ekleHer 10 mg toz haline getirilmiş doku için 200 uL üre tamponu cam tüpüne% 10 r (8 M üre, 2 M tiyoüre,% 4 w / v CHAPS, 20 mM Tris ve 55 mM ditiyotreitol) ilave edildi.
    NOT: Santrifüj tüpünde kalan artık toz halindeki örnek, hesaplanan hacimde üre tamponu kullanılarak geri kazanılabilir.
  10. Borosilikat cam harç ve bir politetrafloroetilen (PTFE) havan ile donatılmış bir karıştırıcı kullanarak numuneyi homojenize edin. 10'ar kez büküm hareketi (1,500 rpm) ile örnek üzerine yavaşça bastırın.
  11. Süpernatanı alın ve onu temiz bir 1.7 mL santrifüj tüpüne aktarın. Kalan numuneyi taze üre tamponuyla tekrar çıkarıp, ilk ekstraksiyon sırasında kullanılan hacmin yarısını ekleyin.
  12. Adım 2.10'ı tekrarlayın.
  13. Süpernatanı alın ve adım 2.11'deki süpernatana birleştirin. Birleştirilen süpernatanı 30 dakika süreyle bir tüp döndürücü üzerine yerleştirin.
  14. Boruyu 13,000 xg ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin.
  15. Süpernatanı veD Bradford protein deneyi kullanılarak üreticinin talimatlarına göre protein konsantrasyonunu ölçün. Kullanana kadar numuneyi -80 ° C'de saklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Proteinlerin üre tamponunda ekstraksiyonu ve çözünmesi, izoelektrofocusing (iki boyutlu elektroforez (2-DE) 11 ve sıvı faz izoelektrik odaklama (IEF) 12 ) temelli proteomik yöntemlerle ve Laemmli tamponu 13'de seyreltildikten sonra immünoblotlama ile doğrudan uyumludur Bir proteaz inhibitörü kokteylini içeren 14 .

Jelden arındırılmış kütle spektrometresi tabanlı yöntemler ( yani, veriden bağımsız kütle spektrometri analizine (LC / MS E ) ve iki boyutlu LC / MS E'ye (2D-LC / MS E ) eşleştirilmiş sıvı kromatografisi için) 15 , alınan örnekler Tanımlanan üre tamponunda, müteakip protein sindirimine ve sıvı kromatografi ayrışmasına müdahale edebilecek üre ve tiyoayı ortadan kaldırmak için daha fazla muamele edilmesi gerekir. ThiS tuz giderme basamağı, proteinlerin çökeltilmesi için imalatçının talimatlarına göre ticari protein çökeltme kitleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Numune daha sonra, protein sindirimi için% 0.1 kırılabilir deterjanlar içeren 25 mM NH4HCO3 içinde çözünebilir16. Proteinlerin çökeltilmesi, tampon bileşenlerini ortadan kaldırabilir ve protein içeriğini (protein giderme:>% 85) en düşük düzeyde etkiler ve böylece numuneyi her türlü analiz için uygun hale getirir.

İnsan mitral kapaklarından protein ekstraksiyonu için bu protokolün uygulanması, daha önce ayrıntılı olarak tarif edilen 11,15 dört farklı proteomik yaklaşımı birleştiren toplam 422 protein tayin edilmesine izin verdi. Spesifik olarak, 169 protein, sıvı-faz IEF tarafından 2-DE, 330 protein, LC / MS E tarafından 96 protein ve 148 protein ile tanımlandı.2D-LC / MS E ile (Tablo 1).

Subselüler lokalizasyon açısından 422 tanımlanan proteini sınıflandırmak için, bir yazılım, gen ontolojisi (GO) analizi ( örn. Cytoscape) için kullanılmıştır. Yazılım ve ilgili plug-in ile oluşturulan ağ, hücre dışı bölgede lokalize olan beklenen proteinlerin yanı sıra ( Şekil 2'nin sağ üst kısmına bakınız) proteomik yaklaşımlarla tanımlanan proteinlerin çoğunun hücre içi bölgeden geldiğini gösterdi ( Yani, sitoplazma, organel, vezikül ve sitoskeleton). Hücre yüzey proteinleri de tespit edildi ( Şekil 2 ).

Sonuçlar, üç bağımsız mitral kapak numunesinde daha da doğrulanmıştır. Immünoblotting, dört proteinin bir grubunu analiz etmek için kullanılmıştır ( yani, septin-11, dört buçuk LIM alan protein 1 (FHL-1), derMatopontin ve alfa-kristalin B (CryAB)) (normal mitral kapakta hiç tanımlanmamıştır) ( Şekil 3 ).

