Summary
İnsan mitral kapağının protein kompozisyonu halen kısmen bilinmemektedir, çünkü analizi düşük selülarite ve dolayısıyla düşük protein biyosentezi ile karmaşıktır. Bu çalışma, mitral kapak proteomunun analizi için verimli bir şekilde protein çıkarmak için bir protokol sağlar.
Abstract
Hücresel proteomun analizi, karmaşık biyolojik sistemlerde bulunan proteinlerin büyük ölçekli tanımlanmasına ve nicelenmesine olanak tanıyan teknolojilerin geliştirilmesine bağlı olarak, hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılmasına yardımcı olabilir. Proteomik bir yaklaşımla edinilen bilgiler potansiyel olarak bir Hastalıkların altında yatan patojenik mekanizmaların daha iyi anlaşılması, yeni tanısal ve prognostik hastalık belirteçlerinin ve umutla terapötik hedeflerin tanımlanmasına izin verilmesi. Bununla birlikte, kardiyak mitral kapak, proteoglikan ve kollajene zenginleştirilmiş hücre dışı matriste düşük sellülariteden dolayı proteomik analiz için çok zor bir örnek oluşturmaktadır. Bu, küresel bir proteomik analiz için proteinlerin çıkarılmasını zorlaştırıyor. Bu çalışma, niceliksel proteomik ve imünoblotlama gibi daha sonraki protein analizleriyle uyumlu bir protokolü açıklamaktadır. Bu, veri endeksinin korelasyonuna izin verebilirG protein ekspresyonu ile kantitatif mRNA ekspresyonu ve kantitatif olmayan immünhistokimyasal analiz verileri. Gerçekten de, bu yaklaşımlar birlikte uygulandığında, mRNA'dan translasyon sonrası proteinin modifikasyonuna kadar hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaların daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına yol açacaktır. Bu nedenle, bu yöntem kardiyak kapak fizyopatolojisi çalışması ile ilgilenen araştırmacılarla alakalı olabilir.
Introduction
Yeni kanıtlar, mRNA sentezinden sonra ortaya çıkan birçok düzenleyici mekanizmanın rollerinin anlaşılmasını değiştirmiştir. Gerçekten de translasyonel, post-transkripsiyonel ve proteolitik süreçler protein bolluğunu ve fonksiyonunu düzenleyebilir. MRNA konsantrasyonlarının mütekabil proteinlerin yakınlıkları olduğunu söyleyen dogma, transkript seviyelerinin protein bolluğunun ana belirleyicisi olduğu varsayılarak kısmen revize edildi. Gerçekten de, transkript seviyeleri sadece protein bolluğunu kısmen tahmin ederek transkripsiyon sonrası olayların kısmen öngörülmesini sağladı. Hücrelerdeki proteinleri regüle etmek için meydana gelir 1 , 2 .
Dahası, proteinler sonuçta hücrenin işleyişini dikte eder ve bu nedenle otokrin, parakrin ve endokrin faktörlere yanıt olarak dinamik değişikliklere uğrayabilen fenotipini dikte eder; Kan yoluyla alınan arabulucular; sıcaklık; İlaç tedavisi; Ve hastalık gelişirve etkin kılar. Bu nedenle, protein seviyesine odaklanmış bir ifade analizi proteomu karakterize etmek ve hastalık patogenezinin bir parçası olarak meydana gelen kritik değişiklikleri çözmek için faydalıdır 3 .
Bu nedenle, mevcut teknolojik zorluklara rağmen, proteomiklerin sağlık ve hastalık koşullarını netleştirmek için sunduğu imkanlar çok zorludur. Proteomiklerin katkıda bulunabileceği özellikle umut verici araştırma alanları: değişen protein ekspresyonunun herhangi bir seviyede tanımlanması ( yani tüm hücreler veya doku, hücre altı bölmeleri ve biyolojik sıvılar); Hastalığın teşhisi ve prognozu için yararlı olan yeni biyolojik belirteçlerin tanımlanması, doğrulanması ve geçerliliği; Ve umarım, ilaçların etkinliği ve toksisitesinin değerlendirilmesi için olduğu kadar, terapötik amaçlar için de kullanılabilen yeni protein hedeflerinin belirlenmesi 4 .
Karmaşıklığını yakalamakProteom teknolojik zorluğu temsil eder. Mevcut proteomik araçlar, değişen protein seviyelerinin tanımlanması, nicelendirilmesi ve geçerliliği için büyük ölçekli, yüksek verimli analiz gerçekleştirme fırsatı sunar. Buna ek olarak, en bol proteinlerin neden olduğu parazitlenmeyi önlemeyi amaçlayan fraksiyonlama ve zenginleştirme tekniklerinin uygulanması, en az miktarda protein içeren protein tanımlamasını geliştirmiştir. Son olarak, proteomik, protein fonksiyonunun önemli modülatörleri olarak giderek artan translasyon sonrası modifikasyonların analizi ile tamamlanmaktadır.
Bununla birlikte, analiz altındaki biyolojik numunelerde numune hazırlama ve protein geri kazanımı hala proteomik iş akışındaki sınırlayıcı adımlardır ve muhtemel tuzaklar için potansiyel arttırır 5 . Gerçekten de, optimize edilmesi gereken moleküler biyoloji tekniklerinin çoğunda, ilk adımlar doku homojenizasyonuIyon ve hücre lizisi, özellikle amplifıkasyon yöntemleri bulunmayan düşük bolluklu proteinlerin analizi sırasında. Buna ek olarak, proteinlerin kimyasal yapısı kendi iyileşmelerini de etkileyebilir. Örneğin, çok hidrofobik proteinlerin analizi çok zordur, çünkü trans-membran proteinleri neredeyse çözünmezken, izoelektrik odaklama esnasında kolayca çökelirler (Referans 5'te incelenmiştir). Dahası, doku bileşimi değişkenliği evrensel bir ekstraksiyon yönteminin geliştirilmesi için önemli bir engel oluşturmaktadır. Son olarak, klinik örneklerin neredeyse tamamı sınırlı miktarda olduğundan, az miktarda numune miktarından maksimum düzeyde iyileşme ve tekrarlanabilirliğe sahip protein hazırlamayı sağlamak çok önemlidir 6 .
Bu çalışma, proteomik analiz için çok zor bir numuneyi temsil eden normal insan kalp kapakçık kapağından protein ekstraksiyonu için optimize edilmiş bir protokolü açıklamaktadır. Normal mitral kapak bir komp.Lex yapısı sol atrium ve kalbin sol ventrikül arasında yatıyor ( Şekil 1 ). Atriyumdan ventriküle doğru kan akışının kontrolünde önemli bir rol oynar, böylece geri akış engellenir ve tüm vücuda doğru oksijen tedariki düzeyi sağlanır, böylece yeterli bir kalp debisi sağlanır. Bununla birlikte, çoğunlukla ekstrasellüler matristeki, düşük sellülarite ve birkaç bileşen içeren, "aktif olmayan" bir doku olarak kabul edilir. Bunun nedeni, normal şartlarda yerleşik valvüler interstisyel hücreler (VIC'ler), düşük bir protein biyosentez oranına sahip sessiz bir fenotiptir.
Bununla birlikte, patolojik bir durumda, spongiosa'daki VIC sayısı arttığı ve protein sentezinin diğer fonksiyonel ve fenotipik değişikliklerle birlikte aktive edildiği gösterilmiştir 8 . Bu nedenle, şurada bulunan en düşük verininLiteratürde aktif VIC'lerin artan sayısı nispeten yüksek tanımlanan proteinleri açıklayabilecek patolojik mitral kapakçıkların 9 , 10 analizine odaklanmıştır.
