Summary
De eiwitsamenstelling van de menselijke mitrale klep is nog steeds gedeeltelijk onbekend, omdat de analyse ervan gecompliceerd is door lage cellulariteit en derhalve door biosynthese met een lage eiwit. Dit werk biedt een protocol om eiwit efficiënt te extraheren voor de analyse van het mitrale klep proteome.
Abstract
Analyse van het cellulaire proteome kan bijdragen tot het verhelderen van de moleculaire mechanismen die aanliggende ziekten zijn door de ontwikkeling van technologieën die de grootschalige identificatie en kwantificering van de eiwitten in complexe biologische systemen mogelijk maken. De kennis die wordt verkregen uit een proteomische benadering kan mogelijk leiden tot een Beter inzicht hebben in de pathogene mechanismen die onderliggende ziekten liggen, waardoor de diagnose van nieuwe diagnostische en prognostische ziekte markers mogelijk wordt gemaakt, en hopelijk van therapeutische doelen. Echter, de cardiale mitrale klep vertegenwoordigt een zeer uitdagend monster voor proteomische analyse vanwege de lage cellulariteit in proteoglycan en collageenverrijkte extracellulaire matrix. Dit maakt het uitdagend om eiwitten te extraheren voor een globale proteomische analyse. Dit werk beschrijft een protocol dat compatibel is met latere eiwitanalyse, zoals kwantitatieve proteomics en immunoblotting. Dit kan voor de correlatie van gegevens zorgenG eiwit expressie met gegevens over kwantitatieve mRNA expressie en niet-kwantitatieve immunohistochemische analyse. Inderdaad zullen deze benaderingen leiden tot een uitgebreider begrip van de moleculaire mechanismen die onderliggende ziekten liggen, van mRNA tot post-translatie eiwitmodificatie. Zo kan deze methode relevant zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de studie van hartklep-fysiopathologie.
Introduction
Recent bewijsmateriaal heeft het begrip van de rollen van de vele regulerende mechanismen die na mRNA synthese optreden veranderd. Inderdaad kunnen translatie-, post-transcriptie- en proteolytische processen het eiwit overvloed en functie regelen. Het dogma - dat zegt dat mRNA concentraties proxies zijn aan die van de bijbehorende eiwitten, in het veronderstellen dat transcriptieniveaus de belangrijkste determinant van eiwit overvloed zijn - is gedeeltelijk herzien. In het begin voorspellen transcriptieniveaus slechts gedeeltelijk eiwit overvloed, wat suggereert dat posttranscriptiegebeurtenissen Voorkomen dat de eiwitten in cellen 1 , 2 gereguleerd worden .
Bovendien dicteert eiwitten uiteindelijk de functie van de cel en dicteert daarom zijn fenotype, dat dynamische veranderingen kan ondergaan in reactie op autocrine, paracriene en endocriene factoren; Bloedgedragen bemiddelaars; temperatuur; behandeling met geneesmiddelen; En ziekte ontwikkelenment. Zo is een expressieanalyse gericht op het eiwitgehalte bruikbaar om het proteome te karakteriseren en de kritische veranderingen die erin voorkomen, te ontrafelen als onderdeel van ziektepatogenese 3 .
Daarom zijn de mogelijkheden die proteomics presenteren om de gezondheids- en ziekteomstandigheden te verduidelijken, ondanks de huidige technologische uitdagingen formidabel. De bijzonder veelbelovende onderzoeksgebieden waaraan proteomics kunnen bijdragen, omvat: het identificeren van gewijzigde eiwituitdrukking op elk niveau ( dwz hele cellen of weefsel, subcellulaire compartimenten en biologische vloeistoffen); De identificatie, verificatie en validatie van nieuwe biomarkers die nuttig zijn voor de diagnose en prognose van de ziekte; En hopelijk de identificatie van nieuwe eiwitdoelstellingen die ter therapeutische doeleinden kunnen worden gebruikt, alsmede voor de beoordeling van de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen 4 .
Het vastleggen van de complexiteit vanHet proteome vertegenwoordigt een technologische uitdaging. De huidige proteomische instrumenten bieden de mogelijkheid om op grote schaal analyses uit te voeren voor de identificatie, kwantificering en validatie van gewijzigde eiwitniveaus. Daarnaast heeft de introductie van fractionerings- en verrijkingstechnieken, die gericht zijn op het vermijden van de interferentie veroorzaakt door de meest overvloedige eiwitten, ook verbeterde eiwitidentificatie door de minste overvloedige eiwitten te omvatten. Tenslotte is proteomics aangevuld met de analyse van post-translational modificaties, die zich als belangrijke modulatoren van eiwitfunctie voordoen.
De monstervoorbereiding en het eiwitherstel in de biologische monsters onder analyse blijven echter de beperkende stappen in de proteomische workflow en vergroten het potentieel voor mogelijke valkuilen 5 . Inderdaad, in de meeste moleculaire biologie technieken die moeten worden geoptimaliseerd, zijn de eerste stappen tissue homogenizatIon- en cellysis, in het bijzonder tijdens de analyse van eiwitten met weinig overvloed waarvoor geen amplificatiemethoden bestaan. Bovendien kan de chemische aard van eiwitten hun eigen herstel beïnvloeden. Bijvoorbeeld, de analyse van zeer hydrofobe eiwitten is zeer uitdagend omdat ze gemakkelijk neerslaan tijdens isoelectrische focus, terwijl transmembraan eiwitten bijna onoplosbaar zijn (in Referentie 5 onderzocht). Bovendien vormt de variatie van de weefselsamenstelling een belangrijke barrière voor het ontwikkelen van een universele extractiemethode. Ten slotte, omdat bijna alle klinische exemplaren van beperkte hoeveelheid zijn, is het essentieel om eiwitbereiding mogelijk te maken met maximaal herstel en reproduceerbaarheid van minimale monsterhoeveelheden 6 .
Dit werk beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor extractie van eiwitten uit de normale menselijke hart mitralisklep, die een zeer uitdagend monster voor proteomische analyse vertegenwoordigt. De normale mitrale klep is een compLex structuur tussen het linker atrium en de linker hartslag van het hart ( figuur 1 ). Het speelt een belangrijke rol in de controle van de bloedstroom van het atrium naar de ventrikel, het voorkomen van terugstroom en het verzekeren van de juiste zuurstofvoorziening aan het hele lichaam, waardoor een adequate hartuitgang wordt behouden. Het wordt echter vaak beschouwd als een "inactief" weefsel, met een lage cellulariteit en weinig componenten, voornamelijk in de extracellulaire matrix. Dit komt doordat de inwendige valvulaire interstitiële cellen (VIC's) onder normale omstandigheden een stil fenotype met een biosynthese van lage proteïnen 7 voordoen.
Er is echter aangetoond dat in een pathologische toestand het aantal VICs in de spongiosa toeneemt en hun proteïnesynthese geactiveerd wordt, samen met andere functionele en fenotypische veranderingen 8 . Daarom is het niet verwonderlijk dat de minimale gegevens die beschikbaar zijn inDe literatuur richt zich op de analyse van pathologische mitrale kleppen 9 , 10 , waarin het verhoogde aantal geactiveerde VIC's het relatief hoge aantal geïdentificeerde eiwitten kan verklaren.