Şekil 1
Şekil 1: Mitral kapak yapısı. Kapalı ( A ) veya açık ( B ) insan mitral kapağını gösteren insan kalbinin üst görünüşü. İnsan kalbinin sol ventrikülünün ön görünüşü ( C ). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Belirlenen mitral kapak proteinlerinin hücresel dağılım açısından analizi. Cytoscape ve eklenti BiNGO obtai için kullanıldıN gen ontolojisi (GO) terimlerinin hücresel bileşen kategorilerinden dağılımı. Daire boyutu, seçilen GO terimleriyle ilişkili protein bileşenleri sayısıyla orantılıdır ve aşırı temsilin p-değeri için renk ölçeği rapor edilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3
Şekil 3: Üç insan normal mitral kapak broşüründen tüm ekstre içinde septin-11, FHL-1, dermatopontin ve CryAB'nin immünoblot analizi. Immünoblotting, CryAB'ye karşı fare monoklonal antikoru ve septin-11, FHL-1 ve dermatopontin antikorlarına karşı tavşan poliklonal antikorları kullanılarak gerçekleştirildi. LütfenBu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.

<td> x <td> <Td> Proteazom altbirim beta tip 4 öncüsü <td> </ Tr> <Td> Transgelin 2 <td> <tr> <td>
katılım Açıklama 2-DE 2D-LC LC-MS E Sıvı faz IEF
A6NMZ7 Kolajen alfa VI x
O00151 PDZ ve LIM domain proteini 1 x
O00299 Klorid hücreiçi kanal protein 1 x
O00764 Piridoksal kinaz x
O14558 Isı şoku protein beta 6 x
O43399 Tümör proteini D54 x
O43488 Aflatoksin B1 aldehit redüktaz üyesi 2 x
O43707 Alfa aktinin 4 x x
O43866 CD5 antijen benzeri prekürsör x
O60493 Sıralama nexin 3 x
O60701 UDP glikoz 6 dehidrojenaz x
O75223 Özellikleri belirlenmemiş protein x
O75368 SH3 etki alanı bağlama Glutamik asit protein bakımından zengin x
O75390 Sitrat sintaz mitokondriyal habercisi x
O75489 NADH dehidrogenaz ubiquinone demir sülfür proteini 3 mitokondriyal prekürsör x x
O75608 Asil protein tioesteraz 1 x
O75828 Karbonil redüktaz NADPH 3 x
O75874 İzositrat dehidrogenaz NADP sitoplazmik x
O75955 Flotillin x
O94760 NG NG dimetilar arginin dimetilaminohidrolaz 1 x
O94788 Retinal dehidrojenaz 2 x
O95865 NG NG dimetilarjinin dimetilaminohidrolaz 2 x x
P00325 Alkol dehidrojenaz 1B x x
P00338 L laktat dehidrojenaz A zinciri x
P00352 Retinal dehidrojenaz 1 x
P00441 Süperoksit dismutaz Cu Zn x x
P00450 Seruloplasmin öncüsü x x
P00488 Koagülasyon faktörü XIII Bir zincir öncüsü x
P00491 Pürin nükleozid fosforilaz x
P00492 Hipoksanthin guanin fosforibosiltransferaz x
P00558 Fosfogliserat kinaz 1 x x
P00568 Adenilat kinaz izoenzimi 1 x
P00734 protrombin x x
P00738 haptoglobin x x x x
P00739 Haptoglobin ile ilgili protein prekürsörü x
P00751 Komplement faktörü B x x x
P00915 Karbonik anhidraz 1 x
P00918 Karbonik anhidraz 2 x
P01008 Antitrombin III öncüsü x x x
P01009 Alfa 1 antitripsin x x x x
P01011 Alfa 1 antikimotripsin x x x x
P01019 Anjiyotensinojen öncüsü x x
P01023 Alfa 2 makroglobülin x x
P01024 Tamamlayıcı C3 x x x x
P01033 Metalloproteinase inhibitörü 1 prekürsörü x
P01042 Kininogen 1 öncüsü x
P01593 Ig kappa zincir VI bölgesi AG x
P01598 Ig kappa zinciri VI bölgesi AB x
P01600 Ig kappa zinciri VI bölgesi Hau x x
P01611 Ig kappa zincir VI bölgesi Wes x
P01620 Ig kappa zinciri V III bölgesi SIE x
P01625 Ig kappa zinciri V IV bölgesi Len x
P01766 Ig ağır zincir V III bölgesi BRO x x
P01781 Ig ağır zincir V III bölgesi GAL x
P01834 Ig kappa zinciri C bölgesi x x x x
P01842 Ig lambda zinciri C bölgeleri x x x
P01857 Ig gama 1 zincir C bölgesi x x x x
P01859 Ig gam2 zincir C bölgesi x x x x
P01860 Ig gama 3 zincir C bölgesi x x x
P01861 Ig gama 4 zincir C bölgesi x x x
P01871 Ig mu zincir C bölgesi x x x
P01876 Ig alfa 1 zincir C bölgesi x x x x
P01877 Ig alfa2 zincir C bölgesi x
P02144 myoglobin x x
P02452 Kolajen alfa 1 I zincir x x x x
P02511 Alfa kristalin B zinciri x
P02545 Lamin AC 70 kDa lamine x x x x
P02647 Apolipoprotein AI x x x x
P02649 Apolipoprotein E x x x x
P02671 Fibrinojen alfa zinciri x x x x
P02675 Fibrinojen beta zinciri x x x x
P02679 Fibrinojen gama zinciri x x x x
P02689 Myelin P2 proteini x
P02735 Serum amiloid A protein öncüsü x
P02741 C reaktif protein öncüsü x
P02743 Serum amiloid P bileşeni x x x x
P02746 Kompleman C1q alt bileşen altbirimi B x x
P02747 Kompleman C1q alt bileşeni altbirim C öncüsü x
P02748 Bileşen C9 tamamlayıcı x x x
P02749 Beta 2 glikoprotein 1 x x x x
P02750 Lösin açısından zengin alfa 2 glikoprotein öncüsü x
P02751 Fibronektin x x
P02760 AMBP protein öncüsü x x x x
P02763 Alfa 1 asit glikoprotein 1 x x x
P02765 Alfa 2 HS glikoprotein öncüsü x
P02766 Transtiretin öncüsü x x x
