Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Optimeret protokol til ekstraktion af proteiner fra humanmitralventilen

doi: 10.3791/55762 Published: June 14, 2017

Summary

Proteinsammensætningen af ​​den humane mitralventil er stadig delvis ukendt, fordi dens analyse er kompliceret ved lav cellulæritet og derfor ved lav proteinbiosyntese. Dette arbejde tilvejebringer en protokol til effektivt at ekstrahere protein til analyse af mitralventilproteomet.

Abstract

Analyse af det cellulære proteom kan bidrage til at belyse de molekylære mekanismer, der ligger til grund for sygdomme som følge af udviklingen af ​​teknologier, som muliggør storskala identifikation og kvantificering af de proteiner, der er til stede i komplekse biologiske systemer. Den viden, der opnås ved en proteomisk tilgang, kan potentielt føre til en Bedre forståelse af de patogene mekanismer, der ligger til grund for sygdomme, hvilket muliggør identifikation af nye diagnostiske og prognostiske sygdomsmarkører og forhåbentlig af terapeutiske mål. Imidlertid repræsenterer den kardiale mitralventil en meget udfordrende prøve til proteomanalyse på grund af den lave cellularitet i proteoglycan og kollagen beriget ekstracellulær matrix. Dette gør det udfordrende at udvinde proteiner til en global proteomanalyse. Dette værk beskriver en protokol, der er kompatibel med efterfølgende proteinanalyse, såsom kvantitativ proteomik og immunoblotting. Dette kan muliggøre korrelation af data vedrG-proteinekspression med data om kvantitativ mRNA-ekspression og ikke-kvantitativ immunhistokemisk analyse. Faktisk vil disse tilgange, når de udføres sammen, føre til en mere omfattende forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for sygdomme, fra mRNA til posttranslationel protein modifikation. Denne metode kan således være relevant for forskere, der er interesseret i undersøgelsen af ​​hjerteventil-fysiopatologi.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nylige beviser har ændret forståelsen af ​​rollerne i de mange reguleringsmekanismer, der opstår efter mRNA-syntese. Faktisk kan translationelle, post-transkriptionelle og proteolytiske processer regulere protein overflod og funktion. Dogmen - som siger, at mRNA-koncentrationer er proxier til de tilsvarende proteiner, forudsat at transkriptionsniveauerne er den vigtigste determinant for protein overflod - er blevet delvist revideret. Indeholdt transkriptniveauer kun delvist forudsige proteinabundance, hvilket tyder på, at posttranskriptionelle hændelser Forekomme for at regulere proteinerne i cellerne 1 , 2 .

Desuden dikterer proteiner i sidste ende cellens funktion og dicterer derfor dens fænotype, som kan undergå dynamiske ændringer som reaktion på autokrine, parakrine og endokrine faktorer; Blodbårne mediatorer; temperatur; Lægemiddelbehandling; Og sygdomsudviklingenling. Således er en ekspressionsanalyse, der er fokuseret på proteinniveauet, nyttig til at karakterisere proteomet og for at løse de kritiske forandringer, der forekommer for det som en del af sygdomspatogenese 3 .

Derfor er mulighederne for proteomics til at klarlægge helbredstilstand og sygdomsbetingelser formidabel, på trods af de eksisterende teknologiske udfordringer. De særligt lovende forskningsområder, som proteomics kan bidrage med, omfatter: Identifikation af ændret proteinekspression på ethvert niveau ( dvs. hele celler eller væv, subcellulære rum og biologiske væsker); Identifikation, verifikation og validering af nye biomarkører, der er nyttige til diagnose og prognose for sygdom Og forhåbentlig identifikation af nye proteinmål, der kan anvendes til terapeutiske formål, samt til vurdering af lægemiddelvirkningsevne og toksicitet 4 .

Fange kompleksiteten afProteomet repræsenterer en teknologisk udfordring. De nuværende proteomiske værktøjer giver mulighed for at udføre storskala, høj gennemstrømningsanalyse til identifikation, kvantificering og validering af ændrede proteinniveauer. Derudover har indførelsen af ​​fraktionerings- og berigelsesmetoder, der har til formål at undgå interferens forårsaget af de mest rigelige proteiner, også forbedret proteinidentifikation ved at inkludere de mindst rigelige proteiner. Endelig er proteomics blevet suppleret med analysen af ​​posttranslationelle modifikationer, som progressivt fremkommer som vigtige modulatorer af proteinfunktion.

Prøveforberedelsen og proteingendannelsen i de biologiske prøver under analyse forbliver imidlertid de begrænsende trin i den proteomiske arbejdsgang og øger potentialet for mulige faldgruber 5 . Faktisk skal de første trin i vævshomogenizat i de fleste molekylærbiologiske teknikker, der skal optimeresIon og celle lysis, især under analysen af ​​proteiner med lavt indhold, for hvilke amplifikationsmetoder ikke eksisterer. Derudover kan proteinernes kemiske natur påvirke deres egen genopretning. Eksempelvis er analysen af ​​stærkt hydrofobe proteiner meget udfordrende, fordi de let fælder under isoelektrisk fokusering, mens trans-membranproteiner er næsten uopløselige (gennemgået i Reference 5). Endvidere skaber vævsammensætningens variabilitet en betydelig barriere for udvikling af en universel ekstraktionsmetode. Endelig, fordi næsten alle de kliniske prøver er af begrænset mængde, er det essentielt at muliggøre proteinpræparation med maksimal genvinding og reproducerbarhed fra minimale prøve mængder 6 .

Dette værk beskriver en optimeret protokol til proteinudvinding fra den normale mitralventil, som er en meget udfordrende prøve til proteomanalyse. Den normale mitralventil er en kompLex struktur liggende mellem venstre atrium og venstre ventrikel i hjertet ( figur 1 ). Det spiller en vigtig rolle i kontrollen af ​​blodgennemstrømning fra atriumet til ventriklen, forhindrer tilbagestrømning og sikrer det korrekte niveau af iltforsyning til hele kroppen og derved opretholder en passende hjerteudgang. Imidlertid anses det ofte for at være et "inaktivt" væv med lav cellulæritet og få komponenter, hovedsagelig i den ekstracellulære matrix. Dette skyldes, at de residente valvulære interstitiale celler (VIC'er) under normale betingelser frembyder en hvilende fænotype med en lav proteinbiosyntesehastighed 7 .