Ten slotte kan het onderhavige protocol dienen om het begrip van de pathogene mechanismen die verantwoordelijk zijn voor mitrale klepziekten te ontwikkelen door middel van het bestuderen van mitrale klep eiwit componenten. Inderdaad, een beter begrip van de onderliggende pathologische processen kan bijdragen tot het verbeteren van het klinisch beheer van klepziekten, waarvan de huidige indicaties voor interventie grotendeels op hemodynamische overwegingen zijn gebaseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In dit protocol worden de menselijke harten verzameld tijdens multi-organische explantatie (koude ischemietijd van 4-12 uur, gemiddeld 6 ± 2 uur) van multi-orgaandonoren die om technische of functionele redenen uitgesloten zijn van orgaantransplantatie, ondanks normale echocardiografische parameters. Ze worden gestuurd naar de Cardiovasculaire Weefselbank van Milaan, het Cardiologisch Centrum van Monzino (Milaan, Italië) voor het bankieren van de aorta- en longventielen. De mitrale posterior folders worden niet voor klinische doeleinden gebruikt, dus ze worden verzameld tijdens de aorta- en pulmonale klepisolatie nadat de toestemming van de donors verworven is. Het weefsel voor transplantatie en onderzoek wordt alleen verzameld na toestemming van de ouders; Op het toestemmingsblad machtigen ze (of niet) het gebruik van het hartweefsel voor onderzoek alleen als het niet geschikt is voor menselijk klinisch gebruik ( dwz microbiologische, functionele en serologische problemen), volgens de richtlijnen van de ethische commissie vanMonzino Cardiologic Center.
1. Mitralklepbereiding
- Oog de menselijke mitrale klep zo snel mogelijk na organische explantatie (koude ischemietijd van 4-12 uur).
- Verwijder in een schone kamer het hart uit de transporttas met een koude (4 ° C) oplossing ( bijv. Zoutoplossing of evenwichtig medium Eurocollins of Wisconsin). Zet het in een emmer en plaats het in een biosafety-kast (biohazard verticale luchtstroom, klasse A, Good Manufacturing Practices (GMP) classificatie) om verder te gaan met de klepbereiding.
- Plaats het hart op een steriele wegwerpdoek in de kast. Snijd het hart volledig, loodrecht op de hoofdas, op het niveau van de linker en rechter ventrikels, ongeveer 4 cm van de top, met behulp van een steriele wegwerpschaalpel.
- Beweeg de oplopende aorta en longslagader om het linker atriale dak weer te geven.
- Met steriele autoclavable tang en picks, snijd de linker auricle op deLinker atriumdak, waardoor de mitralklep zichtbaar is en het mogelijk maakt de grote mitrale leaflet (anterior) en de kleine mitrale leaflet (posterior) te identificeren.
OPMERKING: Antero-laterale en de achterste mediale commissies definiëren de grens van de voorste folder en het achterste gedeelte. - Ontleed het linkeratrium en de ventrikelwanddikte rond de omtrek van de hele mitrale klep met behulp van steriele autoclaverbare scharen en niet-traumatische tang .
- Identificeer de continuïteit van de mitro-aorta klep.
OPMERKING: De linker ventrikel bevat de hele mitrale klep en akkoorden. - Scheep de anterior mitralklepje uit de posterior mitralklepje, snijd de posterior folder langs de insteek met de ventrikel (commissuur).
- Was de posterior folder in de zoutoplossing. Knip de folder in kleine stukken (<1 cm 2 ) en plak ze individueel in aluminiumfolie. Bevroren ze met vloeibare stikstof.
Let op: Volg de veiligheidswerkzaamheden bij het gebruik van vloeibaar stikstof.- Maak de tafel van de kast schoon met een 70% isopropylalcoholoplossing en 6% waterstofperoxideoplossing aan het einde van de procedure.
2. Proteïne extractie
- Gebruik pincet om het monster op te slaan die in vloeibare stikstof is opgeslagen en plaats het op droogijs onmiddellijk terwijl het nog in de aluminiumfolie wordt verpakt. Laat het monster niet ontdooien tijdens overdrachten.
- Voor het slijpen, koud de porselein / zirkonium mortel en stamper van een grindersysteem ( bijv. CryoGrinder), samen met het monster, door ze in een Dewar-fles met vloeibare stikstof (~ 500 ml) te plaatsen.
Let op: Volg de veiligheidswerkzaamheden bij het gebruik van vloeibaar stikstof. - Zet de mortel en de stamper in een polystyreen doos met droogijs. Verwijder het monster uit de aluminiumfolie en steek het in de mortel.
- Grind tHij proeft met de grote stamper tegen de mortel 15-20 keer, met behulp van de schroevendraaier om de stamper te draaien. Meng het monster tijdens het slijpproces met de punt van een voorgekoelde spatel.
- Herhaal met de kleine stamper.
- Breng het grondmonster over op een eerder gewogen buis ( bv. 15 ml centrifugebuis) door de buis om te zetten, plaats het over de mortel en draai ze om elkaar om het monster naar de buis te verplaatsen. Gebruik een voorgekoelde spatel om het materiaal van de mortel te herstellen.
- Houd de buis met het monster op droog ijs om te voorkomen dat het ontdooien tijdens de overdracht.
- Bereken het netto gewicht van het monster.
- Reinig de mortel en de stamper na elk monster en ontreinig ze door autoclaven of verwarm ze bij 200 ° C gedurende 2 uur.
- Breng het poedervormige monster uit de centrifugebuis door de inversie naar de glazen buis van een homogenisator.
- Voeg gefilterde ureumbuffet toeR (8 M ureum, 2 M thiourea, 4% w / v CHAPS, 20 mM Tris en 55 mM dithiotreitol) aan de glazen buis, 200 μl ureumbuffer voor elke 10 mg poederstof.
OPMERKING: Residueel poedermonster dat in de centrifugebuis achterblijft, kan worden hersteld met behulp van een deel van het berekende volume ureumbuffer. - Homogeniseer het monster met behulp van een roerder uitgerust met een borosilicaatglasmortel en een polytetrafluorethyleen (PTFE) stamper. Druk langzaam de stamper op het monster met een draaiende beweging (1500 rpm) 10 keer.
- Herstel de supernatant en verplaats deze naar een schone 1,7 ml centrifugebuis. Trek het resterende monster opnieuw uit met verse ureumbuffer en voeg de helft toe van het volume dat tijdens de eerste extractie werd gebruikt.
- Herhaal stap 2.10.
- Herstel de supernatant en combineer deze met de supernatant uit stap 2.11. Plaats de gecombineerde supernatant gedurende 30 minuten op een buisrotator.
- Centrifugeer de buis gedurende 30 minuten bij 13.000 xg en 4 ° C.
- Herstel de supernatant anD de eiwitconcentratie meten volgens de Bradford-eiwitmeting, volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar het monster bij -80 ° C tot aan het gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De extractie en ontbinding van eiwitten in de ureumbuffer is direct verenigbaar met proteomische methoden op basis van isoelectrofocusing (tweedimensionale elektroforese (2-DE) 11 en vloeibare fase isoelektrische focusing (IEF) 12 ) en met immunoblotting na verdunning in Laemmli buffer 13 Bevattende een proteaseremmerscocktail 14 .