P02768 Serum albümin x x x x
P02774 D vitamini bağlayıcı protein öncüsü x
P02787 Serotransferrin x x x x
P02788 Laktotransferrin öncüsü x
P02790 hemopeksin x x x x
P02792 Ferritin hafif zincir x
P04004 vitronektin x x x x
P04075 Fruktoz bisfosfat aldolaz A x
P04083 Annexin A1 x x x x
P04179 Süperoksit dismutaz Mn mitokondriyal prekürsör x
P04196 Histidin açısından zengin glikoprotein öncüsü x
P04217 Alfa 1B glikoprotein öncüsü x x
P04350 Tubulin beta 4 zinciri x
P04406 Gliseraldehit 3 fosfat dehidrojenaz x x x x
P04792 Isı şoku protein beta 1 x x x x
P05091 Aldehid dehidrojenaz mitokondriyal prekürsörü x x
Plazma proteaz C1 inhibitörü prekürsörü x
P05156 Komplement faktör I prekürsörü x
P05413 Yağ asidi bağlayan protein kalbi x
P05452 Tetranektin öncüsü TN x x
P05787 Keratin tipi II sitoskeletal 8 x
P06396 gelsolin x x x x
P06576 ATP sentaz altbirim beta mitokondriyal öncüsü x x
P06732 Kreatin kinaz M tipi x x
P06733 Alfa enolaz x x x x
P06753 Tropomyosin alfa 3 zinciri x x
P07108 Acyl CoA bağlayıcı protein x
P07195 L laktat dehidrogenaz B zinciri x x x
P07196 Nörofilament hafif polipeptit x
P07197 Nörofilament orta polipeptidi x x
P07237 Protein disülfid izomeraz öncüsü x x
P07339 Katepsin D öncüsü x x
P07355 Annexin A2 x x x x
P07360 Kompleman bileşeni C8 gama zinciri öncüsü x
P07437 Tubulin beta zinciri x x x x
P07585 dekorin x x x x
P07737 Profilin 1 x
P07858 Katepsin B prekürsörü x
P07900 Isı şok proteini HSP 90 alfa x x
P07951 Tropomyosin beta zinciri x
P07954 Fumarat hidrataz mitokondriyal öncüsü x
P07996 Trombospondin 1 x x x
P08107 Isı şoku 70 kDa protein 1A 1B x x x x
P08123 Kolajen alfa 2 I zinciri x x x x
P08133 Annexin A6 x x
P08238 Isı şoku proteini HSP 90 beta x x
P08253 72 kDa tip IV kollajenaz öncüsü x
P08294 Ekstraselüler süperoksit dismutaz Cu Zn prekriptursor x x x
P08590 Miyozin hafif polipeptit 3 x x
P08603 Komplement faktörü H x x x x
P08670 vimentin x x x x
P08729 Keratin tipi II sitoskeletal 7 x
P08758 Annexin A5 x x x x
P09211 Glutatyon S transferaz P x x x
P09382 Galektin 1 x x x
P09417 Dihidropteridin redüktazı x
P09493 Tropomyosin 1 alfa zinciri x x
P09525 Annexin A4 x x
P09651 Heterojen nükleer ribonükleoprotein A1 x
P09871 Kompleman C1s alt bileşeni öncüsü x
P09936 Ubiquitin karboksil terminal hidrolaz izozim L1 x
P09972 Fruktoz bisfosfat aldolaz C x
P0C0L4 Complement C4 Bir öncü x
P0CG05 IgLambda 2 zincir C bölgeleri x
P0CG38 POTE ankirin ailesinin üyesi I x
P10515 Piruvat dehidrojenaz kompleksinin dihidrolipoililizin kalıntısı asetiltransferaz bileşeni x
P10768 S formilglutation hidrolaz x
P10809 60 kDa ısı şok proteini mitokondriyal prekürsör x
P10909 klusterin x x x x
P10915 Hyaluronan ve proteoglikan bağlantılı protein 1 öncüsü x x
P11021 78 kDa gLukoz düzenlenmiş protein x x x
P11047 Laminin altbirim gama 1 öncüsü x
P11142 Isı şoku eşdeğeri 71 kDa protein x x x x
P11177 Pirüvat dehidrojenaz E1 bileşen altbirim beta mitokondriyal öncüsü x
P11217 Glikojen fosforilaz kas formu x
P11310 Orta zincirli spesifik asil CoA dehidrojenaz mitokondriyal öncüsü x
P11413 Glukoz 6 fosfat 1 dehidrojenaz x
P11766 Alkol dehidrojenaz sınıfı 3 zincir zinciri x
P12036 Nevrofilament ağır polipeptit x
P12109 Kolajen alfa 1 VI zinciri x x x x
P12110 Kolajen alfa 2 VI zinciri x x x x
P12111 Kolajen alfa 3 VI zinciri x x x
P12277 Kreatin kinaz B tipi x
P12429 Annexin A3 x x
P12814 Alfa aktinin 1 x x
P12829 Myosin hafif polipeptit 4 x
P12882 Myosin 1 x
P12883 Myosin 7 x x
P12955 Xaa Pro dipeptidaz x
P13489 Ribonükleaz inhibitörü x
P13533 Myosin 6 x x
P13611 Versiküs çekirdek proteini öncüsü x x
P13639 Uzama faktörü 2 x
P13716 Delta aminolevulinik asit dehidrataz x
P13796 Plastin 2 x
P13804 Elektron transferi flavoprotein subunit alfa mitokondriyal prekürsör x
P13929 Beta enolaz x x
P14136 Glial fibriler asidik protein astrosit x
P14314 Glukozidaz 2 altbirim beta prekürsörü x
P14550 Alkol dehidrojenaz NADP x
P14618 Piruvat kinaz izozimler M1 M2 x x x
P14625 </ Td> Endoplazmin öncüsü x x
P15121 Aldoz redüktaz x
P15259 Fosfogliserat mutaz 2 x
P16152 Karbonil redüktaz NADPH 1 x
P17066 Isı şoku 70 kDa protein 6 x x x
P17174 Aspartat aminotransferaz sitoplazmik x
P17540 Kreatin kinaz sarkomerik mitokondriyal prekürsör x
P17661 Desmin x x x x
P17980 26S proteaz düzenleyici alt birim 6A x
P17987 T kompleks protein 1 altbirim alfa x
P18206 vinkulin x x
P18428 Lipopolysaccharide bağlayıcı protein öncüsü x
P18669 Fosfogliserat mutaz 1 x
P19105 Miyozin düzenleyici hafif zincir 2 x x
P19623 Spermidin sintazı x