Imidlertid er det blevet påvist, at i en patologisk tilstand øges antallet af VIC'er i spongiosa og deres proteinsyntese aktiveres sammen med andre funktionelle og fænotypiske ændringer 8 . Det er derfor ikke overraskende, at de minimale data, der er tilgængelige iLitteraturen fokuserer på analysen af ​​patologiske mitralventiler 9 , 10 , hvor det øgede antal aktiverede VIC'er kan forklare det forholdsvis høje antal identificerede proteiner.

Som konklusion kan den foreliggende protokol tjene til at udvikle forståelsen af ​​de patogene mekanismer, der er ansvarlige for mitralventil sygdomme gennem undersøgelsen af ​​mitralventilproteinkomponenter. En større forståelse af de underliggende patologiske processer kunne faktisk bidrage til at forbedre den kliniske styring af ventilsygdomme, hvis nuværende indikationer for intervention i høj grad er baseret på hæmodynamiske overvejelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denne protokol indsamles de menneskelige hjerter under multiorgan explantation (kold iskæmitid på 4-12 timer, gennemsnit 6 ± 2 timer) fra multorgendonorer ekskluderet fra organtransplantation af tekniske eller funktionelle årsager til trods for normale ekkokardiografiske parametre. De sendes til Cardiovascular Tissue Bank i Milano, Monzino Cardiologic Center (Milano, Italien) til banklægning af aorta og lungeventiler. Mitral posterior folderne anvendes ikke til kliniske formål, så de samles under aorta- og lungeventilisolering efter informeret samtykke fra donorernes slægtninge. Vävet til transplantation og forskning indsamles først efter forældres samtykke; På godkendelsesarket tillader de (kun) at bruge hjertevævet til forskning, hvis det ikke er egnet til human klinisk brug ( dvs. mikrobiologiske, funktionelle og serologiske problemer) i overensstemmelse med retningslinjerne i etiske udvalgsMonzino Cardiologic Center.

1. Mitral ventil forberedelse

  1. Høst den humane mitralventil hurtigst muligt efter organteksplantering (kold iskæmistid på 4-12 timer).
  2. I et rent rum skal du fjerne hjertet fra transportposen, der indeholder en kold (4 ° C) opløsning ( dvs. saltopløsning eller afbalanceret medium Eurocollins eller Wisconsin). Sæt den i en spand og læg den i et biosikkerhedsskabe (biohazard vertikal luftstrøm, klasse A, god fremstillingspraksis (GMP)) for at fortsætte med ventilpræparatet.
  3. Placer hjertet på en steril engangsdug i kabinettet. Ved hjælp af en steril engangs scalpel skal du klippe hjertet helt, vinkelret på dets hovedakse, på niveauet af venstre og højre ventrikel, ca. 4 cm væk fra toppen.
  4. Flyt den stigende aorta og lungearterien for at vise det venstre atrielle tag.
  5. Med sterile autoklaverbare pincett og plukker skæres den venstre auricle påVenstre atrieltak, der gør mitralventilen synlig og giver mulighed for at identificere den store mitralbrochure (anterior) og den lille mitralbrochure (bageste).
    BEMÆRK: Antero-lateral og de bakre mediale kommissar definerer grænsen på den forreste folder og det bageste område.
  6. Ved hjælp af sterile autoklaverbare saks og ikke-traumatiske tænger, dissekere venstre atrium og ventrikelvægtykkelse rundt om hele mitralventilens omkreds .
  7. Identificer mitro-aorta ventil kontinuitet.
    BEMÆRK: Venstre ventrikel indeholder hele mitralventilen og akkorderne.
  8. Separér den fremre mitralventilfolie fra den bageste mitralventilblade, og skær den bageste folder langs indsættelsen med ventriklen (kommissur).
  9. Vask den bageste folder i saltvandsløsningen. Skær folderen i små stykker (<1 cm 2 ) og pakk dem individuelt i aluminiumfolie. Snapfrys dem med flydende nitrogen.
    Forsigtig: Følg organisatoriske sikkerhedsprocedurer, når du bruger flydende nitrogen.
    1. Sanitér bordet af kabinettet med en 70% isopropylalkoholopløsning og en 6% hydrogenperoxidopløsning ved afslutningen af ​​proceduren.

2. Proteinekstraktion

  1. Brug pincet til at samle prøven opbevaret i flydende kvælstof og straks placere det på tøris, mens det stadig er indpakket i aluminiumsfolien. Forlad ikke prøven til optøning under overførsler.
  2. Før slipning afkøles porcelæn / zirconiummørtel og pistler i et slibesystem ( f.eks. CryoGrinder) sammen med prøven ved at sætte dem i en Dewar kolbe indeholdende flydende nitrogen (~ 500 ml).
    Forsigtig: Følg organisatoriske sikkerhedsprocedurer, når du bruger flydende nitrogen.
  3. Sæt mørtel og pestles i en polystyren kasse indeholdende tøris. Fjern prøven fra aluminiumsfolien og læg den i mørtel.
  4. Grind tHan prøver med den store støvler mod mørtelen 15-20 gange ved at bruge skruetrækker til at dreje pistlen. Bland prøven med spidsen af ​​en forkølet spatel under slibeprocessen.
    1. Gentag med den lille stamme.
  5. Overfør grundprøven til et tidligere vejet rør ( f.eks. 15 ml centrifugerør) ved at dreje røret, placere det over mørtelen og vende dem sammen for at flytte prøven til røret. Brug en forkølet spatel til at genvinde alt materiale fra mørtel.
    1. Hold røret med prøven på tøris for at undgå prøveoptøning under overførslen.
  6. Beregn nettovægten af ​​prøven.
  7. Rengør mørtel og pestles efter hver prøve og dekontaminere dem ved autoklavering eller opvarmning dem ved 200 ° C i 2 timer.
  8. Overfør den pulveriserede prøve fra centrifugerøret til glasrøret i en homogenisator ved inversion.
  9. Tilsæt filtreret urea buffeR (8 M urea, 2 M thiourinstof, 4% w / v CHAPS, 20 mM Tris og 55 mM dithiotreitol) til glasrøret, 200 μl urinstofpuffer for hver 10 mg pulveriseret væv.
    BEMÆRK: Resterende pulveriseret prøve tilbage i centrifugerøret kan udvindes under anvendelse af en del af det beregnede volumen urinstofpuffer.
  10. Homogeniser prøven ved hjælp af en omrører udstyret med en borosilicatglasmørtel og en polytetrafluorethylen (PTFE) -pestle. Tryk langsomt pestlen på prøven med en vridningsbevægelse (1500 rpm) 10 gange.
  11. Genindvind supernatanten og overfør den til et rent 1,7 ml centrifugerør. Genindvind igen den resterende prøve med frisk urinstofbuffer, og tilsæt halvdelen af ​​det volumen, der blev brugt under den første ekstraktion.
  12. Gentag trin 2.10.
  13. Genindvind supernatanten og kombiner den med supernatanten fra trin 2.11. Anbring den kombinerede supernatant på en rørrotator i 30 minutter.
  14. Centrifuger røret i 30 minutter ved 13.000 xg og 4 ° C.
  15. Gendan supernatanten anD måle proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford-proteinassayet, ifølge producentens anvisninger. Opbevar prøven ved -80 ° C indtil brug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ekstraktionen og opløsningen af ​​proteiner i urinstofpufferen er direkte kompatibel med proteomiske metoder baseret på isoelektrofokusering (todimensionel elektroforese (2-DE) 11 og flydende fase isoelektrisk fokusering (IEF) 12 ) og med immunoblottning efter fortynding i Laemmli-buffer 13 Indeholdende en proteaseinhibitor cocktail 14 .