Voor gelvrije massaspectrometrie gebaseerde methoden ( dat wil zeggen vloeistofchromatografie gekoppeld aan data-onafhankelijke massaspectrometrie analyse (LC / MS E ) en tweedimensionale LC / MS E (2D-LC / MS E )) 15 , de monsters geëxtraheerd In de beschreven ureumbuffer moet verder worden behandeld om het ureum en thioureum te elimineren, die zou kunnen interfereren met de daaropvolgende eiwitvertering en vloeistofchromatografische scheiding. ThiS ontzilting stap kan worden bereikt met behulp van de commerciële eiwit neerslag kits, volgens de instructies van de fabrikant om de eiwitten te precipiteren. Het monster kan vervolgens worden opgelost in 25 mM NH4HCO3 die 0,1% splijbare detergentia bevat voor eiwitvertering 16 . De neerslag van de eiwitten kan buffercomponenten elimineren, waardoor het eiwitgehalte minimaal wordt beïnvloed (eiwitherstel:> 85%), waardoor het monster geschikt is voor elke soort analyse.
De toepassing van dit protocol voor eiwitxtractie van humane mitralkleppen toegestaan voor de identificatie van in totaal 422 eiwitten, waarbij vier verschillende proteomische benaderingen worden gecombineerd die eerder beschreven in detail 11 , 15 zijn . Specifiek werden 169 eiwitten geïdentificeerd door 2-DE, 330 eiwitten door vloeibare fase IEF, 96 eiwitten door LC / MS E en 148 eiwittenDoor 2D-LC / MS E (tabel 1).
Om de 422 geïdentificeerde eiwitten in termen van subcellulaire lokalisatie te classificeren, werd een software gebruikt voor de gen ontologie (GO) analyse (bijvoorbeeld Cytoscape). Het netwerk dat is gecreëerd met de software en de bijbehorende plug-in bleek dat naast de verwachte eiwitten gelokaliseerd in het extracellulaire gebied (zie het rechterboven gedeelte van figuur 2 ), de meeste eiwitten die werden geïdentificeerd door de proteomische benaderingen, afkomstig waren uit het intracellulaire gebied ( Dwz cytoplasma, organellen, vesicles en cytoskelet). Cell-oppervlakte eiwitten werden ook geïdentificeerd ( Figuur 2 ).
Resultaten werden verder bevestigd in drie onafhankelijke mitrale klepmonsters. Immunoblotting werd gebruikt om een groep van vier eiwitten te analyseren ( dwz septine-11, vier en een half LIM-domeinen eiwit 1 (FHL-1), derMatopontine en alfa-kristalline B (CryAB)) die nog nooit in de normale mitrale klep zijn geïdentificeerd ( figuur 3 ).
Figuur 1: Mitrale klepstructuur. Bovenaanzicht van het menselijke hart dat de gesloten ( A ) of open ( B ) menselijke mitrale klep toont. Vooraanzicht van de linker ventrikel van een menselijk hart ( C ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Analyse van de geïdentificeerde mitrale klep eiwitten in termen van cellulaire verdeling. Cytoscape en de plugin BiNGO waren gebruikt om obtai te gebruikenN de verdeling van gen ontologie (GO) termen uit de celcomponentcategorieën. De cirkelgrootte is evenredig aan het aantal eiwitcomponenten die verband houden met de geselecteerde GO-termen, en de kleurenschaal voor de p-waarde van de oververtegenwoordiging wordt gerapporteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Immunoblottende analyse van septin-11, FHL-1, dermatopontine en CryAB in geheel extract uit drie menselijke normale mitrale klepjes. Immunoblotting werd uitgevoerd met gebruikmaking van monoklonaal monoklonaal antilichaam tegen CryAB en konijn polyclonale antilichamen tegen de septine-11, FHL-1 en dermatopontine antilichamen. alsjeblieftKlik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
| toetreding | Beschrijving | 2-DE | 2D-LC | LC-MS E | Vloeibare fase IEF |
| A6NMZ7 | Collageen alfa VI | X | |||
| O00151 | PDZ- en LIM-domeinproteïne 1 | X | |||
| O00299 | Chloride intracellulaire kanaal eiwit 1 | X | |||
| O00764 | Pyridoxale kinase | X | |||
| O14558 | Warmte schok eiwit bèta 6 | X | |||
| O43399 | Tumor eiwit D54 | X | |||
| O43488 | Aflatoxine B1-aldehyde-reductase-lid 2 | X | |||
| O43707 | Alpha actinine 4 | X | X | ||
| O43866 | CD5 antigeen zoals precursor | X | |||
| O60493 | Sorteer Nexin 3 | X | |||
| O60701 | UDP glucose 6 dehydrogenase | X | |||
| O75223 | Ongekarakteriseerd eiwit | X | |||
| O75368 | SH3 domein bindend glutaminezuur rijk aan eiwit | X | |||
| O75390 | Citraat synthase mitochondriale precursor | X | |||
| O75489 | NADH dehydrogenase ubiquinon ijzer zwavel eiwit 3 mitochondriale precursor | X | X | ||
| O75608 | Acyl eiwit thioesterase 1 | X | |||
| O75828 | Carbonylreductase NADPH 3 | X | |||
| O75874 | Isocitraat dehydrogenase NADP cytoplasmatische | X | |||
| O75955 | Flotillin | X | |||
| O94760 | NG NG dimethylarginine-dimethylaminohydrolase 1 | X | |||
| O94788 | Retinale dehydrogenase 2 | X | |||
| O95865 | NG NG dimethylarginine-dimethylaminohydrolase 2 | X | X | ||
| P00325 | Alcoholdehydrogenase 1B | X | X | ||
| P00338 | L lactaat dehydrogenase A ketting | X | |||
| P00352 | Retinale dehydrogenase 1 | X | |||
| P00441 | Superoxide dismutase Cu Zn | X | X | ||
| P00450 | Ceruloplasmin voorloper | X | X | ||
| P00488 | Coagulatiefactor XIII Een ketenvoorloper | X | |||
| P00491 | Purine nucleoside fosforylase | X | |||
| P00492 | Hypoxanthine guanine fosforibosyltransferase | X | |||
| P00558 | Fosfoglyceraatkinase 1 | <td> xX | X | ||
| P00568 | Adenylaatkinase isoenzym 1 | X | |||
| P00734 | protrombine | X | X | ||
| P00738 | haptoglobin | X | X | X | X |
| P00739 | Haptoglobine gerelateerde eiwitvoorloper | X | |||
| P00751 | Complement factor B | X | X | X | |
| P00915 | Koolzuuranhydrase 1 | X | |||
| P00918 | Koolstofanhydrase 2 | X | |||
| P01008 | Antitrombine III voorloper | X | X | X | |
| P01009 | Alpha 1 antitrypsine | X | X | X | X |
| P01011 | Alpha 1 antichymotrypsine | X | X | X | X |
| P01019 | Angiotensinogene voorloper | X | X | ||
| P01023 | Alpha 2 macroglobuline | X | X | ||
| P01024 | Complement C3 | X | X | X | X |
| P01033 | Metalloproteïnaseremmers 1 voorloper | X | |||
| P01042 | Kininogen 1 voorloper | X | |||
| P01593 | Ig kappa keten VI regio AG | X | |||
| P01598 | Ig kappa keten VI regio EU | X | |||
| P01600 | Ig kappa keten VI gebied Hau | X | X | ||
| P01611 | Ig kappa keten VI gebied Wes | X | |||
| P01620 | Ig kappa keten V III regio SIE | X | |||
| P01625 | Ig kappa keten V IV regio Len | X | |||
| P01766 | Ig zware keten V III regio BRO | X | X | ||
| P01781 | Ig zware keten V III regio GAL | X | |||
| P01834 | Ig kappa keten C gebied | X | X | X | X |
| P01842 | Ig lambda keten C gebieden | X | X | X | |
| P01857 | Ig gamma 1-keten C gebied | X | X | X | X |
| P01859 | Ig gamma 2-keten C-gebied | X | X | X | X |
| P01860 | Ig gamma 3-keten C-gebied | X | X | X | |
| P01861 | Ig gamma 4-keten C gebied | X | X | X | |
| P01871 | Ig mu-keten C gebied | X | X | X | |
| P01876 | Ig alfa 1-keten C-gebied | X | X | X | X |
| P01877 | Ig alfa 2-keten C-gebied | X | |||
| P02144 | myoglobin | X | X | ||
| P02452 | Collageen alfa 1 I ketting | X | X | X | X |
| P02511 | Alpha crystalline B-keten | X | |||
| P02545 | Lamine AC 70 kDa laminaat | X | X | X | X |
| P02647 | Apolipoproteïne Al | X | X | X | X |
| P02649 | Apolipoproteïne E | X | X | X | X |
| P02671 | Fibrinogeen alfa keten | X | X | X | X |
| P02675 | Fibrinogeen bèta ketting | X | X | X | X |
| P02679 | Fibrinogeen gamma keten | X | X | X | X |
| P02689 | Myelin P2 eiwit | X | |||
| P02735 | Serumamyloïde Een eiwitvoorloper | X | |||
| P02741 | C reactieve eiwit precursor | X | |||
| P02743 | Serum amyloïde P component | X | X | X | X |
| P02746 | Complement C1q subcomponent subeenheid B | X | X | ||
| P02747 | Complement C1q subcomponent subeenheid C precursor | X | |||
| P02748 | Complementcomponent C9 | X | X | X | |
| P02749 | Beta 2 glycoproteïne 1 | X | X | X | X |
| P02750 | Leucine rijke alfa 2 glycoproteïne precursor | X | |||
| P02751 | fibronectine | X | X | ||
| P02760 | AMBP eiwit precursor | X | X | X | X |
| P02763 | Alpha 1 zuur glycoproteïne 1 | X | X | X | |
| P02765 | Alpha 2 HS glycoproteïne precursor | X | |||
| P02766 | Transthyretin voorloper | X | X | X | |
| P02768 | Serumalbumine | X | X | X | X |
| P02774 | Vitamine D bindende eiwit precursor | X | |||
| P02787 | serotransferrinevoorloper | X | X | X | X |
| P02788 | Lactotransferrine precursor | X | |||
| P02790 | Hemopexine | X | X | X | X |
| P02792 | Ferritine lichte ketting | X | |||
| P04004 | vitronectine | X | X | X | X |
| P04075 | Fructose bisfosfaat aldolase A | X | |||
| P04083 | Bijlage A1 | X | X | X | X |
| P04179 | Superoxide dismutase Mn mitochondriale precursor | X | |||
| P04196 | Histidine rijke glycoproteïne precursor | X | |||
| P04217 | Alpha 1B glycoproteïne precursor | X | X | ||
| P04350 | Tubuline Bèta 4-keten | X | |||
| P04406 | Glyceraldehyde 3 fosfaat dehydrogenase | X | X | X | X |
| P04792 | Warmte schok eiwit beta 1 | X | X | X | X |
| P05091 | Aldehyde dehydrogenase mitochondriale voorloper | X | X | ||
| Plasmaprotease C1 inhibitor precursor | X | ||||
| P05156 | Complement factor I precursor | X | |||
| P05413 | Vetzuur bindend eiwit hart | X | |||
| P05452 | Tetranectine precursor TN | X | X | ||
| P05787 | Keratine type II cytoskeletaal 8 | X | |||
| P06396 | gelsoline | X | X | X | X |
| P06576 | ATP synthase subeenheid beta-mitochondriale voorloper | X | X | ||
| P06732 | Creatine kinase M type | X | X | ||
| P06733 | Alpha enolase | X | X | X | X |
| P06753 | Tropomyosine alfa 3-keten | X | X | ||
| P07108 | Acyl CoA bindend eiwit | X | |||
| P07195 | L lactaat dehydrogenase B keten | X | X | X | |
| P07196 | Neurofilament licht polypeptide | X | |||
| P07197 | Neurofilament medium polypeptide | X | X | ||
| P07237 | Proteïne disulfide isomerase voorloper | X | X | ||
| P07339 | Cathepsin D voorloper | X | X | ||
| P07355 | Bijlage A2 | X | X | X | X |
| P07360 | Complement C8 gamma keten voorloper | X | |||
| P07437 | Tubuline bèta ketting | X | X | X | X |
| P07585 | decorine | X | X | X | X |
| P07737 | Profilin 1 | X | |||
| P07858 | Cathepsin B voorloper | X | |||
| P07900 | Hitte schok eiwit HSP 90 alpha | X | X | ||
| P07951 | Tropomyosine beta chain | X | |||
| P07954 | Fumaraat hydratase mitochondriale precursor | X | |||
| P07996 | Trombospondine 1 | X | X | X | |
| P08107 | Warmte schok 70 kDa eiwit 1A 1B | X | X | X | X |
| P08123 | Collageen alfa 2 I ketting | X | X | X | X |
| P08133 | Bijlage A6 | X | X | ||
| P08238 | Warmte schok eiwit HSP 90 beta | X | X | ||
| P08253 | 72 kDa type IV collagenase voorloper | X | |||
| P08294 | Extracellulaire superoxide dismutase Cu Zn precursor | X | X | X | |
| P08590 | Myosine-lichtpolypeptide 3 | X | X | ||
| P08603 | Complement factor H | X | X | X | X |
| P08670 | vimentine | X | X | X | X |
| P08729 | Keratine type II cytoskeletaal 7 | X | |||
| P08758 | Bijlage A5 | X | X | X | X |
| P09211 | Glutathion S transferase P | X | X | X | |
| P09382 | Galectin 1 | X | X | X | |
| P09417 | Dihydropteridine reductase | <td> | X | ||
| P09493 | Tropomyosine 1 alfa ketting | X | X | ||
| P09525 | Bijlage A4 | X | X | ||
| P09651 | Heterogene nucleaire ribonucleoproteïne Al | X | |||
| P09871 | Component C1s subcomponent voorloper | X | |||
| P09936 | Ubiquitine carboxyl terminale hydrolase isozym L1 | X | |||
| P09972 | Fructose bisfosfaat aldolase C | X | |||
| P0C0L4 | Complement C4 Een voorloper | X | |||
| P0CG05 | IgLambda 2 keten C gebieden | X | |||
| P0CG38 | POTE ankyrine domein familielid I | X | |||
| P10515 | Dihydrolipoyllysine residu acetyltransferase component van pyruvate dehydrogenase complex | X | |||
| P10768 | S-formylglutathionhydrolase | X | |||
| P10809 | 60 kDa warmtechok eiwit mitochondriale precursor | X | |||
| P10909 | clusterin | X | X | X | X |
| P10915 | Hyaluronan en proteoglycan link eiwit 1 precursor | X | X | ||
| P11021 | 78 kDa gLucose gereguleerd eiwit | X | X | X | |
| P11047 | Laminin subunit gamma 1 precursor | X | |||
| P11142 | Warmte schok cognate 71 kDa eiwit | X | X | X | X |
| P11177 | Pyruvate dehydrogenase E1-component subeenheid beta-mitochondriale precursor | X | |||
| P11217 | Glycogeen fosforylase spiervorm | X | |||
| P11310 | Middelketting specifieke acyl CoA dehydrogenase mitochondriale precursor | X | |||
| P11413 | Glucose 6 fosfaat 1 dehydrogenase | X | |||
| P11766 | Alcohol dehydrogenase klasse 3 chi keten | X | |||
| P12036 | Neurofilament zwaar polypeptide | X | |||
| P12109 | Collageen alfa 1 VI ketting | X | X | X | X |
| P12110 | Collageen alfa 2 VI ketting | X | X | X | X |
| P12111 | Collageen alfa 3 VI ketting | X | X | X | |
| P12277 | Creatine kinase B type | X | |||
| P12429 | Bijlage A3 | X | X | ||
| P12814 | Alpha actinine 1 | X | X | ||
| P12829 | Myosin licht polypeptide 4 | X | |||
| P12882 | Myosin 1 | X | |||
| P12883 | Myosin 7 | X | X | ||
| P12955 | Xaa Pro dipeptidase | X | |||
| P13489 | Ribonuclease-remmer | X | |||
| P13533 | Myosin 6 | X | X | ||
| P13611 | Versican kern eiwit precursor | X | X | ||
| P13639 | Verlengingsfactor 2 | X | |||
| P13716 | Delta-aminolevulinezuurdehydratase | X | |||
| P13796 | Plastin 2 | X | |||
| P13804 | Electron overdracht flavoproteïne subeenheid alfa mitochondriale precursor | X | |||
| P13929 | Beta enolase | X | X | ||
| P14136 | Glialfibrillair zuur eiwit astrocyt | X | |||
| P14314 | Glucosidase 2 subeenheid bèta voorloper | X | |||
| P14550 | Alcoholdehydrogenase NADP | X | |||
| P14618 | Pyruvate kinase isozymen M1 M2 | X | X | X | |
| P14625 </ Td> | Endoplasmin voorloper | X | X | ||
| P15121 | Aldose reductase | X | |||
| P15259 | Fosfoglyceraatmutase 2 | X | |||
| P16152 | Carbonylreductase NADPH 1 | X | |||
| P17066 | Warmte schok 70 kDa eiwit 6 | X | X | X | |
| P17174 | Aspartaat aminotransferase cytoplasmatisch | X | |||
| P17540 | Creatine kinase sarcomerische mitochondriale precursor | X | |||
| P17661 | desmine | X | X | X | X |
| P17980 | 26S protease regulerende subeenheid 6A | X | |||
| P17987 | T complex eiwit 1 subeenheid alfa | X | |||
| P18206 | vinculin | X | X | ||
| P18428 | Lipopolysaccharide bindende eiwit precursor | X | |||
| P18669 | Fosfoglyceraatmutase 1 | X | |||
| P19105 | Myosin Regulatory Light Chain 2 | X | X | ||
| P19623 | Spermidine synthase | X | |||
| P19652 | Alpha 1 zuur glycoproteïne 2 precursor | X | X | ||
| P19823 | Inter alfa trypsine-remmer zware keten H2 | X | |||
| P19827 | Inter alfa trypsine remmer zware keten H1 | X | X | ||
| P20073 | Bijlage A7 | X | |||
| P20618 | Proteasome subunit bèta type 1 precursor | X | |||
| P20774 | mimecan | X | X | X | X |
| P21266 | Glutathion S transferase Mu 3 | X | |||
| P21333 | Filamin A | X | X | ||
| P21796 | Spanningsafhankelijk anion selectief kanaal eiwit1 | X | |||
| P21810 | biglycan | X | X | X | X |
| P21980 | Proteïne glutamine gamma glutamyltransferase 2 | X | X | ||
| P22105 | Tenascin X | X | X | ||
| P22314 | Ubiquitine-activerend enzym E1 | X | |||
| P22352 | Glutathion peroxidase 3 precursor | X | X | ||
| P22626 | Heterogene nucleaire ribonucleoproteïnen A2 B1 | X | |||
| P22695 | Ubiquinol cytochroom c reductase complex kern eiwit 2 mitochondriale precursor | X | |||
| P23141 | Levercarboxyesterase 1 voorloper | X | |||
| P23142 | Fibuline 1 | X | X | X | X |
| P23284 | Peptidyl prolyl cis trans isomerase B precursor | X | |||
| P23381 | Cytoplasmatische tryptophanyl tRNA synthetase | X | |||
| P23526 | Adenosylhomocysteinase | X | X | ||
| P23528 | Cofiline 1 | X | |||
| P24752 | Acetyl CoA acetyltransferase mitochondriale precursor | X | |||
| P25311 | Zink alfa 2 glycoproteiN voorloper | X | |||
| P25705 | ATP synthase subeenheid alfa mitochondriale | X | |||
| P25788 | Proteasome subunit alpha type 3 | X | X | ||
| P25789 | Proteasome subunit alpha type 4 | X | |||
| P26447 | Proteïne S100 A4 | X | |||
| P27348 | 14 3 3 proteïne theta | X | X | ||
| P27797 | Calreticulin precursor | X | |||
| P28066 | Proteasome subunit alpha type 5 | X | |||
| P28070 | <Td> Proteasome subunit bèta type 4 precursorX | X | |||
| P28072 | Proteasome subunit beta type 6 precursor | X | |||
| P28074 | Proteasome subunit beta type 5 precursor | X | |||
| P28331 | NADH ubiquinon oxidoreductase 75 kDa subunit mitochondriale precursor | X | |||
| P28838 | Cytosol aminopeptidase | X | |||
| P29218 | Inositol monofosfatase | X | |||
| P29401 | transketolase | X | |||
| P29692 | Verlengingsfactor 1 delta | <td> | X | ||
| P29966 | Myristoyleerd alanine-rijk C-kinase substraat | X | |||
| P30040 | Endoplasmatische reticulumproteïne ERp29 voorloper | X | |||
| P30041 | Peroxiredoxine 6 | X | X | ||
| P30043 | Flavin reductase | X | |||
| P30044 | Peroxiredoxine 5 mitochondriale precursor | X | |||
| P30085 | UMP CMP kinase | X | |||
| P30086 | Fosfatidylethanolamine bindend eiwit 1 | X | |||
| P30101 | ProteiN disulfide isomerase A3 precursor | X | X | X | |
| P30613 | Pyruvate kinase isozymen RL | X | |||
| P30740 | Leukocyt elastase inhibitor | X | |||
| P31025 | Lipocalin 1 voorloper | X | |||
| P31937 | 3 hydroxyisobutyraatdehydrogenase mitochondriale voorloper | X | |||
| P31942 | Heterogene nucleaire ribonucleoproteïne H3 | X | |||
| P31943 | Heterogene nucleaire ribonucleoproteïne H | X | |||
| P31946 | 14 3 3 eiwit beta alfa | X | X | ||
| P31948 | Stress geïnduceerde fosfoproteïne 1 | X | |||
| P31949 | Proteïne S100 A11 | X | |||
| P32119 | Peroxiredoxine 2 | X | X | ||
| P34931 | Warmte schok 70 kDa eiwit 1 zoals | X | X | ||
| P34932 | Warmte schok 70 kDa eiwit 4 | X | |||
| P35232 | prohibitine | X | |||
| P35237 | Serpin B6 | X | |||
| P35443 | Trombospondine 4 | X | </ Tr> | ||
| P35555 | Fibrilline 1 | X | X | ||
| P35579 | Myosin 9 | X | X | X | |
| P35580 | Myosin 10 | X | X | ||
| P35609 | Alpha actinine 2 | X | |||
| P35625 | Metalloproteïnaseremmer 3 | X | X | ||
| P35998 | 26S protease regulerende subeenheid 7 | X | |||
| P36871 | Fosfoglucomutase 1 | X | X | ||
| P36955 | Pigment epithelium afgeleide factor | X | X | ||
| P37802 | <Td> Transgelin 2X | X | |||
| P37837 | transaldolase | X | |||
| P38117 | Electron overdracht flavoproteïne subeenheid beta | X | |||
| P38646 | Stress 70 eiwit mitochondriale voorloper | X | X | ||
| P39687 | Zuurzuur leucine rijk nucleair fosfoproteïne 32 familielid A | X | |||
| P40121 | Macrofage capping eiwit | X | |||
| P40925 | Malate dehydrogenase cytoplasmatisch | X | |||
| P40926 | Malate dehydrogenase mitochondriale voorloper | <td> | X | ||
| P41219 | periferine | X | |||
| P42330 | Aldo keto reductase familie 1 lid C3 | X | |||
| P45880 | Spanningsafhankelijk anion selectief kanaal eiwit 2 | X | |||
| P47755 | F actin capping eiwit subeenheid alpha 2 | X | X | ||
| P47756 | F actin capping eiwit subunit beta | X | X | ||
| P47985 | Ubiquinol cytochroom c reductase ijzerzwavel subeenheid mitochondriale precursor | X | |||
| P48047 | ATP synthase O subeenheid mitochondriale precursor | X | |||
| P48637 | Glutathion synthetase | X | |||
| P48741 | Warmte schok 70 kDa eiwit 7 | X | X | ||
| P49189 | 4 trimethylaminobutyraldehyde dehydrogenase | X | |||
| P49368 | T complex eiwit 1 subeenheid gamma | X | |||
| P49747 | Brokje oligomere matrix eiwit | X | X | X | X |
| P49748 | Zeer lange keten specifieke acyl CoA dehydrogenase mitochondriale precursor | X | |||
| P50395 | Rab BBP dissociatie remmer beta | X | x </ Td> | ||
| P50454 | Serpin H1 precursor | X | |||
| P50995 | Bijlage A11 | X | |||
| P51452 | Dubbele specificiteit eiwit fosfatase 3 | X | |||
| P51884 | lumican | X | X | X | X |
| P51888 | Prolargin voorloper | X | X | X | X |
| P52565 | Rho bbp dissociatie remmer 1 | X | |||
| P52566 | Rho BBP-dissociatieremmer 2 | X | |||
| P54652 | Verwarmingschok gerelateerd 70 kDa eiwit 2 | X | X | X | X |
| P55072 | Transitional endoplasmatische reticulum ATPase | X | |||
| P55083 | Microfibril geassocieerde glycoproteïne 4 precursor | X | X | ||
| P57053 | Histon H2B type F | X | |||
| P60174 | Triosephosphate isomerase | X | X | X | |
| P60660 | Myosin-lichtpolypeptide 6 | X | X | ||
| P60709 | Actin cytoplasmatische 1 | X | X | X | X |
| P60981 | Destrin | X | |||
| P61086 | Ubiquitine conjugerende enzym E2 25 kDa | X | |||
| P61088 | Ubiquitine conjugerende enzym E2 | X | |||
| P61224 | Ras gerelateerde eiwit Rap 1b precursor | X | |||
| P61978 | Heterogeen nucleair ribonucleoproteïne K | X | X | ||
| P61981 | 14 3 3 eiwit gamma | X | X | X | |
| P62258 | 14 3 3 eiwit epsilon 14 3 3E | X | |||
| P62491 | Ras gerelateerd eiwit | X | |||
| P62714 | Serine threonine eiwit fosfatase 2A katalytische subeenheid beta-isoform | X | |||
| P62736 | Actin aorta gladde spier | X | X | X | |
| P62805 | Histon H4 | X | |||
| P62826 | GTP bindende nucleaire eiwit Ran | X | |||
| P62873 | Guanine nucleotide bindende eiwit GIGSGT subeenheid beta 1 | X | |||
| P62879 | Guanine nucleotide bindende eiwit GIGSGT subeenheid beta 2 | X | |||
| P62937 | Peptidyl prolyl cis trans isomerase A | X | X | ||
| P62987 | Ubiquitine 60S ribosomale eiwit L40 | X | |||
| P63104 | 14 3 3 proTein zeta delta | X | X | X | X |
| P63241 | Eukaryotische vertaling initiatief factor 5A 1 | X | |||
| P63244 | Guanine nucleotide binding eiwit subeenheid beta 2 zoals 1 | X | |||
| P63267 | Actin gamma enterische gladde spier | X | X | ||
| P67936 | Tropomyosine alfa 4-keten | X | |||
| P68032 | Actin alfa hartspier 1 | X | |||
| P68104 | Verlengingsfactor 1 alfa 1 | X | X | X | |
| P68133 | Actin alfa skeletspier | ||||
| P68363 | Tubulin alfa 1B keten | X | X | X | |
| P68371 | Tubuline Bèta 2C keten | X | X | X | |
| P68402 | Plateletactiverende factor acetylhydrolase IB subeenheid beta | X | |||
| P68871 | Hemoglobine subeenheid beta | X | X | X | |
| P69905 | Hemoglobine subeenheid alpha | X | X | ||
| P78371 | T complexe eiwit 1 subeenheid beta | X | |||
| P78417 | Glutathion transferase omega 1 | X | X | ||
| P80748 | Ig lambda keten VIII regio LOI | X | |||
| P98095 | Fibuline 2 | X | X | ||
| Q01082 | Spectrin bèta keten hersenen 1 | X | |||
| Q01449 | Myosin regulerende lichtketting 2 atriale isoform | X | |||
| Q01518 | Adenylyl cyclase geassocieerd eiwit 1 | X | |||
| Q01995 | Transgelin Gladde spierproteïne 22 alpha | X | |||
| Q03252 | Lamin B2 | X | X | ||
| Q03591 | Complement factor H gerelateerde eiwit 1 voorloper | X | Q04917 | 14 3 3 eiwit eta | X | X |
| Q06323 | Proteasome activator complex subeenheid 1 | X | |||
| Q06828 | fibromoduline | X | X | X | X |
| Q06830 | Peroxiredoxine 1 | X | X | ||
| Q07507 | Dermatopontin | X | X | X | X |
| Q07960 | Rho GTPase-activerend eiwit 1 | X | |||
| Q08257 | Quinone oxidoreductase | X | |||
| Q08431 | Lactadherin | X | X | ||
| Q12765 | SEcernin 1 | X | |||
| Q13011 | Delta 3 5 Delta 2 4 dienoyl CoA isomerase mitochondriale precursor | X | X | ||
| Q13228 | Selen bindend eiwit 1 | X | X | ||
| Q13404 | Ubiquitine conjugerende enzym E2 variant 1 | X | |||
| Q13409 | Cytoplasmische dynein 1 tussenketting 2 | X | |||
| Q13509 | Tubuline Bèta 3-keten | X | X | X | |
| Q13642 | Vier en een half LIM domeinen eiwit 1 | X | |||
| Q13765 | Nascent polypeptide geassocieerde complex subeenheid alpha | X | |||
| Q13885 | N tubuline bèta 2A keten | X | X | ||
| Q14194 | Dihydropyrimidinase gerelateerd eiwit 1 | X | |||
| Q14195 | Dihydropyrimidinase gerelateerd eiwit 3 | X | X | X | X |
| Q14624 | Inter alfa-trypsine-inhibitor zware keten H4 precursor | X | |||
| Q14697 | Neutrale alpha glucosidase AB precursor | X | |||
| Q14764 | Groot kluisproteïne | X | |||
| Q14767 | Latente transformerende groeifactor beta bindend eiwit 2 | X | <td>X | ||
| Q14894 | Mu crystalline homolog NADP gereguleerd schildklierhormoon bindend eiwit | X | |||
| Q15063 | Periostin voorloper | X | X | X | X |
| Q15084 | Proteïne disulfide isomerase A6 precursor | X | |||
| Q15113 | Procollageen C endopeptidaseversterker 1 voorloper | X | |||
| Q15181 | Anorganische pyrofosfatase | X | |||
| Q15365 | Poly rC bindend eiwit 1 | X | |||
| Q15366 | Poly rC bindend eiwit 2 | X | |||
| Q15582 | Transformeren van groeifactor beta-geïnduceerde eiwitten | X | X | X | |
| Q15819 | Ubiquitine conjugerende enzym E2 variant 2 | X | |||
| Q16352 | Alpha internexin | X | |||
| Q16473 | Putative tenascin XA | X | |||
| Q16555 | Dihydropyrimidinase gerelateerd eiwit 2 | X | X | X | |
| Q16698 | 2 4 dienoyl CoA reductase mitochondriale voorloper | X | |||
| Q16891 | Mitochondriale binnenmembraan | X | |||
| Q562R1 | Betaactine zoals eiwit 2 | X | |||
| Q6S8J3 | POTE ankyrine domein familielid E | X | |||
| Q6UWY5 | Olfactomedine zoals eiwit 1 precursor | X | X | ||
| Q71U36 | Tubulin alfa 1A keten | X | X | X | |
| Q7Z7G0 | Doel van Nesh SH3 precursor | X | X | X | |
| Q8WUM4 | Geprogrammeerde cel dood 6 interactief eiwit | X | |||
| Q8WWX9 | Thioredoxine zoals selenoproteïne M precursor | X | |||
| Q92597 | Proteïne NDRG1 | X | |||
| Q92945 Verstrengeld element bindend eiwit 2 | X | ||||
| Q96CN7 | Isochorismatase-domein dat eiwit 1 bevat | X | |||
| Q96CX2 | BTB POZ-domein bevattende eiwit | X | |||
| Q96KK5 | Histon H2A type 1 H | X | X | ||
| Q96KP4 | Cytosolische niet-specifieke dipeptidase | X | |||
| Q99426 | Tubulinspecifieke chaperon B | X | |||
| Q99497 | Proteïne DJ 1 | X | X | ||
| Q99536 | Synaptische vesikel membraan eiwit | X | X | X | |
| Q99714 | 3 hydroxyacyl CoA dehydrogenase type 2 | X | |||
| Q99715 | Collageen alfa 1 XII ketting | X | X | ||
| Q99798 | Aconitaat hydratase mitochondriale precursor | X | |||
| Q9BQE3 | Tubulin alfa 6 keten | X | |||
| Q9BUF5 | Tubuline Bèta 6-keten | X | X | ||
| Q9BUT1 | 3 hydroxybutyraat dehydrogenase type 2 | X | |||
| Q9BVA1 | Tubuline Bèta 2B keten | X | X | X | |
| Q9BXN1 | Asporin | X | x </ Td> | X | X |
| Q9H0W9 | Ester hydrolase C11orf54 | X | |||
| Q9H4B7 | Tubuline beta 1 keten | X | |||
| Q9NRN5 | Olfactomedine zoals eiwit 3 precursor | X | X | ||
| Q9NRV9 | Heme bindend eiwit 1 | X | |||
| Q9NSB2 | Keratine type II cutikulaire Hb4 | X | X | ||
| Q9NVA2 | Septin 11 | X | |||
| Q9UBR2 | Cathepsin Z voorloper | X | |||
| Q9UBX5 | Fibuline 5 | X | X | ||
| Q9UK22 | F vak alleen eiwit 2 | X | |||
| Q9Y277 | Spanningsafhankelijk anion selectief kanaal proteïne 3 | X | |||
| Q9Y281 | Cofiline 2 | X | |||
| Q9Y490 | Talin 1 | X | |||
| Q9Y696 | Chloride intracellulaire kanaal eiwit 4 | X | |||
| Q9Y6C2 | EMILIN 1 | X | X |
Tabel 1: Lijst van de eiwitten die zijn geïdentificeerd in het mitrale klepweefsel extract wanneer vier verschillende proteomische benaderingen werden toegepast: tweedimensionale elektroforese (2-DE), tweedimensionale LC-MS E (2D-LC / MSE), LC / MSE en vloeibare fase IEF. De methode waarbij elk eiwit werd geïdentificeerd, is gemeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een kritische stap van dit protocol is het gebruik van vloeibare stikstof om het monster te bevriezen en het grindersysteem te chillen. Het gebruik van vloeibare stikstof voorkomt biologische afbraak en zorgt voor efficiënte poedering, maar vereist specifieke training voor veilige hantering.
In dit protocol is een grindersysteem aanwezig voor het slijpen van monsters, omdat kleine monsters moeilijk te herstellen zijn van standaard mortel en stamper. In dit geval verspreiden kleine monsters als een fijn poeder over het morteloppervlak, waardoor de inzameling moeilijk is. Een ander voordeel is dat de grinder gemotoriseerd is, waardoor een groter aantal monsters op een reproduceerbare manier en zonder extra vermoeidheid verwerkt kan worden. Een beperking op het gebruik van een grinder is dat de grootte van het monster klein moet zijn (100 mg of minder) om de stamper effectief tegen de mortel te drukken. Bovendien moeten de maalkomponenten worden verwarmd tot kamertemperatuur tussen toepassingen voor reiniging g. Bijgevolg is de procedure tijdrovend en, als veel monsters dagelijks worden verwerkt, zijn er veel sets nodig.
Een extra kritische stap is de bereiding van de extractiebuffer. De zoutconcentraties, vooral voor het ureum (8 M) en thioureum (2 M), zijn vrij hoog; Dus het volume zout is bijna de helft van het totale volume van de oplossing. Bovendien is de ontbinding niet gemakkelijk, gelet op het feit dat warmte moet worden vermeden, aangezien bij meer dan 37 ° C ureum kan leiden tot eiwitcarbamylering bij de N termini van eiwitten / peptiden en bij de zijketenaminogroepen van lysine- en arginine-resten 17 . Eenmaal opgelost moet de ureumbuffer worden gefiltreerd met 0,22 μm filters en kan gedurende 4 weken bij -80 ° C worden opgeslagen zonder de extractie-effectiviteit ervan te beïnvloeden, maar het moet worden verwarmd tot meer dan 15 ° C voor gebruik om volledige oplossingen mogelijk te maken .
Wijzigingen en probleemoplossing
In dit protocol wordt eiwitxtractie uitgevoerd met behulp van de beschreven ureumbuffer omdat het een van de meest gebruikte eiwit-extractieoplossingen voor proteomische studies is door zijn compatibiliteit met isoelectrofocusing en de efficiëntie daarvan bij het oplossen van spaarzaam oplosbare eiwitten 18 . Aangetoond dat deze buffer zeer efficiënt oplosbare oplosbare eiwitten kan oplossen, zoals integrale membraaneiwitten 19 of eiwitten die zeer gevoelig zijn voor aggregatie, zoals tubuline 18. Bovendien is deze buffer volledig verenigbaar met de Bradford-analyse om eiwitconcentratie te bepalen en Het kan direct worden gebruikt in 2-DE en vloeibare fase IEF analyses.Deze buffer is echter niet ideaal voor de oplosbaarheid van alle eiwitten die in een monster aanwezig zijn. Het is mogelijk dat verschillende extractiebuffers eiwitten die niet door dit protocol worden gedetecteerd, kunnen onthullen. Bijvoorbeeld, het is goed knoDat ribosomale en nucleaire eiwitten beter kunnen worden geëxtraheerd met zure extractie of trichloorazijnzuur / aceton precipitatie 20 , terwijl alkalische pH niveaus meer geschikt zijn voor membraaneiwitten 21 , 22 . Daarom kan het gebruik van alternatieve buffers extra stappen vereisen voor het neerslaan van eiwitten om zouten te elimineren die interfereren met 2-DE of vloeibare fase IEF.
Beperkingen van de techniek
Het aantal eiwitten dat door dit protocol wordt geïdentificeerd, is relatief laag, maar het aantal identificaties en de dekking van de proteomische analyse kan verder worden verhoogd door het gebruik van modernere instrumenten, waarvan de massa-nauwkeurigheid en sequentie snelheid in de laatste jaren dramatisch zijn toegenomen. 23. Het is mogelijk om een groot deel van het proteoom te bedekken, zonder enige prefractioneringsstappen, door gebruik te maken van een lang gradiënt voor vloeibare chRomatografie scheidingen gekoppeld aan een MS-instrument met hoge resolutie, die een snelle sequentie snelheid 24 heeft .
Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande / alternatieve methoden
Het vermogen om eiwitten in de hartkleppen van de mens te identificeren en kwantificeren, zoals de mitrale klep, is een belangrijke en uitdagende taak die de mechanismen van fysiologische / pathologische processen in klepziekten zal toelichten. Het definiëren van de veranderingen van het mitralklep proteome zal het begrip van de aard van de biologische processen die bij de ziekte staat van het weefsel geassocieerd zijn, aanzienlijk verhogen.
De huidige kennis over de fysiopathologie van de mitralklep is beperkt en wordt in het algemeen verkregen door middel van de analyse van individuele eiwitten die betrokken zijn bij specifieke processen, zoals extracellulaire matrix remodellering, hemostase, ontsteking of oxidatieve stress 25 9 , 10 .
Het gebrek aan uitgebreide proteomische studies kan worden toegeschreven aan de complexiteit van dit laagcellulaire weefsel dat zeer rijk is aan extracellulaire matrix eiwitten ( dat wil zeggen proteoglycanen, collageen en elastine). Deze eiwitten vormen ongeveer 80% van het totale aantal, waardoor de analyse van eiwitten met een laag gehalte wordt belemmerd 26 .
Zo was het noodzakelijk om een efficiënt extractieprotocol op te stellen om eiwitsolubilisatie te maximaliseren teneinde het proteoom van dit weefsel te beschrijven. Dit protocol was toegestaan voor de extractie van ~ 50 μg eiwit uit 1 mg weefsel. Dit is een relatief lage opbrengst in vergelijking met "zacht" weefsel, zoAls lever (~ 135 μg van 1 mg weefsel), maar het is voldoende om een eiwitanalyse op individuele monsters uit te voeren. Dit is vooral relevant bij het definiëren van de intra-individuele variabiliteit van een fenomeen.
Bovendien heeft deze methode het voordeel dat deze compatibel is met veel analytische toepassingen. De mitrale klep eiwitten opgelost in de voorgestelde extractie buffer kunnen direct worden gebruikt voor immunoblotting en proteomische analyse gebaseerd op tweedimensionale elektroforese en vloeibare fase isoelectroforese 11 , 12 of na afzetting van eiwitten om buffercomponent interferentie te elimineren voor andere analyses, zoals Gelvrije massaspectrometrie 15 .
Met de toepassing van dit extractieprotocol is een vollediger karakterisering van de eiwitcomponenten van het normale mitrale klepweefsel verkregen door de identificatie van veel intracelLulaire eiwitten. Deze eiwitten zijn gelokaliseerd in de cytosol of in organellen, niet alleen in de extracellulaire matrix, en hebben verschillende moleculaire en biologische functies. Andere interessante eiwitten ( dwz CryAB, septin-11, FHL-1 en dermatopontine) werden ook geïdentificeerd. Deze eiwitten hebben onbekende functies in de mitrale klep, maar hun biologische eigenschappen suggereren een mogelijke rol in klepziekten.
Toekomstige toepassingen of aanwijzingen na het masteren van deze techniek
Met dit protocol is het mogelijk om gegevens betreffende eiwituitdrukking te correleren met gegevens over kwantitatieve mRNA-expressie en niet-kwantitatieve immunohistochemische analyses. In werkelijkheid zullen deze benaderingen inderdaad leiden tot een uitgebreider begrip van de moleculaire mechanismen die onderliggende ziekte liggen, van mRNA tot post-translational eiwitmodificatie. Zo kan deze methode van belang zijn voor onderzoekers die zich richten op hartklep-fysiopathologie. VinBondgenoot, dit protocol kan ook toegepast worden op de porcine mitralklep, die een nauwe lijkvorming heeft op de menselijke klep 27 en wordt gebruikt als een experimenteel model voor de evaluatie van de klepfunctie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het Italiaanse Ministerie van Volksgezondheid steunde deze studie (RC 2013-BIO 15). We bedanken Barbara Micheli voor haar uitstekende technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