P19652 Alfa 1 asit glikoprotein 2 öncüsü x x
P19823 İnter alfa tripsin önleyicisi ağır zincir H2 x
P19827 İnter alfa tripsin önleyicisi ağır zincir H1 x x
P20073 Annexin A7 x
P20618 Proteazom altbirim beta tip 1 prekürsörü x
P20774 Mimecan x x x x
P21266 Glutatyon S transferaz Mu 3 x
P21333 Filamin A x x
P21796 Gerilim bağımlı anyon seçici kanal proteini1 x
P21810 biglikan x x x x
P21980 Protein glutamin gama glutamiltransferaz 2 x x
P22105 Tenascin X x x
P22314 Ubiquitin aktive edici enzim E1 x
P22352 Glutatiyon peroksidaz 3 öncüsü x x
P22626 Heterojen nükleer ribonükleoproteinler A2 B1 x
P22695 Ubiquinol sitokrom c redüktaz kompleks çekirdek protein 2 mitokondriyal prekürsör x
P23141 Karaciğer karboksilesteraz 1 öncüsü x
P23142 Fibulin 1 x x x x
P23284 Peptidil prolil cis trans izomeraz B prekürsörü x
P23381 Triptofanil tRNA sentetaz sitoplazmik x
P23526 Adenosylhomocysteinase x x
P23528 Cofilin 1 x
P24752 Asetil CoA asetiltransferaz mitokondriyal prekürsör x
P25311 Çinko alfa 2 glikoproteisiÖncü x
P25705 ATP sentaz altbirimi alfa mitokondrial x
P25788 Proteazom altbirim alfa türü 3 x x
P25789 Proteazom altbirim alfa türü 4 x
P26447 Protein S100 A4 x
P27348 14 3 3 protein teta x x
P27797 Calretikulin öncüsü x
P28066 Proteazom altbirim alfa türü 5 x
P28070 x x
P28072 Proteazom altbirim beta tip 6 öncüsü x
P28074 Proteazom altbirim beta tip 5 öncüsü x
P28331 NADH ubiquinone oxidoreductase 75 kDa altbirim mitokondriyal prekürsör x
P28838 Sitozol aminopeptidaz x
P29218 İnositol monofosfataz x
P29401 transketolaz x
P29692 Uzama faktörü 1 delta x
P29966 Milistoillenmiş alanin bakımından zengin C kinaz substratı x
P30040 Endoplasmik retikulum protein ERp29 öncüsü x
P30041 Peroksiredoksin 6 x x
P30043 Flavin redüktaz x
P30044 Peroksiredoksin 5 mitokondriyal prekürsör x
P30085 UMP CMP kinazı x
P30086 Fosfatidiletanolamin bağlayıcı protein 1 x
P30101 ProteiN disülfid izomeraz A3 öncüsü x x x
P30613 Piruvat kinaz izoenzimleri RL x
P30740 Lökosit elastaz inhibitörü x
P31025 Lipokalin 1 öncüsü x
P31937 3 hidroksi izobütirat dehidrojenaz mitokondriyal prekürsör x
P31942 Heterojen nükleer ribonükleoprotein H3 x
P31943 Heterojen nükleer ribonükleoprotein H x
P31946 14 3 3 protein beta alfa x x
P31948 Strese bağlı fosfoprotein 1 x
P31949 Protein S100 A11 x
P32119 Peroksiredoksin 2 x x
P34931 Isı şoku 70 kDa protein 1 gibi x x
P34932 Isı şoku 70 kDa protein 4 x
P35232 prohibitin x
P35237 Serpin B6 x
P35443 Trombospondin 4 x
P35555 Fibrilin 1 x x
P35579 Myosin 9 x x x
P35580 Myosin 10 x x
P35609 Alfa aktinin 2 x
P35625 Metalloproteinaz inhibitörü 3 x x
P35998 26S proteaz düzenleyici alt birim 7 x
P36871 Fosfoglukomaz 1 x x
P36955 Pigment epiteli türevi faktör x x
P37802 x x
P37837 transaldolaz x
P38117 Elektron transfer flavoprotein altbirim beta x
P38646 Stres 70 protein mitokondriyal prekürsör x x
P39687 Asidik lösin açısından zengin nükleer fosfoprotein 32 ailesi üyesi A x
P40121 Makrofaj kapak proteini x
P40925 Malat dehidrojenaz sitoplazmik x
P40926 Malat dehidrogenaz mitokondriyal prekürsör x
P41219 periferin x
P42330 Aldo keto redüktaz ailesinin 1 üyesi C3 x
P45880 Gerilim bağımlı anyon seçici kanal proteini 2 x
P47755 F aktin kaplama proteini altbirimi alfa 2 x x
P47756 F aktin kapak protein alt birim beta x x
P47985 Ubiquinol sitokrom c redüktaz demir sülfür alt birimi mitokondriyal prekürsör x
P48047 ATP sentaz O subunit mitokondriyal prekürsör x
P48637 Glutatyon sentetaz x
P48741 Isı şoku 70 kDa protein 7 x x
P49189 4 trimetilaminobütiraldehid dehidrojenaz x
P49368 T kompleks protein 1 alt birim gamma x
P49747 Kıkırdak oligomerik matris proteini x x x x
P49748 Çok uzun zincirli spesifik asil CoA dehidrogenaz mitokondriyal öncüsü x
P50395 Rab GSYİH ayrışma önleyici beta x x </ Td>
P50454 Serpin H1 öncüsü x
P50995 Annexin A11 x
P51452 Çift özgüllük protein fosfataz 3 x
P51884 Lumican x x x x
P51888 Prolargin öncüsü x x x x
P52565 Rho GSYİH ayrışma önleyicisi 1 x
P52566 Rho GSYİH ayrışma önleyicisi 2 x
P54652 Isı şokuyla ilgili 70 kDa protein 2 x x x x
P55072 Geçici endoplazmik retikulum ATPaz x
P55083 Mikrofibrille ilişkili glikoprotein 4 öncüsü x x
P57053 Histon H2B tipi F x
P60174 Triosefosfat izomeraz x x x
P60660 Miyozin hafif polipeptid 6 x x
P60709 Aktin sitoplazmik 1 x x x x
P60981 Destrin x
P61086 Ubiquitin konjuge edici enzim E2 25 kDa x
P61088 Ubiquitin konjuge enzim E2 x
P61224 Ras ile ilgili protein Rap 1b öncüsü x
P61978 Heterojen nükleer ribonükleoprotein K x x
P61981 14 3 3 protein gama x x x