Sonuç olarak, bu protokol, mitral kapak proteini bileşenleri çalışması yoluyla mitral kapak hastalıklarına neden olan patojenik mekanizmaların anlaşılmasını geliştirmeye hizmet edebilir. Aslında, altta yatan patolojik süreçlerin daha iyi anlaşılması, mevcut müdahale endikasyonları büyük ölçüde hemodinamik kaygılarla yüklü olan kapak hastalıklarının klinik yönetimini iyileştirmeye yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde, organ kalpleri normal ekokardiyografik parametrelere rağmen teknik veya işlevsel nedenlerle organ naklinden dışlanan çoklu organ donörlerinden çoklu organ explantasyonu (4-12 saat soğuk iskemi süresi, ortalama ± ± 2 saat) sırasında toplanır. Aortik ve pulmoner kapakçıkların bankacılığı için Milan Kardiyovasküler Doku Bankasına, Monzino Kardiyoloji Merkezi'ne (Milano, İtalya) gönderilirler. Mitral posterior broşürler klinik amaçla kullanılmaz, bu nedenle donorların akrabalarından bilgilendirilmiş onam alındığında aortik ve pulmoner kapak izolasyonu sırasında toplanırlar. Transplantasyon ve araştırma dokusu sadece ebeveynlerin izninden sonra toplanır; Izin belgesinde, insan klinik kullanımına ( yani, mikrobiyolojik, fonksiyonel ve serolojik sorunlar) uygun değilse, kardiyak doku kullanımını araştırma için etik komitesinin talimatlarını izleyen (veya değil)Monzino Kardiyoloji Merkezi.
1. Mitral kapak hazırlığı
- Organ eksplantasyonundan sonra mümkün olduğunca çabuk insan mitral kapağını hasat edin (4-12 saat soğuk iskemi süresi).
- Temiz bir odada kalbi, soğuk (4 ° C) bir solüsyonu ( örn. Tuzlu su çözeltisi veya dengeli orta Eurocollins veya Wisconsin) içeren taşıma çantasından çıkarın. Vantuz hazırlığına geçmek için bir kovaya koyun ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin (biyolojik tehlike sınıfı A, İyi Üretim Uygulamaları (GMP) sınıflandırması).
- Kalbi dolabın içindeki steril tek kullanımlık bir örtünün üzerine koyun. Steril tek kullanımlık bir neşter kullanarak, kalbi tam eksene dik olarak, apsisden yaklaşık 4 cm uzaktaki sol ve sağ ventrikler seviyesinde kesin.
- Sol atrium çatısını görüntülemek için, yükselen aorta ve pulmoner arteri hareket ettirin.
- Steril otoklavlanabilir forseps ve toplar ile sol kulakçığı kesipMitral kapağı görünür hale getirir ve büyük mitral yaprakçık (anterior) ve küçük mitral yaprak posteri (posterior) tanımlanmasına izin verir.
NOT: Antero-lateral ve posterior medial komissürler, ön yaprakçık ve posterior alanın sınırını tanımlar. - Steril otoklavlanabilir makas ve travmatik olmayan forseps kullanarak, tüm sol ventrikül kapağının çevresi etrafında sol atrium ve ventrikül duvar kalınlığını inceleyin .
- Mitro-aort kapak sürekliliğini belirleyin.
NOT: Sol ventrikül bütün mitral kapak ve akorları içerir. - Posterior mitral kapakçık leğeninden ön mitral kapakçık broşürünü ayırın ve posterior broşürü ventrikülle sokma (komissür) ile kesme.
- Salin solüsyonundaki posterior broşürü yıkayın. Broşürünü küçük parçalara (<1 cm2) kesin ve aluminyum folyoya ayrı ayrı sarın. Sıvı azot ile çalkalamayın.
Dikkat: Sıvı azot kullanırken organizasyonel güvenlik prosedürlerini takip edin.- İşlemin sonunda kabininin masasını% 70 izopropil alkol solüsyonu ve% 6 hidrojen peroksit solüsyonuyla haşlayın.
2. Protein ekstraksiyonu
- Sıvı azot içinde depolanan numuneyi almak için forseps kullanın ve alüminyum folyoya sarılı haldeyken derhal kuru buz üzerine koyun. Herhangi bir transfer sırasında numuneyi çözmeye bırakmayın.
- Öğütmeden önce, sıvı azotu (~ 500 mL) içeren bir Dewar şişeye koyarak numuneyle birlikte bir öğütücü sisteminin porselen / zirkon harcı ve havucu suyunu ( örn. CryoGrinder) soğutun.
Dikkat: Sıvı azot kullanırken organizasyonel güvenlik prosedürlerini takip edin. - Harcı ve havaneleri kuru buz içeren bir polistiren kutusuna koyun. Numuneyi alüminyum folyodan çıkarın ve harç içine koyun.
- ÖğütHarç karşı 15-20 kez büyük harç ile örnek, tornavida kullanarak havaneli döndürmek için. Öğütme işlemi sırasında, önceden soğutulmuş bir spatula ucu ile numuneyi karıştırın.
- Küçük havaneli ile tekrarlayın.
- Öğütülmüş numuneyi, tüp ters çevrilerek, harç üzerine yerleştirilerek ve tüpün içine götürmek üzere birlikte ters çevirerek daha önceden tartılmış bir tüpe ( örn., 15 mL santrifüj tüpüne) aktarın. Harca ait tüm malzemeleri geri kazanmak için önceden soğutulmuş bir spatula kullanın.
- Transfer esnasında örnek çözülmesini önlemek için, boruyu numuneyle kuru buzda tutun.
- Numunenin net ağırlığını hesaplayın.
- Her numuneden sonra harç ve kalıntıları temizleyin ve otoklavlayarak veya 200 ° C'de 2 saat ısıtılarak dekontamine ediniz.
- Toz haline getirilmiş numuneyi, ters çevirerek bir homojenleştiricinin cam tübüne santrifüj tüpünden aktarın.
- Filtrelenmiş üre büfesi ekleHer 10 mg toz haline getirilmiş doku için 200 uL üre tamponu cam tüpüne% 10 r (8 M üre, 2 M tiyoüre,% 4 w / v CHAPS, 20 mM Tris ve 55 mM ditiyotreitol) ilave edildi.
NOT: Santrifüj tüpünde kalan artık toz halindeki örnek, hesaplanan hacimde üre tamponu kullanılarak geri kazanılabilir. - Borosilikat cam harç ve bir politetrafloroetilen (PTFE) havan ile donatılmış bir karıştırıcı kullanarak numuneyi homojenize edin. 10'ar kez büküm hareketi (1,500 rpm) ile örnek üzerine yavaşça bastırın.
- Süpernatanı alın ve onu temiz bir 1.7 mL santrifüj tüpüne aktarın. Kalan numuneyi taze üre tamponuyla tekrar çıkarıp, ilk ekstraksiyon sırasında kullanılan hacmin yarısını ekleyin.
- Adım 2.10'ı tekrarlayın.
- Süpernatanı alın ve adım 2.11'deki süpernatana birleştirin. Birleştirilen süpernatanı 30 dakika süreyle bir tüp döndürücü üzerine yerleştirin.
- Boruyu 13,000 xg ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Süpernatanı veD Bradford protein deneyi kullanılarak üreticinin talimatlarına göre protein konsantrasyonunu ölçün. Kullanana kadar numuneyi -80 ° C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Proteinlerin üre tamponunda ekstraksiyonu ve çözünmesi, izoelektrofocusing (iki boyutlu elektroforez (2-DE) 11 ve sıvı faz izoelektrik odaklama (IEF) 12 ) temelli proteomik yöntemlerle ve Laemmli tamponu 13'de seyreltildikten sonra immünoblotlama ile doğrudan uyumludur Bir proteaz inhibitörü kokteylini içeren 14 .
Jelden arındırılmış kütle spektrometresi tabanlı yöntemler ( yani, veriden bağımsız kütle spektrometri analizine (LC / MS E ) ve iki boyutlu LC / MS E'ye (2D-LC / MS E ) eşleştirilmiş sıvı kromatografisi için) 15 , alınan örnekler Tanımlanan üre tamponunda, müteakip protein sindirimine ve sıvı kromatografi ayrışmasına müdahale edebilecek üre ve tiyoayı ortadan kaldırmak için daha fazla muamele edilmesi gerekir. ThiS tuz giderme basamağı, proteinlerin çökeltilmesi için imalatçının talimatlarına göre ticari protein çökeltme kitleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Numune daha sonra, protein sindirimi için% 0.1 kırılabilir deterjanlar içeren 25 mM NH4HCO3 içinde çözünebilir16. Proteinlerin çökeltilmesi, tampon bileşenlerini ortadan kaldırabilir ve protein içeriğini (protein giderme:>% 85) en düşük düzeyde etkiler ve böylece numuneyi her türlü analiz için uygun hale getirir.
İnsan mitral kapaklarından protein ekstraksiyonu için bu protokolün uygulanması, daha önce ayrıntılı olarak tarif edilen 11,15 dört farklı proteomik yaklaşımı birleştiren toplam 422 protein tayin edilmesine izin verdi. Spesifik olarak, 169 protein, sıvı-faz IEF tarafından 2-DE, 330 protein, LC / MS E tarafından 96 protein ve 148 protein ile tanımlandı.2D-LC / MS E ile (Tablo 1).
Subselüler lokalizasyon açısından 422 tanımlanan proteini sınıflandırmak için, bir yazılım, gen ontolojisi (GO) analizi ( örn. Cytoscape) için kullanılmıştır. Yazılım ve ilgili plug-in ile oluşturulan ağ, hücre dışı bölgede lokalize olan beklenen proteinlerin yanı sıra ( Şekil 2'nin sağ üst kısmına bakınız) proteomik yaklaşımlarla tanımlanan proteinlerin çoğunun hücre içi bölgeden geldiğini gösterdi ( Yani, sitoplazma, organel, vezikül ve sitoskeleton). Hücre yüzey proteinleri de tespit edildi ( Şekil 2 ).
Sonuçlar, üç bağımsız mitral kapak numunesinde daha da doğrulanmıştır. Immünoblotting, dört proteinin bir grubunu analiz etmek için kullanılmıştır ( yani, septin-11, dört buçuk LIM alan protein 1 (FHL-1), derMatopontin ve alfa-kristalin B (CryAB)) (normal mitral kapakta hiç tanımlanmamıştır) ( Şekil 3 ).
Şekil 1: Mitral kapak yapısı. Kapalı ( A ) veya açık ( B ) insan mitral kapağını gösteren insan kalbinin üst görünüşü. İnsan kalbinin sol ventrikülünün ön görünüşü ( C ). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Belirlenen mitral kapak proteinlerinin hücresel dağılım açısından analizi. Cytoscape ve eklenti BiNGO obtai için kullanıldıN gen ontolojisi (GO) terimlerinin hücresel bileşen kategorilerinden dağılımı. Daire boyutu, seçilen GO terimleriyle ilişkili protein bileşenleri sayısıyla orantılıdır ve aşırı temsilin p-değeri için renk ölçeği rapor edilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Üç insan normal mitral kapak broşüründen tüm ekstre içinde septin-11, FHL-1, dermatopontin ve CryAB'nin immünoblot analizi. Immünoblotting, CryAB'ye karşı fare monoklonal antikoru ve septin-11, FHL-1 ve dermatopontin antikorlarına karşı tavşan poliklonal antikorları kullanılarak gerçekleştirildi. LütfenBu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.
| katılım | Açıklama | 2-DE | 2D-LC | LC-MS E | Sıvı faz IEF |
| A6NMZ7 | Kolajen alfa VI | x | |||
| O00151 | PDZ ve LIM domain proteini 1 | x | |||
| O00299 | Klorid hücreiçi kanal protein 1 | x | |||
| O00764 | Piridoksal kinaz | x | |||
| O14558 | Isı şoku protein beta 6 | x | |||
| O43399 | Tümör proteini D54 | x | |||
| O43488 | Aflatoksin B1 aldehit redüktaz üyesi 2 | x | |||
| O43707 | Alfa aktinin 4 | x | x | ||
| O43866 | CD5 antijen benzeri prekürsör | x | |||
| O60493 | Sıralama nexin 3 | x | |||
| O60701 | UDP glikoz 6 dehidrojenaz | x | |||
| O75223 | Özellikleri belirlenmemiş protein | x | |||
| O75368 | SH3 etki alanı bağlama Glutamik asit protein bakımından zengin | x | |||
| O75390 | Sitrat sintaz mitokondriyal habercisi | x | |||
| O75489 | NADH dehidrogenaz ubiquinone demir sülfür proteini 3 mitokondriyal prekürsör | x | x | ||
| O75608 | Asil protein tioesteraz 1 | x | |||
| O75828 | Karbonil redüktaz NADPH 3 | x | |||
| O75874 | İzositrat dehidrogenaz NADP sitoplazmik | x | |||
| O75955 | Flotillin | x | |||
| O94760 | NG NG dimetilar arginin dimetilaminohidrolaz 1 | x | |||
| O94788 | Retinal dehidrojenaz 2 | x | |||
| O95865 | NG NG dimetilarjinin dimetilaminohidrolaz 2 | x | x | ||
| P00325 | Alkol dehidrojenaz 1B | x | x | ||
| P00338 | L laktat dehidrojenaz A zinciri | x | |||
| P00352 | Retinal dehidrojenaz 1 | x | |||
| P00441 | Süperoksit dismutaz Cu Zn | x | x | ||
| P00450 | Seruloplasmin öncüsü | x | x | ||
| P00488 | Koagülasyon faktörü XIII Bir zincir öncüsü | x | |||
| P00491 | Pürin nükleozid fosforilaz | x | |||
| P00492 | Hipoksanthin guanin fosforibosiltransferaz | x | |||
| P00558 | Fosfogliserat kinaz 1 | <td> xx | x | ||
| P00568 | Adenilat kinaz izoenzimi 1 | x | |||
| P00734 | protrombin | x | x | ||
| P00738 | haptoglobin | x | x | x | x |
| P00739 | Haptoglobin ile ilgili protein prekürsörü | x | |||
| P00751 | Komplement faktörü B | x | x | x | |
| P00915 | Karbonik anhidraz 1 | x | |||
| P00918 | Karbonik anhidraz 2 | x | |||
| P01008 | Antitrombin III öncüsü | x | x | x | |
| P01009 | Alfa 1 antitripsin | x | x | x | x |
| P01011 | Alfa 1 antikimotripsin | x | x | x | x |
| P01019 | Anjiyotensinojen öncüsü | x | x | ||
| P01023 | Alfa 2 makroglobülin | x | x | ||
| P01024 | Tamamlayıcı C3 | x | x | x | x |
| P01033 | Metalloproteinase inhibitörü 1 prekürsörü | x | |||
| P01042 | Kininogen 1 öncüsü | x | |||
| P01593 | Ig kappa zincir VI bölgesi AG | x | |||
| P01598 | Ig kappa zinciri VI bölgesi AB | x | |||
| P01600 | Ig kappa zinciri VI bölgesi Hau | x | x | ||
| P01611 | Ig kappa zincir VI bölgesi Wes | x | |||
| P01620 | Ig kappa zinciri V III bölgesi SIE | x | |||
| P01625 | Ig kappa zinciri V IV bölgesi Len | x | |||
| P01766 | Ig ağır zincir V III bölgesi BRO | x | x | ||
| P01781 | Ig ağır zincir V III bölgesi GAL | x | |||
| P01834 | Ig kappa zinciri C bölgesi | x | x | x | x |
| P01842 | Ig lambda zinciri C bölgeleri | x | x | x | |
| P01857 | Ig gama 1 zincir C bölgesi | x | x | x | x |
| P01859 | Ig gam2 zincir C bölgesi | x | x | x | x |
| P01860 | Ig gama 3 zincir C bölgesi | x | x | x | |
| P01861 | Ig gama 4 zincir C bölgesi | x | x | x | |
| P01871 | Ig mu zincir C bölgesi | x | x | x | |
| P01876 | Ig alfa 1 zincir C bölgesi | x | x | x | x |
| P01877 | Ig alfa2 zincir C bölgesi | x | |||
| P02144 | myoglobin | x | x | ||
| P02452 | Kolajen alfa 1 I zincir | x | x | x | x |
| P02511 | Alfa kristalin B zinciri | x | |||
| P02545 | Lamin AC 70 kDa lamine | x | x | x | x |
| P02647 | Apolipoprotein AI | x | x | x | x |
| P02649 | Apolipoprotein E | x | x | x | x |
| P02671 | Fibrinojen alfa zinciri | x | x | x | x |
| P02675 | Fibrinojen beta zinciri | x | x | x | x |
| P02679 | Fibrinojen gama zinciri | x | x | x | x |
| P02689 | Myelin P2 proteini | x | |||
| P02735 | Serum amiloid A protein öncüsü | x | |||
| P02741 | C reaktif protein öncüsü | x | |||
| P02743 | Serum amiloid P bileşeni | x | x | x | x |
| P02746 | Kompleman C1q alt bileşen altbirimi B | x | x | ||
| P02747 | Kompleman C1q alt bileşeni altbirim C öncüsü | x | |||
| P02748 | Bileşen C9 tamamlayıcı | x | x | x | |
| P02749 | Beta 2 glikoprotein 1 | x | x | x | x |
| P02750 | Lösin açısından zengin alfa 2 glikoprotein öncüsü | x | |||
| P02751 | Fibronektin | x | x | ||
| P02760 | AMBP protein öncüsü | x | x | x | x |
| P02763 | Alfa 1 asit glikoprotein 1 | x | x | x | |
| P02765 | Alfa 2 HS glikoprotein öncüsü | x | |||
| P02766 | Transtiretin öncüsü | x | x | x | |
| P02768 | Serum albümin | x | x | x | x |
| P02774 | D vitamini bağlayıcı protein öncüsü | x | |||
| P02787 | Serotransferrin | x | x | x | x |
| P02788 | Laktotransferrin öncüsü | x | |||
| P02790 | hemopeksin | x | x | x | x |
| P02792 | Ferritin hafif zincir | x | |||
| P04004 | vitronektin | x | x | x | x |
| P04075 | Fruktoz bisfosfat aldolaz A | x | |||
| P04083 | Annexin A1 | x | x | x | x |
| P04179 | Süperoksit dismutaz Mn mitokondriyal prekürsör | x | |||
| P04196 | Histidin açısından zengin glikoprotein öncüsü | x | |||
| P04217 | Alfa 1B glikoprotein öncüsü | x | x | ||
| P04350 | Tubulin beta 4 zinciri | x | |||
| P04406 | Gliseraldehit 3 fosfat dehidrojenaz | x | x | x | x |
| P04792 | Isı şoku protein beta 1 | x | x | x | x |
| P05091 | Aldehid dehidrojenaz mitokondriyal prekürsörü | x | x | ||
| Plazma proteaz C1 inhibitörü prekürsörü | x | ||||
| P05156 | Komplement faktör I prekürsörü | x | |||
| P05413 | Yağ asidi bağlayan protein kalbi | x | |||
| P05452 | Tetranektin öncüsü TN | x | x | ||
| P05787 | Keratin tipi II sitoskeletal 8 | x | |||
| P06396 | gelsolin | x | x | x | x |
| P06576 | ATP sentaz altbirim beta mitokondriyal öncüsü | x | x | ||
| P06732 | Kreatin kinaz M tipi | x | x | ||
| P06733 | Alfa enolaz | x | x | x | x |
| P06753 | Tropomyosin alfa 3 zinciri | x | x | ||
| P07108 | Acyl CoA bağlayıcı protein | x | |||
| P07195 | L laktat dehidrogenaz B zinciri | x | x | x | |
| P07196 | Nörofilament hafif polipeptit | x | |||
| P07197 | Nörofilament orta polipeptidi | x | x | ||
| P07237 | Protein disülfid izomeraz öncüsü | x | x | ||
| P07339 | Katepsin D öncüsü | x | x | ||
| P07355 | Annexin A2 | x | x | x | x |
| P07360 | Kompleman bileşeni C8 gama zinciri öncüsü | x | |||
| P07437 | Tubulin beta zinciri | x | x | x | x |
| P07585 | dekorin | x | x | x | x |
| P07737 | Profilin 1 | x | |||
| P07858 | Katepsin B prekürsörü | x | |||
| P07900 | Isı şok proteini HSP 90 alfa | x | x | ||
| P07951 | Tropomyosin beta zinciri | x | |||
| P07954 | Fumarat hidrataz mitokondriyal öncüsü | x | |||
| P07996 | Trombospondin 1 | x | x | x | |
| P08107 | Isı şoku 70 kDa protein 1A 1B | x | x | x | x |
| P08123 | Kolajen alfa 2 I zinciri | x | x | x | x |
| P08133 | Annexin A6 | x | x | ||
| P08238 | Isı şoku proteini HSP 90 beta | x | x | ||
| P08253 | 72 kDa tip IV kollajenaz öncüsü | x | |||
| P08294 | Ekstraselüler süperoksit dismutaz Cu Zn prekriptursor | x | x | x | |
| P08590 | Miyozin hafif polipeptit 3 | x | x | ||
| P08603 | Komplement faktörü H | x | x | x | x |
| P08670 | vimentin | x | x | x | x |
| P08729 | Keratin tipi II sitoskeletal 7 | x | |||
| P08758 | Annexin A5 | x | x | x | x |
| P09211 | Glutatyon S transferaz P | x | x | x | |
| P09382 | Galektin 1 | x | x | x | |
| P09417 | Dihidropteridin redüktazı | <td> | x | ||
| P09493 | Tropomyosin 1 alfa zinciri | x | x | ||
| P09525 | Annexin A4 | x | x | ||
| P09651 | Heterojen nükleer ribonükleoprotein A1 | x | |||
| P09871 | Kompleman C1s alt bileşeni öncüsü | x | |||
| P09936 | Ubiquitin karboksil terminal hidrolaz izozim L1 | x | |||
| P09972 | Fruktoz bisfosfat aldolaz C | x | |||
| P0C0L4 | Complement C4 Bir öncü | x | |||
| P0CG05 | IgLambda 2 zincir C bölgeleri | x | |||
| P0CG38 | POTE ankirin ailesinin üyesi I | x | |||
| P10515 | Piruvat dehidrojenaz kompleksinin dihidrolipoililizin kalıntısı asetiltransferaz bileşeni | x | |||
| P10768 | S formilglutation hidrolaz | x | |||
| P10809 | 60 kDa ısı şok proteini mitokondriyal prekürsör | x | |||
| P10909 | klusterin | x | x | x | x |
| P10915 | Hyaluronan ve proteoglikan bağlantılı protein 1 öncüsü | x | x | ||
| P11021 | 78 kDa gLukoz düzenlenmiş protein | x | x | x | |
| P11047 | Laminin altbirim gama 1 öncüsü | x | |||
| P11142 | Isı şoku eşdeğeri 71 kDa protein | x | x | x | x |
| P11177 | Pirüvat dehidrojenaz E1 bileşen altbirim beta mitokondriyal öncüsü | x | |||
| P11217 | Glikojen fosforilaz kas formu | x | |||
| P11310 | Orta zincirli spesifik asil CoA dehidrojenaz mitokondriyal öncüsü | x | |||
| P11413 | Glukoz 6 fosfat 1 dehidrojenaz | x | |||
| P11766 | Alkol dehidrojenaz sınıfı 3 zincir zinciri | x | |||
| P12036 | Nevrofilament ağır polipeptit | x | |||
| P12109 | Kolajen alfa 1 VI zinciri | x | x | x | x |
| P12110 | Kolajen alfa 2 VI zinciri | x | x | x | x |
| P12111 | Kolajen alfa 3 VI zinciri | x | x | x | |
| P12277 | Kreatin kinaz B tipi | x | |||
| P12429 | Annexin A3 | x | x | ||
| P12814 | Alfa aktinin 1 | x | x | ||
| P12829 | Myosin hafif polipeptit 4 | x | |||
| P12882 | Myosin 1 | x | |||
| P12883 | Myosin 7 | x | x | ||
| P12955 | Xaa Pro dipeptidaz | x | |||
| P13489 | Ribonükleaz inhibitörü | x | |||
| P13533 | Myosin 6 | x | x | ||
| P13611 | Versiküs çekirdek proteini öncüsü | x | x | ||
| P13639 | Uzama faktörü 2 | x | |||
| P13716 | Delta aminolevulinik asit dehidrataz | x | |||
| P13796 | Plastin 2 | x | |||
| P13804 | Elektron transferi flavoprotein subunit alfa mitokondriyal prekürsör | x | |||
| P13929 | Beta enolaz | x | x | ||
| P14136 | Glial fibriler asidik protein astrosit | x | |||
| P14314 | Glukozidaz 2 altbirim beta prekürsörü | x | |||
| P14550 | Alkol dehidrojenaz NADP | x | |||
| P14618 | Piruvat kinaz izozimler M1 M2 | x | x | x | |
| P14625 </ Td> | Endoplazmin öncüsü | x | x | ||
| P15121 | Aldoz redüktaz | x | |||
| P15259 | Fosfogliserat mutaz 2 | x | |||
| P16152 | Karbonil redüktaz NADPH 1 | x | |||
| P17066 | Isı şoku 70 kDa protein 6 | x | x | x | |
| P17174 | Aspartat aminotransferaz sitoplazmik | x | |||
| P17540 | Kreatin kinaz sarkomerik mitokondriyal prekürsör | x | |||
| P17661 | Desmin | x | x | x | x |
| P17980 | 26S proteaz düzenleyici alt birim 6A | x | |||
| P17987 | T kompleks protein 1 altbirim alfa | x | |||
| P18206 | vinkulin | x | x | ||
| P18428 | Lipopolysaccharide bağlayıcı protein öncüsü | x | |||
| P18669 | Fosfogliserat mutaz 1 | x | |||
| P19105 | Miyozin düzenleyici hafif zincir 2 | x | x | ||
| P19623 | Spermidin sintazı | x | |||
| P19652 | Alfa 1 asit glikoprotein 2 öncüsü | x | x | ||
| P19823 | İnter alfa tripsin önleyicisi ağır zincir H2 | x | |||
| P19827 | İnter alfa tripsin önleyicisi ağır zincir H1 | x | x | ||
| P20073 | Annexin A7 | x | |||
| P20618 | Proteazom altbirim beta tip 1 prekürsörü | x | |||
| P20774 | Mimecan | x | x | x | x |
| P21266 | Glutatyon S transferaz Mu 3 | x | |||
| P21333 | Filamin A | x | x | ||
| P21796 | Gerilim bağımlı anyon seçici kanal proteini1 | x | |||
| P21810 | biglikan | x | x | x | x |
| P21980 | Protein glutamin gama glutamiltransferaz 2 | x | x | ||
| P22105 | Tenascin X | x | x | ||
| P22314 | Ubiquitin aktive edici enzim E1 | x | |||
| P22352 | Glutatiyon peroksidaz 3 öncüsü | x | x | ||
| P22626 | Heterojen nükleer ribonükleoproteinler A2 B1 | x | |||
| P22695 | Ubiquinol sitokrom c redüktaz kompleks çekirdek protein 2 mitokondriyal prekürsör | x | |||
| P23141 | Karaciğer karboksilesteraz 1 öncüsü | x | |||
| P23142 | Fibulin 1 | x | x | x | x |
| P23284 | Peptidil prolil cis trans izomeraz B prekürsörü | x | |||
| P23381 | Triptofanil tRNA sentetaz sitoplazmik | x | |||
| P23526 | Adenosylhomocysteinase | x | x | ||
| P23528 | Cofilin 1 | x | |||
| P24752 | Asetil CoA asetiltransferaz mitokondriyal prekürsör | x | |||
| P25311 | Çinko alfa 2 glikoproteisiÖncü | x | |||
| P25705 | ATP sentaz altbirimi alfa mitokondrial | x | |||
| P25788 | Proteazom altbirim alfa türü 3 | x | x | ||
| P25789 | Proteazom altbirim alfa türü 4 | x | |||
| P26447 | Protein S100 A4 | x | |||
| P27348 | 14 3 3 protein teta | x | x | ||
| P27797 | Calretikulin öncüsü | x | |||
| P28066 | Proteazom altbirim alfa türü 5 | x | |||
| P28070 | <Td> Proteazom altbirim beta tip 4 öncüsüx | x | |||
| P28072 | Proteazom altbirim beta tip 6 öncüsü | x | |||
| P28074 | Proteazom altbirim beta tip 5 öncüsü | x | |||
| P28331 | NADH ubiquinone oxidoreductase 75 kDa altbirim mitokondriyal prekürsör | x | |||
| P28838 | Sitozol aminopeptidaz | x | |||
| P29218 | İnositol monofosfataz | x | |||
| P29401 | transketolaz | x | |||
| P29692 | Uzama faktörü 1 delta | <td> | x | ||
| P29966 | Milistoillenmiş alanin bakımından zengin C kinaz substratı | x | |||
| P30040 | Endoplasmik retikulum protein ERp29 öncüsü | x | |||
| P30041 | Peroksiredoksin 6 | x | x | ||
| P30043 | Flavin redüktaz | x | |||
| P30044 | Peroksiredoksin 5 mitokondriyal prekürsör | x | |||
| P30085 | UMP CMP kinazı | x | |||
| P30086 | Fosfatidiletanolamin bağlayıcı protein 1 | x | |||
| P30101 | ProteiN disülfid izomeraz A3 öncüsü | x | x | x | |
| P30613 | Piruvat kinaz izoenzimleri RL | x | |||
| P30740 | Lökosit elastaz inhibitörü | x | |||
| P31025 | Lipokalin 1 öncüsü | x | |||
| P31937 | 3 hidroksi izobütirat dehidrojenaz mitokondriyal prekürsör | x | |||
| P31942 | Heterojen nükleer ribonükleoprotein H3 | x | |||
| P31943 | Heterojen nükleer ribonükleoprotein H | x | |||
| P31946 | 14 3 3 protein beta alfa | x | x | ||
| P31948 | Strese bağlı fosfoprotein 1 | x | |||
| P31949 | Protein S100 A11 | x | |||
| P32119 | Peroksiredoksin 2 | x | x | ||
| P34931 | Isı şoku 70 kDa protein 1 gibi | x | x | ||
| P34932 | Isı şoku 70 kDa protein 4 | x | |||
| P35232 | prohibitin | x | |||
| P35237 | Serpin B6 | x | |||
| P35443 | Trombospondin 4 | x | </ Tr> | ||
| P35555 | Fibrilin 1 | x | x | ||
| P35579 | Myosin 9 | x | x | x | |
| P35580 | Myosin 10 | x | x | ||
| P35609 | Alfa aktinin 2 | x | |||
| P35625 | Metalloproteinaz inhibitörü 3 | x | x | ||
| P35998 | 26S proteaz düzenleyici alt birim 7 | x | |||
| P36871 | Fosfoglukomaz 1 | x | x | ||
| P36955 | Pigment epiteli türevi faktör | x | x | ||
| P37802 | <Td> Transgelin 2x | x | |||
| P37837 | transaldolaz | x | |||
| P38117 | Elektron transfer flavoprotein altbirim beta | x | |||
| P38646 | Stres 70 protein mitokondriyal prekürsör | x | x | ||
| P39687 | Asidik lösin açısından zengin nükleer fosfoprotein 32 ailesi üyesi A | x | |||
| P40121 | Makrofaj kapak proteini | x | |||
| P40925 | Malat dehidrojenaz sitoplazmik | x | |||
| P40926 | Malat dehidrogenaz mitokondriyal prekürsör | <td> | x | ||
| P41219 | periferin | x | |||
| P42330 | Aldo keto redüktaz ailesinin 1 üyesi C3 | x | |||
| P45880 | Gerilim bağımlı anyon seçici kanal proteini 2 | x | |||
| P47755 | F aktin kaplama proteini altbirimi alfa 2 | x | x | ||
| P47756 | F aktin kapak protein alt birim beta | x | x | ||
| P47985 | Ubiquinol sitokrom c redüktaz demir sülfür alt birimi mitokondriyal prekürsör | x | |||
| P48047 | ATP sentaz O subunit mitokondriyal prekürsör | x | |||
| P48637 | Glutatyon sentetaz | x | |||
| P48741 | Isı şoku 70 kDa protein 7 | x | x | ||
| P49189 | 4 trimetilaminobütiraldehid dehidrojenaz | x | |||
| P49368 | T kompleks protein 1 alt birim gamma | x | |||
| P49747 | Kıkırdak oligomerik matris proteini | x | x | x | x |
| P49748 | Çok uzun zincirli spesifik asil CoA dehidrogenaz mitokondriyal öncüsü | x | |||
| P50395 | Rab GSYİH ayrışma önleyici beta | x | x </ Td> | ||
| P50454 | Serpin H1 öncüsü | x | |||
| P50995 | Annexin A11 | x | |||
| P51452 | Çift özgüllük protein fosfataz 3 | x | |||
| P51884 | Lumican | x | x | x | x |
| P51888 | Prolargin öncüsü | x | x | x | x |
| P52565 | Rho GSYİH ayrışma önleyicisi 1 | x | |||
| P52566 | Rho GSYİH ayrışma önleyicisi 2 | x | |||
| P54652 | Isı şokuyla ilgili 70 kDa protein 2 | x | x | x | x |
| P55072 | Geçici endoplazmik retikulum ATPaz | x | |||
| P55083 | Mikrofibrille ilişkili glikoprotein 4 öncüsü | x | x | ||
| P57053 | Histon H2B tipi F | x | |||
| P60174 | Triosefosfat izomeraz | x | x | x | |
| P60660 | Miyozin hafif polipeptid 6 | x | x | ||
| P60709 | Aktin sitoplazmik 1 | x | x | x | x |
| P60981 | Destrin | x | |||
| P61086 | Ubiquitin konjuge edici enzim E2 25 kDa | x | |||
| P61088 | Ubiquitin konjuge enzim E2 | x | |||
| P61224 | Ras ile ilgili protein Rap 1b öncüsü | x | |||
| P61978 | Heterojen nükleer ribonükleoprotein K | x | x | ||
| P61981 | 14 3 3 protein gama | x | x | x | |
| P62258 | 14 3 3 protein epsilon 14 3 3E | x | |||
| P62491 | Ras ile ilgili protein | x | |||
| P62714 | Serin treonin proteini fosfataz 2A katalitik altbirim beta izoformu | x | |||
| P62736 | Aktin aort düz kası | x | x | x | |
| P62805 | Histon H4 | x | |||
| P62826 | GTP bağlayıcı nükleer protein Ran | x | |||
| P62873 | Guanin nükleotid bağlama proteini GIGSGT alt birim beta 1 | x | |||
| P62879 | Guanin nükleotid bağlama proteini GIGSGT alt birim beta 2 | x | |||
| P62937 | Peptidil prolil cis trans izomeraz A | x | x | ||
| P62987 | Ubiquitin 60S ribozomal protein L40 | x | |||
| P63104 | 14 3 3 yanlısıTein zeta delta | x | x | x | x |
| P63241 | Ökaryotik çeviri başlatma faktörü 5A 1 | x | |||
| P63244 | Guanin nükleotid bağlama proteini alt birim beta 2, 1 gibi | x | |||
| P63267 | Aktin gama enterik düz kası | x | x | ||
| P67936 | Tropomyosin alfa 4 zinciri | x | |||
| P68032 | Aktin alfa kalp kası 1 | x | |||
| P68104 | Uzama faktörü 1 alfa 1 | x | x | x | |
| P68133 | Aktin alfa iskelet kası | ||||
| P68363 | Tübulin alfa 1B zinciri | x | x | x | |
| P68371 | Tubulin beta 2C zinciri | x | x | x | |
| P68402 | Trombosit aktive edici faktör asetilhidrolaz IB alt birim beta | x | |||
| P68871 | Hemoglobin alt birim beta | x | x | x | |
| P69905 | Hemoglobin subunit alfa | x | x | ||
| P78371 | T kompleks protein 1 altbirim beta | x | |||
| P78417 | Glutatyon transferaz omega 1 | x | x | ||
| P80748 | Ig lambda zinciri VIII bölgesi | x | |||
| P98095 | Fibulin 2 | x | x | ||
| Q01082 | Spectrin beta zinciri beyin 1 | x | |||
| Q01449 | Miyozin düzenleyici hafif zincir 2 atriyal izoform | x | |||
| Q01518 | Adenillyla siklaz ile bağlantılı protein 1 | x | |||
| Q01995 | Transgelin Düz kas proteini 22 alfa | x | |||
| Q03252 | B2 tabakası | x | x | ||
| Q03591 | Komplement faktörü H ile ilgili protein 1 prekürsörü | x | Q04917 | 14 3 3 protein eta | x | x |
| Q06323 | Proteazom aktifleştirici kompleks altbirim 1 | x | |||
| Q06828 | Fibromodulin | x | x | x | x |
| Q06830 | Peroksiredoksin 1 | x | x | ||
| Q07507 | Dermatopontin | x | x | x | x |
| Q07960 | Rho GTPaz aktive edici protein 1 | x | |||
| Q08257 | Kinon oksidoredüktaz | x | |||
| Q08431 | Lactadherin | x | x | ||
| Q12765 | SEkernin 1 | x | |||
| Q13011 | Delta 3 5 Delta 2 4 dienoyl CoA izomeraz mitokondriyal prekürsör | x | x | ||
| Q13228 | Selenyum bağlayıcı protein 1 | x | x | ||
| Q13404 | Ubiquitin konjuge edici enzim E2 varyantı 1 | x | |||
| Q13409 | Sitoplazmik dinein 1 ara zincir 2 | x | |||
| Q13509 | Tubulin beta 3 zinciri | x | x | x | |
| Q13642 | Dört buçuk LIM alan protein 1 | x | |||
| Q13765 | Yeşilleşmiş polipeptid ile ilişkili kompleks altbirim alfa | x | |||
| Q13885 | N Tubulin beta 2A zinciri | x | x | ||
| Q14194 | Dihidropirimidinazla ilgili protein 1 | x | |||
| Q14195 | Dihidropirimidinazla ilgili protein 3 | x | x | x | x |
| Q14624 | İnter alfa tripsin önleyicisi ağır zincir H4 öncüsü | x | |||
| Q14697 | Nötr alfa glukosidaz AB öncüsü | x | |||
| Q14764 | Büyük tonoz proteini | x | |||
| Q14767 | Latent transforming growth factor beta bağlayıcı protein 2 | x | <td>x | ||
| Q14894 | Mu kristalin homologu NADP tiroid hormon bağlama proteinini düzenledi | x | |||
| Q15063 | Periostin öncüsü | x | x | x | x |
| Q15084 | Protein disülfid izomeraz A6 öncüsü | x | |||
| Q15113 | Prokollajen C endopeptidaz arttırıcı 1 öncüsü | x | |||
| Q15181 | İnorganik pirofosfataz | x | |||
| Q15365 | PoliRC bağlayıcı protein 1 | x | |||
| Q15366 | PoliRC bağlama proteini 2 | x | |||
| Q15582 | Büyüme faktörü beta ile indüklenen proteini dönüştüren | x | x | x | |
| Q15819 | Ubiquitin konjuge edici enzim E2 varyantı 2 | x | |||
| Q16352 | Alfa interneksin | x | |||
| Q16473 | Tahmini tenascin XA | x | |||
| Q16555 | Dihidropirimidinazla ilgili protein 2 | x | x | x | |
| Q16698 | 2 dienoil CoA redüktaz mitokondriyal öncüsü | x | |||
| Q16891 | Mitokondriyal iç membran | x | |||
| Q562R1 | Protein 2 gibi beta aktin | x | |||
| Q6S8J3 | POTE ankirin ailesinin üyesi E | x | |||
| Q6UWY5 | Protein 1 öncüsü gibi olfaktomedin | x | x | ||
| Q71U36 | Tubulin alfa 1A zinciri | x | x | x | |
| Q7Z7G0 | Nesh SH3 öncüsü hedefi | x | x | x | |
| Q8WUM4 | Programlanmış hücre ölümleri 6 etkileşen protein | x | |||
| Q8WWX9 | Selenoprotein M öncüsü gibi tioredoksin | x | |||
| Q92597 | Protein NDRG1 | x | |||
| Q92945 Uzak akış yukarı eleman bağlama proteini 2 | x | ||||
| Q96CN7 | Isochorismatase domain içeren protein 1 | x | |||
| Q96CX2 | BTB POZ alanı içeren protein | x | |||
| Q96KK5 | Histone H2A tip 1 H | x | x | ||
| Q96KP4 | Sitozolik spesifik olmayan dipeptidaz | x | |||
| Q99426 | Tubulin spesifik şaperon B | x | |||
| Q99497 | Protein DJ 1 | x | x | ||
| Q99536 | Sinaptik vezikül zar proteini | x | x | x | |
| Q99714 | 3 hidroksiasil CoA dehidrojenaz tip 2 | x | |||
| Q99715 | Kolajen alfa 1 XII zinciri | x | x | ||
| Q99798 | Aconitate hidrataz mitokondriyal prekürsör | x | |||
| Q9BQE3 | Tübulin alfa 6 zinciri | x | |||
| Q9BUF5 | Tubulin beta 6 zinciri | x | x | ||
| Q9BUT1 | 3 hidroksibutirat dehidrojenaz tip 2 | x | |||
| Q9BVA1 | Tubulin beta 2B zinciri | x | x | x | |
| Q9BXN1 | Asporin | x | x </ Td> | x | x |
| Q9H0W9 | Ester hidrolaz C11orf54 | x | |||
| Q9H4B7 | Tubulin beta 1 zinciri | x | |||
| Q9NRN5 | Protein 3 öncüsü gibi olfaktomedin | x | x | ||
| Q9NRV9 | Heme bağlayıcı protein 1 | x | |||
| Q9NSB2 | Keratin tipi II kesicular Hb4 | x | x | ||
| Q9NVA2 | Septin 11 | x | |||
| Q9UBR2 | Katepsin Z öncüsü | x | |||
| Q9UBX5 | Fibulin 5 | x | x | ||
| Q9UK22 | F kutusu sadece protein 2 | x | |||
| Q9Y277 | Voltaja Bağlı Anyon Seçici Kanal Protein 3 | x | |||
| Q9Y281 | Cofilin 2 | x | |||
| Q9Y490 | Talin 1 | x | |||
| Q9Y696 | Klorür hücre içi kanal protein 4 | x | |||
| Q9Y6C2 | EMILIN 1 | x | x |
Tablo 1: Dört farklı proteomik yaklaşım uygulanırken mitral kapak doku ekstraktında tanımlanan proteinlerin listesi: İki boyutlu elektroforez (2-DE), iki boyutlu LC-MS E (2D-LC / MS E ), LC / MS E ve sıvı faz IEF. Her bir proteinin tanımlandığı yöntem rapor edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolün kritik bir adımı, numuneyi dondurmak ve öğütücü sistemini soğutmak için sıvı azot kullanılmasıdır. Sıvı azot kullanımı, biyolojik bozulmayı önler ve verimli tozlamaya izin verir, ancak güvenli kullanım için özel eğitim gerektirir.
Bu protokolde örnek öğütme için bir öğütücü sistemi bulunur, çünkü küçük numunelerin standart harç ve havanelerden kurtarılması zordur. Bu durumda, küçük numuneler, harç yüzeyinin üzerine ince bir toz halinde yayılır ve böylece toplama işlemi zorlaşır. Başka bir avantaj da öğütücünün motorlu olması, daha fazla sayıda numunenin tekrarlanabilir bir şekilde ve yorulmadan eklenmesine olanak sağlamasıdır. Öğütücünün kullanımına ilişkin bir sınırlama, numunenin büyüklüğünün az olması gerekirken (100 mg veya daha az), havan toprağa etkili bir şekilde preslenecek olmasıdır. Ayrıca, öğütücü bileşenleri, temizleme amaçları arasında oda sıcaklığına ısıtılmalıdır g. Sonuç olarak, prosedür çok zaman alıcıdır ve eğer birçok numune günlük olarak işlenirse, birçok takıma ihtiyaç duyulmaktadır.
İlave bir kritik adım, ekstraksiyon tamponunun hazırlanmasıdır. Tuz konsantrasyonları, özellikle üre (8 M) ve tiyoüre (2 M) için oldukça yüksektir; Böylece, tuz hacmi çözeltinin toplam hacminin neredeyse yarısı kadardır. Ayrıca, 37 ° C'den fazla sıcaklıkta üre protein / peptidin N terminalinde ve lizin ve arginin artıklarının 17 yan zincir amino gruplarında protein karbamilasyona neden olabileceği için ısı kaçınılmalıdır, çünkü çözünme kolay değildir. . Çözündükten sonra, üre tamponu 0.22 μm'lik filtrelerle süzülmelidir ve ekstraksiyon etkinliğini etkilemeden -80 ° C'de 4 hafta süreyle saklanabilir, ancak tam çözünmeye izin vermek için kullanımdan önce 15 ° C'den fazla ısıtılmalıdır. .
Değişiklikler ve sorun giderme
Bu protokoldür protein ekstraksiyonu tarif edilen üre tamponu kullanılarak gerçekleştirilir, çünkü izoelektrofokus ile uyumluluğu ve az çözünen proteinleri çözünürleştirmede etkinliği nedeniyle proteomik çalışmalar için en çok kullanılan protein ekstraksiyon çözeltilerinden biridir ( 18) . Bu tamponun, integral membran proteinleri 19 veya tübülin 18 gibi agregasyona oldukça yatkın olan proteinler gibi az çözünür proteinleri çok etkili bir şekilde çözündürebildiğini göstermiştir Ayrıca bu tampon, protein konsantrasyonunu belirlemek için Bradford tahlili ile tamamen uyumludur ve Doğrudan 2-DE ve sıvı fazlı IEF analizlerinde kullanılabilir.Bununla birlikte, bu tampon, bir numunedeki tüm proteinlerin çözünürlüğü için ideal değildir. Farklı ekstraksiyon tamponlarının proteinleri bu protokol ile tespit edilemediği ortaya çıkabilir. Örneğin, iyi biliyorBu ribozomal ve nükleer proteinlerin, asit ekstraksiyonu veya trikloroasetik asit / aseton çökeltme 20 ile daha iyi ekstrakte edilebileceği, buna karşın alkalin pH düzeylerinin membran proteinleri 21 , 22 için daha uygun olduğu bulunmuştur. Bu nedenle, alternatif tamponların kullanılması, 2-DE veya sıvı fazlı IEF'yi etkileyen tuzları ortadan kaldırmak için protein çökeltilmesi için ek adımlar gerektirebilir.
Tekniğin sınırlamaları
Bu protokol tarafından belirlenen protein sayısı nispeten düşüktür, ancak tanımlama sayısı ve proteomik analizi kapsama alanı, son yıllarda kitlesel doğruluk ve dizilim hızı çarpıcı bir biçimde artan daha modern araçların kullanılmasıyla daha da artırılabilir 23. Proteomun büyük bir bölümünü herhangi bir ön ayırma basamağı olmaksızın, sıvı ch için uzun bir gradyan kullanmak suretiyle kaplamak mümkündür.Romatograf ayrımları ve hızlı bir sıralama hızı olan yüksek çözünürlüklü bir MS enstrümanı.
Tekniğin mevcut / alternatif yöntemlere göre önemi
İnsan kalp kapakçıkları (mitral kapak gibi) proteinleri tanımlama ve ölçme kabiliyeti, kapak hastalıklarında fizyolojik / patolojik süreçlerin mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olacak önemli ve zorlayıcı bir görevdir. Mitral kapak proteomunun değişimlerinin tanımlanması, dokunun hastalık durumu ile ilişkili biyolojik süreçlerin doğasını anlamayı arttıracaktır.
Mitral kapağın fizyopatolojisi hakkındaki mevcut bilgiler sınırlıdır ve genellikle hücre dışı matriks yeniden şekillenmesi, hemostaz, inflamasyon veya oksidatif stres gibi spesifik süreçlerde yer alan proteinlerin analiziyle elde edilir. 9 , 10'un analizine odaklanmaktadır.
Kapsamlı proteomik çalışmaların olmaması, hücre dışı matris proteinleri ( örn., Proteoglikanlar, kollajen ve elastin) açısından çok zayıf olan bu düşük hücreli dokunun karmaşıklığına atfedilebilir. Bu proteinler, toplam miktarın yaklaşık% 80'ini oluşturur ve düşük miktarda bulunan proteinlerin analizini engeller 26 .
Bu nedenle, bu dokunun proteomunu tanımlamak için protein çözünürlüğünü en yükseğe çıkarmak için etkili bir ekstraksiyon protokolü kurmak gerekiyordu. Bu protokol, 1 mg dokudan ~ 50 μg proteinin çıkarılmasına izin verdi. Bu, "yumuşak" dokuyla karşılaştırıldığında nispeten düşük bir verimdir, örneğinKaraciğer olarak (1 mg dokudan ~ 135 μg), ancak tek tek numuneler üzerinde bir protein analizi yapmak yeterlidir. Bu, bir fenomenin bireysel değişkenliğini tanımlarken özellikle önemlidir.
Ayrıca, bu yöntem birçok analitik uygulama ile uyumlu olma avantajına sahiptir. Önerilen ekstraksiyon tamponunda çözünen mitral kapak proteinleri, doğrudan iki boyutlu elektroforez ve sıvı faz izoelektroforez 11 , 12 veya protein tortulaştırma sonrası tampon bileşeni girişimini ortadan kaldırmak için kullanılan immünoblotlama ve proteomik analizler için, diğer tahliller için kullanılabilir Jelsiz kütle spektrometresi 15 .
Bu ekstraksiyon protokolünün uygulanması ile, normal mitral kapak dokusunun protein bileşenlerinin daha kapsamlı bir karakterizasyonu birçok intracelLular proteinler. Bu proteinler, sadece hücre dışı matriste değil, sitozolda veya organellerde lokalizedir ve farklı moleküler ve biyolojik fonksiyonlara sahiptir. Diğer ilginç proteinler ( yani, CryAB, septin-11, FHL-1 ve dermatopontin) de tanımlandı. Bu proteinlerin mitral kapaktaki fonksiyonları bilinmemekle birlikte, biyolojik özellikleri kapak hastalıklarında olası bir rol oynadığını göstermektedir.
Bu tekniğe hakim olduktan sonra gelecekteki uygulamalar veya yönler
Bu protokol ile, protein ekspresyonu ile ilgili verileri, niceliksel mRNA ekspresyonu ve kantitatif olmayan immünhistokimyasal analizler ile ilişkilendirmek mümkündür. Gerçekten birlikte, birlikte kullanıldığında, bu yaklaşımlar mRNA'dan translasyon sonrası proteinin modifikasyonuna kadar hastalığın altında yatan moleküler mekanizmaların daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına yol açacaktır. Bu nedenle, bu yöntem kalp kapak fizyopatolojisine odaklanan araştırmacılar için ilginç olabilir. yüzgeçAyrıca, bu protokol, insan valfi 27'ye yakın bir benzerliği olan ve kapak fonksiyonu değerlendirmesi için deneysel bir model olarak kullanılan domuz mitral kapağına da uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
İtalyan Sağlık Bakanlığı, bu çalışmayı destekledi (RC 2013-BIO 15). Mükemmel teknik yardımıyla Barbara Micheli'ye teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