For gel-fri massespektrometri-baserede metoder ( dvs. væskekromatografi koblet til datauafhængig massespektrometrianalyse (LC / MS E ) og todimensionel LC / MS E (2D-LC / MSE)) 15 blev prøverne ekstraheret I den beskrevne urinstofpuffer skal yderligere behandles for at eliminere urinstof og thiourinstof, som kunne interferere med efterfølgende proteinfordøjelse og væskekromatografiseparation. ThiS afsaltningstrin kan udføres under anvendelse af de kommercielle proteinudfældningssæt efter fabrikantens instruktioner til udfældning af proteinerne. Prøven kan derefter opløses i 25 mM NH4HCO3 indeholdende 0,1% spaltbare detergenter til proteinfordøjelse 16 . Udfældningen af ​​proteinerne kan eliminere bufferkomponenter, der minimerer proteinindholdet (proteingendannelse:> 85%), hvilket gør prøven egnet til enhver form for analyse.

Anvendelsen af ​​denne protokol til proteinekstraktion fra humane mitralventiler tilladt til identifikation af i alt 422 proteiner, der kombinerer fire forskellige proteomiske fremgangsmåder, som tidligere er beskrevet i detaljer 11 , 15 . Specifikt blev 169 proteiner identificeret ved 2-DE, 330 proteiner ved hjælp af flydende fase IEF, 96 proteiner af LC / MS E og 148 proteinerVed 2D-LC / MS E (tabel 1).

For at klassificere de 422 identificerede proteiner med hensyn til subcellulær lokalisering blev der anvendt en software til gen ontologi (GO) analyse ( f.eks. Cytoscape). Netværket oprettet med softwaren og dets tilsvarende plugin viste, at foruden de forventede proteiner lokaliseret i den ekstracellulære region (se den øverste højre del af figur 2 ) var de fleste proteiner identificeret ved de proteomiske fremgangsmåder fra det intracellulære område ( Dvs. cytoplasma, organeller, vesikler og cytoskelet). Cell-overfladeproteiner blev også identificeret ( figur 2 ).

Resultaterne blev yderligere bekræftet i tre uafhængige mitralventilprøver. Immunoblotting blev brugt til at analysere en gruppe af fire proteiner ( dvs. septin-11, fire og en halv LIM-domæner protein 1 (FHL-1), derMatopontin og alfa-krystallin B (CryAB)), som aldrig er blevet identificeret i den normale mitralventil ( figur 3 ).

figur 1
Figur 1: Mitralventilstruktur. Øverste billede af det menneskelige hjerte, der viser den lukkede ( A ) eller åbne ( B ) menneskelige mitralventil. Forfra af venstre hjertekammer af et menneskeligt hjerte ( C ). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Analyse af de identificerede mitralventilproteiner i løbet af cellulær fordeling. Cytoscape og plugin BiNGO var vant til at obtaiN fordelingen af ​​gen ontologi (GO) udtryk fra de cellulære komponent kategorier. Cirkelstørrelsen er proportional med antallet af proteinkomponenter associeret med de valgte GO-betingelser, og farveskalaen for p-værdien af ​​overrepræsentation er rapporteret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Immunoblottingsanalyse af septin-11, FHL-1, dermatopontin og CryAB i hel ekstrakt fra tre humane normale mitralventilfolier. Immunoblotting blev udført under anvendelse af monoklonalt mus-antistof mod CryAB og kaninpolyklonale antistoffer mod septin-11, FHL-1 og dermatopontinantistoffer. Vær venligKlik her for at se en større version af denne figur.