P62258 14 3 3 protein epsilon 14 3 3E x
P62491 Ras ile ilgili protein x
P62714 Serin treonin proteini fosfataz 2A katalitik altbirim beta izoformu x
P62736 Aktin aort düz kası x x x
P62805 Histon H4 x
P62826 GTP bağlayıcı nükleer protein Ran x
P62873 Guanin nükleotid bağlama proteini GIGSGT alt birim beta 1 x
P62879 Guanin nükleotid bağlama proteini GIGSGT alt birim beta 2 x
P62937 Peptidil prolil cis trans izomeraz A x x
P62987 Ubiquitin 60S ribozomal protein L40 x
P63104 14 3 3 yanlısıTein zeta delta x x x x
P63241 Ökaryotik çeviri başlatma faktörü 5A 1 x
P63244 Guanin nükleotid bağlama proteini alt birim beta 2, 1 gibi x
P63267 Aktin gama enterik düz kası x x
P67936 Tropomyosin alfa 4 zinciri x
P68032 Aktin alfa kalp kası 1 x
P68104 Uzama faktörü 1 alfa 1 x x x
P68133 Aktin alfa iskelet kası
P68363 Tübulin alfa 1B zinciri x x x
P68371 Tubulin beta 2C zinciri x x x
P68402 Trombosit aktive edici faktör asetilhidrolaz IB alt birim beta x
P68871 Hemoglobin alt birim beta x x x
P69905 Hemoglobin subunit alfa x x
P78371 T kompleks protein 1 altbirim beta x
P78417 Glutatyon transferaz omega 1 x x
P80748 Ig lambda zinciri VIII bölgesi x
P98095 Fibulin 2 x x
Q01082 Spectrin beta zinciri beyin 1 x
Q01449 Miyozin düzenleyici hafif zincir 2 atriyal izoform x
Q01518 Adenillyla siklaz ile bağlantılı protein 1 x
Q01995 Transgelin Düz kas proteini 22 alfa x
Q03252 B2 tabakası x x
Q03591 Komplement faktörü H ile ilgili protein 1 prekürsörü x
Q04917 14 3 3 protein eta x x
Q06323 Proteazom aktifleştirici kompleks altbirim 1 x
Q06828 Fibromodulin x x x x
Q06830 Peroksiredoksin 1 x x
Q07507 Dermatopontin x x x x
Q07960 Rho GTPaz aktive edici protein 1 x
Q08257 Kinon oksidoredüktaz x
Q08431 Lactadherin x x
Q12765 SEkernin 1 x
Q13011 Delta 3 5 Delta 2 4 dienoyl CoA izomeraz mitokondriyal prekürsör x x
Q13228 Selenyum bağlayıcı protein 1 x x
Q13404 Ubiquitin konjuge edici enzim E2 varyantı 1 x
Q13409 Sitoplazmik dinein 1 ara zincir 2 x
Q13509 Tubulin beta 3 zinciri x x x
Q13642 Dört buçuk LIM alan protein 1 x
Q13765 Yeşilleşmiş polipeptid ile ilişkili kompleks altbirim alfa x
Q13885 N Tubulin beta 2A zinciri x x
Q14194 Dihidropirimidinazla ilgili protein 1 x
Q14195 Dihidropirimidinazla ilgili protein 3 x x x x
Q14624 İnter alfa tripsin önleyicisi ağır zincir H4 öncüsü x
Q14697 Nötr alfa glukosidaz AB öncüsü x
Q14764 Büyük tonoz proteini x
Q14767 Latent transforming growth factor beta bağlayıcı protein 2 x x
Q14894 Mu kristalin homologu NADP tiroid hormon bağlama proteinini düzenledi x
Q15063 Periostin öncüsü x x x x
Q15084 Protein disülfid izomeraz A6 öncüsü x
Q15113 Prokollajen C endopeptidaz arttırıcı 1 öncüsü x
Q15181 İnorganik pirofosfataz x
Q15365 PoliRC bağlayıcı protein 1 x
Q15366 PoliRC bağlama proteini 2 x
Q15582 Büyüme faktörü beta ile indüklenen proteini dönüştüren x x x
Q15819 Ubiquitin konjuge edici enzim E2 varyantı 2 x
Q16352 Alfa interneksin x
Q16473 Tahmini tenascin XA x
Q16555 Dihidropirimidinazla ilgili protein 2 x x x
Q16698 2 dienoil CoA redüktaz mitokondriyal öncüsü x
Q16891 Mitokondriyal iç membran x
Q562R1 Protein 2 gibi beta aktin x
Q6S8J3 POTE ankirin ailesinin üyesi E x
Q6UWY5 Protein 1 öncüsü gibi olfaktomedin x x
Q71U36 Tubulin alfa 1A zinciri x x x
Q7Z7G0 Nesh SH3 öncüsü hedefi x x x
Q8WUM4 Programlanmış hücre ölümleri 6 etkileşen protein x
Q8WWX9 Selenoprotein M öncüsü gibi tioredoksin x
Q92597 Protein NDRG1 x
Q92945 Uzak akış yukarı eleman bağlama proteini 2 x
Q96CN7 Isochorismatase domain içeren protein 1 x
Q96CX2 BTB POZ alanı içeren protein x
Q96KK5 Histone H2A tip 1 H x x
Q96KP4 Sitozolik spesifik olmayan dipeptidaz x
Q99426 Tubulin spesifik şaperon B x
Q99497 Protein DJ 1 x x
Q99536 Sinaptik vezikül zar proteini x x x
Q99714 3 hidroksiasil CoA dehidrojenaz tip 2 x
Q99715 Kolajen alfa 1 XII zinciri x x
Q99798 Aconitate hidrataz mitokondriyal prekürsör x
Q9BQE3 Tübulin alfa 6 zinciri x
Q9BUF5 Tubulin beta 6 zinciri x x
Q9BUT1 3 hidroksibutirat dehidrojenaz tip 2 x
Q9BVA1 Tubulin beta 2B zinciri x x x
Q9BXN1 Asporin x x </ Td> x x
Q9H0W9 Ester hidrolaz C11orf54 x
Q9H4B7 Tubulin beta 1 zinciri x
Q9NRN5 Protein 3 öncüsü gibi olfaktomedin x x
Q9NRV9 Heme bağlayıcı protein 1 x
Q9NSB2 Keratin tipi II kesicular Hb4 x x
Q9NVA2 Septin 11 x
Q9UBR2 Katepsin Z öncüsü x
Q9UBX5 Fibulin 5 x x
Q9UK22 F kutusu sadece protein 2 x
Q9Y277 Voltaja Bağlı Anyon Seçici Kanal Protein 3 x
Q9Y281 Cofilin 2 x
Q9Y490 Talin 1 x
Q9Y696 Klorür hücre içi kanal protein 4 x
Q9Y6C2 EMILIN 1 x x

