Summary
تكوين البروتين من صمام الصمام التاجي البشري لا يزال غير معروف جزئيا، لأن تحليله معقد من قبل الخلوية منخفضة، وبالتالي من خلال انخفاض البروتين الحيوي. هذا العمل يوفر بروتوكول لاستخراج البروتين بكفاءة لتحليل بروتيوم صمام الصمام التاجي.
Abstract
تحليل بروتيوم الخلوية يمكن أن تساعد على توضيح الآليات الجزيئية الكامنة الأمراض بسبب تطوير التكنولوجيات التي تسمح على نطاق واسع تحديد وكمية من البروتينات الموجودة في النظم البيولوجية المعقدة.المعرفة المكتسبة من نهج البروتين يمكن أن تؤدي إلى فهم أفضل للآليات المسببة للأمراض الكامنة وراء الأمراض، والسماح لتحديد علامات التشخيص والتشخيص الرواية جديدة، ونأمل، من الأهداف العلاجية. ومع ذلك، فإن الصمام التاجي القلب يمثل عينة صعبة للغاية لتحليل البروتين بسبب انخفاض الخلوية في بروتيوغليكان والمصفوفة خارج الخلية المخصب الكولاجين. وهذا يجعل من الصعب استخراج البروتينات لتحليل البروتين العالمي. يصف هذا العمل بروتوكول متوافق مع تحليل البروتين لاحق، مثل البروتينات الكمية و إمونوبلوتينغ. وهذا يمكن أن يسمح للارتباط البيانات قلقز التعبير البروتين مع البيانات على التعبير الكمي مرنا وغير الكمي تحليل المناعية. في الواقع، هذه النهج، عندما يؤديها معا، سيؤدي إلى فهم أكثر شمولا للآليات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض، من مرنا إلى ما بعد متعدية تعديل البروتين. وهكذا، يمكن لهذه الطريقة تكون ذات صلة للباحثين المهتمين في دراسة أمراض القلب صمام فيسيوباثولوغي.
Introduction
وقد غيرت الأدلة الأخيرة فهم أدوار الآليات التنظيمية العديدة التي تحدث بعد التوليف مرنا. في الواقع، عمليات متعدية، ما بعد النسخي، وعمليات بروتين يمكن أن تنظم بروتين وفرة وظيفة. العقيدة - التي تقول أن تركيزات مرنا هي بروكسيات لتلك التي من البروتينات المقابلة، على افتراض أن مستويات النص هي المحدد الرئيسي للوفرة البروتين - وقد تم تنقيح جزئي. في المقام الأول، ومستويات النص تتنبأ جزئيا فقط وفرة البروتين، مما يشير إلى أن أحداث ما بعد النسخي تحدث لتنظيم البروتينات داخل الخلايا 1 ، 2 .
وعلاوة على ذلك، والبروتينات تملي في نهاية المطاف وظيفة الخلية، وبالتالي تملي النمط الظاهري، والتي يمكن أن تخضع لتغييرات ديناميكية في الاستجابة لعقاقير أوتوكرين، باراكرين، والغدد الصماء. الوسطاء المنقولين بالدم؛ درجة الحرارة؛ العلاج من الإدمان؛ وتطور المرضمنة. وهكذا، فإن تحليل التعبير تركز على مستوى البروتين مفيد لتوصيف بروتيوم وكشف التغيرات الحرجة التي تحدث لها كجزء من المرضية المرض 3 .
ولذلك، فإن الفرص التي توفرها البروتيوميات لتوضيح الظروف الصحية والمرضية هائلة، على الرغم من التحديات التكنولوجية القائمة. المجالات الواعدة بشكل خاص للبحوث التي يمكن أن تسهم بروتيوميكس: تحديد تغيير التعبير البروتين على أي مستوى ( أي خلايا كاملة أو الأنسجة، المقصورات تحت الخلوية، والسوائل البيولوجية). وتحديد والتحقق، والتحقق من المؤشرات الحيوية الرواية مفيدة لتشخيص وتشخيص المرض. ونأمل، وتحديد أهداف البروتين الجديدة التي يمكن استخدامها لأغراض علاجية، فضلا عن تقييم فعالية الدواء والسمية 4 .
التقاط تعقيديمثل البروتيوم تحديا تكنولوجيا. أدوات البروتين الحالية توفر الفرصة لأداء تحليل واسع النطاق، عالية الإنتاجية لتحديد، الكمي، والتحقق من صحة مستويات البروتين المتغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إدخال تقنيات تجزئة وإثراء، وتهدف إلى تجنب التدخل الناجم عن البروتينات الأكثر وفرة، كما تحسنت تحديد البروتين من خلال تضمين البروتينات الأقل وفرة. وأخيرا، تم تكملة البروتيوميات من خلال تحليل التعديلات بعد متعدية، والتي تظهر تدريجيا كمغيرات هامة من وظيفة البروتين.
ومع ذلك، فإن إعداد العينة واستعادة البروتين في العينات البيولوجية تحت التحليل لا تزال الخطوات المحددة في سير العمل البروتين وزيادة إمكانية وقوع المزالق المحتملة 5 . في الواقع، في معظم تقنيات البيولوجيا الجزيئية التي يجب أن تكون الأمثل، والخطوات الأولى هي الأنسجة هوموجينيزاتأيون وتحلل الخلية، وخصوصا خلال تحليل البروتينات وفرة منخفضة التي أساليب التضخيم لا وجود لها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطبيعة الكيميائية للبروتينات يمكن أن تؤثر على الانتعاش الخاصة بهم. على سبيل المثال، تحليل البروتينات مسعور للغاية صعبة للغاية، لأنها تتعجل بسهولة خلال التركيز إسويلكتريك، في حين البروتينات عبر غشاء تقريبا غير قابلة للذوبان (راجع في المرجع 5). وعلاوة على ذلك، فإن تقلب تكوين الأنسجة يخلق حاجزا كبيرا لتطوير طريقة استخراج عالمية. وأخيرا، لأن ما يقرب من جميع العينات السريرية هي من كمية محدودة، فمن الضروري لتمكين إعداد البروتين مع الانتعاش القصوى والتكاثر من الحد الأدنى من كميات عينة 6 .
يصف هذا العمل بروتوكول الأمثل لاستخراج البروتين من صمام القلب التاجي البشري العادي، الذي يمثل عينة صعبة للغاية لتحليل البروتين. صمام التاجي العادي هو كومبهيكل ليكس الكذب بين الأذين الأيسر والبطين الأيسر للقلب ( الشكل 1 ). فإنه يلعب دورا هاما في السيطرة على تدفق الدم من الأذين إلى البطين، ومنع ارتجاعي وضمان المستوى المناسب من إمدادات الأكسجين إلى الجسم كله، وبالتالي الحفاظ على الناتج القلبي الكافي. ومع ذلك، فإنه غالبا ما يعتبر أن يكون "غير نشط" الأنسجة، مع الخلوية منخفضة وعدد قليل من المكونات، وذلك أساسا في المصفوفة خارج الخلية. وذلك لأنه، في الظروف العادية، الخلايا الخلوية صمام المقيمين (فيكس) تقديم النمط الظاهري هادئ مع انخفاض معدل البروتين الحيوي 7 .
ومع ذلك، فقد ثبت أنه في حالة المرضية، وعدد من مراكز فيينا الدولية في زيادة الإسفنجية وتفعيل تخليق البروتين، جنبا إلى جنب مع غيرها من التغيرات الوظيفية والمظاهر الظاهرية 8 . ولذلك، فإنه ليس من المستغرب أن الحد الأدنى من البيانات المتاحة فيوتركز الأدب على تحليل الصمامات التاجية المرضية 9 ، 10 ، والتي قد زيادة عدد فيك المنشط قد يفسر العدد المرتفع نسبيا من البروتينات التي تم تحديدها.
في الختام، فإن هذا البروتوكول قد تعمل على تطوير فهم الآليات المسببة للأمراض المسؤولة عن أمراض الصمام التاجي من خلال دراسة مكونات بروتين صمام التاجي. والواقع أن الفهم الأكبر للعمليات المرضية الكامنة يمكن أن يساعد على تحسين الإدارة السريرية لأمراض الصمامات التي تعتمد مؤشراتها الحالية للتدخل إلى حد كبير على اعتبارات الدورة الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
في هذا البروتوكول، يتم جمع قلوب الإنسان خلال إكسبلانتاتيون متعدد الأجسام (وقت نقص التروية الباردة من 4-12 ساعة، يعني 6 ± 2 ح) من الجهات المانحة متعددة الأعضاء استبعادها من زرع الأعضاء لأسباب تقنية أو وظيفية، على الرغم من المعلمات مخطط صدى القلب العادي. يتم إرسالها إلى بنك الأنسجة القلبية الوعائية في ميلانو، مركز مونزينو كارديولوجيك (ميلان، إيطاليا) لمصارف الصمامات الأبهري والرئوي. لا تستخدم المنشورات الخلفية التاجية للأغراض السريرية، لذلك يتم جمعها خلال عزل الصمام الأبهري والرئوي بعد الحصول على موافقة مستنيرة من أقارب المانحين. يتم جمع الأنسجة لزرع والبحوث إلا بعد موافقة الوالدين. على ورقة الموافقة، فإنهم يأذنون (أو لا) استخدام الأنسجة القلبية للبحث فقط إذا لم يكن مناسبا للاستخدام السريري البشري ( أي الميكروبيولوجية والوظيفية، والمرضية المشاكل)، وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاق منمركز مونزينو كارديولوجيك.
1. إعداد الصمام التاجي
- حصاد صمام الصمام التاجي البشري في أقرب وقت ممكن بعد الجهاز إكسلانتاتيون (وقت نقص التروية الباردة من 4-12 ح).
- في غرفة نظيفة، وإزالة القلب من حقيبة النقل التي تحتوي على البرد (4 درجات مئوية) حل ( أي محلول ملحي أو متوازنة وروكولينز المتوسطة أو ولاية ويسكونسن). وضعه في دلو ووضعه في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية (بيوهازارد تدفق الهواء العمودي، فئة A، تصنيف ممارسات التصنيع الجيدة (غمب) للمضي قدما في إعداد صمام.
- وضع القلب على ثنى المتاح العقيمة في مجلس الوزراء. باستخدام مشرط العقيمة القابل للتصرف، وقطع القلب تماما، عموديا على محورها الرئيسي، على مستوى البطينين الأيسر والأيمن، حوالي 4 سم بعيدا عن قمة.
- نقل الشريان الأورطي الصاعد والشريان الرئوي لعرض السقف الأذيني الأيسر.
- مع ملقط أوتوكلافابل معقمة ويختار، وقطع حول أوريكل الأيسر علىتركت الأذيني سقف، مما يجعل الصمام التاجي مرئية والسماح للنشرة التاجية كبيرة (الأمامي) ومنشور التاجي الصغيرة (الخلفي) التي سيتم تحديدها.
ملاحظة: أنتيرو الجانبي والمسامير الإنسية الخلفي تحديد الحدود من النشرة الأمامية والمنطقة الخلفية. - باستخدام مقص قابل للتعقيم معقمة والملقط غير الصدمة، تشريح الأذين الأيسر وسماكة جدار البطين حول محيط صمام التاجي كله .
- تحديد استمرارية الصمام الشريان الأورطي.
ملاحظة: البطين الأيسر يحتوي على صمام التاجي كله والحبال. - فصل نشرة الصمام التاجي الأمامي من النشرة الخلفية الصمام التاجي، وقطع المنشور الخلفي على طول الإدراج مع البطين (الصوار).
- غسل النشرة الخلفية في محلول ملحي. قطع النشرة إلى قطع صغيرة (<1 سم 2 ) ولفها بشكل فردي في رقائق الألومنيوم. المفاجئة تجميد لهم مع النيتروجين السائل.
تنبيه: اتبع إجراءات السلامة التنظيمية عند استخدام النيتروجين السائل.- تطهير الجدول من مجلس الوزراء مع 70٪ محلول الأيزوبروبيل و 6٪ محلول بيروكسيد الهيدروجين في نهاية الإجراء.
2. استخراج البروتين
- استخدام ملقط لالتقاط العينة المخزنة في النيتروجين السائل ووضعه على الفور على الجليد الجاف في حين لا تزال ملفوفة في رقائق الألومنيوم. لا تترك العينة إلى ذوبان الجليد أثناء أي نقل.
- قبل طحن، والبرد الخزف / الزركونيوم هاون و بيستليس من نظام طاحونة (على سبيل المثال، كريوغريندر)، جنبا إلى جنب مع العينة، عن طريق وضعها في قارورة ديوار تحتوي على النيتروجين السائل (~ 500 مل).
تنبيه: اتبع إجراءات السلامة التنظيمية عند استخدام النيتروجين السائل. - وضع هاون والمدقة في مربع البوليسترين التي تحتوي على الثلج الجاف. إزالة العينة من رقائق الألومنيوم ووضعها في هاون.
- طحن روقال انه عينة مع مدقة كبيرة ضد هاون 15-20 مرات، وذلك باستخدام مفك لتدوير المدقة. مزج العينة مع طرف ملعقة قبل المبردة أثناء عملية الطحن.
- كرر مع المدقة الصغيرة.
- نقل عينة الأرض إلى أنبوب وزنه سابقا (على سبيل المثال، 15 مل أنبوب الطرد المركزي) عن طريق قلب الأنبوب، ووضعه على هاون، وعكسها معا لنقل العينة إلى الأنبوب. استخدام ملعقة قبل المبردة لاستعادة جميع المواد من الهاون.
- إبقاء الأنبوب مع العينة على الجليد الجاف لتجنب عينة ذوبان أثناء نقل.
- حساب الوزن الصافي للعينة.
- تنظيف الهاون والمدقات بعد كل عينة وتطهيرها عن طريق التعقيم أو تسخينها في 200 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- نقل عينة المسحوق من أنبوب الطرد المركزي إلى أنبوب زجاجي من الخالط عن طريق انقلاب.
- إضافة تصفية اليوريا بوف(8 M اليوريا، 2 M ثيوريا، 4٪ ث / V تشابس، 20 ملي تريس، و 55 ملي ديثيوتريتول) إلى أنبوب زجاجي، 200 ميكرولتر من اليوريا العازلة لكل 10 ملغ من الأنسجة المسحوقة.
ملاحظة: المتبقية عينة مسحوق اليسار في أنبوب الطرد المركزي يمكن استردادها باستخدام جزء من حجم المحسوبة من اليوريا العازلة. - تجانس العينة باستخدام النمام مجهزة هاون الزجاج البورسليكات و بيتيترافلوروثيلين (بتف) مدقة. اضغط ببطء المدقة على العينة مع حركة التواء (1500 دورة في الدقيقة) 10 مرات.
- استعادة طاف ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي 1.7 مل نظيفة. مرة أخرى استخراج العينة المتبقية مع العازلة اليوريا الطازجة، مضيفا نصف حجم المستخدمة خلال الاستخراج الأول.
- كرر الخطوة 2.10.
- استعادة طاف والجمع بينه وبين طاف من الخطوة 2.11. وضع طاف مجتمعة على مدورة أنبوب لمدة 30 دقيقة.
- الطرد المركزي أنبوب لمدة 30 دقيقة في 13،000 زغ و 4 درجة مئوية.
- استرداد طاف أد قياس تركيز البروتين باستخدام فحص البروتين برادفورد، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تخزين العينة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخراج و حل البروتينات في العازلة اليوريا هو متوافق مباشرة مع الأساليب البروتينية على أساس إزلكتروفوكوسينغ (ثنائي الأبعاد الكهربائي (2-دي) 11 والتركيز السائل تركيز كهروضوئية (إيف) 12 ) مع إمونوبلوتينغ بعد التخفيف في العازلة ليملي 13 تحتوي على كوكتيل البروتيني مثبط 14 .
أما بالنسبة لطرائق قياس الطيف الكتلي الخالية من الجل ( أي اللوني السائل المقترن بتحليل الطيف الكتلي المستقل للبيانات) لك / مس E ) و لك / مس E ثنائي الأبعاد (2D-لك / مس E )) 15 ، في العازلة اليوريا وصف تحتاج إلى مزيد من العلاج للقضاء على اليوريا و ثيوريا، والتي يمكن أن تتداخل مع الهضم البروتين اللاحقة وفصل اللوني السائل. ثيs يمكن تحقيق خطوة تحلية باستخدام مجموعات بروتين هطول الأمطار التجارية، في أعقاب تعليمات الشركة المصنعة لترسيب البروتينات. ويمكن بعد ذلك حل العينة في 25 ملي نه 4 هكو 3 تحتوي على 0.1٪ المنظفات الانقسام للبروتين الهضم 16 . وهطول الأمطار من البروتينات يمكن القضاء على المكونات العازلة، مما يؤثر على الحد الأدنى من محتوى البروتين (استعادة البروتين:> 85٪)، مما يجعل العينة مناسبة لكل نوع من التحليل.
تطبيق هذا البروتوكول لاستخراج البروتين من الصمامات التاجية الإنسان يسمح لتحديد ما مجموعه 422 البروتينات، والجمع بين أربعة نهج بروتيوميات مختلفة وصفت سابقا في التفاصيل 11 ، 15 . على وجه التحديد، تم التعرف على 169 البروتينات من قبل 2-دي، 330 البروتينات من قبل إيف المرحلة السائلة، 96 البروتينات من قبل لك / مس E ، و 148 بروتيناتبواسطة 2D-لك / مس E (الجدول 1).
لتصنيف 422 البروتينات التي تم تحديدها من حيث توطين تحت الخلوية، تم استخدام برنامج لتحليل الجينات أونتولوغي (غو) (على سبيل المثال، سيتوسكيب). الشبكة التي تم إنشاؤها باستخدام البرنامج والمكونات المقابلة لها أظهرت أنه إلى جانب البروتينات المتوقعة المترجمة في المنطقة خارج الخلية (انظر الجزء العلوي الأيمن من الشكل 2 )، فإن معظم البروتينات التي حددتها النهج البروتين كانت من المنطقة داخل الخلايا ( أي السيتوبلازم ، العضيات، الحويصلات، والهياكل الخلوية). كما تم تحديد البروتينات سطح الخلية ( الشكل 2 ).
كما تم تأكيد النتائج في ثلاثة عينات صمام تاجي مستقلة. تم استخدام إمونوبلوتينغ لتحليل مجموعة من أربعة بروتينات ( أي سبتين -11، أربعة ونصف ليم المجالات البروتين 1 (فل-1)، ديرماتوبونتين، و ألفا-كريستالين B (كرياب)) التي لم يتم تحديدها في صمام التاجي العادي ( الشكل 3 ).
الشكل 1: هيكل صمام التاجي. المنظر العلوي، بسبب، القلب الإنساني، العرض، ال التعريف، مغلق، ( A )، أو، إستهل، ( B )، الإنسان، ميترال، فالف. المنظر الأمامي، بسبب، ال التعريف، اليسار، البطين، بسبب، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، القلب الإنساني، ( C ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل بروتينات الصمام التاجي المحددة في التوزيع الخلوي. تم استخدام سيتوسكيب و بينغو المساعد إلى أوبتاىن توزيع مصطلحات علم الجينات (غو) من فئات المكونات الخلوية. حجم الدائرة يتناسب مع عدد من مكونات البروتين المرتبطة شروط غو المختارة، ويتم الإبلاغ عن مقياس اللون لقيمة p من الإفراط في التمثيل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل إمونوبلوتينغ من سيبتين -11، فل-1، ديرماتوبونتين، و كرياب في مستخلص كامل من ثلاثة الإنسان العادي صمامات الصمام التاجي. تم تنفيذ إمونوبلوتينغ باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس ضد كرياب والأرانب بولكلونل الأجسام المضادة ضد سيبتين -11، فل-1، والأجسام المضادة ديرماتوبونتين. رجاءانقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الانضمام | وصف | 2-DE | 2D-LC | لك-مس E | المرحلة السائلة إيف |
| A6NMZ7 | الكولاجين ألفا السادس | س | |||
| O00151 | بدز و ليم بروتين المجال 1 | س | |||
| O00299 | كلوريد البروتين قناة داخل الخلية 1 | س | |||
| O00764 | بيريدوكسال كيناز | س | |||
| O14558 | الحرارة صدمة بروتين بيتا 6 | س | |||
| O43399 | بروتين الورم D54 | س | |||
| O43488 | أفلاتوكسين B1 ألدهيد ريدوكتاس عضو 2 | س | |||
| O43707 | ألفا أكتينين 4 | س | س | ||
| O43866 | مستضد CD5 مثل السلائف | س | |||
| O60493 | فرز نيكسين 3 | س | |||
| O60701 | أودب الجلوكوز 6 نازعة | س | |||
| O75223 | البروتين غير المميز | س | |||
| O75368 | نطاق SH3 ملزمة حمض الغلوتاميك غنية مثل البروتين | س | |||
| O75390 | سترات سينثاس الميتوكوندريا السلائف | س | |||
| O75489 | ناد هيدروجيناس أوبيكينون بروتين الحديد الكبريت 3 السلائف الميتوكوندريا | س | س | ||
| O75608 | بروتين أسيل ثيوستراس 1 | س | |||
| O75828 | كاربونيل ريدوكتاس نادف 3 | س | |||
| O75874 | إيزوسيترات نازعة سيتوبلازمية نادب | س | |||
| O75955 | Flotillin | س | |||
| O94760 | نغ نغ ديميثيلارجينين ديميثيلامينوهيدرولاس 1 | س | |||
| O94788 | نازعة الشبكية 2 | س | |||
| O95865 | نغ نغ ديميثيلارجينين ديميثيلامينوهيدرولاس 2 | س | س | ||
| P00325 | الكحول نازعة 1B | س | س | ||
| P00338 | L لاكتات نازعة سلسلة | س | |||
| P00352 | نازعة الشبكية 1 | س | |||
| P00441 | سوبر ديسموتاز النحاس الزنك | س | س | ||
| P00450 | سيرولوبلازمين السلائف | س | س | ||
| P00488 | عامل التخثر الثالث عشر سلائف السلسلة | س | |||
| P00491 | بورين نوكليوسيد فسفوريلاز | س | |||
| P00492 | هيبوكسانتين فوسفهوريبوسيلترانزفيراس غوانين | س | |||
| P00558 | فوسفوغليسرات كيناز 1 | <td> سس | س | ||
| P00568 | أدينيلات كيناز إسونزيمي 1 | س | |||
| P00734 | البروثرومبين | س | س | ||
| P00738 | هابتوغلوبين | س | س | س | س |
| P00739 | هابتوغلوبين بروتين السلائف ذات الصلة | س | |||
| P00751 | عامل التكملة ب | س | س | س | |
| P00915 | أنيدراز كربونية 1 | س | |||
| P00918 | أنيدراز كربونية 2 | س | |||
| P01008 | أنتيثرومبين الثالث السلائف | س | س | س | |
| P01009 | ألفا 1 أنتيتريبسين | س | س | س | س |
| P01011 | ألفا 1 أنتيتشيموتريبسين | س | س | س | س |
| P01019 | أنجيوتنسينوجين السلائف | س | س | ||
| P01023 | ألفا 2 ميكروغلوبولين | س | س | ||
| P01024 | تكملة C3 | س | س | س | س |
| P01033 | مثبط ميتالوبروتيناز 1 السلائف | س | |||
| P01042 | كينينوجين 1 السلائف | س | |||
| P01593 | إيغ كابا سلسلة في المنطقة أغ | س | |||
| P01598 | إيغ كابا سلسلة في منطقة الاتحاد الأوروبي | س | |||
| P01600 | إيغ كابا سلسلة في المنطقة هاو | س | س | ||
| P01611 | إيغ كابا سلسلة في المنطقة ويس | س | |||
| P01620 | إيغ كابا سلسلة V إي المنطقة سي | س | |||
| P01625 | إيغ كابا سلسلة V المنطقة الرابعة لين | س | |||
| P01766 | إيغ سلسلة ثقيلة V إي المنطقة برو | س | س | ||
| P01781 | إيغ السلسلة الثقيلة V إي المنطقة غال | س | |||
| P01834 | إغ كابا سلسلة C المنطقة | س | س | س | س |
| P01842 | إيغ لامدا سلسلة C المناطق | س | س | س | |
| P01857 | إغ غاما 1 سلسلة C المنطقة | س | س | س | س |
| P01859 | إغ غاما 2 سلسلة C المنطقة | س | س | س | س |
| P01860 | إيغ غاما 3 سلسلة C المنطقة | س | س | س | |
| P01861 | إيغ غاما 4 سلسلة C المنطقة | س | س | س | |
| P01871 | إغ مو سلسلة C المنطقة | س | س | س | |
| P01876 | إيغ ألفا 1 سلسلة C المنطقة | س | س | س | س |
| P01877 | إيغ ألفا 2 سلسلة C المنطقة | س | |||
| P02144 | الميوجلوبين | س | س | ||
| P02452 | الكولاجين ألفا 1 أنا سلسلة | س | س | س | س |
| P02511 | ألفا كريستالين سلسلة B | س | |||
| P02545 | لامين أس 70 كيلو دالتون لامين | س | س | س | س |
| P02647 | أبوليبوبروتين أي | س | س | س | س |
| P02649 | أبوليبوبروتين E | س | س | س | س |
| P02671 | سلسلة ألفا الفبرينوجين | س | س | س | س |
| P02675 | سلسلة بيتا الفبرينوجين | س | س | س | س |
| P02679 | سلسلة فبرينوجين غاما | س | س | س | س |
| P02689 | ميلين P2 البروتين | س | |||
| P02735 | المصل أميلويد بروتين السلائف | س | |||
| P02741 | C رد الفعل البروتين السلائف | س | |||
| P02743 | المصل أميلويد P المكون | س | س | س | س |
| P02746 | تكملة الوحدة الفرعية الفرعية C1q B | س | س | ||
| P02747 | تكملة C1q الفرعية المكون الفرعي C السلائف | س | |||
| P02748 | مكمل عنصر C9 | س | س | س | |
| P02749 | بيتا 2 بروتين سكري 1 | س | س | س | س |
| P02750 | ليوسين الغنية ألفا 2 بروتين سكري | س | |||
| P02751 | فبرونيكتين | س | س | ||
| P02760 | أمب بروتين السلائف | س | س | س | س |
| P02763 | ألفا 1 بروتين سكري حمض 1 | س | س | س | |
| P02765 | ألفا 2 هس بروتين سكري | س | |||
| P02766 | ترانستهيريتين السلائف | س | س | س | |
| P02768 | مصل الألبومين | س | س | س | س |
| P02774 | فيتامين D ملزمة البروتين السلائف | س | |||
| P02787 | Serotransferrin | س | س | س | س |
| P02788 | لاكتوترانسفيرين السلائف | س | |||
| P02790 | هيموبيكسين | س | س | س | س |
| P02792 | سلسلة ضوء الفيريتين | س | |||
| P04004 | Vitronectin | س | س | س | س |
| P04075 | الفركتوز بيسفوسفهات ألدولاز A | س | |||
| P04083 | أنيكسين A1 | س | س | س | س |
| P04179 | ديسموتاز الفائق من السلائف الميتوكوندريا | س | |||
| P04196 | هستيدين غليكوبروتين الغنية السلائف | س | |||
| P04217 | ألفا 1B بروتين سكري | س | س | ||
| P04350 | سلسلة توبولين بيتا 4 | س | |||
| P04406 | غليسيرالدهيد 3 نازعة فوسفات | س | س | س | س |
| P04792 | بروتين الصدمة الحرارية بيتا 1 | س | س | س | س |
| P05091 | ألدهيد نازعة السلائف الميتوكوندريا | س | س | ||
| البلازما البروتيني C1 المانع السلائف | س | ||||
| P05156 | عامل التكملة الأول السلائف | س | |||
| P05413 | حمض الدهنية ملزمة البروتين البروتين | س | |||
| P05452 | تيترانيكتين السلائف تن | س | س | ||
| P05787 | الكيراتين نوع الثاني الهيكل الخلوي 8 | س | |||
| P06396 | Gelsolin | س | س | س | س |
| P06576 | أتب سينثيز فرعية بيتا الميتوكوندريا السلائف | س | س | ||
| P06732 | الكرياتين كيناز نوع M | س | س | ||
| P06733 | ألفا إينولاس | س | س | س | س |
| P06753 | تروبوميوسين ألفا 3 سلسلة | س | س | ||
| P07108 | أسيل كوا ملزمة البروتين | س | |||
| P07195 | L لاكتات نازعة سلسلة B | س | س | س | |
| P07196 | نيوروفيلامنت ضوء ببتيد | س | |||
| P07197 | البولي ببتيد المتوسطة العصبية | س | س | ||
| P07237 | بروتين كبريتيد إسوميراز بروتين | س | س | ||
| P07339 | كاثبسين D السلائف | س | س | ||
| P07355 | أنيكسين A2 | س | س | س | س |
| P07360 | مكمل عنصر C8 سلسلة غاما السلائف | س | |||
| P07437 | سلسلة بيتولين بيتولين | س | س | س | س |
| P07585 | Decorin | س | س | س | س |
| P07737 | بروفيلين 1 | س | |||
| P07858 | كاثبسين B السلائف | س | |||
| P07900 | بروتين صدمة الحرارة هسب 90 ألفا | س | س | ||
| P07951 | سلسلة تروبوميوسين بيتا | س | |||
| P07954 | فومارات هيدراتاس السلائف الميتوكوندريا | س | |||
| P07996 | ثرومبوسبوندين 1 | س | س | س | |
| P08107 | صدمة الحرارة 70 كيلو دالتون بروتين 1A 1B | س | س | س | س |
| P08123 | الكولاجين ألفا 2 أنا سلسلة | س | س | س | س |
| P08133 | أنيكسين A6 | س | س | ||
| P08238 | بروتين صدمة الحرارة هسب 90 بيتا | س | س | ||
| P08253 | 72 كيلو دالتون نوع الرابع كولاجيناز السلائف | س | |||
| P08294 | الفائق خارج الخلية ديسموتاز النحاس زن قبلursor | س | س | س | |
| P08590 | ميوسين ضوء ببتيد 3 | س | س | ||
| P08603 | عامل التكملة H | س | س | س | س |
| P08670 | فيمنتين | س | س | س | س |
| P08729 | الكيراتين نوع الثاني الهيكل الخلوي 7 | س | |||
| P08758 | أنيكسين A5 | س | س | س | س |
| P09211 | الجلوتاثيون S ترانسفيز P | س | س | س | |
| P09382 | غاليكتين 1 | س | س | س | |
| P09417 | ديهيدروبتيريدين ريدوكتاس | <td> | س | ||
| P09493 | تروبوميوسين 1 سلسلة ألفا | س | س | ||
| P09525 | أنيكسين A4 | س | س | ||
| P09651 | البروتين النووي النووي غير المتجانس A1 | س | |||
| P09871 | تكملة السلائف المكونة C1s | س | |||
| P09936 | أوبيكيتين الكربوكسيل محطة هدرولاز إيزوزيم L1 | س | |||
| P09972 | الفركتوز بيسفوسفهات ألدولاز C | س | |||
| P0C0L4 | تكملة C4 سلائف | س | |||
| P0CG05 | زايلامدا 2 سلسلة C المناطق | س | |||
| P0CG38 | بوت أنكيرين عضو أسرة النطاق I | س | |||
| P10515 | ديهيدروليبويليزين بقايا مكون أسيتيلترانزفيراس من البيروفات مركب نازعة الهيدروجين | س | |||
| P10768 | S فورميللوتاثيون هدرولاز | س | |||
| P10809 | 60 كيلو دالتون بروتين الصدمة الحرارية الميتوكوندريا السلائف | س | |||
| P10909 | Clusterin | س | س | س | س |
| P10915 | هيالورونان و بروتيوغليكان ربط البروتين 1 السلائف | س | س | ||
| P11021 | 78 كيلو دالتون زالبروتين ينظم لوكوس | س | س | س | |
| P11047 | لامينين فرعية غاما 1 السلائف | س | |||
| P11142 | صدمة الحرارة مماثلة 71 بروتين كيلو دالتون | س | س | س | س |
| P11177 | بايروفات هيدروجيناس E1 المكون الوحيدات بيتا الميتوكوندريا السلائف | س | |||
| P11217 | شكل جليكوجين فسفوريلاز العضلات | س | |||
| P11310 | سلسلة متوسطة أسيل كوا نازعة سلائف الميتوكوندريا محددة | س | |||
| P11413 | الجلوكوز 6 الفوسفات 1 نازعة | س | |||
| P11766 | الكحول سلسلة نازعة 3 تشي سلسلة | س | |||
| P12036 | البولي ببتيد الثقيلة العصبية | س | |||
| P12109 | الكولاجين ألفا 1 سلسلة السادس | س | س | س | س |
| P12110 | الكولاجين ألفا 2 سلسلة السادس | س | س | س | س |
| P12111 | الكولاجين ألفا 3 سلسلة السادس | س | س | س | |
| P12277 | الكرياتين كيناز نوع B | س | |||
| P12429 | أنيكسين A3 | س | س | ||
| P12814 | ألفا أكتينين 1 | س | س | ||
| P12829 | ميوسين ضوء ببتيد 4 | س | |||
| P12882 | ميوسين 1 | س | |||
| P12883 | ميوسين 7 | س | س | ||
| P12955 | زا برو ديبيبتيديس | س | |||
| P13489 | ريبونوكلياز المانع | س | |||
| P13533 | ميوسين 6 | س | س | ||
| P13611 | فيروسيكان البروتين الأساسية السلائف | س | س | ||
| P13639 | عامل استطالة 2 | س | |||
| P13716 | دلتا أمينوليفولينيك حمض ديهيدراتاس | س | |||
| P13796 | بلاستين 2 | س | |||
| P13804 | الإلكترون نقل فلافوبروتين ألفا السلائف الميتوكوندريا | س | |||
| P13929 | بيتا إنولاز | س | س | ||
| P14136 | الدبقية فبريلاري الحمضية البروتين الحمضية | س | |||
| P14314 | غلوكوسيديس 2 سوبونيت بيتا السلائف | س | |||
| P14550 | الكحول نادب نازف | س | |||
| P14618 | البيروفات كيناز ايزوزيم M1 M2 | س | س | س | |
| P14625 </ td> | إندوبلاسمين السلائف | س | س | ||
| P15121 | ألدوز ريدوكتاس | س | |||
| P15259 | الفوسفوغليسرات طفرة 2 | س | |||
| P16152 | كاربونيل ريدوكتاس نادف 1 | س | |||
| P17066 | صدمة الحرارة 70 كيلو دالتون بروتين 6 | س | س | س | |
| P17174 | أسبارتات أمينوترانزفيراس السيتوبلازمية | س | |||
| P17540 | الكرياتين كيناز ساركوميريك السلائف الميتوكوندريا | س | |||
| P17661 | Desmin | س | س | س | س |
| P17980 | 26S البروتياز وحدة فرعية 6A | س | |||
| P17987 | T البروتين المعقدة 1 وحدة فرعية ألفا | س | |||
| P18206 | فينكولين | س | س | ||
| P18428 | ليبوسوليزاكاريد ملزمة بروتين السلائف | س | |||
| P18669 | الفوسفوغليسرات طفرة 1 | س | |||
| P19105 | ميوسين سلسلة ضوء التنظيمية 2 | س | س | ||
| P19623 | سبيرميدين سينثاس | س | |||
| P19652 | ألفا 1 بروتين سكري حامض 2 السلائف | س | س | ||
| P19823 | إنتر ألفا التربسين مثبط سلسلة الثقيلة H2 | س | |||
| P19827 | إنتر ألفا التربسين المانع سلسلة الثقيلة H1 | س | س | ||
| P20073 | أنيكسين A7 | س | |||
| P20618 | بروتيزوم سوبونيت بيتا نوع 1 السلائف | س | |||
| P20774 | Mimecan | س | س | س | س |
| P21266 | الجلوتاثيون S ترانزفيرز مو 3 | س | |||
| P21333 | فيلامين أ | س | س | ||
| P21796 | الجهد تعتمد أنيون انتقائية قناة البروتين1 | س | |||
| P21810 | Biglycan | س | س | س | س |
| P21980 | بروتين الجلوتامين غاما غلوتاميل ترانزفيراس 2 | س | س | ||
| P22105 | تيناسين X | س | س | ||
| P22314 | أوبيكيتين تفعيل انزيم E1 | س | |||
| P22352 | الجلوتاثيون بيروكسيداز 3 السلائف | س | س | ||
| P22626 | البروتينات النووية ريبونوكليوبروتين غير متجانسة A2 B1 | س | |||
| P22695 | أوبيكينول السيتوكروم ج المخفض البروتين الأساسية المعقدة 2 السلائف الميتوكوندريا | س | |||
| P23141 | كاربوكسيلستيراز الكبد 1 السلائف | س | |||
| P23142 | فيبولين 1 | س | س | س | س |
| P23284 | الببتيديل بروليل رابطة الدول المستقلة عبر ايزوميراز ب السلائف | س | |||
| P23381 | تريبتوفانيل الحمض الريبي النووي النقال سينثيتاس السيتوبلازمية | س | |||
| P23526 | Adenosylhomocysteinase | س | س | ||
| P23528 | كوفيلين 1 | س | |||
| P24752 | الأسيتيل لجنة الزراعة أسيتيلترانزفيراس السلائف الميتوكوندريا | س | |||
| P25311 | الزنك ألفا 2 غليكوبروتيn السلائف | س | |||
| P25705 | أتب سينثيز الوحيدات الميتوكوندريا ألفا | س | |||
| P25788 | بروتيزوم الوحيدات نوع ألفا 3 | س | س | ||
| P25789 | بروتيزوم الوحيدات نوع ألفا 4 | س | |||
| P26447 | بروتين S100 A4 | س | |||
| P27348 | 14 3 3 بروتين ثيتا | س | س | ||
| P27797 | كالريتيكولين السلائف | س | |||
| P28066 | بروتيزوم الوحيدات نوع ألفا 5 | س | |||
| P28070 | <تد> بروتيزوم سوبونيت بيتا تايب 4 بريسورسورس | س | |||
| P28072 | بروتيزوم سوبونيت بيتا نوع 6 السلائف | س | |||
| P28074 | بروتيزوم سوبونيت بيتا نوع 5 السلائف | س | |||
| P28331 | ناد أوبيكينون أوكسيدوريدوكتاس 75 كيلو دالتون فرعية السلائف الميتوكوندريا | س | |||
| P28838 | سايتوسول أمينوببتيداس | س | |||
| P29218 | إينوزيتول مونوفوسفهاتاز | س | |||
| P29401 | ناقلة الكيتول | س | |||
| P29692 | استطالة عامل 1 دلتا | <td> | س | ||
| P29966 | ميريستولاتد ألانين الغنية C كيناز الركيزة | س | |||
| P30040 | بروتين الشبكة إندوبلازميك ERp29 السلائف | س | |||
| P30041 | بيروكسيروكسين 6 | س | س | ||
| P30043 | فلافين ريدوكتاس | س | |||
| P30044 | بيروكسيروكسين 5 السلائف الميتوكوندريا | س | |||
| P30085 | أومب سمب كيناز | س | |||
| P30086 | فوسفاتيديلثانولامين بروتين ملزم 1 | س | |||
| P30101 | Protein ثاني كبريتيد إسوميراز A3 السلائف | س | س | س | |
| P30613 | بايروفات كيناز إيزوزيميس رل | س | |||
| P30740 | الكريات البيض إلاستاز المانع | س | |||
| P31025 | ليبوكالين 1 السلائف | س | |||
| P31937 | 3 هيدروكسيسوبوتيريت نازعة السلائف الميتوكوندريا | س | |||
| P31942 | ريبونوكلوبروتين النووي H3 غير المتجانسة | س | |||
| P31943 | البروتين النووي ريبونوكلي بروتين H غير المتجانسة H | س | |||
| P31946 | 14 3 3 بروتين بيتا ألفا | س | س | ||
| P31948 | الإجهاد الناجم عن فوسفوبروتين 1 | س | |||
| P31949 | بروتين S100 A11 | س | |||
| P32119 | بيروكسيروكسين 2 | س | س | ||
| P34931 | صدمة الحرارة 70 كيلو دالتون بروتين 1 مثل | س | س | ||
| P34932 | صدمة الحرارة 70 كيلو دالتون بروتين 4 | س | |||
| P35232 | Prohibitin | س | |||
| P35237 | سيربين B6 | س | |||
| P35443 | الثرومبوسبوندين 4 | س | </ tr> | ||
| P35555 | فبريلين 1 | س | س | ||
| P35579 | ميوسين 9 | س | س | س | |
| P35580 | ميوسين 10 | س | س | ||
| P35609 | ألفا أكتينين 2 | س | |||
| P35625 | مثبط ميتالوبروتيناز 3 | س | س | ||
| P35998 | 26S بروتياز التنظيمية الفرعية 7 | س | |||
| P36871 | فسفوغلوكوموتاس 1 | س | س | ||
| P36955 | ظهارة الصباغ المشتقة عامل | س | س | ||
| P37802 | <تد> ترانسجيلين 2س | س | |||
| P37837 | ناقلة الألدول | س | |||
| P38117 | الإلكترون نقل فلافوبروتين بيتا | س | |||
| P38646 | الإجهاد 70 بروتين الميتوكوندريا السلائف | س | س | ||
| P39687 | الحمضية ليوسين الغنية فوسفوبروتين النووي 32 عضو الأسرة A | س | |||
| P40121 | بلعم السد البروتين | س | |||
| P40925 | مالات نازعة سيتوبلازمية | س | |||
| P40926 | مالات نازعة الميتوكوندريا السلائف | <td> | س | ||
| P41219 | Peripherin | س | |||
| P42330 | ألدو كيتو ريدوكتاس الأسرة 1 عضو C3 | س | |||
| P45880 | الجهد تعتمد أنيون انتقائية قناة البروتين 2 | س | |||
| P47755 | F أكتين متوجا البروتينات ألفا 2 | س | س | ||
| P47756 | F أكتين السد البروتين بيتا فرعية | س | س | ||
| P47985 | أوبيكينول السيتوكروم ج ريدوكتاز الحديد الكبريت فرعية الميتوكوندريا السلائف | س | |||
| P48047 | أتب سينثاس س وحدة فرعية السلائف الميتوكوندريا | س | |||
| P48637 | الجلوتاثيون سينثيتاس | س | |||
| P48741 | صدمة الحرارة 70 كيلو دالتون بروتين 7 | س | س | ||
| P49189 | 4 تريمثيلامينوبوتيرالدهيد هيدروجيناز | س | |||
| P49368 | T البروتين المعقدة 1 غاما فرعية | س | |||
| P49747 | الغضاريف أوليغوميريك البروتين المصفوفة | س | س | س | س |
| P49748 | سلسلة طويلة جدا أسيل كوا نازعة سلائف الميتوكوندريا محددة | س | |||
| P50395 | راب الناتج المحلي الإجمالي التفكك بيتا المانع | س | س </ td> | ||
| P50454 | سيربين H1 السلائف | س | |||
| P50995 | أنيكسين A11 | س | |||
| P51452 | المزدوج خصوصية البروتين الفوسفاتيز 3 | س | |||
| P51884 | Lumican | س | س | س | س |
| P51888 | برولارجين السلائف | س | س | س | س |
| P52565 | رو الناتج المحلي الإجمالي التفكك المانع 1 | س | |||
| P52566 | رو الناتج المحلي الإجمالي التفكك المانع 2 | س | |||
| P54652 | صدمة الحرارة المتعلقة 70 كيلو دالتون بروتين 2 | س | س | س | س |
| P55072 | الانتقالية إندوبلاسميك الشبكة أتباس | س | |||
| P55083 | ميكروفبريل المرتبطة بروتين سكري 4 السلائف | س | س | ||
| P57053 | هيستون H2B نوع F | س | |||
| P60174 | تريوسيفوسفهات إيزوميراس | س | س | س | |
| P60660 | ميوسين ضوء ببتيد 6 | س | س | ||
| P60709 | أكتين السيتوبلازمية 1 | س | س | س | س |
| P60981 | Destrin | س | |||
| P61086 | أوبيكيتين كونجوغاتينغ إنزيم E2 25 كدا | س | |||
| P61088 | أوبيكيتين كونجوغاتينغ إنزيم E2 | س | |||
| P61224 | راس ذات الصلة بروتين الراب 1b السلائف | س | |||
| P61978 | ريبونوكلوبروتين النووي غير المتجانسة K | س | س | ||
| P61981 | 14 3 3 بروتين غاما | س | س | س | |
| P62258 | 14 3 3 بروتين إبسيلون 14 3 3E | س | |||
| P62491 | راس البروتين ذات الصلة | س | |||
| P62714 | سيرين ثريونين بروتين الفوسفاتيز 2A الحفزية إيسوفورم بيتا | س | |||
| P62736 | أكتين الأبهري العضلات الملساء | س | س | س | |
| P62805 | هيستون H4 | س | |||
| P62826 | غتب ملزمة البروتين النووي ران | س | |||
| P62873 | غوانين البروتين النوكليوتيدات ملزمة جيغسغت فرعية بيتا 1 | س | |||
| P62879 | غوانين البروتين النوكليوتيدات ملزمة جيغسغت فرعية بيتا 2 | س | |||
| P62937 | بيبتيديل بروليل رابطة الدول المستقلة عبر ايزوميراز A | س | س | ||
| P62987 | أوبيكيتين 60S ريبوسومال بروتين L40 | س | |||
| P63104 | 14 3 3 بروتيتا زيتا دلتا | س | س | س | س |
| P63241 | عامل بدء ترجمة يوكاريوتيك 5A 1 | س | |||
| P63244 | قوانين النيوكليوتيدات البروتين ملزمة بيتا بيتا 2 مثل 1 | س | |||
| P63267 | أكتين غاما المعوية العضلات الملساء | س | س | ||
| P67936 | تروبوميوسين ألفا 4 سلسلة | س | |||
| P68032 | أكتين ألفا عضلة القلب 1 | س | |||
| P68104 | عامل استطالة 1 ألفا 1 | س | س | س | |
| P68133 | أكتين ألفا، والهيكل العظمي، موسكل | ||||
| P68363 | سلسلة توبولين ألفا 1B | س | س | س | |
| P68371 | سلسلة توبولين بيتا 2C | س | س | س | |
| P68402 | الصفائح الدموية عامل تفعيل أسيتيلهيدرولاس يب بيتا فرعية | س | |||
| P68871 | الهيموغلوبين وحدة فرعية بيتا | س | س | س | |
| P69905 | الهيموجلوبين الفرعية ألفا | س | س | ||
| P78371 | T بروتين مجمع 1 بيتا فرعية | س | |||
| P78417 | الجلوتاثيون ترانسفيراس أوميجا 1 | س | س | ||
| P80748 | سلسلة إيغ لامدا السادسإي المنطقة لوا | س | |||
| P98095 | فيبولين 2 | س | س | ||
| Q01082 | سبيكترين بيتا سلسلة الدماغ 1 | س | |||
| Q01449 | ميوسين سلسلة ضوء التنظيمية 2 الإسوية الأذينية | س | |||
| Q01518 | أدينيليل سيكليس البروتين المرتبطة 1 | س | |||
| Q01995 | ترانسجيلين بروتين العضلات السلس 22 ألفا | س | |||
| Q03252 | لمين B2 | س | س | ||
| Q03591 | عامل التكملة H البروتين ذات الصلة 1 السلائف | س | Q04917 | 14 3 3 بروتين إتا | س | س |
| Q06323 | بروتيزوم المنشط معقدة فرعية 1 | س | |||
| Q06828 | Fibromodulin | س | س | س | س |
| Q06830 | بيروكسيروكسين 1 | س | س | ||
| Q07507 | Dermatopontin | س | س | س | س |
| Q07960 | رو غتباس تنشيط البروتين 1 | س | |||
| Q08257 | كينون أوكسيدوريدوكتاس | س | |||
| Q08431 | Lactadherin | س | س | ||
| Q12765 | Sإكرنين 1 | س | |||
| Q13011 | دلتا 3 5 دلتا 2 4 دينويل كوا إسوميراس السلائف الميتوكوندريا | س | س | ||
| Q13228 | السيلينيوم ملزمة البروتين 1 | س | س | ||
| Q13404 | أوبيكيتين مترافق انزيم E2 البديل 1 | س | |||
| Q13409 | السيتوبلازمية دينين 1 سلسلة وسيطة 2 | س | |||
| Q13509 | سلسلة توبولين بيتا 3 | س | س | س | |
| Q13642 | أربعة ونصف ليم المجالات البروتين 1 | س | |||
| Q13765 | ببتيد الوليد المرتبطة ألفا معقدة معقدة | س | |||
| Q13885 | N توبولين بيتا 2A سلسلة | س | س | ||
| Q14194 | ديهيدروبيريميديناز البروتين ذات الصلة 1 | س | |||
| Q14195 | ديهيدروبيريميديناز البروتين ذات الصلة 3 | س | س | س | س |
| Q14624 | إنتر ألفا التربسين مثبط سلسلة ثقيلة H4 السلائف | س | |||
| Q14697 | محايد ألفا غلوكوسيديس أب السلائف | س | |||
| Q14764 | بروتين القبو الرئيسي | س | |||
| Q14767 | عامل التحول تحويل الكامنة بيتا ملزمة البروتين 2 | س | <td>س | ||
| Q14894 | مو كريستالين هومولوج نادب تنظيم الغدة الدرقية هرمون البروتين ملزمة | س | |||
| Q15063 | بيريوستين السلائف | س | س | س | س |
| Q15084 | بروتين ثاني كبريتيد إسوميراز A6 السلائف | س | |||
| Q15113 | بروكولاجن C إندوببتيداز محسن 1 السلائف | س | |||
| Q15181 | بيروفوسفاتيز غير عضوي | س | |||
| Q15365 | بولي بروتين أرسي ملزم 1 | س | |||
| Q15366 | بولي بروتين أرسي ملزم 2 | س | |||
| Q15582 | تحويل عامل النمو بيتا يسببها البروتين | س | س | س | |
| Q15819 | أوبيكيتين مترافق انزيم E2 فاريانت 2 | س | |||
| Q16352 | ألفا إنتيرنيكسين | س | |||
| Q16473 | المفترضة تيناسين زا | س | |||
| Q16555 | ديهيدروبيريميديناز البروتين ذات الصلة 2 | س | س | س | |
| Q16698 | 2 4 دينويل كوا ريدوكتاس السلائف الميتوكوندريا | س | |||
| Q16891 | الغشاء الداخلي الميتوكوندريا | س | |||
| Q562R1 | بيتا أكتين مثل البروتين 2 | س | |||
| Q6S8J3 | بوت أنكيرين عضو أسرة النطاق E | س | |||
| Q6UWY5 | أولفاكتوميدين مثل البروتين 1 السلائف | س | س | ||
| Q71U36 | سلسلة توبولين ألفا 1A | س | س | س | |
| Q7Z7G0 | الهدف من نيش SH3 السلائف | س | س | س | |
| Q8WUM4 | الموت الخلية المبرمجة 6 التفاعل البروتين | س | |||
| Q8WWX9 | ثيوريدوكسين مثل سلينوبروتين M السلائف | س | |||
| Q92597 | بروتين NDRG1 | س | |||
| Q92945 بعيدا عنصر المنبع البروتين ملزمة 2 | س | ||||
| Q96CN7 | إيزوكوريسماتاس المجال يحتوي على البروتين 1 | س | |||
| Q96CX2 | بتب بوز مجال يحتوي على البروتين | س | |||
| Q96KK5 | هيستون H2A نوع 1 H | س | س | ||
| Q96KP4 | ديبتبيداز نونتوبيسيفيك غير محددة | س | |||
| Q99426 | توبولين محددة تشابيرون ب | س | |||
| Q99497 | بروتين دج 1 | س | س | ||
| Q99536 | سينابتيك حويصلة بروتين غشاء | س | س | س | |
| Q99714 | 3 هيدروكسياسيل لجنة الزراعة نوع نازعة 2 | س | |||
| Q99715 | سلسلة الكولاجين ألفا 1 زي | س | س | ||
| Q99798 | أكونيتات هيدراتاس السلائف الميتوكوندريا | س | |||
| Q9BQE3 | سلسلة توبولين ألفا 6 | س | |||
| Q9BUF5 | سلسلة توبولين بيتا 6 | س | س | ||
| Q9BUT1 | 3 هيدروكسي بوتيرات نازعة نوع 2 | س | |||
| Q9BVA1 | سلسلة توبولين بيتا 2B | س | س | س | |
| Q9BXN1 | Asporin | س | س </ td> | س | س |
| Q9H0W9 | إستر هدرولاس C11orf54 | س | |||
| Q9H4B7 | سلسلة توبولين بيتا 1 | س | |||
| Q9NRN5 | أولفاكتوميدين مثل البروتين 3 السلائف | س | س | ||
| Q9NRV9 | الهيم البروتين ملزمة 1 | س | |||
| Q9NSB2 | الكيراتين من النوع الثاني Hb4 | س | س | ||
| Q9NVA2 | 11 سبتمبر | س | |||
| Q9UBR2 | كاثبسين Z السلائف | س | |||
| Q9UBX5 | فيبولين 5 | س | س | ||
| Q9UK22 | F مربع فقط البروتين 2 | س | |||
| Q9Y277 | الجهد تعتمد أنيون انتقائية قناة البروتين 3 | س | |||
| Q9Y281 | كوفيلين 2 | س | |||
| Q9Y490 | تالين 1 | س | |||
| Q9Y696 | كلوريد البروتين قناة داخل الخلية 4 | س | |||
| Q9Y6C2 | إميلين 1 | س | س |
الجدول 1: قائمة من البروتينات التي تم تحديدها في استخراج الأنسجة صمام الصمام التاجي عندما تم تطبيق أربعة نهج البروتين المختلفة: الكهربائي ثنائي الأبعاد (2-DE)، ثنائي الأبعاد لك-مس E (2D-لك / مس E )، لك / مس E ، و إيف المرحلة السائلة. تم الإبلاغ عن الطريقة التي تم تحديد كل البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوة واحدة حاسمة من هذا البروتوكول هو استخدام النيتروجين السائل لتجميد العينة والبرد نظام طاحونة. إن استخدام النيتروجين السائل يمنع التدهور البيولوجي ويسمح بالمسحوق الفعال، ولكنه يتطلب تدريبا خاصا للتعامل الآمن.
في هذا البروتوكول يتميز نظام طاحونة لعينة طحن لأن عينات صغيرة من الصعب استرداد من هاون القياسية والمدقات. في هذه الحالة، عينات صغيرة تنتشر على شكل مسحوق ناعم على سطح الهاون، مما يجعل جمع الصعب. ميزة أخرى هي أن طاحونة هو بمحركات، والذي يسمح لعدد أكبر من العينات ليتم معالجتها بطريقة استنساخه ودون إضافة التعب. أحد القيود على استخدام طاحونة هو أن حجم العينة التي يجب أن تكون صغيرة (100 ملغ أو أقل) للمدقة للضغط بشكل فعال ضد الهاون. وعلاوة على ذلك، يجب أن تكون حرارة المكونات طاحونة لدرجة حرارة الغرفة بين الاستخدامات ل كليانين ز. وبالتالي، فإن الإجراء يستغرق وقتا طويلا، وإذا تم معالجة العديد من العينات يوميا، وهناك حاجة إلى مجموعات كثيرة.
خطوة حاسمة إضافية هي إعداد العازلة استخراج. تركيزات الملح، وخاصة بالنسبة اليوريا (8 م) وثيوريا (2 م)، مرتفعة جدا. وبالتالي، فإن حجم الملح هو ما يقرب من نصف الحجم الكلي للحل. وعلاوة على ذلك، فإن حل ليس من السهل النظر في أن الحرارة يجب تجنبها لأنه في أكثر من 37 درجة مئوية، اليوريا يمكن أن يؤدي إلى كارباميلاتيون البروتين في N تيرميني من البروتينات / الببتيدات وعلى المجموعات الجانبية سلسلة الأمين من ليسين وبقايا أرجينين 17 . مرة واحدة حلها، يجب أن يتم تصفية العازلة اليوريا مع مرشحات 0.22 ميكرون ويمكن تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع دون التأثير على فعالية استخلاصها، ولكن يجب أن تكون درجة حرارة إلى أكثر من 15 درجة مئوية قبل الاستخدام للسماح للحل الكامل .
التعديلات وتحري الخلل وإصلاحه
إنت "> في هذا البروتوكول، يتم تنفيذ استخراج البروتين باستخدام العازلة اليوريا وصفها لأنها واحدة من الأكثر شيوعا حلول استخراج البروتين للدراسات البروتين بسبب توافقه مع إسويلتروفوكوسينغ وكفاءتها في سولوبيليزينغ البروتينات القابلة للذوبان على نحو متقطع 18. وقد تم أثبتت أن هذا المخزن المؤقت يمكن أن يذوب بكفاءة جدا البروتينات القابلة للذوبان، مثل البروتينات غشاء لا يتجزأ 19 ، أو البروتينات التي هي عرضة للغاية للتجميع، مثل توبولين 18. وعلاوة على ذلك، هذا المخزن المؤقت متوافق تماما مع فحص برادفورد لتحديد تركيز البروتين، و ويمكن استخدامه مباشرة في 2-دي والتحليل السائل المرحلة إيف.ومع ذلك، هذه المخزن المؤقت ليست مثالية لذوبان جميع البروتينات الموجودة في العينة. فمن الممكن أن المخازن استخراج مختلفة يمكن أن تكشف عن البروتينات لا يمكن الكشف عنها بواسطة هذا البروتوكول. على سبيل المثال، هو جيداون أن البروتينات الريبوزية والبروتينات النووية يمكن استخراجها بشكل أفضل مع استخراج حمض أو حمض ثلاثي كلورواسيتيك / الأسيتون هطول الأمطار 20 ، في حين أن مستويات درجة الحموضة القلوية هي أكثر ملاءمة للبروتينات الغشاء 21،22. ولذلك، فإن استخدام مخازن بديلة قد تتطلب خطوات إضافية لهطول البروتين للقضاء على الأملاح التي تتداخل مع 2-دي أو إيف المرحلة السائلة.
قيود التقنية
عدد البروتينات التي تم تحديدها من قبل هذا البروتوكول منخفضة نسبيا، ولكن عدد من هويات وتغطية تحليل البروتين يمكن زيادة زيادة من خلال استخدام الأدوات أكثر حداثة، والتي زادت دقة الشامل وسرعة التسلسل بشكل كبير في السنوات القليلة الماضية 23. فمن الممكن لتغطية جزء كبير من بروتيوم، دون أي خطوات تحريف، من خلال توظيف التدرج الطويل للالسائل تشوفصل الروماتوغرافيا إلى جانب أداة مس عالية الدقة التي لديها سرعة تسلسل سريع 24 .
أهمية هذه التقنية فيما يتعلق بالطرق القائمة / البديلة
القدرة على تحديد وكمية البروتينات في صمامات القلب البشرية، مثل صمام التاجي، مهمة مهمة وصعبة من شأنها أن تساعد على توضيح آليات العمليات الفسيولوجية / المرضية في أمراض الصمام. تحديد التغيرات في صمام الصمام التاجي بروتيوم سيزيد كثيرا من فهم طبيعة العمليات البيولوجية التي ترتبط مع حالة المرض من الأنسجة.
المعرفة الحالية على فيسيوباثولوغي من الصمام التاجي محدودة ويتم الحصول عليها عموما من خلال تحليل البروتينات الفردية المشاركة في عمليات محددة، مثل إعادة عرض المصفوفة خارج الخلية، الارقاء، والتهاب، أو الاكسدة 25 9 ، 10 .
عدم وجود دراسات البروتين الشامل يمكن أن يعزى إلى تعقيد هذه الأنسجة منخفضة الخلوية التي هي غنية جدا في البروتينات المصفوفة خارج الخلية ( أي بروتيوغليكان، الكولاجين، والإيلاستين). تشكل هذه البروتينات حوالي 80٪ من المبلغ الإجمالي، مما يعيق تحليل البروتينات منخفضة وفرة 26 .
وهكذا، كان من الضروري إنشاء بروتوكول استخراج كفاءة لتحقيق أقصى قدر من الانحلال البروتين من أجل وصف بروتيوم من هذا النسيج. يسمح هذا البروتوكول لاستخراج ~ 50 ميكروغرام من البروتين من 1 ملغ من الأنسجة. هذا هو العائد المنخفض نسبيا بالمقارنة مع الأنسجة "لينة"، مثلكما الكبد (~ 135 ميكروغرام من 1 ملغ من الأنسجة)، ولكن يكفي لإجراء تحليل البروتين على عينات الفردية. ويكتسي ذلك أهمية خاصة عند تحديد التباين داخل الفرد للظاهرة.
وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة لديها ميزة كونها متوافقة مع العديد من التطبيقات التحليلية. بروتين صمام التاجي الذائبة في المخزن المؤقت استخراج يمكن استخدامها مباشرة ل إمونوبلوتينغ وتحليل البروتين على أساس الكهربائي ثنائي الأبعاد ورحلة السائل إسولكتروريسيس 11 ، 12 أو بعد هطول الأمطار البروتين للقضاء على التدخل عنصر العازلة، لفحوصات أخرى، مثل هلام خالية من الطيف الكتلي 15 .
مع تطبيق هذا البروتوكول استخراج، توصيف أكثر شمولا من مكونات البروتين من الأنسجة صمام الصمام التاجي العادي تم الحصول عليها من خلال تحديد العديد من إنتراسيلبروتينات. وتترجم هذه البروتينات في السيتوسول أو في العضيات، وليس فقط في المصفوفة خارج الخلية، ولها وظائف الجزيئية والبيولوجية المختلفة. كما تم تحديد بروتينات أخرى مثيرة للاهتمام ( أي كرياب ، سيبتين -11، فل-1، و ديرماتوبونتين). هذه البروتينات لها وظائف غير معروفة في الصمام التاجي، ولكن خصائصها البيولوجية تشير إلى دور محتمل في أمراض الصمامات.
التطبيقات أو الاتجاهات المستقبلية بعد اتقان هذه التقنية
مع هذا البروتوكول، فمن الممكن لربط البيانات المتعلقة التعبير البروتين مع البيانات عن التعبير مرنا الكمي والتحليلات المناعية غير الكمي. في الواقع، عندما تستخدم معا، وهذه النهج تؤدي إلى فهم أكثر شمولا للآليات الجزيئية الكامنة وراء المرض، من مرنا إلى ما بعد متعدية تعديل البروتين. وهكذا، فإن هذه الطريقة يمكن أن تكون ذات فائدة للباحثين تركز على القلب فيسيوباثولوغي صمام. زعنفةالحليف، ويمكن أيضا أن يطبق هذا البروتوكول إلى صمام الخنازير الخنازير، الذي يحمل تشابه وثيق لصمام الإنسان 27 ويستخدم نموذج تجريبي لتقييم وظيفة صمام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقد دعمت وزارة الصحة الإيطالية هذه الدراسة (أرسي 2013-بيو 15). نشكر باربرا ميشيلي لمساعدتها التقنية الممتازة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