<td> x <td> <Td> Proteasome subunit beta type 4 precursor <td> </ Tr> <Td> Transgelin 2 <td> <tr> <td>
tiltrædelse Beskrivelse 2-DE 2D-LC LC-MS E Flydende fase IEF
A6NMZ7 Kollagen alfa VI x
O00151 PDZ- og LIM-domæneprotein 1 x
O00299 Chlorid-intracellulært kanalprotein 1 x
O00764 Pyridoxalkinase x
O14558 Varmechokprotein beta 6 x
O43399 Tumorprotein D54 x
O43488 Aflatoxin B1-aldehydreduktaseelement 2 x
O43707 Alpha actinin 4 x x
O43866 CD5 antigen-lignende precursor x
O60493 Sortering af nexin 3 x
O60701 UDP glucose 6 dehydrogenase x
O75223 Ukarakteriseret protein x
O75368 SH3 domænebindende glutaminsyre, som er rig på protein x
O75390 Citrat syntase mitochondriale forstadie x
O75489 NADH dehydrogenase ubiquinon jern svovlprotein 3 mitochondriale forstadie x x
O75608 Acylproteintioesterase 1 x
O75828 Carbonylreduktase NADPH 3 x
O75874 Isocitrat dehydrogenase NADP cytoplasmatisk x
O75955 Flotillin x
O94760 NG NG dimethylarginindimethylaminohydrolase 1 x
O94788 Retinal dehydrogenase 2 x
O95865 NG NG dimethylarginindimethylaminohydrolase 2 x x
P00325 Alkohol dehydrogenase 1B x x
P00338 L lactat dehydrogenase A kæde x
P00352 Retinal dehydrogenase 1 x
P00441 Superoxiddismutase Cu Zn x x
P00450 Ceruloplasmin forløber x x
P00488 Koagulationsfaktor XIII En kædeprecursor x
P00491 Purin-nukleosidphosphorylase x
P00492 Hypoxanthin guanin phosphoribosyltransferase x
P00558 Phosphoglyceratkinase 1 x x
P00568 Adenylatkinaseisoenzym 1 x
P00734 prothrombin x x
P00738 haptoglobin x x x x
P00739 Haptoglobin-relateret proteinprecursor x
P00751 Komplementfaktor B x x x
P00915 Carbonanhydrase 1 x
P00918 Carbonanhydrase 2 x
P01008 Antitrombin III precursor x x x
P01009 Alfa 1 antitrypsin x x x x
P01011 Alfa 1 antichymotrypsin x x x x
P01019 Angiotensinogen forløber x x
P01023 Alpha 2-makroglobulin x x
P01024 Komplement C3 x x x x
P01033 Metalloproteinaseinhibitor 1 precursor x
P01042 Kininogen 1 precursor x
P01593 Ig kappa kæde VI region AG x
P01598 Ig kappa kæde VI region EU x
P01600 Ig kappa kæde VI region Hau x x
P01611 Ig kappa kæde VI region Wes x
P01620 Ig kappa kæde V III region SIE x
P01625 Ig kappa kæde V IV region Len x
P01766 Ig tung kæde V III region BRO x x
P01781 Ig tungkæde V III region GAL x
P01834 Ig kappa kæde C region x x x x
P01842 Ig lambda kæde C regioner x x x
P01857 Ig gamma 1-kæde C-region x x x x
P01859 Ig gamma 2-kæde C-region x x x x
P01860 Ig gamma 3-kæde C-region x x x
P01861 Ig gamma 4-kæde C-region x x x
P01871 Ig mu kæde C region x x x
P01876 Ig alfa 1-kæde C-region x x x x
P01877 Ig alfa 2-kæde C-region x
P02144 myoglobin x x
P02452 Kollagen alfa 1 I kæde x x x x
P02511 Alfa-krystallinske B-kæde x
P02545 Lamin AC 70 kDa lamin x x x x
P02647 Apolipoprotein Al x x x x
P02649 Apolipoprotein E x x x x
P02671 Fibrinogen alfa-kæde x x x x
P02675 Fibrinogen beta-kæde x x x x
P02679 Fibrinogen gamma kæde x x x x
P02689 Myelin P2 protein x
P02735 Serumamyloid En proteinprecursor x
P02741 C-reaktivproteinprecursor x
P02743 Serumamyloid P-komponent x x x x
P02746 Komplement C1q underkomponent subenhed B x x
P02747 Komplement C1q subkomponent subenhed C precursor x
P02748 Komplementkomponent C9 x x x
P02749 Beta 2 glycoprotein 1 x x x x
P02750 Leucin Rich Alfa 2-glycoproteinprecursor x
P02751 Fibronectin x x
P02760 AMBP proteinprecursor x x x x
P02763 Alfa 1 syre glycoprotein 1 x x x
P02765 Alpha 2 HS glycoproteinprecursor x
P02766 Transthyretinprecursor x x x
P02768 Serumalbumin x x x x
P02774 Vitamin D-bindende proteinprecursor x
P02787 Serotransferrin x x x x
P02788 Lactotransferrinprecursor x
P02790 hæmopexin x x x x
P02792 Ferritin let kæde x
P04004 vitronectin x x x x
P04075 Fructose bisfosfat aldolase A x
P04083 Bilag A1 x x x x
P04179 Superoxid dismutase Mn mitokondriale forstadie x
P04196 Histidin-rich glycoproteinprecursor x
P04217 Alpha 1B glycoproteinprecursor x x
P04350 Tubulin beta 4 kæde x
P04406 Glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase x x x x
P04792 Varmechokprotein beta 1 x x x x
P05091 Aldehyddehydrogenase mitochondriale forstadie x x
Plasmaprotease C1-inhibitorprecursor x
P05156 Komplement faktor I precursor x
P05413 Fedtsyrebindende proteinhjerte x
P05452 Tetranectinprecursor TN x x
P05787 Keratin type II cytoskeletal 8 x
P06396 gelsolin x x x x
P06576 ATP syntase subunit beta mitokondriale precursor x x
P06732 Kreatin kinase M type x x
P06733 Alfa enolase x x x x
P06753 Tropomyosin alfa 3-kæde x x
P07108 Acyl CoA bindende protein x
P07195 L lactat dehydrogenase B kæde x x x
P07196 Neurofilament lyspolypeptid x
P07197 Neurofilament medium polypeptid x x
P07237 Proteindisulfid-isomeraseprecursor x x
P07339 Cathepsin D forløber x x
P07355 Bilag A2 x x x x
P07360 Komplementkomponent C8 gamma kædeprecursor x
P07437 Tubulin beta-kæde x x x x
P07585 decorin x x x x
P07737 Profilin 1 x
P07858 Cathepsin B precursor x
P07900 Varmechokprotein HSP 90 alpha x x
P07951 Tropomyosin beta kæde x
P07954 Fumarathydratase mitokondriale forstadie x
P07996 Trombospondin 1 x x x
P08107 Varmechok 70 kDa protein 1A 1B x x x x
P08123 Kollagen alfa 2 I kæde x x x x
P08133 Bilag A6 x x
P08238 Varmechokprotein HSP 90 beta x x
P08253 72 kDa type IV collagenase forstadie x
P08294 Ekstracellulær superoxiddismutase Cu Zn precursor x x x
P08590 Myosin-lyspolypeptid 3 x x
P08603 Komplementfaktor H x x x x
P08670 vimentin x x x x
P08729 Keratin type II cytoskeletal 7 x
P08758 Annexin A5 x x x x
P09211 Glutathion S transferase P x x x
P09382 Galectin 1 x x x
P09417 Dihydropteridinreduktase x
P09493 Tropomyosin 1-alfa-kæde x x
P09525 Bilag A4 x x
P09651 Heterogent nukleært ribonukleoprotein A1 x
P09871 Komplement C1s subkomponentforløber x
P09936 Ubiquitin carboxyl-terminalt hydrolase-isozym L1 x
P09972 Fructose bisfosfat aldolase C x
P0C0L4 Komplement C4 En precursor x
P0CG05 igLambda 2 kæde C regioner x
P0CG38 POTE ankyrin domæne familiemedlem I x
P10515 Dihydrolipoyllysinrest-acetyltransferasekomponent af pyruvat-dehydrogenase-kompleks x
P10768 S-formylglutathionhydrolase x
P10809 60 kDa varmchokprotein mitokondriale precursor x
P10909 clusterin x x x x
P10915 Hyaluronan og proteoglycan link protein 1 forstadie x x
P11021 78 kDa gLucose reguleret protein x x x
P11047 Laminin subunit gamma 1 precursor x
P11142 Varmestød medregnet 71 kDa protein x x x x
P11177 Pyruvat dehydrogenase E1 komponent subunit beta mitochondriale forstadie x
P11217 Glycogen phosphorylase muskelform x
P11310 Medium kæde specifik acyl CoA dehydrogenase mitokondriale forstadie x
P11413 Glucose 6 phosphat 1 dehydrogenase x
P11766 Alkohol dehydrogenase klasse 3 chi kæde x
P12036 Neurofilament tungt polypeptid x
P12109 Kollagen alfa 1 VI kæde x x x x
P12110 Kollagen alfa 2 VI kæde x x x x
P12111 Kollagen alfa 3 VI kæde x x x
P12277 Kreatin kinase B type x
P12429 Annexin A3 x x
P12814 Alpha actinin 1 x x
P12829 Myosin-lyspolypeptid 4 x
P12882 Myosin 1 x
P12883 Myosin 7 x x
P12955 Xaa Pro dipeptidase x
P13489 Ribonucleaseinhibitor x
P13533 Myosin 6 x x
P13611 Versican kerneproteinforløber x x
P13639 Forlængelsesfaktor 2 x
P13716 Delta-aminolevulinsyre dehydratase x
P13796 Plastin 2 x
P13804 Elektron overførsel af flavoprotein subunit alfa mitochondriale precursor x
P13929 Beta-enolase x x
P14136 Glialfibrillær sur proteinastrocyt x
P14314 Glucosidase 2 subunit beta precursor x
P14550 Alkohol dehydrogenase NADP x
P14618 Pyruvat kinaseisozymer M1 M2 x x x
P14625 </ Td> Endoplasminprecursor x x
P15121 Aldose reduktase x
P15259 Phosphoglyceratmutase 2 x
P16152 Carbonylreduktase NADPH 1 x
P17066 Varmechok 70 kDa protein 6 x x x
P17174 Aspartat aminotransferase cytoplasmatisk x
P17540 Kreatinsinkomarisk mitokondriel forstadie x
P17661 desmin x x x x
P17980 26S protease regulatorisk underenhed 6A x
P17987 T kompleks protein 1 subenhed alfa x
P18206 vinculin x x
P18428 Lipopolysaccharidbindende proteinprecursor x
P18669 Phosphoglyceratmutase 1 x
P19105 Myosin regulatorisk let kæde 2 x x
P19623 Spermidin syntase x
P19652 Alpha 1 syre glycoprotein 2 precursor x x
P19823 Inter alfa trypsininhibitor tung kæde H2 x
P19827 Inter alfa trypsininhibitor tung kæde H1 x x
P20073 Annexin A7 x
P20618 Proteasome subunit beta type 1 precursor x
P20774 mimecan x x x x
P21266 Glutathion S transferase Mu 3 x
P21333 Filamin A x x
P21796 Spændingsafhængigt anionselektivt kanalprotein1 x
P21810 biglycan x x x x
P21980 Proteinglutamin gamma glutamyltransferase 2 x x
P22105 Tenascin X x x
P22314 Ubiquitin-aktiverende enzym E1 x
P22352 Glutathionperoxidase 3 precursor x x