Tablo 1: Dört farklı proteomik yaklaşım uygulanırken mitral kapak doku ekstraktında tanımlanan proteinlerin listesi: İki boyutlu elektroforez (2-DE), iki boyutlu LC-MS E (2D-LC / MS E ), LC / MS E ve sıvı faz IEF. Her bir proteinin tanımlandığı yöntem rapor edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokolün kritik bir adımı, numuneyi dondurmak ve öğütücü sistemini soğutmak için sıvı azot kullanılmasıdır. Sıvı azot kullanımı, biyolojik bozulmayı önler ve verimli tozlamaya izin verir, ancak güvenli kullanım için özel eğitim gerektirir.

Bu protokolde örnek öğütme için bir öğütücü sistemi bulunur, çünkü küçük numunelerin standart harç ve havanelerden kurtarılması zordur. Bu durumda, küçük numuneler, harç yüzeyinin üzerine ince bir toz halinde yayılır ve böylece toplama işlemi zorlaşır. Başka bir avantaj da öğütücünün motorlu olması, daha fazla sayıda numunenin tekrarlanabilir bir şekilde ve yorulmadan eklenmesine olanak sağlamasıdır. Öğütücünün kullanımına ilişkin bir sınırlama, numunenin büyüklüğünün az olması gerekirken (100 mg veya daha az), havan toprağa etkili bir şekilde preslenecek olmasıdır. Ayrıca, öğütücü bileşenleri, temizleme amaçları arasında oda sıcaklığına ısıtılmalıdır g. Sonuç olarak, prosedür çok zaman alıcıdır ve eğer birçok numune günlük olarak işlenirse, birçok takıma ihtiyaç duyulmaktadır.

