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Biochemistry

从人体二尖瓣提取蛋白质的优化方案

Published: June 14, 2017 doi: 10.3791/55762
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1, 2,3,4
1Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 2Cardiovascular Tissue Bank of Milan, Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 3Department of Clinical Sciences and Community Health, Cardiovascular Section, University of Milan, 4Department of Cardiovascular Disease, Development and Innovation Cardiac Surgery Unit, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

Summary

人二尖瓣的蛋白质组成仍然是部分未知的，因为其分析由于细胞数量低，因此通过低蛋白质生物合成而复杂化。这项工作提供了有效提取蛋白质用于二尖瓣蛋白质组分析的方案。

Abstract

细胞蛋白质组学的分析可以帮助阐明基于疾病的分子机制，这是由于技术的发展，允许大规模鉴定和定量复制生物系统中存在的蛋白质。从蛋白质组学方法获得的知识有可能导致更好地了解基础疾病的致病机制，允许鉴定新的诊断和预后疾病标志物，以及希望的治疗靶点。然而，心脏二尖瓣代表蛋白质组学分析的非常具有挑战性的样品，因为蛋白多糖和富含胶原蛋白的细胞外基质的细胞数量较少。这使得挑选提取蛋白质进行全球蛋白质组学分析。该工作描述了与随后的蛋白质分析相容的方案，如定量蛋白质组学和免疫印迹。这可以允许数据关联的相关性g蛋白表达与定量mRNA表达和非定量免疫组化分析数据。实际上，这些方法在一起执行时，可以更全面地了解基因疾病的基因分子机制，从mRNA到翻译后蛋白质的修饰。因此，这种方法可以与对心脏瓣膜病理学研究感兴趣的研究者有关。

Introduction

最近的证据改变了对mRNA合成后发生的许多调节机制的作用的理解。实际上，翻译，转录后和蛋白水解过程可以调节蛋白丰度和功能。假设转录本水平是蛋白质丰度的主要决定因素，mRNA的浓度代表相应蛋白质的代谢 - 已被部分修订。目前，转录本水平仅部分预测蛋白质丰度，这表明转录后事件发生调节细胞内的蛋白质1,2 。

此外，蛋白质最终决定细胞的功能，因此决定其表型，其可以经受自分泌，旁分泌和内分泌因子的响应的动态变化;血液介体;温度;药物治疗和疾病发展换货。因此，以蛋白质水平为重点的表达分析有助于表征蛋白质组，并且揭示其作为疾病发病机理的一部分发生的关键变化3 。

因此，尽管现有的技术挑战，蛋白质组学所提出的澄清健康和疾病状况的机会也是艰巨的。蛋白质组学可以贡献的特别有希望的研究领域包括：在任何水平（ 即全细胞或组织，亚细胞区室和生物液体）上鉴定改变的蛋白质表达;用于疾病诊断和预后的新型生物标志物的鉴定，验证和验证;并希望能够鉴定可用于治疗目的的新蛋白质靶标，以及药物功效和毒性的评估。

捕捉复杂性蛋白质组是技术挑战。目前的蛋白质组学工具提供了进行大规模，高通量分析来鉴定，定量和验证改变的蛋白质水平的机会。此外，引入分馏和富集技术，旨在避免由最丰富的蛋白质引起的干扰，还通过包括最少丰富的蛋白质来改善蛋白质鉴定。最后，蛋白质组学被补充了翻译后修饰的分析，其逐渐成为蛋白质功能的重要调节剂。

然而，分析中的生物标本中的样品制备和蛋白质回收仍然是蛋白质组学工作流程中的限制步骤，并增加可能陷阱的潜力5 。事实上，在大多数必须优化的分子生物学技术中，第一步是组织匀浆离子和细胞裂解，特别是在不存在扩增方法的低丰度蛋白质的分析过程中。此外，蛋白质的化学性质可以影响其自身的恢复。例如，高疏水性蛋白质的分析是非常具有挑战性的，因为它们在等电聚焦过程中容易沉淀，而跨膜蛋白几乎不溶（参见参考文献5）。此外，组织组成变异性为开发通用提取方法创造了显着的障碍。最后，由于几乎所有临床标本的数量都是有限的，所以必须以最小的样品量使蛋白质制备具有最大的恢复和重现性。

这项工作描述了从正常人心脏二尖瓣进行蛋白质提取的优化方案，这代表了蛋白质组学分析的非常具有挑战性的样品。正常二尖瓣是一种lex结构位于左心房和心脏左心室之间（ 图1 ）。它在控制从心房到脑室的血液流量方面起着重要的作用，防止回流，并确保适当的氧气供应给全身，从而保持足够的心输出量。然而，它通常被认为是一种“无活性”组织，细胞率低，组成少，主要是细胞外基质。这是因为在正常情况下，驻留的瓣膜间质细胞（VIC）具有低蛋白质生物合成速率7的静止表型。

然而，已经证明，在病理状态下，海绵体中的VIC的数量增加并且其蛋白质合成被激活，以及其他功能和表型变化8 。因此，最少的数据可用并不奇怪文献集中于病理性二尖瓣9,10的分析，其中活化的VIC的增加的数量可能解释相对较高数量的鉴定的蛋白质。

总之，本议定书可能通过研究二尖瓣蛋白组分来发展对负责二尖瓣疾病的致病机制的理解。事实上，更深入地了解潜在的病理过程可能有助于改善瓣膜疾病的临床管理，其目前的干预指标主要取决于血液动力学考虑因素。

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Protocol

在该方案中，尽管正常的超声心动图参数，在多器官移植（冷缺血时间4-12小时，平均6±2小时）内，从器官移植排除器官移植的技术或功能原因收集人心脏。他们被送到米兰的心血管组织银行Monzino心脏中心（意大利米兰），为主动脉瓣和肺动脉瓣的银行服务。二尖瓣后叶不用于临床目的，因此在从供体亲属获得知情同意后，在主动脉瓣和肺动脉瓣隔离期间收集二尖瓣后叶。移植和研究的组织仅在家长同意后收集;在同意书上，只有在不适合人类临床使用（ 即微生物，功能和血清学问题）的情况下，他们授权（或不）使用心脏组织进行研究，遵循伦理委员会的指导方针蒙齐诺心脏中心。

二尖瓣制备

  1. 器官移植后尽早收集人体二尖瓣（冷缺血时间4-12 h）。
  2. 在洁净室内，从含有冷（4℃）溶液（ 即盐水溶液或平衡介质Eurocollins或威斯康星州）的运输袋中取出心脏。将其放入桶中并放置在生物安全柜（生物危害垂直空气流，A级，良好生产规范（GMP）分类）中，以进行阀门准备。
  3. 将心脏放在柜内的无菌一次性悬垂物上。使用无菌的一次性手术刀，在距离顶点约4厘米处的左心室和右心室的水平上将心脏完全切开，与其主轴垂直。
  4. 移动升主动脉和肺动脉显示左心房顶。
  5. 用无菌高压灭菌镊子和捡拾，切割左耳廓上的左心房顶部，使二尖瓣可见，并允许确定大二尖瓣（前）和小二尖瓣（后）。
    注意：前外侧和后内侧合缝定义前叶和后区的边界。
  6. 使用无菌高压灭菌剪刀和非创伤镊子，解剖左心房和围绕整个二尖瓣周围的心室壁厚度。
  7. 确定主动脉瓣主动脉瓣连续性。
    注意：左心室包含整个二尖瓣和和弦。
  8. 将二尖瓣二尖瓣分离自二尖瓣后叶小叶，沿着插入与心室切开后叶（连合）。
  9. 在盐水溶液中洗后叶。将小叶切成小块（<1厘米2 ），并单独包裹在铝箔上。用液氮快速冻结。
    注意：使用液氮时应遵循组织安全程序。
    1. 在程序结束时，用70％异丙醇溶液和6％过氧化氢溶液对柜子进行消毒。

蛋白质提取

  1. 使用镊子拿起储存在液氮中的样品，并立即将其放在干冰上，同时仍然包裹在铝箔中。在转运期间不要让样品解冻。
  2. 在研磨之前，将研磨机系统（ 例如， CryoGrinder）的瓷/锆砂浆和样品与样品一起放入含有液氮（〜500 mL）的杜瓦瓶中。
    注意：使用液氮时应遵循组织安全程序。
  3. 将砂浆和杵放在含干冰的聚苯乙烯箱中。从铝箔上取出样品并放入砂浆中。
  4. 研磨他用大杵取样15-15次，用螺丝刀旋转杵。在研磨过程中将样品与预先冷却的铲刀的尖端混合。
    1. 用小杵重复。
  5. 将研磨的样品转移到先前称重的管（ 例如 15mL离心管）上，通过倒置管，将其放置在研钵上，并将它们反转到一起以将样品移动到管中。使用预冷的铲子从砂浆中回收所有材料。
    1. 将样品保持在干冰上，以避免样品在转移过程中解冻。
  6. 计算样品的净重。
  7. 在每个样品后清洁砂浆和杵，并通过高压灭菌或在200℃加热2小时对其进行去污。
  8. 通过反转将粉末样品从离心管转移到均化器的玻璃管中。
  9. 加入过滤的尿素缓冲液将r（8M尿素，2M硫脲，4％w / v CHAPS，20mM Tris和55mM二硫苏糖醇）加入到玻璃管中，每10mg粉状组织200μL尿素缓冲液。
    注意：离心管中残留的粉末样品可以使用部分计算的尿素缓冲液体积进行回收。
  10. 使用装有硼硅酸盐玻璃研钵和聚四氟乙烯（PTFE）杵的搅拌器均匀化样品。用搓动（1500转/分钟）将杵慢慢按压到样品上10次。
  11. 回收上清液并将其转移到干净的1.7 mL离心管中。再次用新鲜的尿素缓冲液提取剩余的样品，加入第一次提取过程中使用的体积的一半。
  12. 重复步骤2.10。
  13. 回收上清液并将其与步骤2.11的上清液组合。将合并的上清液放在管旋转器上30分钟。
  14. 在13,000 xg和4℃下离心管30分钟。
  15. 恢复上清液d根据制造商的说明书使用Bradford蛋白测定法测量蛋白质浓度。将样品储存在-80°C直到使用。

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Representative Results

蛋白质在尿素缓冲液中的提取和溶解与基于等电聚焦（二维电泳（2-DE） 11和液相等电聚焦（IEF） 12 ）的蛋白质组学方法直接相容，并且在Laemmli缓冲液13中稀释后进行免疫印迹含有蛋白酶抑制剂混合物14 。

对于基于无凝胶质谱法（ 即与数据无关质谱分析（LC / MS E ）和二维LC / MS E （2D-LC / MS E ））相结合的液相色谱法15 ，样品提取在所述的尿素缓冲液中需要进一步处理以除去尿素和硫脲，这可能干扰随后的蛋白质消化和液相色谱分离。氏可以使用商业蛋白质沉淀试剂盒，按照制造商的说明来沉淀蛋白质来完成脱盐步骤。然后将样品溶解在含有0.1％可切割洗涤剂的25mM NH 4 HCO 3中用于蛋白质消化16 。蛋白质的沉淀可以消除缓冲液组分，最小限度影响蛋白质含量（蛋白质回收率> 85％），从而使样品适用于各种分析。

该方案在人二尖瓣的蛋白质提取中的应用允许鉴定总共422个蛋白质，结合先前详细描述的四种不同的蛋白质组学方法11,15。具体来说，通过2-DE鉴定了169个蛋白质，通过液相IEF鉴定了330个蛋白质，通过LC / MS E鉴定了96个蛋白质，以及148个蛋白质通过2D-LC / MS E （表1）。

为了根据亚细胞定位对422种鉴定的蛋白进行分类，使用软件进行基因本体（GO）分析（ 例如， Cytoscape）。使用软件及其相应的插件创建的网络显示，除了局限在细胞外区域的预期蛋白质（参见图2的右上部分）外，蛋白质组学方法鉴定的蛋白质大部分来自细胞内区域（ 即细胞质，细胞器，囊泡和细胞骨架）。还鉴定了细胞表面蛋白（ 图2 ）。

在三个独立的二尖瓣样本中进一步证实结果。使用免疫印迹法分析一组四种蛋白质（ 即 septin-11，四个和半个LIM结构域蛋白1（FHL-1），dermatopontin和α-晶状体蛋白B（CryAB）），这在二尖瓣正常（ 图3 ）中从未被发现。

图1
图1：二尖瓣结构。人的心脏的顶视图显示闭合（ A ）或开放（ B ）人体二尖瓣。人心脏左心室前视图（ C ）。 请点击此处查看此图的较大版本。

图2
图2：在细胞分布方面鉴定的二尖瓣蛋白质的分析。 Cytoscape和插件BiNGO被用来看待n来自细胞组分类别的基因本体（GO）术语的分布。圆尺寸与所选GO项相关联的蛋白质成分的数量成比例，并且报告了超值表示的p值的颜色标度。 请点击此处查看此图的较大版本。

图3
图3：来自三个人正常二尖瓣小叶的全部提取物中septin-11，FHL-1，皮肤素和CryAB的免疫印迹分析。使用针对CryAB的小鼠单克隆抗体和针对septin-11，FHL-1和皮肤接头抗体的兔多克隆抗体进行免疫印迹。 请点击这里查看此图的较大版本。

<TD> X <TD> <蛋白酶体亚型β4型前体 <TD> </ TR> <td> Transgelin 2 <TD> <TR> <TD>
加入 描述 2-DE 2D-LC LC-MS E 液相IEF
A6NMZ7 胶原alpha VI X
O00151 PDZ和LIM结构域蛋白1 X
O00299 氯化物细胞内通道蛋白1 X
O00764 吡哆醛激酶 X
O14558 热休克蛋白β6 X
O43399 肿瘤蛋白D54 X
O43488 黄曲霉毒素B1醛还原酶成员2 X
O43707 阿尔法肌动蛋白4 X X
O43866 CD5抗原如前体 X
O60493 排序nexin 3 X
O60701 UDP葡萄糖6脱氢酶 X
O75223 未鉴定蛋白 X
O75368 SH3结构域结合谷氨酸富含蛋白质 X
O75390 柠檬酸合酶线粒体前体 X
O75489 NADH脱氢酶泛醌铁硫蛋白3线粒体前体 X X
O75608 酰基蛋白硫酯酶1 X
O75828 羰基还原酶NADPH 3 X
O75874 异柠檬酸脱氢酶NADP细胞质 X
O75955 阀蛋白 X
O94760 NG NG二甲基精氨酸二甲氨基水解酶1 X
O94788 视网膜脱氢酶2 X
O95865 NG NG二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶2 X X
P00325 酒精脱氢酶1B X X
P00338 L乳酸脱氢酶A链 X
P00352 视网膜脱氢酶1 X
P00441 超氧化物歧化酶Cu Zn X X
P00450 血浆铜蓝蛋白前体 X X
P00488 凝血因子XIII A链前体 X
P00491 嘌呤核苷磷酸化酶 X
P00492 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 X
P00558 磷酸甘油酸激酶1 X X
P00568 腺苷酸激酶同工酶1 X
P00734 凝血酶原 X X
P00738 结合珠蛋白 X X X X
P00739 类胡萝卜素相关蛋白前体 X
P00751 补充因子B X X X
P00915 碳酸酐酶1 X
P00918 碳酸酐酶2 X
P01008 抗凝血酶III前体 X X X
P01009 Alpha 1抗胰蛋白酶 X X X X
P01011 阿尔法1抗胰凝乳蛋白酶 X X X X
P01019 血管紧张素原前体 X X
P01023 阿尔法2巨球蛋白 X X
P01024 补体C3 X X X X
P01033 金属蛋白酶抑制剂1前体 X
P01042 激肽原1前体 X
P01593 Igκ链VI区AG X
P01598 Ig卡巴链VI区欧盟 X
P01600 Ig卡巴链VI区Hau X X
P01611 Ig卡巴链VI区Wes X
P01620 Ig卡巴链V III区SIE X
P01625 Ig卡巴链V IV区域Len X
P01766 Ig重链V III区BRO X X
P01781 Ig重链V III区GAL X
P01834 Igκ链C区 X X X X
P01842 Igλ链C区 X X X
P01857 Igγ1链C区 X X X X
P01859 Igγ2链C区 X X X X
P01860 Igγ3链C区 X X X
P01861 Igγ4链C区 X X X
P01871 Ig链C区 X X X
P01876 Igα1链C区 X X X X
P01877 Igα2链C区 X
P02144 肌红蛋白 X X
P02452 胶原α1 I链 X X X X
P02511 α晶状体B链 X
P02545 层压AC 70kDa层压板 X X X X
P02647 载脂蛋白AI X X X X
P02649 载脂蛋白 X X X X
P02671 纤维蛋白原α链 X X X X
P02675 纤维蛋白原β链 X X X X
P02679 纤维蛋白原γ链 X X X X
P02689 髓磷脂P2蛋白 X
P02735 血清淀粉样蛋白A蛋白前体 X
P02741 C反应蛋白前体 X
P02743 血清淀粉样蛋白P成分 X X X X
P02746 补体C1q亚组分B X X
P02747 补体C1q亚组分C前体 X
P02748 补充成分C9 X X X
P02749 β2糖蛋白1 X X X X
P02750 富含亮氨酸的α2糖蛋白前体 X
P02751 纤维连接蛋白 X X
P02760 AMBP蛋白前体 X X X X
P02763 α1酸性糖蛋白1 X X X
P02765 Alpha 2 HS糖蛋白前体 X
P02766 曲氨酸蛋白前体 X X X
P02768 血清白蛋白 X X X X
P02774 维生素D结合蛋白前体 X
P02787 Serotransferrin X X X X
P02788 乳酸转铁蛋白前体 X
P02790 血液结合 X X X X
P02792 铁蛋白轻链 X
P04004 玻 X X X X
P04075 果糖二磷酸醛缩酶A X
P04083 膜联蛋白A1 X X X X
P04179 超氧化物歧化酶Mn线粒体前体 X
P04196 组氨酸丰富的糖蛋白前体 X
P04217 Alpha 1B糖蛋白前体 X X
P04350 微管蛋白β4链 X
P04406 甘油醛3磷酸脱氢酶 X X X X
P04792 热休克蛋白β1 X X X X
P05091 醛脱氢酶线粒体前体 X X
血浆蛋白酶C1抑制剂前体 X
P05156 补体因子I前体 X
P05413 脂肪酸结合蛋白心脏 X
P05452 叶绿素前体TN X X
P05787 角蛋白II型细胞骨架8 X
P06396 凝 X X X X
P06576 ATP合酶亚基β线粒体前体 X X
P06732 肌酸激酶M型 X X
P06733 Alpha烯醇化酶 X X X X
P06753 原肌球蛋白α3链 X X
P07108 酰基辅酶A结合蛋白 X
P07195 L乳酸脱氢酶B链 X X X
P07196 神经丝光多肽 X
P07197 神经纤维培养基多肽 X X
P07237 蛋白二硫键异构酶前体 X X
P07339 组织蛋白酶D前体 X X
P07355 膜联蛋白A2 X X X X
P07360 补充组分C8γ链前体 X
P07437 微管蛋白β链 X X X X
P07585 核心蛋白聚糖 X X X X
P07737 Profilin 1 X
P07858 组织蛋白酶B前体 X
P07900 热休克蛋白HSP90α X X
P07951 原肌球蛋白β链 X
P07954 富马酸水合酶线粒体前体 X
P07996 血小板反应蛋白1 X X X
P08107 热休克70 kDa蛋白1A 1B X X X X
P08123 胶原α2I链 X X X X
P08133 膜联蛋白A6 X X
P08238 热休克蛋白HSP 90 beta X X
P08253 72 kDa IV型胶原酶前体 X
P08294 细胞外超氧化物歧化酶Cu Znursor X X X
P08590 肌球蛋白轻多肽3 X X
P08603 补码因子H X X X X
P08670 波形蛋白 X X X X
P08729 角蛋白II型细胞骨架7 X
P08758 膜联蛋白A5 X X X X
P09211 谷胱甘肽转移酶 X X X
P09382 半乳凝素1 X X X
P09417 二氢蝶啶还原酶 X
P09493 原肌球蛋白1α链 X X
P09525 膜联蛋白A4 X X
P09651 异质核核糖核蛋白A1 X
P09871 补体C1s亚成分前体 X
P09936 泛素羧基末端水解酶同工酶L1 X
P09972 果糖二磷酸醛缩酶C X
P0C0L4 补体C4A前体 X
P0CG05 免疫球蛋白λ2链C区 X
P0CG38 POTE ankyrin域家族成员I X
P10515 丙酮酸脱氢酶复合物的二氢硫辛酰赖氨酸残基乙酰转移酶组分 X
P10768 甲酰谷胱甘肽水解酶 X
P10809 60 kDa热休克蛋白线粒体前体 X
P10909 丛生 X X X X
P10915 透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1前体 X X
P11021 78 kDa g透明调节蛋白 X X X
P11047 层粘连蛋白亚基γ1前体 X
P11142 热休克同源71 kDa蛋白 X X X X
P11177 丙酮酸脱氢酶E1组分亚单位β线粒体前体 X
P11217 糖原磷酸化酶肌肉形态 X
P11310 中链特异性酰基辅酶A脱氢酶线粒体前体 X
P11413 葡萄糖6磷酸酯1脱氢酶 X
P11766 酒精脱氢酶3级链 X
P12036 神经丝重多肽 X
P12109 胶原alpha 1 VI链 X X X X
P12110 胶原alpha 2 VI链 X X X X
P12111 胶原alpha 3 VI链 X X X
P12277 肌酸激酶B型 X
P12429 膜联蛋白A3 X X
P12814 阿尔法肌动蛋白1 X X
P12829 肌球蛋白轻多肽4 X
P12882 肌球蛋白1 X
P12883 肌球蛋白7 X X
P12955 Xaa Pro二肽酶 X
P13489 核糖核酸酶抑制剂 X
P13533 肌球蛋白6 X X
P13611 Versican核心蛋白前体 X X
P13639 伸长因子2 X
P13716 三角洲氨基乙酰丙酸脱水酶 X
P13796 Plastin 2 X
P13804 电子转移黄素蛋白亚基α线粒体前体 X
P13929 β-烯醇化酶 X X
P14136 胶质纤维酸性蛋白星形胶质细胞 X
P14314 葡萄糖苷酶2亚基β前体 X
P14550 酒精脱氢酶NADP X
P14618 丙酮酸激酶同功酶M1 M2 X X X
P14625 </ TD> 内啡肽前体 X X
P15121 醛糖还原酶 X
P15259 磷酸甘油酸变位酶2 X
P16152 羰基还原酶NADPH 1 X
P17066 热休克70 kDa蛋白6 X X X
P17174 天冬氨酸氨基转移酶细胞质 X
P17540 肌酸激酶肌节线粒体前体 X
P17661 结蛋白 X X X X
P17980 26S蛋白酶调节亚基6A X
P17987 T复合蛋白1亚基α X
P18206 纽蛋白 X X
P18428 脂多糖结合蛋白前体 X
P18669 磷酸甘油酸变位酶1 X
P19105 肌球蛋白调节轻链2 X X
P19623 亚精胺合酶 X
P19652 α1酸性糖蛋白2前体 X X
P19823 α型胰蛋白酶抑制剂重链H2 X
P19827 α型胰蛋白酶抑制剂重链H1 X X
P20073 膜联蛋白A7 X
P20618 蛋白酶体亚型β1型前体 X
P20774 Mimecan X X X X
P21266 谷胱甘肽S转移酶3 X
P21333 菲拉明A X X
P21796 电压依赖性阴离子选择通道蛋白1 X
P21810 二聚糖 X X X X
P21980 蛋白谷氨酰胺γ谷氨酰转移酶2 X X
P22105 Tenascin X X X
P22314 泛素活化酶E1 X
P22352 谷胱甘肽过氧化物酶3前体 X X
P22626 异质核核糖核蛋白A2 B1 X
P22695 Ubiquinol细胞色素c还原酶复合核心蛋白2线粒体前体 X
P23141 肝羧酸酯酶1前体 X
P23142 纤维蛋白1 X X X X
P23284 肽基脯氨酰顺反异构酶B前体 X
P23381 色氨酰tRNA合成酶细胞质 X
P23526 腺苷高半胱氨酸酶 X X
P23528 科菲林1 X
P24752 乙酰CoA乙酰转移酶线粒体前体 X
P25311 锌α2糖蛋白n前体 X
P25705 ATP合酶亚基α线粒体 X
P25788 蛋白酶体亚型α3型 X X
P25789 蛋白酶体亚型α4型 X
P26447 蛋白S100 A4 X
P27348 14 3 3蛋白质theta X X
P27797 钙网蛋白前体 X
P28066 蛋白酶体亚型α5型 X
P28070 X X
P28072 蛋白酶体亚型β型6型前体 X
P28074 蛋白酶体亚单位β5型前体 X
P28331 NADH泛醌氧化还原酶75kDa亚单位线粒体前体 X
P28838 细胞溶素氨基肽酶 X
P29218 肌醇单磷酸酶 X
P29401 转酮醇 X
P29692 伸长系数1 delta X
P29966 富含酪胺酰化丙氨酸的C激酶底物 X
P30040 内质网蛋白ERp29前体 X
P30041 过氧化还原酶6 X X
P30043 黄素还原酶 X
P30044 过氧化还原毒素5线粒体前体 X
P30085 UMP CMP激酶 X
P30086 磷脂酰乙醇胺结合蛋白1 X
P30101 Protei二硫化物异构酶A3前体 X X X
P30613 丙酮酸激酶同工酶RL X
P30740 白细胞弹性蛋白酶抑制剂 X
P31025 Lipocalin 1前体 X
P31937 3羟基异丁酸脱氢酶线粒体前体 X
P31942 异质核核糖核酸蛋白H3 X
P31943 异质核核糖核蛋白H X
P31946 14 3 3蛋白βα X X
P31948 应激诱导的磷蛋白1 X
P31949 蛋白S100A11 X
P32119 过氧氧化还原酶2 X X
P34931 热休克70 kDa蛋白1 X X
P34932 热休克70 kDa蛋白4 X
P35232 抑制素 X
P35237 Serpin B6 X
P35443 血小板反应蛋白4 X
P35555 纤维蛋白1 X X
P35579 肌球蛋白9 X X X
P35580 肌球蛋白10 X X
P35609 阿尔法肌动蛋白2 X
P35625 金属蛋白酶抑制剂3 X X
P35998 26S蛋白酶调节亚基7 X
P36871 磷酸调解酶1 X X
P36955 颜料上皮衍生因子 X X
P37802 X X
P37837 转醛 X
P38117 电子转移黄素蛋白亚基β X
P38646 应激70蛋白线粒体前体 X X
P39687 酸性亮氨酸富含核蛋白32个家族成员A X
P40121 巨噬细胞封端蛋白 X
P40925 苹果酸脱氢酶细胞质 X
P40926 苹果酸脱氢酶线粒体前体 X
P41219 外周 X
P42330 Aldo酮还原酶家族1成员C3 X
P45880 电压依赖性阴离子选择通道蛋白2 X
P47755 F肌动蛋白封端蛋白亚基α2 X X
P47756 F肌动蛋白封端蛋白亚基β X X
P47985 Ubiquinol细胞色素c还原酶铁硫亚单位线粒体前体 X
P48047 ATP合酶O亚单位线粒体前体 X
P48637 谷胱甘肽合成酶 X
P48741 热休克70 kDa蛋白7 X X
P49189 4三甲基氨基丁醛脱氢酶 X
P49368 T复合蛋白1亚基γ X
P49747 软骨低聚基质蛋白 X X X X
P49748 非常长链特异性酰基辅酶A脱氢酶线粒体前体 X
P50395 Rab GDP解离抑制剂β X X </ TD>
P50454 Serpin H1前体 X
P50995 膜联蛋白A11 X
P51452 双重特异性蛋白磷酸酶3 X
P51884 基膜聚糖 X X X X
P51888 前列腺素前体 X X X X
P52565 Rho GDP解离抑制剂1 X
P52566 Rho GDP解离抑制剂2 X
P54652 热休克相关70 kDa蛋白2 X X X X
P55072 过渡性内质网ATP酶 X
P55083 微纤维相关糖蛋白4前体 X X
P57053 组蛋白H2B型F X
P60174 三磷酸异构酶 X X X
P60660 肌球蛋白轻多肽6 X X
P60709 肌动蛋白细胞质1 X X X X
P60981 Destrin X
P61086 泛素缀合酶E2 25 kDa X
P61088 泛素缀合酶E2 X
P61224 Ras相关蛋白Rap 1b前体 X
P61978 异质核核糖核蛋白K X X
P61981 14 3 3蛋白质γ X X X
P62258 14 3 3蛋白质ε14 3 3E X
P62491 Ras相关蛋白 X
P62714 丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶2A催化亚基β亚型 X
P62736 肌动蛋白主动脉平滑肌 X X X
P62805 组蛋白H4 X
P62826 GTP结合核蛋白Ran X
P62873 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白GIGSGT亚基β1 X
P62879 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白GIGSGT亚基β2 X
P62937 肽基脯氨酰顺反异构酶A X X
P62987 泛素60S核糖体蛋白L40 X
P63104 14 3 3亲in eta三角洲 X X X X
P63241 真核翻译起始因子5A 1 X
P63244 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基β2如1 X
P63267 肌动蛋白γ肠平滑肌 X X
P67936 原肌球蛋白α4链 X
P68032 肌动蛋白α心肌1 X
P68104 伸长因子1 alpha 1 X X X
P68133 肌动蛋白α骨骼肌
P68363 微管蛋白α1B链 X X X
P68371 微管蛋白β2C链 X X X
P68402 血小板活化因子乙酰水解酶IB亚单位β X
P68871 血红蛋白亚基β X X X
P69905 血红蛋白亚基α X X
P78371 T复合蛋白1亚基β X
P78417 谷胱甘肽转移酶ω1 X X
P80748 Igλ链VI二区LOI X
P98095 纤维蛋白2 X X
Q01082 Spectrinβ链脑1 X
Q01449 肌球蛋白调节轻链2心房同种型 X
Q01518 腺苷酸环化酶相关蛋白1 X
Q01995 Transgelin平滑肌蛋白22α X
Q03252 Lamin B2 X X
Q03591 补体因子H相关蛋白1前体 X
Q04917 14 3 3蛋白质等 X X
Q06323 蛋白酶体激活剂复合亚单位1 X
Q06828 纤 X X X X
Q06830 过氧化还原酶1 X X
Q07507 皮肤桥 X X X X
Q07960 Rho GTPase激活蛋白1 X
Q08257 喹诺酮氧化还原酶 X
Q08431 乳凝集素 X X
Q12765 小号ecernin 1 X
Q13011 Delta 3 5 Delta 2 4二烯酰辅酶A异构酶线粒体前体 X X
Q13228 硒结合蛋白1 X X
Q13404 泛素缀合酶E2变体1 X
Q13409 细胞质动力蛋白1中间链2 X
Q13509 微管蛋白β3链 X X X
Q13642 四个半LIM域蛋白1 X
Q13765 激素多肽相关复合亚单位α X
Q13885 N微管蛋白β2A链 X X
Q14194 二氢嘧啶酶相关蛋白1 X
Q14195 二氢嘧啶酶相关蛋白3 X X X X
Q14624 α型胰蛋白酶抑制剂重链H4前体 X
Q14697 中性α葡糖苷酶AB前体 X
Q14764 主要蛋白质 X
Q14767 潜在的转化生长因子β结合蛋白2 X X
Q14894 Mu晶体蛋白同源物NADP调节甲状腺激素结合蛋白 X
Q15063 骨膜素前体 X X X X
Q15084 蛋白二硫键异构酶A6前体 X
Q15113 Procollagen C内肽酶增强子1前体 X
Q15181 无机焦磷酸酶 X
Q15365 聚rC结合蛋白1 X
Q15366 Poly rC结合蛋白2 X
Q15582 转化生长因子β诱导蛋白 X X X
Q15819 泛素缀合酶E2变体2 X
Q16352 Alpha internexin X
Q16473 推定腱生蛋白XA X
Q16555 二氢嘧啶酶相关蛋白2 X X X
Q16698 2 4二烯酰辅酶A还原酶线粒体前体 X
Q16891 线粒体内膜 X
Q562R1 β肌动蛋白如蛋白2 X
Q6S8J3 POTE ankyrin域家族成员E X
Q6UWY5 茉莉香素类似蛋白1前体 X X
Q71U36 微管蛋白α1A链 X X X
Q7Z7G0 目标Nesh SH3前体 X X X
Q8WUM4 程序性细胞死亡6相互作用蛋白 X
Q8WWX9 硫氧还蛋白如硒蛋白M前体 X
Q92597 蛋白NDRG1 X
Q92945 远上游元件结合蛋白2 X
Q96CN7 含有蛋白质的等位基因组域1 X
Q96CX2 BTB POZ结构域含有蛋白质 X
Q96KK5 组蛋白H2A 1 H X X
Q96KP4 细胞因子非特异性二肽酶 X
Q99426 微管蛋白特异性伴侣B X
Q99497 蛋白质DJ 1 X X
Q99536 突触小泡膜蛋白 X X X
Q99714 3羟酰基CoA脱氢酶2型 X
Q99715 胶原alpha 1 XII链 X X
Q99798 乌头酸水合酶线粒体前体 X
Q9BQE3 微管蛋白α6链 X
Q9BUF5 微管蛋白β6链 X X
Q9BUT1 3羟基丁酸脱氢酶2型 X
Q9BVA1 微管蛋白β2B链 X X X
Q9BXN1 Asporin X X </ TD> X X
Q9H0W9 酯水解酶C11orf54 X
Q9H4B7 微管蛋白β1链 X
Q9NRN5 茉莉素类似蛋白3前体 X X
Q9NRV9 血红蛋白结合蛋白1 X
Q9NSB2 角蛋白II型角质层Hb4 X X
Q9NVA2 Septin 11 X
Q9UBR2 组织蛋白酶Z前体 X
Q9UBX5 纤维蛋白5 X X
Q9UK22 F盒只蛋白2 X
Q9Y277 电压依赖性阴离子选择通道蛋白3 X
Q9Y281 科菲林2 X
Q9Y490 塔林1 X
Q9Y696 氯化物细胞内通道蛋白4 X
Q9Y6C2 EMILIN 1 X X

表1：应用四种不同蛋白质组学方法时在二尖瓣组织提取物中鉴定的蛋白质列表：二维电泳（2-DE），二维LC-MS E （2D-LC / MS E ），LC / MS E和液相IEF。报道了鉴定每种蛋白质的方法。

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Discussion

该方案的一个关键步骤是使用液氮冷冻样品并冷却研磨机系统。液氮的使用可防止生物降解并有效地进行粉末化，但需要对培训进行安全处理。

在该协议中，具有用于样品研磨的研磨机系统，因为小样品难以从标准的砂浆和杵中回收。在这种情况下，小样品作为细粉扩散到砂浆表面，使收集困难。另一个优点是研磨机是电动的，这允许以可再现的方式处理更多数量的样品并且没有增加的疲劳。对研磨机的使用的一个限制是，必须将杵的力量小（100mg或更少）的样品的尺寸有效地压在砂浆上。此外，研磨机组件必须在清洁用途之间加热至室温 G。因此，该过程是耗时的，并且如果每天处理许多样品，则需要许多组。

另外的关键步骤是提取缓冲液的制备。盐浓度，特别是尿素（8M）和硫脲（2M）的浓度相当高;因此，盐的体积几乎是溶液总体积的一半。此外，考虑到必须避免热量，溶解是不容易的，因为在大于37℃时，尿素可导致蛋白质/肽的N末端和赖氨酸和精氨酸残基17的侧链氨基处的蛋白质氨基甲酰化。一旦溶解，尿素缓冲液必须用0.22μm过滤器过滤，并且可以在-80℃下储存4周而不影响其提取效果，但是在使用之前必须将其温热至15℃以上才能完全溶解。

修改和故障排除

在本协议中，使用所述的尿素缓冲液进行蛋白质提取，因为它是用于蛋白质组研究的最常用的蛋白质提取溶液之一，因为其与等电聚焦的相容性及其在溶解微溶蛋白中的效率18已经被证明这种缓冲液可以非常有效地溶解微溶蛋白，例如整合膜蛋白19或高度易于聚集的蛋白质，如微管蛋白18 ，此外，该缓冲液与Bradford测定法完全相容以确定蛋白质浓度，它可以直接用于2-DE和液相IEF分析。

然而，该缓冲液对于溶解样品中存在的所有蛋白质不是理想的。不同的提取缓冲液有可能揭示该方案不可检测的蛋白质。例如，它是很好的kno可以用酸提取或三氯乙酸/丙酮沉淀20更好地提取核糖体和核蛋白，而碱性pH水平更适合于膜蛋白21,22 。因此，使用替代缓冲液可能需要额外的蛋白质沉淀步骤来消除干扰2-DE或液相IEF的盐。

技术的局限性

通过该方案鉴定的蛋白质数量相对较少，但是通过使用更现代的仪器，可以进一步提高鉴定数量和蛋白质组学分析的覆盖范围，这些仪器的质量准确度和测序速度在过去几年中急剧增加23 ，可以通过采用长时间的液体梯度梯度来覆盖大部分蛋白质组，无需任何预分步骤与高分辨率MS仪器相结合，具有快速排序速度24 。

技术对现有/替代方法的重要意义

识别和量化人类心脏瓣膜中的蛋白质（如二尖瓣）的能力是一个重要且具有挑战性的任务，有助于阐明瓣膜疾病中生理/病理过程的机制。定义二尖瓣蛋白质组的变化将大大增加对与组织疾病状态相关的生物过程的性质的理解。

目前关于二尖瓣病理生理学的知识是有限的，通常通过分析涉及特定过程的个体蛋白质，如细胞外基质重塑，止血，炎症或氧化应激25 9,10的分析中。

缺乏综合的蛋白质组学研究可归因于细胞外基质蛋白（ 即蛋白聚糖，胶原蛋白和弹性蛋白）高度富含的这种低细胞组织的复杂性。这些蛋白质占总量的约80％，妨碍了低丰度蛋白质26的分析。

因此，为了描述该组织的蛋白质组，需要建立一种有效的提取方案以使蛋白质溶解最大化。该方案允许从1mg组织中提取约50μg蛋白质。与“软”组织相比，这是相对较低的产量作为肝脏（从1mg组织中〜135μg），但对各个样品进行蛋白质分析就足够了。这在定义现象的个体内变异性时尤为重要。

此外，该方法具有与许多分析应用兼容的优点。溶解在所提出的提取缓冲液中的二尖瓣蛋白质可以直接用于基于二维电泳和液相电泳11,12的免疫印迹和蛋白质组学分析，或者在蛋白沉淀后，为了消除缓冲液成分的干扰，可用于其他测定，例如无凝胶质谱法15 。

随着该提取方案的应用，通过鉴定许多细胞内质粒获得正常二尖瓣组织的蛋白质组分的更详尽的表征细胞蛋白。这些蛋白质不仅在细胞外基质中位于胞质溶胶或细胞器中，而且具有不同的分子和生物功能。还鉴定了其他有趣的蛋白质（ 即 CryAB，septin-11，FHL-1和皮肤粘蛋白）。这些蛋白质在二尖瓣中具有未知功能，但其生物学特性表明在瓣膜疾病中可能起作用。

掌握此技术后的未来应用或方向

使用该方案，可以将关于蛋白质表达的数据与定量mRNA表达和非定量免疫组织化学分析的数据相关联。事实上，当一起使用这些方法将导致更全面地了解从mRNA到翻译后蛋白质修饰的基础疾病的分子机制。因此，这种方法对于集中在心脏瓣膜病理生理学的研究人员而言是值得关注的。鳍该方案也可应用于与二次阀27非常相似的猪二尖瓣，并用作阀功能评估的实验模型。

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Disclosures

作者没有什么可以披露的。

Acknowledgments

意大利卫生部支持这项研究（RC 2013-BIO 15）。我们非常感谢Barbara Micheli的优秀技术援助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

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References

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生物化学，第124期，人正常二尖瓣，蛋白质提取，组织匀浆，蛋白质分析，蛋白质组学，生物化学
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Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

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