P22626 Heterogene nukleare ribonukleoproteiner A2 B1 x
P22695 Ubiquinol cytochrom c-reduktase-komplekskerneprotein 2 mitokondriale forstadie x
P23141 Levercarboxylesterase 1 forstadie x
P23142 Fibulin 1 x x x x
P23284 Peptidyl prolyl cis trans isomerase B precursor x
P23381 Cytoplasmatisk tryptophanyl-tRNA syntetase x
P23526 Adenosylhomocysteinase x x
P23528 Cofilin 1 x
P24752 Acetyl CoA acetyltransferase mitokondriale precursor x
P25311 Zink alfa 2 glycoproteiN forløber x
P25705 ATP syntase subunit alpha mitochondrial x
P25788 Proteasom subunit alfa type 3 x x
P25789 Proteasom subunit alfa type 4 x
P26447 Protein S100 A4 x
P27348 14 3 3 protein theta x x
P27797 Calreticulin forstadie x
P28066 Proteasom subunit alfa type 5 x
P28070 x x
P28072 Proteasome subunit beta type 6 precursor x
P28074 Proteasome subunit beta type 5 precursor x
P28331 NADH ubiquinonoxidoreduktase 75 kDa subunit mitokondriale forstadie x
P28838 Cytosol aminopeptidase x
P29218 Inositolmonophosphatase x
P29401 transketolase x
P29692 Forlængelsesfaktor 1 delta x
P29966 Myristoylerede alaninrige C-kinasesubstrat x
P30040 Endoplasmatisk reticulumprotein ERp29-forstadie x
P30041 Peroxiredoxin 6 x x
P30043 Flavinreduktase x
P30044 Peroxiredoxin 5 mitochondriale forstadie x
P30085 UMP CMP kinase x
P30086 Phosphatidylethanolaminbindende protein 1 x
P30101 ProteiN disulfid isomerase A3 precursor x x x
P30613 Pyruvat kinase isozymer RL x
P30740 Leukocyt elastase inhibitor x
P31025 Lipocalin 1 forløber x
P31937 3 hydroxyisobutyrat dehydrogenase mitochondriale precursor x
P31942 Heterogent nukleært ribonukleoprotein H3 x
P31943 Heterogent nukleært ribonukleoprotein H x
P31946 14 3 3 protein beta alfa x x
P31948 Stressinduceret phosphoprotein 1 x
P31949 Protein S100 A11 x
P32119 Peroxiredoxin 2 x x
P34931 Varmechok 70 kDa protein 1 som x x
P34932 Varmechok 70 kDa protein 4 x
P35232 prohibitin x
P35237 Serpin B6 x
P35443 Trombospondin 4 x
P35555 Fibrillin 1 x x
P35579 Myosin 9 x x x
P35580 Myosin 10 x x
P35609 Alpha actinin 2 x
P35625 Metalloproteinaseinhibitor 3 x x
P35998 26S protease regulatorisk underenhed 7 x
P36871 Phosphoglucomutase 1 x x
P36955 Pigmentepitel-afledt faktor x x
P37802 x x
P37837 transaldolase x
P38117 Elektron overførsel flavoprotein subunit beta x
P38646 Stress 70 protein mitokondriale forstadie x x
P39687 Syre-leucin-rige nukleare phosphoprotein 32-familiemedlem A x
P40121 Makrofag-capping protein x
P40925 Malat dehydrogenase cytoplasmatisk x
P40926 Malat dehydrogenase mitochondriale forstadie x
P41219 peripherin x
P42330 Aldo keto reductase familie 1 medlem C3 x
P45880 Spændingsafhængigt anionsselektivt kanalprotein 2 x
P47755 F actin capping protein subunit alfa 2 x x
P47756 F actin capping protein subunit beta x x
P47985 Ubiquinol cytochrom c reductase jern svovl subunit mitokondriale forstadie x
P48047 ATP syntase O subunit mitokondriale precursor x
P48637 Glutathionsyntetase x
P48741 Varmechok 70 kDa protein 7 x x
P49189 4 trimethylaminobutyraldehyddehydrogenase x
P49368 T kompleks protein 1 subenhed gamma x
P49747 Brusk-oligomert matrixprotein x x x x
P49748 Meget lang kædespecifik acyl CoA dehydrogenase mitokondriale precursor x
P50395 Rab GDP dissociation inhibitor beta x x </ Td>
P50454 Serpin H1 precursor x
P50995 Annexin A11 x
P51452 Dual specificity protein phosphatase 3 x
P51884 Lumican x x x x
P51888 Prolargin precursor x x x x
P52565 Rho GDP dissociation inhibitor 1 x
P52566 Rho GDP dissociation inhibitor 2 x
P54652 Varmechokrelateret 70 kDa protein 2 x x x x
P55072 Transitional endoplasmatisk reticulum ATPase x
P55083 Microfibril associeret glycoprotein 4 precursor x x
P57053 Histon H2B type F x
P60174 Triosephosphatisomerase x x x
P60660 Myosin-lyspolypeptid 6 x x
P60709 Actin cytoplasmatisk 1 x x x x
P60981 Destrin x
P61086 Ubiquitin-konjugerende enzym E2 25 kDa x
P61088 Ubiquitin-konjugerende enzym E2 x
P61224 Rasrelateret protein Rap 1b precursor x
P61978 Heterogent nukleært ribonukleoprotein K x x
P61981 14 3 3 protein gamma x x x
P62258 14 3 3 protein epsilon 14 3 3E x
P62491 Rasrelateret protein x
P62714 Serin threoninprotein phosphatase 2A katalytisk subunit beta isoform x
P62736 Actin aorta glat muskel x x x
P62805 Histon H4 x
P62826 GTP-bindende nukleært protein Ran x
P62873 Guaninukleotidbindende protein GIGSGT subunit beta 1 x
P62879 Guaninukleotidbindende protein GIGSGT subunit beta 2 x
P62937 Peptidyl prolyl cis trans isomerase A x x
P62987 Ubiquitin 60S ribosomalt protein L40 x
P63104 14 3 3 proTein zeta delta x x x x
P63241 Eukaryotisk translationsinitieringsfaktor 5A1 x
P63244 Guanin-nukleotidbindende proteinunderenhed beta 2 som 1 x
P63267 Actin gamma enterisk glat muskel x x
P67936 Tropomyosin alfa 4-kæde x
P68032 Actin alfa-hjertemuskel 1 x
P68104 Forlængelsesfaktor 1 alfa 1 x x x
P68133 Actin alfa skeletmuskel
P68363 Tubulin alfa 1B kæde x x x
P68371 Tubulin beta 2C kæde x x x
P68402 Blodpladeaktiverende faktor acetylhydrolase IB subunit beta x
P68871 Hemoglobin subunit beta x x x
P69905 Hemoglobin subunit alfa x x
P78371 T-kompleks protein 1 subenhed beta x
P78417 Glutathion transferase omega 1 x x
P80748 Ig lambda kæde VIII region LOI x
P98095 Fibulin 2 x x
Q01082 Spectrin beta kæde hjerne 1 x
Q01449 Myosin regulatorisk let kæde 2 atriel isoform x
Q01518 Adenylylcyclaseassocieret protein 1 x
Q01995 Transgelin Glat muskelprotein 22 alpha x
Q03252 Lamin B2 x x
Q03591 Komplement faktor H beslægtet protein 1 precursor x
Q04917 14 3 3 protein eta x x
Q06323 Proteasomaktivator kompleks subenhed 1 x
Q06828 Fibromodulin x x x x
Q06830 Peroxiredoxin 1 x x
Q07507 Dermatopontin x x x x
Q07960 Rho GTPase-aktiverende protein 1 x
Q08257 Quinonoxidoreduktase x
Q08431 Lactadherin x x
Q12765 SEcernin 1 x
Q13011 Delta 3 5 Delta 2 4 dienoyl CoA-isomerase mitochondriale precursor x x
Q13228 Selenbindende protein 1 x x
Q13404 Ubiquitin-konjugerende enzym E2-variant 1 x
Q13409 Cytoplasmisk dynein 1 mellemkæde 2 x
Q13509 Tubulin beta 3 kæde x x x
Q13642 Fire og en halv LIM-domæner protein 1 x
Q13765 Nascent polypeptidassocieret kompleks subunit alpha x
Q13885 N-tubulin beta 2A-kæde x x
Q14194 Dihydropyrimidinase-relateret protein 1 x
Q14195 Dihydropyrimidinase-relateret protein 3 x x x x
Q14624 Inter alpha trypsininhibitor tungkæde H4 precursor x
Q14697 Neutral alfa glucosidase AB precursor x
Q14764 Stort hvælveprotein x
Q14767 Latent transformerende vækstfaktor beta bindende protein 2 x x
Q14894 Mu-krystallinsk homolog-NADP-reguleret thyroidhormonbindende protein x
Q15063 Periostinprecursor x x x x
Q15084 Proteindisulfid-isomerase A6-precursor x
Q15113 Procollagen C endopeptidaseforstærker 1 precursor x
Q15181 Uorganisk pyrophosphatase x
Q15365 Poly rC bindingsprotein 1 x
Q15366 Poly rC bindingsprotein 2 x
Q15582 Omdannelse af vækstfaktor beta-induceret protein x x x
Q15819 Ubiquitin-konjugerende enzym E2-variant 2 x
Q16352 Alpha internexin x
Q16473 Putative tenascin XA x
Q16555 Dihydropyrimidinase-relateret protein 2 x x x
Q16698 2 4 dienoyl CoA reduktase mitochondriale precursor x
Q16891 Mitokondriel indre membran x
Q562R1 Beta aktin som protein 2 x
Q6S8J3 POTE ankyrin domæne familiemedlem E x
Q6UWY5 Olfactomedin som protein 1 precursor x x
Q71U36 Tubulin alfa 1A kæde x x x
Q7Z7G0 Mål for Nesh SH3 precursor x x x
Q8WUM4 Programmeret celledød 6 interaktionsprotein x
Q8WWX9 Thioredoxin som selenoprotein M precursor x
Q92597 Protein NDRG1 x
Q92945 Langt opstrøms elementbindende protein 2 x
Q96CN7 Isochorismatase-domæne indeholdende protein 1 x
Q96CX2 BTB POZ-domæne indeholdende protein x
Q96KK5 Histon H2A type 1 H x x
Q96KP4 Cytosolisk uspecifik dipeptidase x
Q99426 Tubulin-specifik chaperon B x
Q99497 Protein DJ 1 x x
Q99536 Synaptisk vesikel membranprotein x x x
Q99714 3 hydroxyacyl CoA dehydrogenase type 2 x
Q99715 Kollagen alfa 1 XII kæde x x
Q99798 Aconiter hydratase mitochondriale precursor x
Q9BQE3 Tubulin alfa 6 kæde x
Q9BUF5 Tubulin beta 6 kæde x x
Q9BUT1 3 hydroxybutyrat dehydrogenase type 2 x
Q9BVA1 Tubulin beta 2B kæde x x x
Q9BXN1 Asporin x x </ Td> x x
Q9H0W9 Esterhydrolase C11orf54 x
Q9H4B7 Tubulin beta 1 kæde x
Q9NRN5 Olfactomedin som protein 3 precursor x x
Q9NRV9 Heme bindende protein 1 x
Q9NSB2 Keratin type II cutikulær Hb4 x x
Q9NVA2 Septin 11 x
Q9UBR2 Cathepsin Z forløber x
Q9UBX5 Fibulin 5 x x
Q9UK22 F boks kun protein 2 x
Q9Y277 Spændingsafhængigt anionsselektivt kanalprotein 3 x
Q9Y281 Cofilin 2 x
Q9Y490 Talin 1 x
Q9Y696 Chlorid-intracellulært kanalprotein 4 x
Q9Y6C2 EMILIN 1 x x