İlave bir kritik adım, ekstraksiyon tamponunun hazırlanmasıdır. Tuz konsantrasyonları, özellikle üre (8 M) ve tiyoüre (2 M) için oldukça yüksektir; Böylece, tuz hacmi çözeltinin toplam hacminin neredeyse yarısı kadardır. Ayrıca, 37 ° C'den fazla sıcaklıkta üre protein / peptidin N terminalinde ve lizin ve arginin artıklarının 17 yan zincir amino gruplarında protein karbamilasyona neden olabileceği için ısı kaçınılmalıdır, çünkü çözünme kolay değildir. . Çözündükten sonra, üre tamponu 0.22 μm'lik filtrelerle süzülmelidir ve ekstraksiyon etkinliğini etkilemeden -80 ° C'de 4 hafta süreyle saklanabilir, ancak tam çözünmeye izin vermek için kullanımdan önce 15 ° C'den fazla ısıtılmalıdır. .

Değişiklikler ve sorun giderme

Bu protokoldür protein ekstraksiyonu tarif edilen üre tamponu kullanılarak gerçekleştirilir, çünkü izoelektrofokus ile uyumluluğu ve az çözünen proteinleri çözünürleştirmede etkinliği nedeniyle proteomik çalışmalar için en çok kullanılan protein ekstraksiyon çözeltilerinden biridir ( 18) . Bu tamponun, integral membran proteinleri 19 veya tübülin 18 gibi agregasyona oldukça yatkın olan proteinler gibi az çözünür proteinleri çok etkili bir şekilde çözündürebildiğini göstermiştir Ayrıca bu tampon, protein konsantrasyonunu belirlemek için Bradford tahlili ile tamamen uyumludur ve Doğrudan 2-DE ve sıvı fazlı IEF analizlerinde kullanılabilir.

Bununla birlikte, bu tampon, bir numunedeki tüm proteinlerin çözünürlüğü için ideal değildir. Farklı ekstraksiyon tamponlarının proteinleri bu protokol ile tespit edilemediği ortaya çıkabilir. Örneğin, iyi biliyorBu ribozomal ve nükleer proteinlerin, asit ekstraksiyonu veya trikloroasetik asit / aseton çökeltme 20 ile daha iyi ekstrakte edilebileceği, buna karşın alkalin pH düzeylerinin membran proteinleri 21 , 22 için daha uygun olduğu bulunmuştur. Bu nedenle, alternatif tamponların kullanılması, 2-DE veya sıvı fazlı IEF'yi etkileyen tuzları ortadan kaldırmak için protein çökeltilmesi için ek adımlar gerektirebilir.

Tekniğin sınırlamaları

Bu protokol tarafından belirlenen protein sayısı nispeten düşüktür, ancak tanımlama sayısı ve proteomik analizi kapsama alanı, son yıllarda kitlesel doğruluk ve dizilim hızı çarpıcı bir biçimde artan daha modern araçların kullanılmasıyla daha da artırılabilir 23. Proteomun büyük bir bölümünü herhangi bir ön ayırma basamağı olmaksızın, sıvı ch için uzun bir gradyan kullanmak suretiyle kaplamak mümkündür.Romatograf ayrımları ve hızlı bir sıralama hızı olan yüksek çözünürlüklü bir MS enstrümanı.

Tekniğin mevcut / alternatif yöntemlere göre önemi

İnsan kalp kapakçıkları (mitral kapak gibi) proteinleri tanımlama ve ölçme kabiliyeti, kapak hastalıklarında fizyolojik / patolojik süreçlerin mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olacak önemli ve zorlayıcı bir görevdir. Mitral kapak proteomunun değişimlerinin tanımlanması, dokunun hastalık durumu ile ilişkili biyolojik süreçlerin doğasını anlamayı arttıracaktır.

Mitral kapağın fizyopatolojisi hakkındaki mevcut bilgiler sınırlıdır ve genellikle hücre dışı matriks yeniden şekillenmesi, hemostaz, inflamasyon veya oksidatif stres gibi spesifik süreçlerde yer alan proteinlerin analiziyle elde edilir. 9 , 10'un analizine odaklanmaktadır.

Kapsamlı proteomik çalışmaların olmaması, hücre dışı matris proteinleri ( örn., Proteoglikanlar, kollajen ve elastin) açısından çok zayıf olan bu düşük hücreli dokunun karmaşıklığına atfedilebilir. Bu proteinler, toplam miktarın yaklaşık% 80'ini oluşturur ve düşük miktarda bulunan proteinlerin analizini engeller 26 .

Bu nedenle, bu dokunun proteomunu tanımlamak için protein çözünürlüğünü en yükseğe çıkarmak için etkili bir ekstraksiyon protokolü kurmak gerekiyordu. Bu protokol, 1 mg dokudan ~ 50 μg proteinin çıkarılmasına izin verdi. Bu, "yumuşak" dokuyla karşılaştırıldığında nispeten düşük bir verimdir, örneğinKaraciğer olarak (1 mg dokudan ~ 135 μg), ancak tek tek numuneler üzerinde bir protein analizi yapmak yeterlidir. Bu, bir fenomenin bireysel değişkenliğini tanımlarken özellikle önemlidir.

Ayrıca, bu yöntem birçok analitik uygulama ile uyumlu olma avantajına sahiptir. Önerilen ekstraksiyon tamponunda çözünen mitral kapak proteinleri, doğrudan iki boyutlu elektroforez ve sıvı faz izoelektroforez 11 , 12 veya protein tortulaştırma sonrası tampon bileşeni girişimini ortadan kaldırmak için kullanılan immünoblotlama ve proteomik analizler için, diğer tahliller için kullanılabilir Jelsiz kütle spektrometresi 15 .

Bu ekstraksiyon protokolünün uygulanması ile, normal mitral kapak dokusunun protein bileşenlerinin daha kapsamlı bir karakterizasyonu birçok intracelLular proteinler. Bu proteinler, sadece hücre dışı matriste değil, sitozolda veya organellerde lokalizedir ve farklı moleküler ve biyolojik fonksiyonlara sahiptir. Diğer ilginç proteinler ( yani, CryAB, septin-11, FHL-1 ve dermatopontin) de tanımlandı. Bu proteinlerin mitral kapaktaki fonksiyonları bilinmemekle birlikte, biyolojik özellikleri kapak hastalıklarında olası bir rol oynadığını göstermektedir.

Bu tekniğe hakim olduktan sonra gelecekteki uygulamalar veya yönler

Bu protokol ile, protein ekspresyonu ile ilgili verileri, niceliksel mRNA ekspresyonu ve kantitatif olmayan immünhistokimyasal analizler ile ilişkilendirmek mümkündür. Gerçekten birlikte, birlikte kullanıldığında, bu yaklaşımlar mRNA'dan translasyon sonrası proteinin modifikasyonuna kadar hastalığın altında yatan moleküler mekanizmaların daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına yol açacaktır. Bu nedenle, bu yöntem kalp kapak fizyopatolojisine odaklanan araştırmacılar için ilginç olabilir. yüzgeçAyrıca, bu protokol, insan valfi 27'ye yakın bir benzerliği olan ve kapak fonksiyonu değerlendirmesi için deneysel bir model olarak kullanılan domuz mitral kapağına da uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

İtalyan Sağlık Bakanlığı, bu çalışmayı destekledi (RC 2013-BIO 15). Mükemmel teknik yardımıyla Barbara Micheli'ye teşekkür ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5, (12), 1512-1526 (2009).
  3. Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422, (6928), 226-232 (2003).
  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
  5. Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
  6. Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4, (9), 1123-1140 (2012).
  7. Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62, (4), 605-611 (2004).
  8. Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104, (21), 2525-2532 (2001).
  9. Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
  10. Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15, (17), 2934-2944 (2015).
  11. Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38, (5), 341-350 (2010).
  12. Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9, (5), 1344-1352 (2009).
  13. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193, (1), 265-275 (1951).
  14. Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85, (2), 208-217 (1999).
  15. Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37, (20), 2633-2643 (2016).
  16. Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
  17. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  18. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18, (3-4), 307-316 (1997).
  19. Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21, (6), 1054-1070 (2000).
  20. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2, (6), 1445-1457 (2007).
  21. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93, (1), 97-102 (1982).
  22. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, (12), 3665-3685 (2004).
  23. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (47), 18132-18138 (2008).
  24. Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10, (8), M110.003699 (2011).
  25. Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151, (2), 129-135 (2011).
  26. Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118, (18), 1864-1880 (2008).
  27. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53, (5), 432-438 (2014).
İnsan Mitral Valfinden Proteinlerin Çıkarılması İçin Optimize Edilmiş Protokol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).More

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter