Summary
הרכב החלבון של שסתום המיטרל האנושי עדיין לא ידוע חלקית, משום שהניתוח שלו מסובך על ידי תאימות נמוכה ולכן על ידי ביוסינתזה חלבונית נמוכה. עבודה זו מספקת פרוטוקול ביעילות לחלץ חלבון לניתוח של proteome שסתום מיטרלי.
Abstract
ניתוח של proteome הסלולר יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות עקב פיתוח של טכנולוגיות המאפשרים זיהוי בקנה מידה גדול וכימות של חלבונים הנוכחי במערכות ביולוגיות מורכבות.ידע שנרכש מתוך גישה proteomic יכול להוביל הבנה טובה יותר של המנגנונים הפתוגניים המונחים ביסוד מחלות, ומאפשרת זיהוי של סמני מחלה אבחנתיים ופרוגנוסטיים חדשים, וכן, בתקווה, של מטרות טיפוליות. עם זאת, שסתום מיטרלי הלב מייצג מדגם מאתגר מאוד עבור ניתוח proteomic בגלל הסלולר נמוכה ב proteoglycan ו קולגן מועשר תאיים מטריקס. זה עושה את זה מאתגר לחלץ חלבונים לניתוח proteomic העולמי. עבודה זו מתארת פרוטוקול התואם ניתוח חלבון לאחר מכן, כגון proteomics כמותי immunoblotting. זה יכול לאפשר את המתאם של נתונים דאגהG ביטוי חלבון עם נתונים על ביטוי mRNA כמותי ניתוח כמותי אימונוהיסטוכימיים. ואכן, גישות אלה, כאשר ביצע יחד, יוביל להבנה מקיפה יותר של המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות, מ mRNA כדי שינוי שלאחר החלבון translational. לכן, שיטה זו יכולה להיות רלוונטית לחוקרים המעוניינים במחקר physiopathology שסתום הלב.
Introduction
עדויות האחרונות שינו את ההבנה של התפקידים של מנגנונים רגולטוריים רבים המתרחשים לאחר סינתזת mRNA. ואכן, תהליכים טרנסלציוניים, פוסט-תעתיקיים ופרוטוליטיים יכולים להסדיר את שפע החלבון ולתפקודו. הדוגמה - שאומרת כי ריכוזי ה- mRNA הם פרוקסי לאלה של החלבונים המתאימים, בהנחה שרמות התמלילים הן הגורם העיקרי לשפע החלבון - תוקנו חלקית. למרות זאת, רמות התמליל רק מנבאות באופן חלקי את כמות החלבון, מה שמרמז על אירועים פוסט-תעתיק להתרחש כדי לווסת את החלבונים בתוך תאים 1 , 2 .
יתר על כן, חלבונים בסופו של דבר להכתיב את הפונקציה של התא ולכן להכתיב פנוטיפ שלה, אשר יכול לעבור שינויים דינמיים בתגובה גורמים אוטוקרינית, פאראקרין, אנדוקרינית; מתווכים עם דם; טֶמפֶּרָטוּרָה; טיפול תרופתי; ואת המחלה לפתחמנט. לפיכך, ניתוח הביטוי התמקדו ברמת החלבון הוא שימושי כדי לאפיין את proteome ולפרם את השינויים הקריטיים המתרחשים אליו כחלק מחולי המחלה 3 .
לכן, את ההזדמנויות כי proteomics הנוכחי כדי להבהיר בריאות ומחלות התנאים הם אדירים, למרות האתגרים הטכנולוגיים הקיימים. התחומים המבטיחים במיוחד של מחקר, שבהם יכולים פרוטאומיסטים לתרום: זיהוי של ביטוי חלבון שונה בכל רמה ( כלומר, תאים שלמים או רקמות, תאים תת-תאיים ונוזלים ביולוגיים); זיהוי, אימות ואימות של סמנים ביולוגיים חדשים המשמשים לאבחון ולפרוגנוזה של מחלות; וכן, בתקווה, זיהוי של מטרות חלבון חדש שניתן להשתמש בהם למטרות טיפוליות, כמו גם להערכת יעילות התרופות ואת הרעילות 4 .
לכידת המורכבות שלהפרוטאום מייצג אתגר טכנולוגי. כלים proteomic הנוכחי מציעים את ההזדמנות לבצע בקנה מידה גדול, תפוקה גבוהה ניתוח עבור זיהוי, כימות, ואימות של רמות חלבון השתנה. בנוסף, הכנסת שיטות חלוקה והעשרה, שמטרתן למנוע את ההפרעה הנגרמת על ידי החלבונים השופעים ביותר, שיפרה גם את זיהוי החלבון על ידי הכללת החלבונים הפחות שופעים. לבסוף, proteomics הושלמה על ידי ניתוח של שינויים לאחר translational, אשר בהדרגה מופיעים כמו מאפננים חשובים של תפקוד החלבון.
עם זאת, ההכנה המדגם התאוששות חלבון בדגימות ביולוגי תחת ניתוח עדיין להישאר הגבלת הצעדים של זרימת העבודה proteomic ולהגדיל את הפוטנציאל האפשרי pitfalls 5 . ואכן, ברוב טכניקות ביולוגיה מולקולרית כי חייב להיות מותאם, הצעדים הראשונים הם homogenizat רקמותיון ותאי תא, במיוחד במהלך ניתוח של חלבונים בשפע נמוכה עבורם שיטות הגברה לא קיימים. בנוסף, הטבע הכימי של חלבונים יכול להשפיע על ההתאוששות שלהם. לדוגמה, ניתוח של חלבונים הידרופובי מאוד הוא מאתגר מאוד, כי הם מזרזים בקלות במהלך ההתמקדות isoelectric, בעוד חלבונים ממברנה טרנס הם כמעט בלתי מסיסים (נסקרת ב הפניה 5). יתר על כן, השתנות הרכב הרקמה יוצרת מחסום משמעותי לפיתוח שיטת החילוץ האוניברסלית. לבסוף, כי כמעט כל הדגימות הקליניות הן של כמות מוגבלת, זה חיוני כדי לאפשר הכנת חלבון עם התאוששות מקסימלית reproducibility מ כמויות מדגם מינימלי 6 .
עבודה זו מתארת פרוטוקול אופטימיזציה עבור החילוץ חלבון מן השסתום המיטרלי של הלב האנושי, המייצג מדגם מאתגר מאוד עבור ניתוח proteomic. שסתום מיטרלי רגיל הוא compמבנה lx שוכב בין אטריום שמאל החדר השמאלי של הלב ( איור 1 ). זה משחק תפקיד חשוב בשליטה על זרימת הדם מן אטריום החדר, מניעת backflow ולהבטיח את רמת נאותה של אספקת חמצן לכל הגוף, ובכך לשמור על פלט לב נאותה. עם זאת, הוא נחשב לעתים קרובות רקמה "לא פעילה", עם תאיות נמוכה כמה רכיבים, בעיקר מטריקס תאיים. הסיבה לכך היא, בתנאים נורמליים, התאים intervitial valvular תושב (VICs) להציג פנוטיפ שקט עם שיעור נמוך biosynthesis חלבון 7 .
עם זאת, הוכח כי במצב פתולוגי, מספר VICs ב spongiosa עולה סינתזת החלבון שלהם מופעל, יחד עם שינויים פונקציונליים אחרים פנוטיפי 8 . לכן, אין זה מפתיע כי הנתונים המינימליים הזמיניםהספרות מתמקדת בניתוח של שסתומים מיטרליים פתולוגיים 9 , 10 , שבהם מספר מוגבר של VICs מופעל עשוי להסביר את המספר הגבוה יחסית של חלבונים מזוהים.
לסיכום, פרוטוקול זה עשוי לשמש כדי להבין את ההבנה של מנגנונים פתוגניים האחראים על מחלות שסתום מיטרלי באמצעות מחקר של מרכיבי חלבון מיטרלי שסתום. ואכן, הבנה גדולה יותר של התהליכים הפתולוגיים הבסיסיים יכולה לסייע בשיפור הניהול הקליני של מחלות שסתום, אשר האינדיקציות הנוכחיות שלהם להתערבות מבוססות במידה רבה על שיקולים המודינאמיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בפרוטוקול זה, לבבות האדם נאספים במהלך explantation multiorgan (זמן איסכמיה קר של 4-12 שעות, כלומר 6 ± 2 שעות) מתורמים רב איברים שלא נכללו בהשתלת איברים מסיבות טכניות או פונקציונליות, למרות פרמטרים אקו-קרדיוגרפיים רגילים. הם נשלחים לבנק רקמות לב וכלי דם של מילאנו, מונזינו Cardiologic מרכז (מילאנו, איטליה) עבור הבנקאות של שסתומים אבי העורקים ריאתי. העלונים האחוריים המיטרליים אינם משמשים למטרות קליניות, ולכן הם נאספים במהלך בידוד שסתום אבי העורקים וריאתי לאחר קבלת הסכמה מדעת מצד קרובי התורמים. רקמת ההשתלה והמחקר נאספת רק לאחר הסכמת ההורים; בגיליון ההסכמה, הם מסמיכים (או לא) את השימוש ברקמת הלב למחקר רק אם אינו מתאים לשימוש קליני בבני אדם ( כלומר, בעיות מיקרוביולוגיות, תפקודיות וסרולוגיות), בהתאם להנחיות ועדת האתיקה שלמרכז קרדיולוגי של מונזינו.
1. הכנת שסתום Mitral
- קציר שסתום מיטרלי האדם בהקדם האפשרי לאחר explantation איבר (זמן איסכמיה קרה של 4-12 שעות).
- בחדר נקי, הוצא את הלב מתיק ההובלה המכיל פתרון קר (4 מעלות צלזיוס) ( כלומר תמיסת מלח או אירוקולינים בינוניים או ויסקונסין). הכנס אותו לתוך דלי והכניס אותו ארון biosafety (זרימת אוויר אנכי ביוגזאר, Class A, Good Practices טוב (GMP) סיווג) להמשיך בהכנה שסתום.
- מניחים את הלב על עטיפה סטרילית חד פעמי בארון. בעזרת אזמל חד פעמי סטרילי, לחתוך את הלב לחלוטין, באופן אופקי לציר המרכזי שלה, על רמת החדרים השמאלית והימנית, כ 4 ס"מ מן השיא.
- הזז את אבי העורקים עולה ועורק הריאה כדי להציג את הגג הפרוזדורי השמאלי.
- עם מלקחיים autoclavable סטרילית ומבחר, לחתוך סביב האוזן השמאלית עלהגג פרוזדורי שמאל, מה שהופך את שסתום המיטרלית גלוי ומאפשר עבור עלון גדול metral (הקדמי) ואת העלון קטן metral (אחורי) להיות מזוהה.
הערה: אנטרו-לרוחב ופרוסקופים המדיאלי האחורי מגדירים את הגבול של העלון הקדמי והאזור האחורי. - באמצעות מספריים autoclable סטרילי מלקחיים שאינם טראומטיים, לנתח את אטריום שמאל ועובי דופן החדר סביב היקף שסתום המיטרלית כולה .
- זיהוי המשכיות שסתום מיטרו-אבי העורקים.
הערה: החדר השמאלי מכיל את כל שסתום המיטרל והאקורדים. - הפרד את העלון הקדמי של שסתום המיטרל מעלון שסתום המטרל האחורי, חותך את העלון האחורי לאורך ההכנסה עם החדר (הקומיסר).
- לשטוף את העלון האחורי של תמיסת מלח. חותכים את עלון לחתיכות קטנות (<1 ס"מ 2 ) ו בנפרד לעטוף אותם בנייר אלומיניום. הצמד להקפיא אותם עם חנקן נוזלי.
זהירות: בצע את נוהלי הבטיחות הארגוניים בעת השימוש בחנקן נוזלי.- לטהר את השולחן של הממשלה עם פתרון אלכוהול 70% איזופרופיל ו 6% מי חמצן פתרון בסוף ההליך.
2. חלבון מיצוי
- השתמש מלקחיים כדי לאסוף את המדגם מאוחסן חנקן נוזלי ומיד למקם אותו על קרח יבש בעוד עטוף בנייר אלומיניום. אל תשאיר את המדגם להפשר במהלך העברות.
- לפני שחיקה, צמרמורת חרסינה / זירקוניום ו העליונות של מערכת מלתעה ( למשל, CryoGrinder), יחד עם המדגם, על ידי לשים אותם בקבוק דיואר המכיל חנקן נוזלי (~ 500 מ"ל).
זהירות: בצע את נוהלי הבטיחות הארגוניים בעת השימוש בחנקן נוזלי. - שים את המרגמה ואת העלי בתיבה קלקר המכיל קרח יבש. הסר את המדגם מתוך רדיד אלומיניום והכניס אותו לתוך המלט.
- Grind tהוא מדגם עם העלי הגדול נגד המרגמה 15-20 פעמים, באמצעות מברג לסובב את העלי. מערבבים את המדגם עם קצה של מרית טרום צונן במהלך תהליך השחזה.
- חזור עם העלי הקטן.
- מעבירים את המדגם הקרקע צינור שקלול בעבר ( למשל, צינור צנטריפוגה 15 מ"ל) על ידי הפיכת הצינור, הצבתה על המלט, והפך אותם יחד כדי להעביר את המדגם לצינור. השתמש מרית מראש צונן לשחזר את כל החומר מן המרגמה.
- שמור את הצינור עם המדגם על קרח יבש, כדי למנוע מדגם הפשרה במהלך ההעברה.
- חישוב משקל נטו של המדגם.
- נקה את המלט ואת העלי אחרי כל מדגם ולטהר אותם על ידי מעוקר או חימום אותם ב 200 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- מעבירים את המדגם אבקת מן צינור צנטריפוגה כדי צינור זכוכית של homogenizer על ידי היפוך.
- הוסף Buree אוריאה מסונניםR (8 M אוריאה, 2 M thiourea, 4% w / v CHAPS, 20 מ"מ טריס, ו dithiotreitol 55 מ"מ) כדי צינור זכוכית, 200 μL של חיץ אוריאה עבור כל 10 מ"ג אבקת רקמה.
הערה: שאריות אבקת שיורית שנותר צינור צנטריפוגה ניתן לשחזר באמצעות חלק נפח מחושב של חיץ אוריאה. - Homogenize המדגם באמצעות stirrer מצויד עם מרגמה זכוכית borosilicate ו עליון polytetrafluoroethylene (PTFE). לאט לאט לחץ על העלי על המדגם עם תנועה מתפתל (1,500 סל"ד) 10 פעמים.
- לשחזר את supernatant ולהעביר אותו צינור נקי 1.7 מ"ל צנטריפוגות. שוב לחלץ את המדגם הנותר עם טריים אוריאה חיץ, הוספת חצי נפח בשימוש במהלך החילוץ הראשון.
- חזור על שלב 2.10.
- לשחזר את supernatant ולשלב אותו עם supernatant משלב 2.11. מניחים את supernatant משולב על מסובבת צינור במשך 30 דקות.
- צנטריפוגה הצינור למשך 30 דקות ב XG 13,000 ו 4 ° C.
- לשחזר את supernatant אד למדוד את ריכוז החלבון באמצעות assay חלבון Bradford, לפי הוראות היצרן. חנות המדגם ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
החילוץ והפירוק של חלבונים במאגר אוריאה תואם באופן ישיר עם שיטות proteomic מבוסס על isoelectrofocusing (דו מימדי אלקטרופורזה (2-DE) 11 ו בשלב נוזלי isoelectric התמקדות (IEF) 12 ) ועם immunoblotting לאחר דילול במאגר Laemmli 13 המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז 14 .
עבור ג 'ל חופשי המוני ספקטרומטר מבוסס שיטות ( כלומר, כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים לנתונים עצמאיים לנתח ספקטרומטריית מסה (LC / MS E ) ו דו מימדי LC / MS E (2D-LC / MS E )) 15 , דגימות מופק במאגר אוריאה המתואר צריך להיות מטופל נוסף כדי לחסל את אוריאה ו thiourea, אשר עלול להפריע עיכול חלבון הבאים הפרדת כרומטוגרפיה נוזלית. Thiשלב זה יכול להתבצע באמצעות ערכות משקעים חלבונים מסחריים, בעקבות הוראות היצרן כדי לזרז את החלבונים. המדגם יכול להיות מומס לאחר מכן ב 25 מ"מ NH 4 HCO 3 המכיל 0.1% דטרגנטים חדישים לעיכול חלבון 16 . משקעים של חלבונים יכולים לחסל מרכיבים חיץ, המשפיעים מינימלית על תוכן החלבון (התאוששות חלבון:> 85%), ובכך להפוך את המדגם מתאים לכל סוג של ניתוח.
היישום של פרוטוקול זה מיצוי חלבונים מן שסתומים מיטרליים האדם מותר לזיהוי של סך של 422 חלבונים, שילוב של ארבע גישות proteomics שונים שתוארו לעיל בפירוט 11 , 15 . באופן ספציפי, 169 חלבונים זוהו על ידי 2-DE, 330 חלבונים על ידי נוזל שלב IEF, 96 חלבונים על ידי LC / MS E , ו 148 חלבוניםעל ידי 2D-LC / MS E (טבלה 1).
כדי לסווג את 422 חלבונים שזוהו במונחים של לוקליזציה תת-תאית, נעשה שימוש בתוכנה לאנליזה של גנים (GO) ( למשל, Cytoscape). הרשת שנוצרה עם התוכנה ואת התוספת המקביל שלה הראה כי, מלבד החלבונים הצפוי מקומי באזור תאיים (ראה החלק הימני העליון של איור 2 ), רוב החלבונים המזוהים על ידי גישות proteomic היו מן האזור תאיים ( כלומר, ציטופלזמה, אברונים, שלפוחית, ו cytoskeleton). תאים חלבונים פנימיים זוהו גם ( איור 2 ).
תוצאות אושרו עוד בשלושה דגימות שסתום מיטרלי עצמאית. Immunoblotting שימש כדי לנתח קבוצה של ארבעה חלבונים ( כלומר, ספטין -11, ארבעה וחצי תחומים LIM חלבונים 1 (FHL-1), derMetopontin, ו- alpha crystallin B (Cryab)) אשר מעולם לא זוהו בשסתום המיטרלי הרגיל ( איור 3 ).
איור 1: מבנה שסתום Mitral. מבט מלמעלה על הלב האנושי מראה את שסתום מיטרלי ( A ) סגור או פתוח ( B ). מבט קדמי של החדר השמאלי של הלב האנושי ( C ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ניתוח של חלבונים שסתום מיטרלי מזוהים בטווח של התפלגות הסלולר. Cytoscape ואת תוסף BiNGO שימשו כדי getaiN הפצה של מונחים אונטולוגיים של גנים (GO) מקטגוריות הרכיב הסלולרי. גודל המעגל הוא פרופורציונלי למספר רכיבי החלבון הנלווים למונחי ה- GO שנבחרו, וסולם הצבעים עבור ערך ה- p של הייצוג המוגזם מדווח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: ניתוח Immunoblotting של SEptin-11, FHL-1, dermatopontin, ו Cryab בתמצית שלמה משלושה כרוזים שסתום האדם מיטרלי נורמלי. Immunoblotting בוצע באמצעות נוגדנים חד שבטיים העכבר נגד נוגדנים cryab ארנב ו polyclonal נגד ספטין -1, FHL-1, ו dermatopontin נוגדנים. אנאלחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| הִצטָרְפוּת | תאור | 2-DE | 2D-LC | LC-MS E | שלב IEF נוזלי |
| A6NMZ7 | קולגן אלפא VI | איקס | |||
| O00151 | PDZ ו LIM תחום חלבון 1 | איקס | |||
| O00299 | כלוריד ערוץ חלבון תאיים 1 | איקס | |||
| O00764 | קינאז Pyridoxal | איקס | |||
| O14558 | מחממים הלם חלבון בטא 6 | איקס | |||
| O43399 | גידול חלבון D54 | איקס | |||
| O43488 | אפלוקסין B1 אלדהיד רדוקטאז חבר 2 | איקס | |||
| O43707 | אלפא אקטין 4 | איקס | איקס | ||
| O43866 | אנטיגן CD5 כמו מבשר | איקס | |||
| O60493 | מיון nexin 3 | איקס | |||
| O60701 | UDP גלוקוז 6 dehydrogenase | איקס | |||
| O75223 | חלבון uncharacterized | איקס | |||
| O75368 | SH3 מחייב חומצה גלוטמית עשיר כמו חלבון | איקס | |||
| O75390 | ציטראז סינתזה המיטוכונדריה מבשר | איקס | |||
| O75489 | NADH dehydrogenase ubiquinone ברזל חלבון גופרית 3 מבשר המיטוכונדריאלי | איקס | איקס | ||
| O75608 | Acyl חלבון thioesterase 1 | איקס | |||
| O75828 | קרבוניל רדוקטאז NADPH 3 | איקס | |||
| O75874 | Isiditrate dehydrogenase NADP cytoplasmic | איקס | |||
| O75955 | ציטוטים | איקס | |||
| O94760 | NG dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1 | איקס | |||
| O94788 | דיידרוגנאז רשתית 2 | איקס | |||
| O95865 | NG dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 | איקס | איקס | ||
| P00325 | אלכוהול dehydrogenase 1B | איקס | איקס | ||
| P00338 | L דיאטידרוגניז L | איקס | |||
| P00352 | דיידרוגנאז רשתית 1 | איקס | |||
| P00441 | Superoxide לדכא Cu Zn | איקס | איקס | ||
| P00450 | מבשר קרולופלאסמין | איקס | איקס | ||
| P00488 | גורם קרישה XIII מבשר שרשרת | איקס | |||
| P00491 | פוספורלאז | איקס | |||
| P00492 | Hypoxanthine גוספא פוספוריבוסילטרנספראז | איקס | |||
| P00558 | קינאז phosphoglycerate 1 | <Td> xאיקס | איקס | ||
| P00568 | Adinylate קינאז isoenzyme 1 | איקס | |||
| P00734 | פרותומבין | איקס | איקס | ||
| P00738 | הפטוגלובין | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P00739 | Haptoglobin קשור מבשר חלבון | איקס | |||
| P00751 | גורם משלים ב | איקס | איקס | איקס | |
| P00915 | פחמימות אנהידראז 1 | איקס | |||
| P00918 | פחמימות אנהידראז | איקס | |||
| P01008 | Antithrombin השלישי מבשר | איקס | איקס | איקס | |
| P01009 | אלפא 1 antitrypsin | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P01011 | אלפא 1 antichymotrypsin | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P01019 | מבשר אנגיוטנסינוגני | איקס | איקס | ||
| P01023 | אלפא 2 macroglobulin | איקס | איקס | ||
| P01024 | השלמה C3 | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P01033 | מעכב Metalloproteinase 1 מבשר | איקס | |||
| P01042 | קינינוגן 1 מבשר | איקס | |||
| P01593 | AG באזור VI שרשרת קאפה איג | איקס | |||
| P01598 | Ig kappa chain VI אזור האיחוד האירופי | איקס | |||
| P01600 | Ig kappa שרשרת VI אזור Hau | איקס | איקס | ||
| P01611 | Ig kappa שרשרת VI אזור Wes | איקס | |||
| P01620 | Ig kappa שרשרת V III אזור SIE | איקס | |||
| P01625 | Ig kappa שרשרת V IV אזור לן | איקס | |||
| P01766 | BRO V III באזור שרשרת כבדה איג | איקס | איקס | ||