Tabel 1: Liste over proteinerne identificeret i mitralventilvævsekstraktet, når der blev anvendt fire forskellige proteomiske fremgangsmåder: todimensionel elektroforese (2-DE), todimensionel LC-MS E (2D-LC / MSE), LC / MS E og flydende fase IEF. Fremgangsmåden ved hvilken hvert protein blev identificeret er rapporteret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Et kritisk trin i denne protokol er brugen af ​​flydende nitrogen til at fryse prøven og afkøle grindersystemet. Brug af flydende nitrogen forhindrer biologisk nedbrydning og giver mulighed for effektiv pulverisering, men det kræver specifik træning for sikker håndtering.

I denne protokol er der et slibesystem til prøveslibning, fordi små prøver er vanskelige at genvinde fra standard mørtel og pistler. I dette tilfælde spredte små prøver som et fint pulver over mørteloverfladen, hvilket gør indsamling vanskeligt. En anden fordel er, at kværnen er motoriseret, hvilket gør det muligt for et større antal prøver at blive behandlet på en reproducerbar måde og uden ekstra træthed. En begrænsning ved brugen af ​​en slibemaskine er, at prøven skal være lille (100 mg eller mindre) for at pestlen skal presses effektivt mod mørtel. Endvidere skal kværnkomponenterne opvarmes til stuetemperatur mellem anvendelser til rengøring g. Derfor er proceduren tidskrævende, og hvis mange prøver behandles dagligt, er der brug for mange sæt.

