Summary
Die Proteinzusammensetzung des menschlichen Mitralklappens ist noch teilweise unbekannt, weil seine Analyse durch niedrige Zellularität und damit durch eine geringe Proteinbiosynthese kompliziert wird. Diese Arbeit liefert ein Protokoll zur effizienten Extraktion von Protein für die Analyse des Mitralklappenproteoms.
Abstract
Die Analyse des zellulären Proteoms kann dazu beitragen, die molekularen Mechanismen, die den Krankheiten zugrunde liegen, durch die Entwicklung von Technologien zu erhellen, die die großflächige Identifizierung und Quantifizierung der in komplexen biologischen Systemen vorhandenen Proteine ermöglichen. Das Wissen, das aus einem proteomischen Ansatz gewonnen wird, kann möglicherweise zu einem Ein besseres Verständnis der pathogenen Mechanismen, die Krankheiten zugrunde liegen, die die Identifizierung von neuartigen diagnostischen und prognostischen Krankheitsmarkern und hoffentlich von therapeutischen Zielen ermöglichen. Allerdings stellt das Herz-Mitralklappen eine sehr anspruchsvolle Probe für die proteomische Analyse aufgrund der geringen Zellularität in der Proteoglycan- und Kollagen-angereicherten extrazellulären Matrix dar. Dies macht es schwierig, Proteine für eine globale Proteomanalyse zu extrahieren. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll, das mit der nachfolgenden Proteinanalyse kompatibel ist, wie z. B. quantitative Proteomik und Immunoblotting. Dies kann die Korrelation der Daten betreffenG Proteinexpression mit Daten über die quantitative mRNA-Expression und nicht-quantitative immunhistochemische Analyse. In der Tat werden diese Ansätze, wenn sie zusammen durchgeführt werden, zu einem umfassenderen Verständnis der molekularen Mechanismen führen, die Krankheiten zugrunde liegen, von mRNA zu posttranslationaler Proteinmodifikation. So kann diese Methode für Forscher relevant sein, die sich für die Untersuchung der Herz-Ventil-Physiopathologie interessieren.
Introduction
Der jüngste Beweis hat das Verständnis der Rollen der vielen regulatorischen Mechanismen, die nach der mRNA-Synthese auftreten, verändert. In der Tat können translatorische, posttranskriptionelle und proteolytische Prozesse die Proteinabundanz und -funktion regulieren. Das Dogma - das sagt, dass mRNA-Konzentrationen Proxies zu denen der entsprechenden Proteine sind, unter der Annahme, dass Transkript-Ebenen die Hauptdeterminante der Protein-Häufigkeit sind - wurde teilweise überarbeitet. In den Transkript-Ebenen nur teilweise prognostizieren Protein-Fülle, was darauf hindeutet, dass post-Transkription Ereignisse Um die Proteine innerhalb der Zellen 1 , 2 zu regulieren .
Darüber hinaus diktieren Proteine schließlich die Funktion der Zelle und diktieren daher ihren Phänotyp, der dynamische Veränderungen in Reaktion auf autokrine, parakrine und endokrine Faktoren erfahren kann; Blutübertragene Vermittler; Temperatur; Medikamentöse Behandlung; Und krankheit entwickeln sich. So ist eine Expressionsanalyse, die auf die Proteinebene fokussiert ist, nützlich, um das Proteom zu charakterisieren und die kritischen Veränderungen, die ihm als Teil der Krankheitspathogenese auftreten, zu entschlüsseln.
Daher sind die Chancen, die die Proteomik zur Klärung von Gesundheits- und Krankheitsverhältnissen bietet, trotz der bestehenden technologischen Herausforderungen furchtbar. Die besonders vielversprechenden Forschungsgebiete, denen die Proteomik beitragen kann, beinhalten: die Identifizierung der veränderten Proteinexpression auf jeder Ebene ( dh ganze Zellen oder Gewebe, subzelluläre Kompartimente und biologische Flüssigkeiten); Die Identifizierung, Überprüfung und Validierung von neuartigen Biomarkern, die für die Diagnose und Prognose von Krankheiten nützlich sind; Und hoffentlich die Identifizierung neuer Proteinziele, die für therapeutische Zwecke verwendet werden können, sowie für die Beurteilung der Arzneimittelwirksamkeit und Toxizität 4 .
Erfassen der Komplexität vonDas Proteom stellt eine technologische Herausforderung dar. Die aktuellen Proteomwerkzeuge bieten die Möglichkeit, eine groß angelegte Hochdurchsatzanalyse zur Identifizierung, Quantifizierung und Validierung veränderter Proteingehalte durchzuführen. Darüber hinaus hat die Einführung von Fraktionierungs- und Anreicherungstechniken, die darauf abzielen, die Interferenz zu vermeiden, die durch die am häufigsten vorkommenden Proteine verursacht wird, auch die Proteinidentifizierung verbessert, indem sie die am wenigsten vorhandenen Proteine einschließen. Schließlich wurde die Proteomik durch die Analyse von posttranslationalen Modifikationen ergänzt, die schrittweise als wichtige Modulatoren der Proteinfunktion auftauchen.
Allerdings bleiben die Probenvorbereitung und die Proteingewinnung in den untersuchten biologischen Proben nach wie vor die begrenzenden Schritte im proteomischen Arbeitsablauf und erhöhen das Potenzial für mögliche Fallstricke 5 . In der Tat, in den meisten der molekularbiologischen Techniken, die optimiert werden müssen, sind die ersten Schritte Gewebe HomogenisierungIonen- und Zelllyse, insbesondere während der Analyse von Proteinen mit geringer Häufigkeit, für die keine Amplifikationsmethoden existieren. Darüber hinaus kann die chemische Natur von Proteinen ihre eigene Erholung beeinflussen. Zum Beispiel ist die Analyse von hoch hydrophoben Proteinen sehr schwierig, da sie während der isoelektrischen Fokussierung leicht ausfallen, während trans-Membranproteine nahezu unlöslich sind (siehe Referenz 5). Darüber hinaus schafft die Gewebszusammensetzungsvariabilität eine signifikante Barriere für die Entwicklung eines universellen Extraktionsverfahrens. Schließlich, da fast alle klinischen Proben von begrenzter Menge sind, ist es unerlässlich, die Proteinpräparation mit maximaler Wiedergewinnung und Reproduzierbarkeit aus minimalen Probenmengen zu ermöglichen 6 .
Diese Arbeit beschreibt ein optimiertes Protokoll für die Proteinextraktion aus dem normalen menschlichen Herzrhythmusventil, das eine sehr anspruchsvolle Probe für die proteomische Analyse darstellt. Das normale Mitralklappe ist ein KompLex-Struktur, die zwischen dem linken Vorhof und dem linken Ventrikel des Herzens liegt (Abbildung 1 ). Es spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Blutflusses vom Atrium zum Ventrikel, verhindert den Rückfluss und sorgt für die richtige Sauerstoffversorgung des ganzen Körpers, wodurch ein adäquates Herzzeitvolumen aufrechterhalten wird. Allerdings wird es oft als ein "inaktives" Gewebe betrachtet, mit einer geringen Zellularität und wenigen Komponenten, hauptsächlich in der extrazellulären Matrix. Dies liegt daran, dass unter normalen Bedingungen die residenten valvularen interstitiellen Zellen (VICs) einen ruhigen Phänotyp mit einer niedrigen Proteinbiosyntheserate 7 darstellen.
Es wurde jedoch gezeigt, dass in einem pathologischen Zustand die Anzahl der VICs in der Spongiosa zunimmt und ihre Proteinsynthese zusammen mit anderen funktionellen und phänotypischen Veränderungen aktiviert wird. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die minimalen Daten inDie Literatur konzentriert sich auf die Analyse der pathologischen Mitralklappen 9 , 10 , bei denen die erhöhte Anzahl aktivierter VICs die relativ hohe Anzahl identifizierter Proteine erklären könnte.
Abschließend kann das vorliegende Protokoll dazu dienen, das Verständnis der pathogenen Mechanismen, die für Mitral-Ventil-Erkrankungen verantwortlich sind, durch die Untersuchung von Mitralklappen-Protein-Komponenten zu entwickeln. In der Tat könnte ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden pathologischen Prozesse dazu beitragen, das klinische Management von Ventilkrankheiten zu verbessern, deren derzeitige Indikationen für die Intervention weitgehend auf hämodynamische Überlegungen beruhen.
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Protocol
In diesem Protokoll werden die menschlichen Herzen während der Multiorgan-Explantation (kalte Ischämiezeit von 4-12 h, Mittelwert 6 ± 2 h) von Multiorganspendern, die aus der Organtransplantation aus technischen oder funktionalen Gründen ausgeschlossen sind, trotz normaler echokardiographischer Parameter gesammelt. Sie werden an die Herz-Kreislauf-Tissue Bank von Mailand, Monzino Cardiologic Center (Mailand, Italien) für die Bank der Aorten- und Pulmonalventile geschickt. Die Mitral-posterioren Blättchen werden nicht für klinische Zwecke verwendet, so dass sie während der Aorten- und Lungenventilisolation gesammelt werden, nachdem eine informierte Zustimmung von den Verwandten der Spender erhalten wurde. Das Gewebe für die Transplantation und Forschung wird erst nach der elterlichen Zustimmung gesammelt; Englisch : eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUri...0053: EN: HTML Auf der Einverständniserklärung genehmigen sie die Verwendung des Herzgewebes für die Forschung nur, wenn sie nicht für den menschlichen klinischen Gebrauch ( dh mikrobiologische, funktionelle und serologische Probleme) nach den Richtlinien des Ethik - Komitees vonMonzino Kardiologisches Zentrum.
1. Mitralklappenvorbereitung
- Das menschliche Mitralklappe so schnell wie möglich nach der Organexplantation (kalte Ischämiezeit von 4-12 h) ernten.
- In einem sauberen Raum, entfernen Sie das Herz aus dem Transportbeutel mit einer kalten (4 ° C) Lösung ( dh Kochsalzlösung oder ausgewogene Medium Eurocollins oder Wisconsin). Legen Sie es in einen Eimer und legen Sie ihn in einen Biosicherheitsschrank (Biohazard-Vertikal-Luftstrom, Klasse A, Good Manufacturing Practices (GMP) Klassifizierung), um mit der Ventilvorbereitung fortzufahren.
- Legen Sie das Herz auf eine sterile Einweg-Tuch im Schrank. Mit einem sterilen Einweg-Skalpell, schneide das Herz ganz, senkrecht zu seiner Hauptachse, auf der Ebene der linken und rechten Ventrikel, etwa 4 cm entfernt von der Spitze.
- Bewegen Sie die aufsteigende Aorta und die pulmonale Arterie, um das linke Vorhofdach anzuzeigen.
- Mit sterilen autoklavierbaren Pinzetten und Picks, um die linke Ohrmuschel schneidenLinks atriales Dach, so dass das Mitralklappe sichtbar und ermöglicht die große Mitral-Prospekt (anterior) und die kleine Mitral-Broschüre (posterior) identifiziert werden.
HINWEIS: Antero-laterale und hintere mediale Kommissuren definieren die Grenze der vorderen Broschüre und des hinteren Bereichs. - Mit sterilen autoklavierbaren Scheren und nichttraumatischen Zangen sezieren Sie den linken Vorhof und die Ventrikelwanddicke um den Umfang des gesamten Mitralklappens .
- Identifizieren Sie die Mitro-Aortenklappen-Kontinuität.
HINWEIS: Der linke Ventrikel enthält das ganze Mitralklappe und Akkorde. - Trennen Sie die vordere Mitralklappe aus dem hinteren Mitralklappenblatt, schneiden Sie die hintere Blättchen entlang der Einfügung mit dem Ventrikel (Commissure).
- Waschen Sie die hintere Broschüre in der Kochsalzlösung. Schneiden Sie die Broschüre in kleine Stücke (<1 cm 2 ) und wickeln Sie sie einzeln in Aluminiumfolie ein. Snap-freeze sie mit flüssigem Stickstoff.
Achtung: Bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff die organisatorischen Sicherheitsmaßnahmen beachten.- Den Tisch des Schrankes mit einer 70% igen Isopropylalkohollösung und einer 6% igen Wasserstoffperoxidlösung am Ende des Verfahrens abgeben.
2. Proteinextraktion
- Verwenden Sie Pinzette, um die in flüssigem Stickstoff gespeicherte Probe aufzunehmen und sofort auf Trockeneis zu legen, während sie noch in die Aluminiumfolie eingewickelt ist. Lassen Sie die Probe nicht während der Transfers auftauen.
- Vor dem Schleifen den Porzellan / Zirkonium-Mörser und die Stößel eines Mahlsystems ( z. B. CryoGrinder) zusammen mit der Probe kühlen, indem man sie in einen Dewar-Kolben mit flüssigem Stickstoff (~ 500 ml) bringt.
Achtung: Bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff die organisatorischen Sicherheitsmaßnahmen beachten. - Setzen Sie den Mörser und die Pistillen in eine Polystyrol-Box mit Trockeneis. Entfernen Sie die Probe von der Aluminiumfolie und stecken Sie sie in den Mörtel.
- Schleifen tEr Probe mit der großen Stößel gegen den Mörtel 15-20 mal, mit dem Schraubendreher, um die Stößel zu drehen. Mischen Sie die Probe mit der Spitze eines vorgekühlten Spatels während des Mahlprozesses.
- Wiederholen Sie mit der kleinen Stößel.
- Übertragen Sie die Bodenprobe auf ein zuvor gewogenes Rohr ( z. B. 15 mL Zentrifugenröhrchen), indem Sie das Röhrchen umkehren, über den Mörtel legen und umdrehen, um die Probe in die Röhre zu bewegen. Verwenden Sie einen vorgekühlten Spatel, um alle Materialien aus dem Mörser zu erholen.
- Halten Sie das Röhrchen mit der Probe auf Trockeneis, um Probenproben während der Übertragung zu vermeiden.
- Berechnen Sie das Nettogewicht der Probe.
- Reinigen Sie den Mörser und die Pistillen nach jeder Probe und dekontaminieren sie durch Autoklavieren oder Erwärmen bei 200 ° C für 2 h.
- Übertragen Sie die pulverförmige Probe aus dem Zentrifugenröhrchen in die Glasröhre eines Homogenisators durch Inversion.
- Füge gefilterten Harnstoff zu(8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% G / V CHAPS, 20 mM Tris und 55 mM Dithiotreitol) zum Glasröhrchen, 200 μl Harnstoffpuffer für je 10 mg pulverförmiges Gewebe.
HINWEIS: Die im Zentrifugenröhrchen verbleibende Restpulverprobe kann unter Verwendung eines Teils des berechneten Harnstoffpaketes zurückgewonnen werden. - Homogenisieren der Probe unter Verwendung eines Rührers, der mit einem Borosilikatglasmörtel und einem Polytetrafluorethylen (PTFE) Pistill ausgestattet ist. Langsam die Pistille mit einer Drallbewegung (1.500 U / min) 10 mal auf die Probe drücken.
- Den Überstand wiederherstellen und in ein sauberes 1,7-ml-Zentrifugenröhrchen überführen. Wiederholen Sie die restliche Probe mit frischem Harnstoffpuffer, indem Sie die Hälfte des bei der ersten Extraktion verwendeten Volumens hinzufügen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.10.
- Erholen Sie den Überstand und kombinieren Sie ihn mit dem Überstand aus Schritt 2.11. Den zusammengesetzten Überstand für 30 min auf einen Rohrrotator stellen.
- Das Röhrchen für 30 min bei 13.000 xg und 4 ° C zentrifugieren.
- Den Überstand wiederherstellenD messen die Proteinkonzentration unter Verwendung des Bradford-Protein-Assays nach den Anweisungen des Herstellers. Die Probe bei -80 ° C bis zum Gebrauch aufbewahren.
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Representative Results
Die Extraktion und Auflösung von Proteinen im Harnstoffpuffer ist direkt mit proteomischen Methoden auf der Basis von Isoelektrofokussierung (zweidimensionale Elektrophorese (2-DE) 11 und Flüssigphasen-isoelektrische Fokussierung (IEF) 12 ) und mit Immunoblotting nach Verdünnung im Laemmli-Puffer 13 verträglich Mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail 14 .
Für gelfreie Massenspektrometrie-basierte Methoden ( dh Flüssigchromatographie gekoppelt an datenunabhängige Massenspektrometrieanalyse (LC / MS E ) und zweidimensionale LC / MS E (2D-LC / MS E )) 15 wurden die Proben extrahiert In dem beschriebenen Harnstoffpuffer müssen weiter behandelt werden, um den Harnstoff und Thioharnstoff zu eliminieren, was die anschließende Proteinverdauung und die Flüssigchromatographie-Trennung beeinträchtigen könnte. ThiDer Entsalzungsschritt kann unter Verwendung der kommerziellen Protein-Präzipitations-Kits durchgeführt werden, wobei die Anweisungen des Herstellers folgen, um die Proteine auszufällen. Die Probe kann dann in 25 mM NH 4 HCO 3 gelöst werden, das 0,1% spaltbare Reinigungsmittel für die Proteinverdauung enthält. Die Ausfällung der Proteine kann Pufferkomponenten eliminieren, die den Proteingehalt minimal beeinflussen (Proteinrückgewinnung:> 85%), wodurch die Probe für jede Art von Analyse geeignet ist.
Die Anwendung dieses Protokolls auf die Proteinextraktion aus menschlichen Mitralklappen ermöglichte die Identifizierung von insgesamt 422 Proteinen, wobei vier verschiedene Proteomikansätze kombiniert wurden, die zuvor im Detail beschrieben wurden 11 , 15 . Speziell wurden 169 Proteine durch 2-DE, 330 Proteine durch Flüssigphasen-IEF, 96 Proteine durch LC / MS E und 148 Proteine identifiziertDurch 2D-LC / MS E (Tabelle 1).
Um die 422 identifizierten Proteine hinsichtlich der subzellulären Lokalisation zu klassifizieren, wurde eine Software für die Gen-Ontologie (GO) -Analyse ( z. B. Cytoscape) verwendet. Das Netzwerk, das mit der Software und dem entsprechenden Plug-In erstellt wurde, zeigte, dass neben den erwarteten Proteinen, die in der extrazellulären Region lokalisiert sind (siehe oben rechts von Abbildung 2 ), die meisten Proteine, die durch die proteomischen Ansätze identifiziert wurden, aus dem intrazellulären Bereich stammten ( Dh Zytoplasma, Organellen, Vesikel und Zytoskelett). Zelloberflächenproteine wurden ebenfalls identifiziert (Abbildung 2 ).
Die Ergebnisse wurden in drei unabhängigen Mitralklappenproben weiter bestätigt. Immunoblotting wurde verwendet, um eine Gruppe von vier Proteinen ( dh Septin-11, vier und ein halbes LIM-Domänen-Protein 1 (FHL-1), derMatopontin und Alpha-Kristallin B (CryAB)), die noch nie im normalen Mitralklappen identifiziert wurden (Abbildung 3 ).
Abbildung 1: Mitralklappenstruktur. Draufsicht auf das menschliche Herz zeigt das geschlossene ( A ) oder offene ( B ) menschliche Mitralklappe. Vorderansicht des linken Ventrikels eines menschlichen Herzens ( C ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Analyse der identifizierten Mitralklappenproteine im Sinne der Zellverteilung. Cytoscape und das Plugin BiNGO wurden verwendet, um obtaiN die Verteilung der Gen-Ontologie (GO) Begriffe aus den zellulären Komponenten Kategorien. Die Kreisgröße ist proportional zur Anzahl der Proteinkomponenten, die mit den ausgewählten GO-Termen assoziiert sind, und die Farbskala für den p-Wert der Überdarstellung wird berichtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Immunoblotting-Analyse von Septin-11, FHL-1, Dermatopontin und CryAB in ganzem Extrakt aus drei menschlichen normalen Mitralklappenblättern. Das Immunoblotting wurde unter Verwendung eines monoklonalen Maus-Antikörpers gegen CryAB- und Kaninchen-polyklonale Antikörper gegen die Septin-11-, FHL-1- und Dermatopontin-Antikörper durchgeführt. BitteKlicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Beitritt | Beschreibung | 2-DE | 2D-LC | LC-MS E | Flüssigphase IEF |
| A6NMZ7 | Kollagen alpha VI | X | |||
| O00151 | PDZ und LIM Domäne Protein 1 | X | |||
| O00299 | Chlorid intrazelluläres Kanalprotein 1 | X | |||
| O00764 | Pyridoxalkinase | X | |||
| O14558 | Hitzeschockprotein Beta 6 | X | |||
| O43399 | Tumorprotein D54 | X | |||
| O43488 | Aflatoxin B1 Aldehydreduktaseelement 2 | X | |||
| O43707 | Alpha actinin 4 | X | X | ||
| O43866 | CD5-Antigen wie Vorläufer | X | |||
| O60493 | Sortierung nexin 3 | X | |||
| O60701 | UDP-Glucose-6-dehydrogenase | X | |||
| O75223 | Uncharakterisiertes Protein | X | |||
| O75368 | SH3 Domäne Bindung Glutaminsäure reich wie Protein | X | |||
| O75390 | Citratsynthase mitochondrialer Vorläufer | X | |||
| O75489 | NADH-Dehydrogenase-Ubichinon-Eisen-Schwefel-Protein 3 mitochondrialer Vorläufer | X | X | ||
| O75608 | Acyl-Protein-Thioesterase 1 | X | |||
| O75828 | Carbonylreduktase NADPH 3 | X | |||
| O75874 | Isocitratdehydrogenase NADP zytoplasmatisch | X | |||
| O75955 | Flotillin | X | |||
| O94760 | NG NG Dimethylarginindimethylaminohydrolase 1 | X | |||
| O94788 | Retinale Dehydrogenase 2 | X | |||
| O95865 | NG NG Dimethylarginindimethylaminohydrolase 2 | X | X | ||
| P00325 | Alkoholdehydrogenase 1B | X | X | ||
| P00338 | L-Lactat-Dehydrogenase Eine Kette | X | |||
| P00352 | Netzhautdehydrogenase 1 | X | |||
| P00441 | Superoxid-Dismutase Cu Zn | X | X | ||
| P00450 | Ceruloplasmin Vorläufer | X | X | ||
| P00488 | Koagulationsfaktor XIII A Kettenvorläufer | X | |||
| P00491 | Purin-Nukleosid-Phosphorylase | X | |||
| P00492 | Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase | X | |||
| P00558 | Phosphoglycerat-Kinase 1 | <Td> xX | X | ||
| P00568 | Adenylat-Kinase-Isoenzym 1 | X | |||
| P00734 | Prothrombin | X | X | ||
| P00738 | Haptoglobin | X | X | X | X |
| P00739 | Haptoglobin-verwandter Proteinvorläufer | X | |||
| P00751 | Komplementfaktor B | X | X | X | |
| P00915 | Kohlensäureanhydrase 1 | X | |||
| P00918 | Kohlensäureanhydrase 2 | X | |||
| P01008 | Antithrombin-III-Vorläufer | X | X | X | |
| P01009 | Alpha 1 Antitrypsin | X | X | X | X |
| P01011 | Alpha 1 Antichymotrypsin | X | X | X | X |
| P01019 | Angiotensinogenvorläufer | X | X | ||
| P01023 | Alpha 2 -Makroglobulin | X | X | ||
| P01024 | Ergänzung C3 | X | X | X | X |
| P01033 | Metalloproteinase-Inhibitor 1-Vorläufer | X | |||
| P01042 | Kininogen 1 Vorläufer | X | |||
| P01593 | Ig Kappa Kette VI Region AG | X | |||
| P01598 | Ig Kappa Kette VI Region EU | X | |||
| P01600 | Ig Kappa Kette VI Region Hau | X | X | ||
| P01611 | Ig Kappa Kette VI Region Wes | X | |||
| P01620 | Ig Kappa Kette V III Region SIE | X | |||
| P01625 | Ig Kappa Kette V IV Region Len | X | |||
| P01766 | Ig schwere Kette V III Region BRO | X | X | ||
| P01781 | Ig schwere Kette V III Region GAL | X | |||
| P01834 | Ig Kappa Kette C Region | X | X | X | X |
| P01842 | Ig Lambda Kette C Regionen | X | X | X | |
| P01857 | Ig Gamma 1 Kette C Region | X | X | X | X |
| P01859 | Ig Gamma 2 Kette C Region | X | X | X | X |
| P01860 | Ig Gamma 3 Kette C Region | X | X | X | |
| P01861 | Ig Gamma 4 Kette C Region | X | X | X | |
| P01871 | Ig mu Kette C Region | X | X | X | |
| P01876 | Ig alpha 1 Kette C Region | X | X | X | X |
| P01877 | Ig alpha 2 Kette C Region | X | |||
| P02144 | Myoglobin | X | X | ||
| P02452 | Kollagen alpha 1 I Kette | X | X | X | X |
| P02511 | Alpha-Kristallin-B-Kette | X | |||
| P02545 | Lamin AC 70 kDa Laminat | X | X | X | X |
| P02647 | Apolipoprotein AI | X | X | X | X |
| P02649 | Apolipoprotein E | X | X | X | X |
| P02671 | Fibrinogen alpha Kette | X | X | X | X |
| P02675 | Fibrinogen beta Kette | X | X | X | X |
| P02679 | Fibrinogen-Gammakette | X | X | X | X |
| P02689 | Myelin P2-Protein | X | |||
| P02735 | Serum-Amyloid Ein Proteinvorläufer | X | |||
| P02741 | C reaktive Proteinvorstufe | X | |||
| P02743 | Serum-Amyloid-P-Komponente | X | X | X | X |
| P02746 | Ergänzung C1q Unterkomponente Untereinheit B | X | X | ||
| P02747 | Komplement C1q Unterkomponente Untereinheit C Vorläufer | X | |||
| P02748 | Ergänzungskomponente C9 | X | X | X | |
| P02749 | Beta 2 Glykoprotein 1 | X | X | X | X |
| P02750 | Leucin-reiche Alpha-2-Glykoprotein-Vorstufe | X | |||
| P02751 | Fibronectin | X | X | ||
| P02760 | AMBP-Proteinvorläufer | X | X | X | X |
| P02763 | Alpha-1-Säure-Glykoprotein 1 | X | X | X | |
| P02765 | Alpha 2 HS-Glykoproteinvorläufer | X | |||
| P02766 | Transthyretinvorläufer | X | X | X | |
| P02768 | Serumalbumin | X | X | X | X |
| P02774 | Vitamin D bindende Proteinvorstufe | X | |||
| P02787 | Serotransferrin | X | X | X | X |
| P02788 | Lactotransferrinvorläufer | X | |||
| P02790 | Hemopexin | X | X | X | X |
| P02792 | Ferritin leichte Kette | X | |||
| P04004 | Vitronectin | X | X | X | X |
| P04075 | Fructosebisphosphataldolase A | X | |||
| P04083 | Anhang A1 | X | X | X | X |
| P04179 | Superoxid-Dismutase Mn mitochondrialer Vorläufer | X | |||
| P04196 | Histidin-reiche Glykoprotein-Vorstufe | X | |||
| P04217 | Alpha-1B-Glykoprotein-Vorläufer | X | X | ||
| P04350 | Tubulin beta 4 Kette | X | |||
| P04406 | Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase | X | X | X | X |
| P04792 | Hitzeschock-Protein Beta 1 | X | X | X | X |
| P05091 | Aldehyddehydrogenase mitochondrialer Vorläufer | X | X | ||
| Plasmaprotease C1-Inhibitor-Vorläufer | X | ||||
| P05156 | Komplementfaktor I Vorläufer | X | |||
| P05413 | Fettsäure bindende Protein Herz | X | |||
| P05452 | Tetranectinvorläufer TN | X | X | ||
| P05787 | Keratin Typ II Zytoskelett 8 | X | |||
| P06396 | Gelsolin | X | X | X | X |
| P06576 | ATP-Synthase-Untereinheit beta mitochondrialer Vorläufer | X | X | ||
| P06732 | Creatinkinase M-Typ | X | X | ||
| P06733 | Alpha-Enolase | X | X | X | X |
| P06753 | Tropomyosin alpha 3 Kette | X | X | ||
| P07108 | Acyl-CoA-bindendes Protein | X | |||
| P07195 | L-Lactat-Dehydrogenase-B-Kette | X | X | X | |
| P07196 | Neurofilament Licht Polypeptid | X | |||
| P07197 | Neurofilament-Medium-Polypeptid | X | X | ||
| P07237 | Protein-Disulfid-Isomerase-Vorläufer | X | X | ||
| P07339 | Cathepsin D Vorläufer | X | X | ||
| P07355 | Anhang A2 | X | X | X | X |
| P07360 | Komplementkomponente C8-Gamma-Kettenvorläufer | X | |||
| P07437 | Tubulin beta Kette | X | X | X | X |
| P07585 | Decorin | X | X | X | X |
| P07737 | Profilin 1 | X | |||
| P07858 | Cathepsin B Vorläufer | X | |||
| P07900 | Hitzeschockprotein HSP 90 alpha | X | X | ||
| P07951 | Tropomyosin-beta-Kette | X | |||
| P07954 | Fumarat-Hydratase-Mitochondrien-Vorläufer | X | |||
| P07996 | Thrombospondin 1 | X | X | X | |
| P08107 | Hitzeschock 70 kDa Protein 1A 1B | X | X | X | X |
| P08123 | Kollagen alpha 2 I Kette | X | X | X | X |
| P08133 | Anhang A6 | X | X | ||
| P08238 | Hitzeschockprotein HSP 90 beta | X | X | ||
| P08253 | 72 kDa Typ IV Kollagenase Vorläufer | X | |||
| P08294 | Extrazelluläre Superoxid-Dismutase Cu Zn vorUrsor | X | X | X | |
| P08590 | Myosin-Lichtpolypeptid 3 | X | X | ||
| P08603 | Ergänzungsfaktor H | X | X | X | X |
| P08670 | Vimentin | X | X | X | X |
| P08729 | Keratin Typ II Zytoskelett 7 | X | |||
| P08758 | Anhang A5 | X | X | X | X |
| P09211 | Glutathion S Transferase P | X | X | X | |
| P09382 | Galectin 1 | X | X | X | |
| P09417 | Dihydropteridin-Reduktase | <Td> | X | ||
| P09493 | Tropomyosin-1-alpha-Kette | X | X | ||
| P09525 | Anhang A4 | X | X | ||
| P09651 | Heterogenes nukleares Ribonukleoprotein A1 | X | |||
| P09871 | Ergänzung C1s Unterkomponente Vorläufer | X | |||
| P09936 | Ubiquitin-Carboxyl-terminales Hydrolase-Isozyme L1 | X | |||
| P09972 | Fructosebisphosphat-Aldolase C | X | |||
| P0C0L4 | Ergänzung C4 Ein Vorläufer | X | |||
| P0CG05 | Ich GLambda 2 Kette C Regionen | X | |||
| P0CG38 | POTE Ankyrin Domain Familienmitglied I | X | |||
| P10515 | Dihydrolipoyllysinrest-Acetyltransferase-Komponente des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes | X | |||
| P10768 | S Formylglutathionhydrolase | X | |||
| P10809 | 60 kDa Hitzeschock Protein mitochondrialen Vorläufer | X | |||
| P10909 | Clusterin | X | X | X | X |
| P10915 | Hyaluronan und Proteoglycan Link Protein 1 Vorläufer | X | X | ||
| P11021 | 78 kDa gLucose-reguliertes Protein | X | X | X | |
| P11047 | Laminin Untereinheit Gamma 1 Vorläufer | X | |||
| P11142 | Hitzeschock cognate 71 kDa Protein | X | X | X | X |
| P11177 | Pyruvat-Dehydrogenase-E1-Komponenten-Untereinheit beta mitochondrialer Vorläufer | X | |||
| P11217 | Glykogenphosphorylase-Muskelform | X | |||
| P11310 | Mittelketten-spezifische Acyl-CoA-Dehydrogenase mitochondriale Vorstufe | X | |||
| P11413 | Glucose-6-phosphat-1-dehydrogenase | X | |||
| P11766 | Alkohol Dehydrogenase Klasse 3 Chi Kette | X | |||
| P12036 | Neurofilament schweres Polypeptid | X | |||
| P12109 | Kollagen alpha 1 VI Kette | X | X | X | X |
| P12110 | Kollagen alpha 2 VI Kette | X | X | X | X |
| P12111 | Kollagen alpha 3 VI Kette | X | X | X | |
| P12277 | Creatinkinase B-Typ | X | |||
| P12429 | Anhang A3 | X | X | ||
| P12814 | Alpha actinin 1 | X | X | ||
| P12829 | Myosin-Lichtpolypeptid 4 | X | |||
| P12882 | Myosin 1 | X | |||
| P12883 | Myosin 7 | X | X | ||
| P12955 | Xaa Pro Dipeptidase | X | |||
| P13489 | Ribonuclease-Inhibitor | X | |||
| P13533 | Myosin 6 | X | X | ||
| P13611 | Versican Kernprotein Vorläufer | X | X | ||
| P13639 | Dehnungsfaktor 2 | X | |||
| P13716 | Delta-Aminolävulinsäure-Dehydratase | X | |||
| P13796 | Plastin 2 | X | |||
| P13804 | Elektronentransfer-Flavoprotein-Untereinheit alpha mitochondrialer Vorläufer | X | |||
| P13929 | Beta-Enolase | X | X | ||
| P14136 | Glial fibrillärer saurer Protein Astrozyt | X | |||
| P14314 | Glucosidase 2 Untereinheit Beta Vorläufer | X | |||
| P14550 | Alkohol Dehydrogenase NADP | X | |||
| P14618 | Pyruvat-Kinase-Isozyme M1 M2 | X | X | X | |
| P14625 </ Td> | Endoplasmin-Vorläufer | X | X | ||
| P15121 | Aldose-Reduktase | X | |||
| P15259 | Phosphoglycerat-Mutase 2 | X | |||
| P16152 | Carbonylreduktase NADPH 1 | X | |||
| P17066 | Hitzeschock 70 kDa Protein 6 | X | X | X | |
| P17174 | Aspartat-Aminotransferase zytoplasmatisch | X | |||
| P17540 | Creatin-Kinase-Sarkom-Mitochondrien-Vorläufer | X | |||
| P17661 | Desmin | X | X | X | X |
| P17980 | 26S-Protease-regulatorische Untereinheit 6A | X | |||
| P17987 | T-Komplex-Protein 1 Untereinheit alpha | X | |||
| P18206 | Vinculin | X | X | ||
| P18428 | Lipopolysaccharid-bindende Proteinvorstufe | X | |||
| P18669 | Phosphoglycerat-Mutase 1 | X | |||
| P19105 | Myosin regulatorische Lichtkette 2 | X | X | ||
| P19623 | Spermidin-Synthase | X | |||
| P19652 | Alpha 1 Säure Glykoprotein 2 Vorläufer | X | X | ||
| P19823 | Inter alpha Trypsin-Inhibitor schwere Kette H2 | X | |||
| P19827 | Inter alpha Trypsin-Inhibitor schwere Kette H1 | X | X | ||
| P20073 | Anhang A7 | X | |||
| P20618 | Proteasom Untereinheit Beta Typ 1 Vorläufer | X | |||
| P20774 | Mimecan | X | X | X | X |
| P21266 | Glutathion S Transferase Mu 3 | X | |||
| P21333 | Filamin A | X | X | ||
| P21796 | Spannungsabhängiges anionselektives Kanalprotein1 | X | |||
| P21810 | Biglycan | X | X | X | X |
| P21980 | Protein Glutamin Gamma Glutamyltransferase 2 | X | X | ||
| P22105 | Tenascin X | X | X | ||
| P22314 | Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1 | X | |||
| P22352 | Glutathionperoxidase 3 Vorläufer | X | X | ||
| P22626 | Heterogene nukleare Ribonucleoproteine A2 B1 | X | |||
| P22695 | Ubiquinol-Cytochrom-c-Reduktase-Komplex-Kernprotein 2 mitochondrialer Vorläufer | X | |||
| P23141 | Leber Carboxylesterase 1 Vorläufer | X | |||
| P23142 | Fibulin 1 | X | X | X | X |
| P23284 | Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase-B-Vorläufer | X | |||
| P23381 | Tryptophanyl-tRNA-Synthetase-Zytoplasma | X | |||
| P23526 | Adenosylhomocysteinase | X | X | ||
| P23528 | Cofilin 1 | X | |||
| P24752 | Acetyl-CoA-Acetyltransferase-mitochondrialen Vorläufers | X | |||
| P25311 | Zink Alpha 2 GlykoproteiN Vorläufer | X | |||
| P25705 | ATP-Synthase-Untereinheit alpha mitochondrial | X | |||
| P25788 | Proteasom Untereinheit Alpha Typ 3 | X | X | ||
| P25789 | Proteasom Untereinheit Alpha Typ 4 | X | |||
| P26447 | Protein S100 A4 | X | |||
| P27348 | 14 3 3 Protein-Theta | X | X | ||
| P27797 | Calreticulin-Vorläufer | X | |||
| P28066 | Proteasom Untereinheit Alpha Typ 5 | X | |||
| P28070 | <Td> Proteasom Untereinheit Beta Typ 4 VorläuferX | X | |||
| P28072 | Proteasom Untereinheit Beta Typ 6 Vorläufer | X | |||
| P28074 | Proteasom Untereinheit Beta Typ 5 Vorläufer | X | |||
| P28331 | NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase 75 kDa-Untereinheit mitochondrialer Vorläufer | X | |||
| P28838 | Cytosolaminopeptidase | X | |||
| P29218 | Inositolmonophosphatase | X | |||
| P29401 | Transketolase | X | |||
| P29692 | Dehnungsfaktor 1 Delta | <Td> | X | ||
| P29966 | Myristoyliertes alaninreiches C-Kinase-Substrat | X | |||
| P30040 | Endoplasmatisches Retikulumprotein ERp29 Vorläufer | X | |||
| P30041 | Peroxiredoxin 6 | X | X | ||
| P30043 | Flavin-Reduktase | X | |||
| P30044 | Peroxiredoxin 5 mitochondrialer Vorläufer | X | |||
| P30085 | UMP CMP Kinase | X | |||
| P30086 | Phosphatidylethanolamin-bindendes Protein 1 | X | |||
| P30101 | ProteiN-Disulfid-Isomerase-A3-Vorläufer | X | X | X | |
| P30613 | Pyruvat-Kinase-Isozyme RL | X | |||
| P30740 | Leukozytenelastase-Inhibitor | X | |||
| P31025 | Lipocalin 1 Vorläufer | X | |||
| P31937 | 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase-mitochondrialen Vorläufers | X | |||
| P31942 | Heterogenes nukleares Ribonukleoprotein H3 | X | |||
| P31943 | Heterogenes nukleares Ribonukleoprotein H | X | |||
| P31946 | 14 3 3 Protein beta alpha | X | X | ||
| P31948 | Stress induziertes Phosphoprotein 1 | X | |||
| P31949 | Protein S100 A11 | X | |||
| P32119 | Peroxiredoxin 2 | X | X | ||
| P34931 | Hitzeschock 70 kDa Protein 1 wie | X | X | ||
| P34932 | Hitzeschock 70 kDa Protein 4 | X | |||
| P35232 | Prohibitin | X | |||
| P35237 | Serpin B6 | X | |||
| P35443 | Thrombospondin 4 | X | </ Tr> | ||
| P35555 | Fibrillin 1 | X | X | ||
| P35579 | Myosin 9 | X | X | X | |
| P35580 | Myosin 10 | X | X | ||
| P35609 | Alpha actinin 2 | X | |||
| P35625 | Metalloproteinase-Inhibitor 3 | X | X | ||
| P35998 | 26S-Protease-regulatorische Untereinheit 7 | X | |||
| P36871 | Phosphoglucomutase 1 | X | X | ||
| P36955 | Pigment-Epithel abgeleitet Faktor | X | X | ||
| P37802 | <Td> Transgelin 2X | X | |||
| P37837 | Transaldolase | X | |||
| P38117 | Elektronentransfer-Flavoprotein-Untereinheit beta | X | |||
| P38646 | Stress 70 Protein mitochondrialen Vorläufer | X | X | ||
| P39687 | Acidisches Leucin-reines Kernphosphoprotein 32 Familienmitglied A | X | |||
| P40121 | Makrophagen-Verschlussprotein | X | |||
| P40925 | Malat dehydrogenase zytoplasmatisch | X | |||
| P40926 | Malch-Dehydrogenase-Mitochondrienvorläufer | <Td> | X | ||
| P41219 | Peripherin | X | |||
| P42330 | Aldo Keto Reduktase Familie 1 Mitglied C3 | X | |||
| P45880 | Spannungsabhängiges anionselektives Kanalprotein 2 | X | |||
| P47755 | F Aktin Capping Protein Untereinheit Alpha 2 | X | X | ||
| P47756 | F-Aktin-Verschluss-Protein-Untereinheit beta | X | X | ||
| P47985 | Ubiquinol Cytochrom c Reduktase Eisen Schwefel Untereinheit mitochondrialen Vorläufer | X | |||
| P48047 | ATP-Synthase O-Untereinheit mitochondrialen Vorläufer | X | |||
| P48637 | Glutathion-Synthetase | X | |||
| P48741 | Hitzeschock 70 kDa Protein 7 | X | X | ||
| P49189 | 4 Trimethylaminobutyraldehyddehydrogenase | X | |||
| P49368 | T-Komplex-Protein 1 Untereinheit Gamma | X | |||
| P49747 | Knorpel-oligomere Matrixprotein | X | X | X | X |
| P49748 | Sehr langkettige spezifische Acyl-CoA-Dehydrogenase-mitochondriale Vorstufe | X | |||
| P50395 | Rab BIP-Dissoziation Inhibitor Beta | X | X </ Td> | ||
| P50454 | Serpin H1 Vorläufer | X | |||
| P50995 | Anhang A11 | X | |||
| P51452 | Duale Spezifität Protein Phosphatase 3 | X | |||
| P51884 | Lumican | X | X | X | X |
| P51888 | Prolargin Vorläufer | X | X | X | X |
| P52565 | Rho-BIP-Dissoziationsinhibitor 1 | X | |||
| P52566 | Rho-BIP-Dissoziationsinhibitor 2 | X | |||
| P54652 | Hitzeschock im Zusammenhang mit 70 kDa Protein 2 | X | X | X | X |
| P55072 | Übergangsendoplasmatisches Retikulum ATPase | X | |||
| P55083 | Mikrofibrillen-assoziiertes Glykoprotein-4-Vorläufer | X | X | ||
| P57053 | Histon H2B Typ F | X | |||
| P60174 | Triosephosphat-Isomerase | X | X | X | |
| P60660 | Myosin-Lichtpolypeptid 6 | X | X | ||
| P60709 | Actin zytoplasmatisch 1 | X | X | X | X |
| P60981 | Destrin | X | |||
| P61086 | Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2 25 kDa | X | |||
| P61088 | Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2 | X | |||
| P61224 | Ras verwandter Protein Rap 1b Vorläufer | X | |||
| P61978 | Heterogenes nukleares Ribonukleoprotein K | X | X | ||
| P61981 | 14 3 3 Protein-Gamma | X | X | X | |
| P62258 | 14 3 3 Protein epsilon 14 3 3E | X | |||
| P62491 | Ras verwandtes Protein | X | |||
| P62714 | Serin-Threonin-Protein-Phosphatase 2A katalytische Untereinheit Beta-Isoform | X | |||
| P62736 | Actin Aorta glatte Muskulatur | X | X | X | |
| P62805 | Histone H4 | X | |||
| P62826 | GTP-Bindungs-Kernprotein Ran | X | |||
| P62873 | Guanin-Nukleotid-Bindungsprotein GIGSGT-Untereinheit beta 1 | X | |||
| P62879 | Guanin-Nukleotid-Bindungsprotein GIGSGT-Untereinheit beta 2 | X | |||
| P62937 | Peptidylprolylcis-trans-Isomerase A | X | X | ||
| P62987 | Ubiquitin 60S ribosomales Protein L40 | X | |||
| P63104 | 14 3 3 proTein zeta delta | X | X | X | X |
| P63241 | Eukaryotischer Translationsinitiierungsfaktor 5A 1 | X | |||
| P63244 | Guanin-Nukleotid-bindende Protein-Untereinheit beta 2 wie 1 | X | |||
| P63267 | Actin gamma enterischen glatten Muskel | X | X | ||
| P67936 | Tropomyosin alpha 4 Kette | X | |||
| P68032 | Actin alpha Herzmuskel 1 | X | |||
| P68104 | Dehnungsfaktor 1 alpha 1 | X | X | X | |
| P68133 | Aktin-Alpha-Skelettmuskel | ||||
| P68363 | Tubulin alpha 1B Kette | X | X | X | |
| P68371 | Tubulin beta 2C Kette | X | X | X | |
| P68402 | Plättchenaktivierungsfaktor Acetylhydrolase IB Untereinheit beta | X | |||
| P68871 | Hämoglobin-Untereinheit beta | X | X | X | |
| P69905 | Hämoglobin-Untereinheit alpha | X | X | ||
| P78371 | T-Komplex-Protein 1 Untereinheit beta | X | |||
| P78417 | Glutathion transferase omega 1 | X | X | ||
| P80748 | Ig Lambda Kette VIII Region LOI | X | |||
| P98095 | Fibulin 2 | X | X | ||
| Q01082 | Spectrin Beta Ketten Gehirn 1 | X | |||
| Q01449 | Myosin regulatorische leichte Kette 2 atriale Isoform | X | |||
| Q01518 | Adenylylcyclase assoziiertes Protein 1 | X | |||
| Q01995 | Transgelin Glattes Muskelprotein 22 alpha | X | |||
| Q03252 | Lamin B2 | X | X | ||
| Q03591 | Komplementfaktor H-verwandter Protein 1-Vorläufer | X | Q04917 | 14 3 3 Protein eta | X | X |
| Q06323 | Proteasom Aktivator komplexe Untereinheit 1 | X | |||
| Q06828 | Fibromodulin | X | X | X | X |
| Q06830 | Peroxiredoxin 1 | X | X | ||
| Q07507 | Dermatopontin | X | X | X | X |
| Q07960 | Rho GTPase Aktivierungsprotein 1 | X | |||
| Q08257 | Quinone Oxidoreduktase | X | |||
| Q08431 | Lactadherin | X | X | ||
| Q12765 | SEcernin 1 | X | |||
| Q13011 | Delta 3 5 Delta 2 4 Dienoyl CoA Isomerase mitochondrialer Vorläufer | X | X | ||
| Q13228 | Selen bindendes Protein 1 | X | X | ||
| Q13404 | Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2-Variante 1 | X | |||
| Q13409 | Cytoplasmatische Dynein 1 Zwischenkette 2 | X | |||
| Q13509 | Tubulin beta 3 Kette | X | X | X | |
| Q13642 | Vier und eine halbe LIM Domänen Protein 1 | X | |||
| Q13765 | Nascent Polypeptid assoziierte komplexe Untereinheit alpha | X | |||
| Q13885 | N Tubulin beta 2A Kette | X | X | ||
| Q14194 | Dihydropyrimidinase-verwandtes Protein 1 | X | |||
| Q14195 | Dihydropyrimidinase-verwandtes Protein 3 | X | X | X | X |
| Q14624 | Inter alpha Trypsin-Inhibitor schwere Kette H4 Vorläufer | X | |||
| Q14697 | Neutrale Alpha-Glucosidase-AB-Vorstufe | X | |||
| Q14764 | Großes Gewölbeprotein | X | |||
| Q14767 | Latentes transformierendes Wachstumsfaktor Beta-Bindungsprotein 2 | X | <Td>X | ||
| Q14894 | Mu-Kristallin-Homolog-NADP-reguliertes Schilddrüsenhormon-bindendes Protein | X | |||
| Q15063 | Periostinvorläufer | X | X | X | X |
| Q15084 | Protein-Disulfid-Isomerase A6-Vorläufer | X | |||
| Q15113 | Prokollagen C Endopeptidase Enhancer 1 Vorläufer | X | |||
| Q15181 | Anorganische Pyrophosphatase | X | |||
| Q15365 | Poly-rC-bindendes Protein 1 | X | |||
| Q15366 | Poly-rC-bindendes Protein 2 | X | |||
| Q15582 | Umwandlungswachstumsfaktor beta-induziertes Protein | X | X | X | |
| Q15819 | Ubiquitin-konjugierendes Enzym E2-Variante 2 | X | |||
| Q16352 | Alpha-Internexin | X | |||
| Q16473 | Putative Tenascin XA | X | |||
| Q16555 | Dihydropyrimidinase-verwandtes Protein 2 | X | X | X | |
| Q16698 | 2 4 Dienoyl-CoA-Reduktase-mitochondrialen Vorläufer | X | |||
| Q16891 | Mitochondriale innere Membran | X | |||
| Q562R1 | Beta Aktin wie Protein 2 | X | |||
| Q6S8J3 | POTE Ankyrin Domain Familienmitglied E | X | |||
| Q6UWY5 | Olfactomedin wie Protein 1 Vorläufer | X | X | ||
| Q71U36 | Tubulin alpha 1A Kette | X | X | X | |
| Q7Z7G0 | Ziel von Nesh SH3 Vorläufer | X | X | X | |
| Q8WUM4 | Programmierter Zelltod 6 wechselwirkendes Protein | X | |||
| Q8WWX9 | Thioredoxin wie Selenoprotein M Vorläufer | X | |||
| Q92597 | Protein NDRG1 | X | |||
| Q92945 Weites stromaufwärtiges Element Bindungsprotein 2 | X | ||||
| Q96CN7 | Isochorismatase-Domäne mit Protein 1 | X | |||
| Q96CX2 | BTB POZ Domäne mit Protein | X | |||
| Q96KK5 | Histon H2A Typ 1 H | X | X | ||
| Q96KP4 | Cytosolische unspezifische Dipeptidase | X | |||
| Q99426 | Tubulinspezifischer Chaperon B | X | |||
| Q99497 | Protein DJ 1 | X | X | ||
| Q99536 | Synaptisches Vesikelmembranprotein | X | X | X | |
| Q99714 | 3 Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase Typ 2 | X | |||
| Q99715 | Kollagen alpha 1 XII Kette | X | X | ||
| Q99798 | Aconitate Hydratase mitochondrialen Vorläufer | X | |||
| Q9BQE3 | Tubulin alpha 6 Kette | X | |||
| Q9BUF5 | Tubulin beta 6 Kette | X | X | ||
| Q9BUT1 | 3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase Typ 2 | X | |||
| Q9BVA1 | Tubulin beta 2B Kette | X | X | X | |
| Q9BXN1 | Asporin | X | X </ Td> | X | X |
| Q9H0W9 | Ester Hydrolase C11orf54 | X | |||
| Q9H4B7 | Tubulin beta 1 Kette | X | |||
| Q9NRN5 | Olfactomedin wie Protein 3 Vorläufer | X | X | ||
| Q9NRV9 | Heme-bindendes Protein 1 | X | |||
| Q9NSB2 | Keratin Typ II cuticular Hb4 | X | X | ||
| Q9NVA2 | Septin 11 | X | |||
| Q9UBR2 | Kathepsin-Z-Vorläufer | X | |||
| Q9UBX5 | Fibulin 5 | X | X | ||
| Q9UK22 | F-Box nur Protein 2 | X | |||
| Q9Y277 | Spannungsabhängiges anionselektives Kanalprotein 3 | X | |||
| Q9Y281 | Cofilin 2 | X | |||
| Q9Y490 | Talin 1 | X | |||
| Q9Y696 | Chlorid intrazelluläres Kanalprotein 4 | X | |||
| Q9Y6C2 | EMILIN 1 | X | X |
Tabelle 1: Liste der im Mitralklappengewebeextrakt identifizierten Proteine, wenn vier verschiedene proteomische Ansätze angewendet wurden: zweidimensionale Elektrophorese (2-DE), zweidimensionale LC-MS E (2D-LC / MS E ), LC / MS E und Flüssigphasen-IEF. Die Methode, mit der jedes Protein identifiziert wurde, wird berichtet.
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Discussion
Ein kritischer Schritt dieses Protokolls ist die Verwendung von flüssigem Stickstoff, um die Probe einzufrieren und das Mahlsystem zu kühlen. Die Verwendung von flüssigem Stickstoff verhindert biologischen Abbau und ermöglicht eine effiziente Pulverisierung, erfordert aber eine spezielle Schulung für eine sichere Handhabung.
In diesem Protokoll ist ein Schleifsystem für das Probenschleifen, da kleine Proben schwer von Standardmörtel und Stößeln zu erholen sind. In diesem Fall breiten sich kleine Proben als feines Pulver über die Mörteloberfläche aus und machen die Sammlung schwierig. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Schleifmaschine motorisiert wird, wodurch eine größere Anzahl von Proben reproduzierbar und ohne zusätzliche Ermüdung verarbeitet werden kann. Eine Begrenzung der Verwendung einer Schleifmaschine ist, dass die Größe der Probe, die klein sein muss (100 mg oder weniger) für die Stößel wirksam gegen den Mörtel gedrückt werden muss. Darüber hinaus müssen die Schleiferkomponenten auf Raumtemperatur zwischen den Verwendungen für die Reinigung erwärmt werden G. Folglich ist das Verfahren zeitaufwendig und wenn viele Proben täglich verarbeitet werden, werden viele Sätze benötigt.
Ein weiterer kritischer Schritt ist die Vorbereitung des Extraktionspuffers. Die Salzkonzentrationen, besonders für den Harnstoff (8 M) und Thioharnstoff (2 M), sind recht hoch; So ist das Salzvolumen fast die Hälfte des Gesamtvolumens der Lösung. Darüber hinaus ist die Auflösung nicht leicht zu bedenken, dass Wärme vermieden werden muss, da bei mehr als 37 ° C Harnstoff zu Protein-Carbamylierung an den N-Termini von Proteinen / Peptiden und an den Seitenketten-Aminogruppen von Lysin- und Argininresten führen kann . Sobald es gelöst ist, muss der Harnstoffpuffer mit 0,22 μm Filtern filtriert werden und kann bei -80 ° C für 4 Wochen gelagert werden, ohne seine Extraktionswirksamkeit zu beeinträchtigen, aber er muss vor dem Gebrauch auf mehr als 15 ° C erwärmt werden, um eine vollständige Auflösung zu ermöglichen .
Änderungen und Fehlersuche
In diesem Protokoll wird die Proteinextraktion unter Verwendung des beschriebenen Harnstoffpuffers durchgeführt, da es eine der am häufigsten verwendeten Proteinextraktionslösungen für proteomische Untersuchungen aufgrund ihrer Kompatibilität mit der Isoelektrofokussierung und deren Effizienz bei der Solubilisierung schwerlöslicher Proteine ist Dass dieser Puffer sehr sparsam lösliche Proteine, wie z. B. integrale Membranproteine 19 , oder Proteine, die stark anfällig für Aggregation sind, wie Tubulin 18 , sehr gut löslich sind. Weiterhin ist dieser Puffer voll kompatibel mit dem Bradford-Assay zur Bestimmung der Proteinkonzentration und Es kann direkt in 2-DE- und Flüssigphasen-IEF-Analysen eingesetzt werden.Dieser Puffer ist jedoch nicht ideal für die Solubilisierung aller in einer Probe vorhandenen Proteine. Es ist möglich, dass verschiedene Extraktionspuffer Proteine zeigen konnten, die durch dieses Protokoll nicht nachweisbar waren. Zum Beispiel ist es gut knoMit welchen ribosomalen und nuklearen Proteinen mit Säureextraktion oder Trichloressigsäure / Aceton-Präzipitation 20 besser extrahiert werden können, während alkalische pH-Werte für die Membranproteine 21 , 22 besser geeignet sind. Daher kann die Verwendung von alternativen Puffern zusätzliche Schritte zur Proteinausfällung erfordern, um Salze zu eliminieren, die mit 2-DE oder Flüssigphasen-IEF interferieren.
Einschränkungen der Technik
Die Anzahl der durch dieses Protokoll identifizierten Proteine ist relativ gering, aber die Anzahl der Identifikationen und die Abdeckung der Proteomanalyse können durch den Einsatz modernerer Instrumente weiter erhöht werden, deren Massengenauigkeit und Sequenzgeschwindigkeit in den letzten Jahren dramatisch angestiegen sind Es ist möglich, einen großen Teil des Proteoms ohne jegliche Vorbeugungsschritte zu decken, indem man einen langen Gradienten für flüssige ChRomatographische Trennungen gekoppelt mit einem hochauflösenden MS-Instrument mit einer schnellen Sequenzgeschwindigkeit 24 .
Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / alternative Methoden
Die Fähigkeit, Proteine in den menschlichen Herzklappen zu identifizieren und zu quantifizieren, wie das Mitralklappen, ist eine wichtige und herausfordernde Aufgabe, die dazu beitragen wird, die Mechanismen der physiologischen / pathologischen Prozesse bei Ventilkrankheiten aufzuklären. Die Definition der Veränderungen des Mitralklappen-Proteoms wird das Verständnis der Natur der biologischen Prozesse, die mit dem Krankheitszustand des Gewebes verbunden sind, stark erhöhen.
Das aktuelle Wissen über die Physiopathologie des Mitralklappens ist begrenzt und wird in der Regel durch die Analyse einzelner Proteine, die an spezifischen Prozessen beteiligt sind, wie z. B. extrazelluläre Matrix-Remodellierung, Hämostase, Entzündungen oder oxidativer Stress, erhalten 9 , 10 .
Der Mangel an umfassenden proteomischen Studien kann der Komplexität dieses niederzellulären Gewebes zugeschrieben werden, das hochgradig reich an extrazellulären Matrixproteinen ( dh Proteoglykanen, Kollagen und Elastin) ist. Diese Proteine machen etwa 80% der Gesamtmenge aus und behindern die Analyse von Proteinen mit geringer Häufigkeit 26 .
So war es notwendig, ein effizientes Extraktionsprotokoll zu etablieren, um die Protein-Solubilisierung zu maximieren, um das Proteom dieses Gewebes zu beschreiben. Dieses Protokoll erlaubte die Extraktion von ~ 50 μg Protein aus 1 mg Gewebe. Dies ist eine relativ geringe Ausbeute im Vergleich zu "weichem" GewebeAls Leber (~ 135 μg aus 1 mg Gewebe), aber es genügt, eine Proteinanalyse an einzelnen Proben durchzuführen. Dies ist besonders relevant bei der Definition der intraindividuellen Variabilität eines Phänomens.
Darüber hinaus hat diese Methode den Vorteil, mit vielen analytischen Anwendungen kompatibel zu sein. Die in dem vorgeschlagenen Extraktionspuffer gelösten Mitralklappenproteine können direkt für die Immunoblotting- und Proteomanalyse auf Basis der zweidimensionalen Elektrophorese und der Flüssigphasen-Isoelektrophorese 11 , 12 oder nach der Proteinausfällung zur Beseitigung der Pufferkomponenten-Interferenz für andere Assays, wie z Gel-freie Massenspektrometrie 15 .
Mit der Anwendung dieses Extraktionsprotokolls wurde eine erschöpfende Charakterisierung der Proteinkomponenten des normalen Mitralklappengewebes durch die Identifizierung von vielen intracel erhaltenLose Proteine. Diese Proteine sind im Cytosol oder in Organellen nicht nur in der extrazellulären Matrix lokalisiert und haben unterschiedliche molekulare und biologische Funktionen. Andere interessante Proteine ( dh CryAB, Septin-11, FHL-1 und Dermatopontin) wurden ebenfalls identifiziert. Diese Proteine haben im Mitralklappen unbekannte Funktionen, aber ihre biologischen Eigenschaften deuten auf eine mögliche Rolle bei Ventilkrankheiten hin.
Zukünftige Anwendungen oder Richtungen nach der Beherrschung dieser Technik
Mit diesem Protokoll ist es möglich, Daten bezüglich der Proteinexpression mit Daten über die quantitative mRNA-Expression und nicht-quantitative immunhistochemische Analysen zu korrelieren. In der Tat, wenn sie zusammen verwendet werden, werden diese Ansätze zu einem umfassenderen Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Krankheit zugrunde liegen, von der mRNA bis zur posttranslationalen Proteinmodifikation führen. So kann diese Methode für Forscher von Interesse sein, die sich auf die Herz-Ventil-Physiopathologie konzentrieren. FlosseKann dieses Protokoll auch auf das Schweine-Mitralklappen angewendet werden, das eine enge Ähnlichkeit mit dem menschlichen Ventil 27 hat und als experimentelles Modell für die Ventilfunktionsbewertung verwendet wird.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Das italienische Gesundheitsministerium unterstützte diese Studie (RC 2013-BIO 15). Wir danken Barbara Micheli für ihre hervorragende technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
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