| P01781 | Ig כבד שרשרת V III אזור GAL | איקס | |||
| P01834 | Ig קאפה שרשרת אזור C | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P01842 | Ig למבדה שרשרת C אזורים | איקס | איקס | איקס | |
| P01857 | Ig gamma 1 שרשרת | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P01859 | Ig gamma 2 שרשרת | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P01860 | Ig gamma 3 שרשרת | איקס | איקס | איקס | |
| P01861 | Ig gamma 4 שרשרת | איקס | איקס | איקס | |
| P01871 | שר50 | איקס | איקס | איקס | |
| P01876 | Ig אלפא 1 שרשרת | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P01877 | Ig אלפא 2 שרשרת באזור C | איקס | |||
| P02144 | מיוגלובין | איקס | איקס | ||
| P02452 | קולגן אלפא 1 אני שרשרת | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P02511 | אלפא Crystallin B שרשרת | איקס | |||
| P02545 | למינציה AC 70 kDa lamin | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P02647 | Apolipoprotein AI | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P02649 | Apolipoprotein E | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P02671 | שרשרת אלפא פיברינוגן | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P02675 | פיברינוגן | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P02679 | שרשרת גמא פיברינוגן | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P02689 | מיאלין P2 חלבון | איקס | |||
| P02735 | סרום עמילואיד מבשר חלבון | איקס | |||
| P02741 | C מבשר חלבון תגובתי | איקס | |||
| P02743 | סרום עמילואיד P מרכיב | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P02746 | משלים C1q משנה תת יחידה ב | איקס | איקס | ||
| P02747 | משלים C1q משנה תת יחידה C מבשר | איקס | |||
| P02748 | רכיב משלים C9 | איקס | איקס | איקס | |
| P02749 | בטא 2 גליקופרוטין 1 | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P02750 | Leucine עשיר אלפא 2 מבשר glycoprotein | איקס | |||
| P02751 | פיברונקטין | איקס | איקס | ||
| P02760 | מבשר חלבון AMBP | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P02763 | אלפא 1 חומצה גליקופרוטאינים 1 | איקס | איקס | איקס | |
| P02765 | אלפא 2 מבשר גליקופרוטין HS | איקס | |||
| P02766 | מבשר טרנסתיירטין | איקס | איקס | איקס | |
| P02768 | אלבומין בסרום | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P02774 | ויטמין D מחייב חלבון מבשר | איקס | |||
| P02787 | סרוטראנספרין | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P02788 | מבשר Lactotransferrin | איקס | |||
| P02790 | Hemopexin | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P02792 | Ferritin שרשרת האור | איקס | |||
| P04004 | ויטרונקטין | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P04075 | פרוקטוז ביספוספט אלדולס א | איקס | |||
| P04083 | נספח A1 | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P04179 | Superoxide dissutase Mn מבשר המיטוכונדריאלי | איקס | |||
| P04196 | Histidine עשיר מבשר glycoprotein | איקס | |||
| P04217 | אלפא 1B מבשר גליקופרוטין | איקס | איקס | ||
| P04350 | Tubulin ביתא 4 שרשרת | איקס | |||
| P04406 | Glyceraldehyde 3 פוספט dehydrogenase | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P04792 | מחממים הלם חלבון בטא 1 | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P05091 | Aldehyde dehydrogenase מבשר המיטוכונדריה | איקס | איקס | ||
| פלזמה פרוטאז C1 מעכב מבשר | איקס | ||||
| P05156 | גורם משלים אני מבשר | איקס | |||
| P05413 | חומצת שומן חומצה לב מחייב הלב | איקס | |||
| P05452 | Tetranectin מבשר TN | איקס | איקס | ||
| P05787 | סוג קראטין II cytoskeletal 8 | איקס | |||
| P06396 | גלסולין | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P06576 | ATP סינתזה תת מבטא מיטוכונדריה מבשר | איקס | איקס | ||
| P06732 | קריאין קינאז M סוג | איקס | איקס | ||
| P06733 | אלפא enolase | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P06753 | Tropomyosin אלפא 3 שרשרת | איקס | איקס | ||
| P07108 | Acyl CoA מחייב חלבון | איקס | |||
| P07195 | L לקטיד dehydrogenase B שרשרת | איקס | איקס | איקס | |
| P07196 | אור פוליפפטיד Neurofilament | איקס | |||
| P07197 | פוליפרופיד בינוני Neurofilament | איקס | איקס | ||
| P07237 | פרוטאין דיסולפיד איזומרז מבשר | איקס | איקס | ||
| P07339 | מבשר קפסין D | איקס | איקס | ||
| P07355 | נספח א 2 | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P07360 | מרכיב משלים C8 מבשר שרשרת גמא | איקס | |||
| P07437 | טובולין שרשרת ביתא | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P07585 | דקורין | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P07737 | פרופילין 1 | איקס | |||
| P07858 | מבשר קפסין B | איקס | |||
| P07900 | מחממים הלם חלבון HSP 90 אלפא | איקס | איקס | ||
| P07951 | Tropomyosin ביתא שרשרת | איקס | |||
| P07954 | Fometate hydratase מבשר המיטוכונדריה | איקס | |||
| P07996 | טרומבוספונדין 1 | איקס | איקס | איקס | |
| P08107 | הלם חום 70 kDa חלבון 1A 1B | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P08123 | קולגן אלפא 2 אני שרשרת | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P08133 | נספח A6 | איקס | איקס | ||
| P08238 | מחממים הלם חלבון HSP 90 בטא | איקס | איקס | ||
| P08253 | 72 kDa סוג IV מבשר קולגן | איקס | |||
| P08294 | תאית superoxide dissutase Cu Zn מראשהסמן | איקס | איקס | איקס | |
| P08590 | פוליפפטיד אור מיוזין 3 | איקס | איקס | ||
| P08603 | גורם משלים ח | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P08670 | וימנטין | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P08729 | סוג קראטין II cytoskeletal 7 | איקס | |||
| P08758 | נספח A5 | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P09211 | גלוטתיון S Transferase P | איקס | איקס | איקס | |
| P09382 | גלקטין 1 | איקס | איקס | איקס | |
| P09417 | Dihydropteridine רדוקטאז | <Td> | איקס | ||
| P09493 | Tropomyosin 1 שרשרת אלפא | איקס | איקס | ||
| P09525 | נספח A4 | איקס | איקס | ||
| P09651 | הטרוגניות ribonucleoprotein A1 | איקס | |||
| P09871 | משלים C1s מבשר המשנה | איקס | |||
| P09936 | מסוף הידרוזיס קרבוקסיל isozyme L1 | איקס | |||
| P09972 | פרוקטוז ביספוספט אלדולז ג | איקס | |||
| P0C0L4 | השלמה C4 מבשר | איקס | |||
| P0CG05 | IgLambda 2 שרשרת C אזורים | איקס | |||
| P0CG38 | POTE ankyrin תחום משפחה אני | איקס | |||
| P10515 | Dhyydrolipoyllysine שאריות acetyltransferase רכיב של deydrogenase pyruvate מורכבים | איקס | |||
| P10768 | פורמולגלוטיון | איקס | |||
| P10809 | 60 kDa חום הלם חלבון מבשר המיטוכונדריה | איקס | |||
| P10909 | קלוסטרין | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P10915 | Hyaluronan ו proteoglycan קישור חלבון 1 מבשר | איקס | איקס | ||
| P11021 | 78 kDa gחלבון מוסדר | איקס | איקס | איקס | |
| P11047 | יחידת | איקס | |||
| P11142 | הלם חום cognate 71 חלבון kDa | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P11177 | Phyvate dehydrogenase E1 רכיב משנה תת מבשר המיטוכונדריה | איקס | |||
| P11217 | שריר גליקוגן phosphorylase טופס | איקס | |||
| P11310 | שרשרת בינונית ספציפית acyl coa dehydrogenase מבשר המיטוכונדריה | איקס | |||
| P11413 | גלוקוז 6 פוספט 1 dehydrogenase | איקס | |||
| P11766 | אלכוהול dehydrogenase בכיתה 3 צ 'י שרשרת | איקס | |||
| P12036 | Neurofilament כבד פוליפפטיד | איקס | |||
| P12109 | קולגן אלפא 1 VI שרשרת | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P12110 | קולגן אלפא 2 שרשרת VI | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P12111 | קולגן אלפא 3 שרשרת VI | איקס | איקס | איקס | |
| P12277 | קריאין קינאז מסוג B | איקס | |||
| P12429 | נספח A3 | איקס | איקס | ||
| P12814 | אלפא אקטין 1 | איקס | איקס | ||
| P12829 | פוליפפטיד אור מיוזין 4 | איקס | |||
| P12882 | מיוזין 1 | איקס | |||
| P12883 | מיוזין 7 | איקס | איקס | ||
| P12955 | XEP Pro Dipeptidase | איקס | |||
| P13489 | מעכב Ribonuclease | איקס | |||
| P13533 | מיוזין 6 | איקס | איקס | ||
| P13611 | Versican מבשר חלבון הליבה | איקס | איקס | ||
| P13639 | גורם הארכה 2 | איקס | |||
| P13716 | דלתא חומצה אמינולאית | איקס | |||
| P13796 | פלסטין 2 | איקס | |||
| P13804 | העברת אלקטרונים flavoprotein מטהרת אלפא מיטוכונדריאלי מבשר | איקס | |||
| P13929 | בטא אנולז | איקס | איקס | ||
| P14136 | אסטרוציט חלבון פיבריללי חומצי | איקס | |||
| P14314 | גלוקוזידאז 2 מקדם ביתא מבטל | איקס | |||
| P14550 | אלכוהול dehydrogenase NADP | איקס | |||
| P14618 | קינאז Pyrovate isinymes M1 M2 | איקס | איקס | איקס | |
| P14625 </ Td> | Endoplasmin מבשר | איקס | איקס | ||
| P15121 | הפחתה | איקס | |||
| P15259 | Phosphoglycerate mutase 2 | איקס | |||
| P16152 | קרבוניל רדוקטאז NADPH 1 | איקס | |||
| P17066 | הלם חום 70 ק"ג חלבון 6 | איקס | איקס | איקס | |
| P17174 | Asperate aminotransferase cytoplasmic | איקס | |||
| P17540 | קריאין קינאז מבשר מיטוכונדריאלי | איקס | |||
| P17661 | דסמין | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P17980 | 26S פרוטאז רגולטורית תת 6A | איקס | |||
| P17987 | T חלבון מורכב 1 אלפא משנה | איקס | |||
| P18206 | וינסולין | איקס | איקס | ||
| P18428 | Lipopolysaccharide מבשר חלבון מבשר | איקס | |||
| P18669 | טרשת נפוצה של phosphoglycerate 1 | איקס | |||
| P19105 | מיוזין רגולטורית שרשרת האור 2 | איקס | איקס | ||
| P19623 | Spermidine סינתזה | איקס | |||
| P19652 | אלפא 1 חומצה glycoprotein 2 מבשר | איקס | איקס | ||
| P19823 | אלפא טריפסין מעכב כבד שרשרת H2 | איקס | |||
| P19827 | מעכב טריפסין אלפא כבד שרשרת H1 | איקס | איקס | ||
| P20073 | נספח A7 | איקס | |||
| P20618 | פרוטאזום יחידת משנה סוג ביתא 1 מבשר | איקס | |||
| P20774 | מימקן | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P21266 | גלוטתיון S | איקס | |||
| P21333 | פילמין א | איקס | איקס | ||
| P21796 | מתח תלוי בחלבון הערוץ הסלקטיבי של אניון1 | איקס | |||
| P21810 | ביגלייקן | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P21980 | פרוטאין גלוטמין גמא גלוטמיילטרנספראז 2 | איקס | איקס | ||
| P22105 | טנאסקין X | איקס | איקס | ||
| P22314 | הפעלת אנזים E1 | איקס | |||
| P22352 | גלוטתיון peroxidase 3 מבשר | איקס | איקס | ||
| P22626 | הטרוגניות ribonucleoproteins A2 B1 | איקס | |||
| P22695 | Ubiquinol ציטוכרום c רדוקטאז מורכב חלבון הליבה 2 מבשר המיטוכונדריאלי | איקס | |||
| P23141 | כבד carboxylesterase 1 מבשר | איקס | |||
| P23142 | פיבולין 1 | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P23284 | Pptidyl prolyl cis trans isomerase B מבשר | איקס | |||
| P23381 | טריפטופניל tRNA synthtase cytoplasmic | איקס | |||
| P23526 | Adenosylhomocysteinase | איקס | איקס | ||
| P23528 | קופילין 1 | איקס | |||
| P24752 | Acetyl CoA acetyltransferase מבשר המיטוכונדריה | איקס | |||
| P25311 | אבץ אלפא 2 glycoproteiמבשר | איקס | |||
| P25705 | ATP סינתזה יחידת משנה אלפא מיטוכונדריה | איקס | |||
| P25788 | סוג אלפא תת-פרוטאזומי 3 | איקס | איקס | ||
| P25789 | סוג אלפא תת-פרוטאזומי 4 | איקס | |||
| P26447 | חלבון S100 A4 | איקס | |||
| P27348 | 14 3 3 חלבון | איקס | איקס | ||
| P27797 | מבשר קלריצולין | איקס | |||
| P28066 | סוג אלפא תת-פרוטאזומי 5 | איקס | |||
| P28070 | <Td> פרוטאזום תת סוג בטא 4 מבשראיקס | איקס | |||
| P28072 | פרוטאזום תת סוג ביתא 6 מבשר | איקס | |||
| P28074 | פרוטאזום subunit ביתא סוג 5 מבשר | איקס | |||
| P28331 | NADH ubiquinone oxidoreductase 75 kDa מבשר מיטוכונדריאלי מבשר | איקס | |||
| P28838 | ציטוזול אמינופפטידאז | איקס | |||
| P29218 | מונוספטאטוז אינוסיטול | איקס | |||
| P29401 | Transketolase | איקס | |||
| P29692 | גורם הארכה 1 דלתא | <Td> | איקס | ||
| P29966 | Myarioylated alanine עשיר C מצע קינאז | איקס | |||
| P30040 | חלבון reticulum Endoplasmic ERP29 מבשר | איקס | |||
| P30041 | Peroxiredoxin 6 | איקס | איקס | ||
| P30043 | Flavin רדוקטאז | איקס | |||
| P30044 | Peroxiredoxin 5 מבשר המיטוכונדריה | איקס | |||
| P30085 | UMP CMP קינאז | איקס | |||
| P30086 | חלבון מחייב phosphatidylthamolamine 1 | איקס | |||
| P30101 | פרוטיN דיסולפיד isomerase A3 מבשר | איקס | איקס | איקס | |
| P30613 | Pyrovate קינאז isozymes RL | איקס | |||
| P30740 | מעכב elastase ליקוציט | איקס | |||
| P31025 | Lipocalin 1 מבשר | איקס | |||
| P31937 | 3 מבשר המיטוכונדריאלי hydroxyisobutyrate dehydrogenase | איקס | |||
| P31942 | הטרוגניות ribonucleoprotein H3 | איקס | |||
| P31943 | הטרוגניות ribonucleoprotein H | איקס | |||
| P31946 | 14 3 3 חלבון ביתא אלפא | איקס | איקס | ||
| P31948 | פוספופרוטין המופעל על ידי מתח 1 | איקס | |||
| P31949 | חלבון S100 A11 | איקס | |||
| P32119 | Peroxiredoxin 2 | איקס | איקס | ||
| P34931 | הלם חום 70 kDa חלבון 1 כמו | איקס | איקס | ||
| P34932 | הלם חום 70 ק"ג חלבון 4 | איקס | |||
| P35232 | לאסור | איקס | |||
| P35237 | סרפין B6 | איקס | |||
| P35443 | טרומבוספונדין 4 | איקס | </ Tr> | ||
| P35555 | פיברילין 1 | איקס | איקס | ||
| P35579 | מיוזין 9 | איקס | איקס | איקס | |
| P35580 | מיוזין 10 | איקס | איקס | ||
| P35609 | אלפא actinin 2 | איקס | |||
| P35625 | מעכב Metalloproteinase 3 | איקס | איקס | ||
| P35998 | 26S פרוטאז רגולטורית תת יחידה 7 | איקס | |||
| P36871 | Phosphoglucomutase 1 | איקס | איקס | ||
| P36955 | פיגמנט אפיתל נגזר גורם | איקס | איקס | ||
| P37802 | <Td> Transgelin 2איקס | איקס | |||
| P37837 | Transaldolase | איקס | |||
| P38117 | העברת אלקטרונים | איקס | |||
| P38646 | מתח 70 מבשר המיטוכונדריה חלבון | איקס | איקס | ||
| P39687 | Acucic leucine עשיר phosphoprotein גרעיני 32 בן משפחה א | איקס | |||
| P40121 | מקרופאג המכסה חלבון | איקס | |||
| P40925 | Malate dehydrogenase cytoplasmic | איקס | |||
| P40926 | מבשר מיטוכונדריאלי | <Td> | איקס | ||
| P41219 | פריפרין | איקס | |||
| P42330 | 1 חבר C3 | איקס | |||
| P45880 | מתח תלוי בחלבון הערוץ הסלקטיבי של אניון | איקס | |||
| P47755 | F אקטין מכסת חלבון תת יחידה אלפא 2 | איקס | איקס | ||
| P47756 | F אקטין מכסת חלבון תת חטיבה | איקס | איקס | ||
| P47985 | Ubiquinol ציטוכרום c רדוקטאז ברזל גופרית תת מבשר המיטוכונדריה | איקס | |||
| P48047 | ATP סינתזה O מבשר מיטוכונדריאלי | איקס | |||
| P48637 | גלוטתיון סינתטיז | איקס | |||
| P48741 | הלם חום 70 ק"ג חלבון 7 | איקס | איקס | ||
| P49189 | 4 trimethylaminobutyraldehydehyase dehyderogenase | איקס | |||
| P49368 | T חלבונים מורכבים 1 יחידת גמא | איקס | |||
| P49747 | סחוס חלבון אוליגומרי מטריקס | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P49748 | שרשרת ארוכה מאוד acyl ספציפי COA dehydrogenase מבשר המיטוכונדריה | איקס | |||
| P50395 | מעבדה | איקס | X </ Td> | ||
| P50454 | מבשר סרפין H1 | איקס | |||
| P50995 | נספח A11 | איקס | |||
| P51452 | חלבון ספציפי phosphatase 3 | איקס | |||
| P51884 | לומיקני | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P51888 | מבשר קדום | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P52565 | Rho תמ"ג דיסוציאציה 1 | איקס | |||
| P52566 | Rho תמ"ג דיסוציאציה 2 | איקס | |||
| P54652 | הלם חום הקשורים 70 חלבון קדה 2 | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P55072 | טרנספורמציה טרשתית אנדופלסמית ATPase | איקס | |||
| P55083 | Microfibril הקשורים glycoprotein 4 מבשר | איקס | איקס | ||
| P57053 | היסטון H2B סוג F | איקס | |||
| P60174 | איסומראז תלת-פוספט | איקס | איקס | איקס | |
| P60660 | פוליפפטיד אור מיוזין 6 | איקס | איקס | ||
| P60709 | אקטין cytoplasmic 1 | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P60981 | דסטין | איקס | |||
| P61086 | הצטברות אנזים Ubiquitin E2 25 kDa | איקס | |||
| P61088 | הצטברות אנזים Ebiquitin | איקס | |||
| P61224 | ראס קשור חלבון ראב 1b מבשר | איקס | |||
| P61978 | הטרוגניות ribonucleoprotein K | איקס | איקס | ||
| P61981 | 14 3 3 חלבון גמא | איקס | איקס | איקס | |
| P62258 | 14 3 3 חלבון epsilon 14 3 3E | איקס | |||
| P62491 | ראס הקשורים חלבון | איקס | |||
| P62714 | סרום threonine חלבון phosphatase 2A קטליטי יחידת משנה ביתא isoform | איקס | |||
| P62736 | שריר אקטין שריר חלק | איקס | איקס | איקס | |
| P62805 | היסטון H4 | איקס | |||
| P62826 | GTP מחייב חלבון גרעיני רן | איקס | |||
| P62873 | חלבון גואנין נוקלאוטיד מחייב GIGSGT יחידת משנה ביתא 1 | איקס | |||
| P62879 | גואנין נוקליאוטידים מחייב חלבון GIGSGT subunit ביתא 2 | איקס | |||
| P62937 | פפטידל prolyl cis trans isomerase א | איקס | איקס | ||
| P62987 | חלבון ריבוזומלי 60 ליטר | איקס | |||
| P63104 | 14 3 3 3דאטה דלתא זטה | איקס | איקס | איקס | איקס |
| P63241 | מקדם ייזום תרגום אוקריוטים 5 א 1 | איקס | |||
| P63244 | גואנין נוקליאוטידים מחייב חלבון יחידת משנה ביתא 2 כמו 1 | איקס | |||
| P63267 | אקטין גמא אנטריק שריר חלק | איקס | איקס | ||
| P67936 | Tropomyosin אלפא 4 שרשרת | איקס | |||
| P68032 | שריר הלב של אקטין אלפא 1 | איקס | |||
| P68104 | גורם הארכה 1 אלפא 1 | איקס | איקס | איקס | |
| P68133 | אקטין שרירי השלד | ||||
| P68363 | טובולין אלפא 1B שרשרת | איקס | איקס | איקס | |
| P68371 | טובולין בטא 2C שרשרת | איקס | איקס | איקס | |
| P68402 | טסיות גורם הפעלת acetylhydrolase IB תת יחידה | איקס | |||
| P68871 | המוגלובין | איקס | איקס | איקס | |
| P69905 | המוגלובין יחידת משנה אלפא | איקס | איקס | ||
| P78371 | חלבון מורכב 1 בטא יחידה | איקס | |||
| P78417 | גלוטתיון טרנספרס אומגה 1 | איקס | איקס | ||
| P80748 | Ig למבדה שרשרת VIאזור II LOI | איקס | |||
| P98095 | פיבולין 2 | איקס | איקס | ||
| Q01082 | Spectrin בטא בשר המוח 1 | איקס | |||
| Q01449 | Myosin רגולטורית שרשרת האור 2 איזופורם פרוזדורי | איקס | |||
| Q01518 | Adenylyl cyclase הקשורים חלבון 1 | איקס | |||
| Q01995 | Transgelin חלקלק שריר חלבון 22 אלפא | איקס | |||
| Q03252 | Lamin B2 | איקס | איקס | ||
| Q03591 | גורם משלים H הקשורים חלבון 1 מבשר | איקס | Q04917 | 14 3 3 חלבון eta | איקס | איקס |
| Q06323 | יחידת משנה מורכבת של פרוטאזום activator 1 | איקס | |||
| Q06828 | פיברומודולין | איקס | איקס | איקס | איקס |
| Q06830 | פרוקסידוקסין 1 | איקס | איקס | ||
| Q07507 | דרמטופונטין | איקס | איקס | איקס | איקס |
| Q07960 | Rho GTPase הפעלת חלבון 1 | איקס | |||
| Q08257 | קוקסנון חמצון | איקס | |||
| Q08431 | לקטרין | איקס | איקס | ||
| Q12765 | S1 | איקס | |||
| Q13011 | דלתא 3 5 דלתא 2 4 dienoyl CoA איזומראז מבשר המיטוכונדריה | איקס | איקס | ||
| Q13228 | סלניום חלבון מחייב 1 | איקס | איקס | ||
| Q13404 | הצטברות אנזים Ebiquitin E2 גרסה 1 | איקס | |||
| Q13409 | דינאין ציטופלסמה 1 שרשרת ביניים 2 | איקס | |||
| Q13509 | Tubulin ביתא 3 שרשרת | איקס | איקס | איקס | |
| Q13642 | ארבעה וחצי תחומים חלבון LIM 1 | איקס | |||
| Q13765 | פוליפפטיד המתהווה הקשורים אלפא משנה מורכבת | איקס | |||
| Q13885 | N Tubulin ביתא 2A שרשרת | איקס | איקס | ||
| Q14194 | חלבון הקשור Dihydropyrimidinase 1 | איקס | |||
| Q14195 | חלבון הקשור Dihydropyrimidinase 3 | איקס | איקס | איקס | איקס |
| Q14624 | מעכב טריפסין אלפא כבד שרשרת H4 מבשר | איקס | |||
| Q14697 | ניטרלי אלפא glucosidase א מבשר | איקס | |||
| Q14764 | החלבון העיקרי של קמרון | איקס | |||
| Q14767 | גורם המרה גורם צמיחה ביתא מחייב חלבון 2 | איקס | <Td>איקס | ||
| Q14894 | מומו גבישי הורמון הורמון בלוטת התריס הורמון בלוטת התריס | איקס | |||
| Q15063 | מבשר Periostin | איקס | איקס | איקס | איקס |
| Q15084 | פרוטאין דיסולפיד איזומראז A6 מבשר | איקס | |||
| Q15113 | פרופולגן C endopeptidase משפר 1 מבשר | איקס | |||
| Q15181 | פירווספטאטז אנאורגני | איקס | |||
| Q15365 | פוליפרופילן מחייב פוליאתילן 1 | איקס | |||
| Q15366 | פוליפרופילן מחייב פוליאתילן 2 | איקס | |||
| Q15582 | שינוי גורם הבטא גורם חלבון | איקס | איקס | איקס | |
| Q15819 | Ubiquitin אנזים מצומד E2 גרסה 2 | איקס | |||
| Q16352 | אלפא אינטרקסין | איקס | |||
| Q16473 | טססקין | איקס | |||
| Q16555 | חלבון הקשור Dihydropyrimidinase 2 | איקס | איקס | איקס | |
| Q16698 | 2 4 דינויל CoA רדוקטאז מבשר המיטוכונדריה | איקס | |||
| Q16891 | קרום פנימי מיטוכונדריאלי | איקס | |||
| Q562R1 | בטא כמו חלבון 2 | איקס | |||
| Q6S8J3 | POTE ankyrin תחום בן משפחה E | איקס | |||
| Q6UWY5 | Olfactomedin כמו חלבון 1 מבשר | איקס | איקס | ||
| Q71U36 | Tubulin אלפא 1A שרשרת | איקס | איקס | איקס | |
| Q7Z7G0 | יעד מבשר Nesh SH3 | איקס | איקס | איקס | |
| Q8WUM4 | מוות מתוכנן של תאים 6 אינטראקציה חלבון | איקס | |||
| Q8WWX9 | Thioredoxin כמו מבשר מ 'selenoprotein | איקס | |||
| Q92597 | חלבון NDRG1 | איקס | |||
| Q92945 אלמנט במעלה הזרם | איקס | ||||
| Q96CN7 | Isochorismatase תחום המכיל חלבון 1 | איקס | |||
| Q96CX2 | BTB POZ תחום המכיל חלבון | איקס | |||
| Q96KK5 | היסטון H2A סוג 1 H | איקס | איקס | ||
| Q96KP4 | דיפפטידאז ציטוזולי לא ספציפי | איקס | |||
| Q99426 | Tubulin ספציפי chaperone ב | איקס | |||
| Q99497 | פרוטאין DJ 1 | איקס | איקס | ||
| Q99536 | חלבון שלפוחית שלפוחית סינפטית | איקס | איקס | איקס | |
| Q99714 | 3 hydroxyacyl COA dehydrogenase סוג 2 | איקס | |||
| Q99715 | קולגן אלפא 1 XII שרשרת | איקס | איקס | ||
| Q99798 | מבשר hydratease מבשר המיטוכונדריה | איקס | |||
| Q9BQE3 | Tubulin אלפא 6 שרשרת | איקס | |||
| Q9BUF5 | Tubulin ביתא 6 שרשרת | איקס | איקס | ||
| Q9BUT1 | סוג hydroxybutyrate dehydrogenase 2 | איקס | |||
| Q9BVA1 | Tubulin ביתא 2B שרשרת | איקס | איקס | איקס | |
| Q9BXN1 | אספורין | איקס | X </ Td> | איקס | איקס |
| Q9H0W9 | אסטר הידראולזי C11orf54 | איקס | |||
| Q9H4B7 | Tubulin ביתא 1 שרשרת | איקס | |||
| Q9NRN5 | Olfactomedin כמו חלבון 3 מבשר | איקס | איקס | ||
| Q9NRV9 | חלבון מחייב Heme 1 | איקס | |||
| Q9NSB2 | סוג קראטין II קורטיקולרי Hb4 | איקס | איקס | ||
| Q9NVA2 | 11 בספטמבר | איקס | |||
| Q9UBR2 | מבשר קאתפסין Z | איקס | |||
| Q9UBX5 | פיבולין 5 | איקס | איקס | ||
| Q9UK22 | F חלבונים רק 2 | איקס | |||
| Q9Y277 | תרכובת חלבון אניון תלויי מתח 3 | איקס | |||
| Q9Y281 | קופילין 2 | איקס | |||
| Q9Y490 | טלין 1 | איקס | |||
| Q9Y696 | כלוריד ערוץ חלבון תאיים 4 | איקס | |||
| Q9Y6C2 | אמילין 1 | איקס | איקס |
טבלה 1: רשימת החלבונים שזוהו בתמיסת רקמת המסתם המיטרלית כאשר הוחלו ארבע גישות פרוטאומיות שונות: אלקטרופורזה דו מימדי (2)-DE), דו מימדי LC-MS E (2D-LC / MS E ), LC / MS E , ו- IEF בשלב נוזלי. השיטה שבה כל חלבון זוהה הוא דיווח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעד קריטי אחד של פרוטוקול זה הוא השימוש של חנקן נוזלי להקפיא את המדגם כדי לצנן את מערכת המטחנה. השימוש בחנקן נוזלי מונע השפלה ביולוגית ומאפשר אבקה יעילה, אבל זה דורש הכשרה ספציפית לטיפול בטוח.
בפרוטוקול זה תכונות מערכת המטחנה עבור מדגם שחיקה כי דגימות קטנות קשה להתאושש מרגמה רגילה ועלי. במקרה זה, דגימות קטנות להתפשט כמו אבקה דקה על פני השטח מרגמה, טיוח אוסף קשה. יתרון נוסף הוא כי המטחנה ממונע, אשר מאפשר מספר גדול יותר של דגימות להיות מעובד בצורה לשחזור וללא עייפות הוסיף. מגבלה אחת על השימוש במטחנה היא כי גודל המדגם אשר חייב להיות קטן (100 מ"ג או פחות) עבור העלי להיות לחוץ ביעילות נגד המרגמה. יתר על כן, מרכיבים מטחנת חייב להיות מחוממת לטמפרטורת החדר בין משתמש cleanin ז. כתוצאה מכך, ההליך הוא זמן רב, אם דגימות רבות מעובדים מדי יום, ערכות רבות נדרשים.
צעד קריטי נוסף הוא הכנת המאגר החילוץ. ריכוזי המלח, במיוחד עבור אוריאה (8 M) ו thiourea (2 M), הם גבוהים למדי; לכן, נפח המלח הוא כמעט מחצית הנפח הכולל של הפתרון. יתר על כן, פירוק לא קל בהתחשב בכך החום יש להימנע, כי ב 37 מעלות צלזיוס יותר, אוריאה יכול להוביל carbamylation חלבון ב N termini של חלבונים / פפטידים ועל קבוצות שרשרת אמינו בצד של שאריות ליזין arginine 17 . לאחר מומס, חיץ אוריאה חייב להיות מסוננים עם מסננים 0.22 מיקרומטר והוא יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס למשך 4 שבועות מבלי להשפיע על יעילות החילוץ שלה, אבל זה חייב להתחמם ליותר מ 15 מעלות צלזיוס לפני השימוש כדי לאפשר פירוק מוחלט .
שינויים ופתרון בעיות
Ent "> בפרוטוקול זה, מיצוי חלבון מבוצע באמצעות חיץ אוריאה המתואר כי זה אחד הפתרונות הנפוצים ביותר חלבון מיצוי עבור מחקרים proteomic בשל תאימותו עם isoelectrofocusing ויעילותה solubilizing חלבונים מסיסים במשורה 18. זה כבר הראה כי חיץ זה יכול ביעילות רבה solubilize חלבונים מסיסים במשורה, כגון חלבונים ממברנה אינטגרלי 19 , או חלבונים כי הם נוטים מאוד צבירה, כגון tubulin 18. יתר על כן, מאגר זה תואם באופן מלא עם assay Bradford לקבוע ריכוז החלבון, זה יכול לשמש ישירות 2-DE ו נוזל שלב IEF מנתח.עם זאת, חיץ זה אינו אידיאלי עבור solubilization של כל החלבונים הנוכחי במדגם. זה אפשרי כי מאגרים החילוץ שונים יכולים לחשוף חלבונים שאינם ניתנים לזיהוי על ידי פרוטוקול זה. לדוגמה, זה גם knoWn כי חלבונים ribosomal ו גרעיני יכול להיות טוב יותר שחולצו עם מיצוי חומצה או חומצה trichloroacetic / אצטון 20 , בעוד רמות ה- pH אלקליין מתאימים יותר חלבונים ממברנה 21 , 22 . לכן, השימוש במאגרים חלופיים עשוי לדרוש צעדים נוספים עבור משקעים חלבונים לחסל מלחים אשר מפריעים 2-DE או בשלב נוזלי IEF.
מגבלות הטכניקה
מספר החלבונים שזוהו על ידי פרוטוקול זה נמוך יחסית, אך ניתן לזהות את מספר הזיהויות ואת הכיסוי של הניתוח הפרוטאומי באמצעות שימוש במכשירים מודרניים יותר, אשר דיוק המסה שלהם ורצף הגדילה שלהם גדלו בצורה דרמטית בשנים האחרונות 23. ניתן לכסות חלק גדול של proteome, ללא כל צעדים prefractionation, על ידי העסקת שיפוע ארוך עבור ch נוזליהפרדות הרומנטוגרפיה יחד עם מכשיר ברזולוציה גבוהה MS שיש לו מהירות רצף מהיר 24 .
משמעות הטכניקה ביחס לשיטות קיימות / חלופיות
היכולת לזהות ולכמת חלבונים בשסתומי הלב של האדם, כגון השסתום המיטרלי, היא משימה חשובה ומאתגרת שתסייע בבירור מנגנונים של תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים במחלות שסתום. הגדרת השינויים של proteome שסתום מיטרלי יגדיל מאוד את ההבנה של הטבע של תהליכים ביולוגיים הקשורים עם מצב המחלה של הרקמה.
הידע הנוכחי על physiopathology של שסתום מיטרלי מוגבל ו מתקבל בדרך כלל באמצעות ניתוח של חלבונים בודדים המעורבים בתהליכים ספציפיים, כגון remodeling מטריקס תאיים, המוסטאזיס, דלקת, או מתח חמצוני 25 9 , 10 .
ניתן לייחס את היעדרם של מחקרים פרוטאומיים מקיפים למורכבותה של רקמה נמוכה זו, שהיא עשירה בחלבונים מטריקס תאיים ( כלומר, פרוטוגליקנים, קולגן ואלסטין). חלבונים אלה מהווים כ 80% מהכמות הכוללת, מה שמקשה על ניתוח של חלבונים בשפע נמוך 26 .
לכן, היה צורך להקים פרוטוקול מיצוי יעיל כדי למקסם את solubilization חלבון על מנת לתאר את proteome של רקמה זו. פרוטוקול זה מותר עבור מיצוי ~ 50 מיקרוגרם של חלבון מ 1 מ"ג של רקמות. זוהי תשואה נמוכה יחסית בהשוואה לרקמה "רכה"כמו כבד (~ 135 מיקרוגרם מ 1 מ"ג של הרקמה), אבל זה מספיק כדי לבצע ניתוח חלבון על דגימות בודדות. זה רלוונטי במיוחד כאשר מגדירים את השונות האינדיווידואלית של התופעה.
יתר על כן, שיטה זו יש את היתרון של להיות תואם עם יישומים אנליטיים רבים. חלבונים שסתום מיטרלי מומס במאגר החילוץ המוצע ניתן להשתמש ישירות עבור immunoblotting ו proteomic הניתוח מבוסס על אלקטרופורזה דו מימדי נוזל שלב isoelectrophoresis 11 , 12 או, לאחר משקעים חלבון לחסל הפרעה רכיב חיץ, עבור מבחני אחרים, כגון ספקטרומטריית מסה ללא ג'ל 15 .
עם היישום של פרוטוקול החילוץ הזה, אפיון ממצה יותר של מרכיבי החלבון של רקמות שסתום מיטרלי רגיל הושג באמצעות זיהוי של intracel רביםחלבונים חלביים. חלבונים אלה ממוקמים בציטוזול או באברונים, לא רק במטריצה החוץ-תאית, ויש להם תפקודים מולקולריים וביולוגיים שונים. חלבונים מעניינים אחרים ( כלומר, Cryab , septin-11, FHL-1 ו- dermatopontin) זוהו גם הם. חלבונים אלה יש פונקציות ידועים שסתום מיטרלי, אבל התכונות הביולוגיות שלהם מציע תפקיד אפשרי במחלות שסתום.
יישומים עתידיים או כיוונים לאחר מאסטרינג טכניקה זו
עם פרוטוקול זה, ניתן לקשר נתונים לגבי ביטוי חלבון עם נתונים על ביטוי mRNA כמותי ולא כמותי immunohistochemical מנתח. ואכן, כאשר משתמשים יחד, גישות אלה יוביל להבנה מקיפה יותר של המנגנונים המולקולריים שבבסיס המחלה, מ mRNA כדי שינוי שלאחר החלבון translational. לכן, שיטה זו יכולה להיות עניין לחוקרים המתמקדים physiopathology שסתום הלב. סְנַפִּירברית, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על שסתום מיטרלי חזירי, אשר נושא דמיון קרוב לשסתום האדם 27 והוא משמש מודל ניסיוני להערכת תפקוד שסתום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
משרד הבריאות האיטלקי תמך במחקר זה (RC 2013-BIO 15). אנו מודים לברברה מישלי על עזרתה הטכנית המצוינת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