Et yderligere kritisk trin er fremstillingen af ​​ekstraktionsbufferen. Saltkoncentrationerne, især for urea (8 M) og thiourinstof (2 M), er ret høje; Således er saltmængden næsten halvdelen af ​​opløsningens totale volumen. Desuden er opløsningen ikke let i betragtning af, at varme skal undgås, fordi urinstof ved mere end 37 ° C kan føre til proteincarbamylering ved N-terminalerne af proteiner / peptider og ved sidekædeaminogrupperne af lysin- og argininrester 17 . Når opløsningen er opløst, skal urinstofpufferen filtreres med 0,22 μm filtre og kan opbevares ved -80 ° C i 4 uger uden at påvirke dets ekstraktionseffektivitet, men den skal opvarmes til mere end 15 ° C før brug for at muliggøre fuldstændig opløsning .

Ændringer og fejlfinding

I denne protokol udføres proteinekstraktion ved anvendelse af den beskrevne urinstofpuffer, fordi den er en af ​​de mest anvendte proteinekstraktionsløsninger til proteomiske undersøgelser på grund af dets kompatibilitet med isoelektrofokusering og dens effektivitet ved opløsning af sparsomt opløselige proteiner 18. Det har været Demonstreret, at denne buffer meget effektivt kan opløse de sparsomt opløselige proteiner, såsom integrerede membranproteiner 19 eller proteiner, der er meget tilbøjelige til aggregering, såsom tubulin 18. Endvidere er denne buffer fuldstændig kompatibel med Bradford-analysen for at bestemme proteinkoncentrationen, og Det kan anvendes direkte i 2-DE og flydende fase IEF analyser.

Imidlertid er denne buffer ikke ideel til opløsning af alle proteiner, der er til stede i en prøve. Det er muligt, at forskellige ekstraktionsbuffere kunne afsløre proteiner, der ikke kan påvises ved denne protokol. For eksempel er det godt knoDa ribosomale og nukleare proteiner bedre kunne ekstraheres med syreekstraktion eller trichloreddikesyre / acetoneudfældning 20 , mens alkaliske pH-niveauer er mere egnede til membranproteiner 21 , 22 . Anvendelsen af ​​alternative buffere kan derfor kræve yderligere trin til proteinudfældning for at eliminere salte der interfererer med 2-DE eller flydende fase IEF.

Begrænsninger af teknikken

Antallet af proteiner identificeret ved denne protokol er forholdsvis lavt, men antallet af identifikationer og dækningen af ​​proteomanalysen kan yderligere forøges ved brug af mere moderne instrumenter, hvis massens nøjagtighed og sekvenseringshastighed er steget dramatisk i de sidste par år 23. Det er muligt at dække en stor del af proteomet uden nogen forfractioneringstrin ved at anvende en lang gradient for flydende chRomatografiseparationer kombineret med et MS-instrument med høj opløsning, der har en hurtig sekvenseringshastighed 24 .

Betydningen af ​​teknikken med hensyn til eksisterende / alternative metoder

Evnen til at identificere og kvantificere proteiner i de menneskelige hjerteventiler, såsom mitralventilen, er en vigtig og udfordrende opgave, som vil bidrage til at belyse mekanismerne for fysiologiske / patologiske processer i ventilsygdomme. Definering af ændringerne af mitralventilproteomet vil i høj grad øge forståelsen af ​​arten af ​​de biologiske processer, som er forbundet med sygdoms tilstand af vævet.

Den nuværende viden om mitralventilens fysiopatologi er begrænset og opnås generelt ved analyse af individuelle proteiner involveret i specifikke processer, såsom ekstracellulær matrix-remodeling, hæmostase, inflammation eller oxidativ stress 25 9 , 10 .

Manglen på omfattende proteomiske undersøgelser kan tilskrives kompleksiteten af ​​dette lavcellulært væv, der er stærkt rigt på ekstracellulære matrixproteiner ( dvs. proteoglycaner, collagen og elastin). Disse proteiner udgør ca. 80% af det totale antal, hvilket hæmmer analysen af ​​lavmængdeproteiner 26 .

Det var således nødvendigt at etablere en effektiv ekstraktionsprotokol for at maksimere proteinopløseliggørelse for at beskrive proteomet af dette væv. Denne protokol tillod ekstraktionen af ​​~ 50 μg protein fra 1 mg væv. Dette er et relativt lavt udbytte i sammenligning med "blødt" væv, sådanSom lever (~ 135 μg fra 1 mg væv), men det er tilstrækkeligt at udføre en proteinanalyse på individuelle prøver. Dette er særlig relevant, når man definerer en fænomenes intra-individuelle variabilitet.

Desuden har denne metode den fordel at være kompatibel med mange analytiske applikationer. Mitralventilproteinerne opløst i den foreslåede ekstraktionsbuffer kan anvendes direkte til immunblotting og proteomanalyse baseret på tvådimensionel elektroforese og væskefaseisoelektroforese 11 , 12 eller efter proteinpræcipitation for at eliminere bufferkomponentinterferens for andre analyser, såsom Gel-fri massespektrometri 15 .

Ved anvendelse af denne ekstraktionsprotokol er der opnået en mere udtømmende karakterisering af proteinkomponenterne i det normale mitralventilvæv ved identifikation af mange intracelLulære proteiner. Disse proteiner er lokaliseret i cytosol eller i organeller, ikke kun i den ekstracellulære matrix, og har forskellige molekylære og biologiske funktioner. Andre interessante proteiner ( dvs. CryAB, septin-11, FHL-1 og dermatopontin) blev også identificeret. Disse proteiner har ukendte funktioner i mitralventilen, men deres biologiske egenskaber indikerer en mulig rolle i ventilsygdomme.

Fremtidige applikationer eller retninger efter mastering af denne teknik

Med denne protokol er det muligt at korrelere data vedrørende proteinekspression med data om kvantitativ mRNA-ekspression og ikke-kvantitative immunhistokemiske analyser. Faktisk vil disse tilgange, når de bruges sammen, føre til en mere omfattende forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for sygdom, fra mRNA til posttranslationel proteinmodifikation. Således kan denne metode være af interesse for forskere fokuseret på hjerteventil-fysiopatologi. finAllieret kan denne protokol også anvendes på porcin mitralventilen, som har en tæt lighed med den humane ventil 27 og anvendes som en eksperimentel model til evaluering af ventilfunktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Det italienske sundhedsministerium støttede denne undersøgelse (RC 2013-BIO 15). Vi takker Barbara Micheli for sin fremragende tekniske assistance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5, (12), 1512-1526 (2009).
  3. Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422, (6928), 226-232 (2003).
  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
  5. Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
  6. Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4, (9), 1123-1140 (2012).
  7. Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62, (4), 605-611 (2004).
  8. Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104, (21), 2525-2532 (2001).
  9. Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
  10. Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15, (17), 2934-2944 (2015).
  11. Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38, (5), 341-350 (2010).
  12. Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9, (5), 1344-1352 (2009).
  13. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193, (1), 265-275 (1951).
  14. Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85, (2), 208-217 (1999).
  15. Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37, (20), 2633-2643 (2016).
  16. Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
  17. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  18. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18, (3-4), 307-316 (1997).
  19. Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21, (6), 1054-1070 (2000).
  20. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2, (6), 1445-1457 (2007).
  21. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93, (1), 97-102 (1982).
  22. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, (12), 3665-3685 (2004).
  23. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (47), 18132-18138 (2008).
  24. Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10, (8), M110.003699 (2011).
  25. Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151, (2), 129-135 (2011).
  26. Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118, (18), 1864-1880 (2008).
  27. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53, (5), 432-438 (2014).
Optimeret protokol til ekstraktion af proteiner fra humanmitralventilen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).More

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter