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Biochemistry

मानव मैट्रल वाल्व से प्रोटीन के निष्कर्षण के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल

doi: 10.3791/55762 Published: June 14, 2017

Summary

मानव मिट्रल वाल्व की प्रोटीन संरचना अभी भी आंशिक रूप से अज्ञात है, क्योंकि इसका विश्लेषण कम सेल्युलैरिटी द्वारा जटिल है और इसलिए कम प्रोटीन बायोसिंथेसिस द्वारा। यह काम मित्राल वाल्व प्रोटीम के विश्लेषण के लिए प्रोटीन को कुशलतापूर्वक निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

Abstract

सेलुलर प्रोटीम का विश्लेषण जटिल जैविक प्रणालियों में मौजूद प्रोटीनों की बड़े पैमाने पर पहचान और मात्रा का ठहराव की अनुमति देने वाले प्रौद्योगिकियों के विकास के कारण होने वाली बीमारियों के आणविक तंत्र को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है। एक प्रोटिओमिक दृष्टिकोण से प्राप्त ज्ञान संभावित रूप से एक रोगों के अंतर्निहित रोगजनक तंत्रों की बेहतर समझ, उपन्यास नैदानिक ​​और भविष्यवाणी रोग मार्करों की पहचान के लिए, और उम्मीद है कि, चिकित्सीय लक्ष्य। हालांकि, हृदयात्मक मिट्रल वाल्व प्रोटियोपॉलिकैन और कोलेजन-समृद्ध बाह्य मैट्रिक्स में कम सेल्युलैरिटी के कारण प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए एक बहुत चुनौतीपूर्ण नमूना का प्रतिनिधित्व करता है। यह एक वैश्विक प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए प्रोटीन निकालने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाता है। यह काम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो बाद के प्रोटीन विश्लेषण के साथ संगत है, जैसे मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स और इम्यूनोब्लॉटिंग। यह डेटा चिंता के संबंध के लिए अनुमति दे सकता हैमात्रात्मक एमआरएनए अभिव्यक्ति और गैर-मात्रात्मक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण पर डेटा के साथ जी प्रोटीन अभिव्यक्ति। दरअसल, इन तरीकों, जब एक साथ प्रदर्शन किया जाता है, तो एमआरएनए से पोस्ट-ट्रांसलेशन प्रोटीन संशोधनों से, आणविक तंत्रों के अंतर्निहित रोगों की एक अधिक व्यापक समझ प्राप्त करेगा। इस प्रकार, यह विधि कार्डियक वाल्व फिजियोपैथोलॉजी के अध्ययन में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए प्रासंगिक हो सकती है।

Introduction

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हाल के सबूतों में एमआरएनए संश्लेषण के बाद होने वाली कई नियामक तंत्रों की भूमिका की समझ में बदलाव आया है। दरअसल, अनुवाद, पोस्ट ट्रांसक्रिप्शनल, और प्रोटीयोलायटिक प्रोसेस प्रोटीन बहुतायत और कार्य को विनियमित कर सकते हैं। हठधर्मिता - जो कहती है कि एमआरएनए सांद्रता संबंधित प्रोटीनों के लिए प्रॉक्सी हैं, यह मानते हुए कि ट्रांस्क्रिप्ट स्तर प्रोटीन बहुतायत का मुख्य निर्धारक हैं - आंशिक रूप से संशोधित किया गया है। वास्तव में, प्रतिलेख स्तर केवल प्रोटीन की प्रचुरता का आंशिक रूप से अनुमान लगाता है, जो कि पोस्ट ट्रांसक्रिप्शनल इवेंट्स कोशिकाओं 1 , 2 के भीतर प्रोटीन को विनियमित करने के लिए होते हैं

इसके अलावा, प्रोटीन अंततः सेल के कार्य को नियंत्रित करता है और इसलिए अपने फ़िनोटाइप को नियंत्रित करता है, जो ऑटोक्राइन, पैराकाइन और अंतःस्रावी कारकों के जवाब में गतिशील परिवर्तन कर सकता है; रक्तजनित मध्यस्थों; तापमान; दवा से इलाज; और रोग का विकासजाहिर। इस प्रकार, प्रोटीन स्तर पर केंद्रित एक अभिव्यक्ति विश्लेषण प्रोटीम को चिह्नित करने और बीमारी रोगजनन 3 के भाग के रूप में होने वाले महत्वपूर्ण बदलावों को उजागर करने के लिए उपयोगी है।

इसलिए, मौजूदा तकनीकी चुनौतियों के बावजूद स्वास्थ्य और रोग की स्थितियों को स्पष्ट करने के लिए मौजूद प्रोटीओमिक्स मौजूद हैं। अनुसंधान के विशेष रूप से होनहार क्षेत्रों, जिनके लिए प्रोटिओमिक्स योगदान कर सकते हैं: किसी भी स्तर पर बदलकर प्रोटीन अभिव्यक्ति की पहचान ( यानी पूरे कोशिकाओं या ऊतक, subcellular डिब्बों, और जैविक तरल पदार्थ); रोग के निदान और रोग का निदान के लिए उपयोगी उपन्यास बायोमार्कर की पहचान, सत्यापन, और सत्यापन; और, उम्मीद है, नए प्रोटीन लक्ष्य की पहचान जो चिकित्सीय प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही साथ दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए 4

की जटिलता पर कब्जाप्रोटीम एक तकनीकी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है वर्तमान प्रोटिओमिक टूल, प्रोटीन के स्तरों की पहचान, मात्रा का ठहराव और सत्यापन के लिए बड़े पैमाने पर, उच्च-थ्रुपुट विश्लेषण का प्रदर्शन करने का अवसर प्रदान करते हैं। इसके अलावा, फॉक्साशन और संवर्धन तकनीकों का परिचय, जो कि प्रचुर मात्रा में प्रोटीनों की वजह से हस्तक्षेप से बचने के उद्देश्य से कम से कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीनों को शामिल करके प्रोटीन की पहचान में सुधार लाया है। अंत में, प्रोटिओमिक्स को पोस्ट-ट्रांसलेशन संबंधी संशोधनों के विश्लेषण द्वारा पूरित किया गया है, जो प्रोटीन फ़ंक्शन के उत्तरोत्तर महत्वपूर्ण modulators के रूप में उभरते हैं।

हालांकि, विश्लेषण के तहत जैविक नमूनों में नमूना तैयार करने और प्रोटीन की वसूली अभी भी प्रोटिओमिक वर्कफ़्लो में सीमित कदम बनी रहती है और संभावित नुकसान 5 की संभावना बढ़ाती है। वास्तव में, अधिकांश आणविक जीव विज्ञान तकनीकों में जो अनुकूलित किया जाना चाहिए, पहले चरण ऊतक होमोजीजिएट हैंआयन और सेल विश्लेषण, विशेष रूप से कम प्रचलीता प्रोटीन के विश्लेषण के दौरान, जिसके लिए प्रवर्धन विधि मौजूद नहीं हैं। इसके अलावा, प्रोटीन की रासायनिक प्रकृति अपने स्वयं के वसूली को प्रभावित कर सकती है। उदाहरण के लिए, अत्यधिक हाइड्रोफोबिक प्रोटीन का विश्लेषण बहुत ही चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि वे आसानी से आइसोइक्ट्रिक के दौरान ध्यान केंद्रित करते हैं, जबकि ट्रांस-झिल्ली प्रोटीन लगभग अघुलनशील हैं (संदर्भ 5 में समीक्षा की गई)। इसके अलावा, ऊतक रचना परिवर्तनशीलता सार्वभौमिक निकासी विधि को विकसित करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा पैदा करती है। अंत में, क्योंकि लगभग सभी नैदानिक ​​नमूने सीमित मात्रा के हैं, कम से कम नमूना मात्रा 6 से अधिकतम वसूली और प्रजनन क्षमता के साथ प्रोटीन की तैयारी को सक्षम करना आवश्यक है।

यह काम सामान्य मानव कार्डियक मिट्रल वाल्व से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए एक बहुत चुनौतीपूर्ण नमूना का प्रतिनिधित्व करता है। सामान्य मैट्रल वाल्व एक COMP हैबाएं आलिंद और दिल के बाएं वेंट्रिकल के बीच झूठ बोलने वाला लेक्स संरचना ( चित्रा 1 )। यह एट्रियम से रक्त प्रवाह के नियंत्रण में वेंट्रिकल के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, बैकफ्लो को रोकने और पूरे शरीर को ऑक्सीजन की आपूर्ति का उचित स्तर सुनिश्चित करता है, इस प्रकार एक पर्याप्त कार्डियक आउटपुट बनाए रखता है हालांकि, यह आमतौर पर बाह्य मैट्रिक्स में कम सेल्युलैरिटी और कुछ घटकों के साथ "निष्क्रिय" ऊतक माना जाता है। इसका कारण यह है, सामान्य परिस्थितियों में, निवासी वाल्व्युलर इन्स्ट्रिसियल सेल (वीआईसी) कम प्रोटीन बायोसिंथेसिस दर 7 के साथ एक मौनसंपादित करें।

हालांकि, यह दिखाया गया है कि, एक रोगशास्त्रीय स्थिति में, स्पन्गॉआसा में वीआईसी की संख्या बढ़ जाती है और उनके प्रोटीन संश्लेषण सक्रिय होते हैं, साथ में अन्य कार्यात्मक और फेनोटिकल बदलाव 8 । इसलिए, यह आश्चर्यजनक नहीं है कि न्यूनतम डेटा उपलब्ध हैसाहित्यिक रोगी वाल्व 9 , 10 के विश्लेषण पर साहित्य का ध्यान केंद्रित किया गया है , जिसमें सक्रिय वीआईसी की संख्या बढ़ी हुई प्रोटीनों की अपेक्षाकृत उच्च संख्या की व्याख्या कर सकती है।

निष्कर्ष में, वर्तमान प्रोटोकॉल मिथ्रल वाल्व प्रोटीन घटकों के अध्ययन के माध्यम से विकृति रोगों के लिए जिम्मेदार रोगजनक तंत्र की समझ विकसित करने के लिए काम कर सकता है। दरअसल, अंतर्निहित रोग प्रक्रियाओं की एक बड़ी समझ से वाल्व रोगों के नैदानिक ​​प्रबंधन में सुधार करने में मदद मिल सकती है, जिनके मौजूदा हस्तक्षेप के संकेतों को मोटे तौर पर हेमोडायनामिक विचारों पर माना जाता है।

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Protocol

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इस प्रोटोकॉल में, सामान्य एकोकार्डियोग्राफिक मापदंडों के बावजूद, बहु-आयुर्विज्ञान explantation (4/12 एच, 6 ± 2 ज के ठंड इस्किमिया समय के दौरान तकनीकी या कार्यात्मक कारणों के लिए अंग प्रत्यारोपण से बाहर रखा गया) वे महाधमनी और फुफ्फुसीय वाल्वों के बैंकिंग के लिए कार्डियोवस्कुलर टिशू बैंक ऑफ मिलान, मोनजिनो कार्डियोलोगिक सेंटर (मिलान, इटली) को भेजे जाते हैं। मिट्राल पोस्टर लीफलेट का उपयोग नैदानिक ​​उद्देश्यों के लिए नहीं किया जाता है, इसलिए उन्हें महाधमनी और फुफ्फुसीय वाल्व अलगाव के दौरान एकत्रित किया जाता है, के बाद सूचित सहमति दांतों के रिश्तेदारों से प्राप्त की जाती है। प्रत्यारोपण और शोध के ऊतक को माता-पिता की सहमति के बाद ही एकत्र किया जाता है; सहमति पत्र पर, वे केवल अनुसंधान के लिए कार्डियाक टिशू के उपयोग को अधिकृत करते हैं (या नहीं) यदि यह मानवीय नैदानिक ​​उपयोग ( यानी, सूक्ष्मजीवविज्ञानी, कार्यात्मक और सीरॉलॉजिकल समस्याएं) के लिए उपयुक्त नहीं है, तो नैतिक समिति के दिशानिर्देशों के अनुसारमोनजिनो कार्डियोलॉजिक सेंटर

1. मैट्रल वाल्व तैयारी

  1. अंग विस्फोट के बाद जितनी जल्दी हो सके मानव मित्राल वाल्व का उत्पादन करें (4-12 घंटे का ठंडा इस्किमिया समय)।
  2. एक साफ कमरे में, ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) समाधान ( यानी, खारा समाधान या संतुलित मध्यम यूरोकोलिन या विस्कॉन्सिन) वाले परिवहन बैग से दिल को हटा दें। इसे एक बाल्टी में रखकर वाल्व की तैयारी के साथ आगे बढ़ने के लिए इसे जैव सुरक्षा कैबिनेट (बायोहेज़र्ड ऊर्ध्वाधर वायु प्रवाह, कक्षा ए, गुड मैनफैक्चरिंग प्रैक्टिस (जीएमपी) वर्गीकरण) में रखें।
  3. कैबिनेट में एक बाँझ डिस्पोजेबल कपड़ा पर दिल रखें। बाँझ डिस्पोजेबल स्केलपेल का इस्तेमाल करके, बाएं और दाएं निलय के स्तर पर, सिर के पूरी तरह से, अपने मुख्य अक्ष को लंबवत रूप से कट कर, शीर्ष से 4 सेमी दूर।
  4. बाईं आलिंद छत को प्रदर्शित करने के लिए आरोही महाधमनी और फुफ्फुसीय धमनी को स्थानांतरित करें।
  5. बाँझ autoclavable संदंश और चुनने के साथ, पर छोड़ दिया अण्डाकार के आसपास कटौतीबाएं आलिंद छत, मिट्राल वाल्व को दिखाई देता है और महान मिट्राल लेफलेट (पूर्वकाल) और छोटे मीट्रिक पत्रक (पोस्टर) को पहचानने के लिए अनुमति देता है।
    नोट: एंटरो-पार्श्व और बाद के माध्यमिक कमांडर पूर्वकाल पुस्तिका और पिछड़े क्षेत्र की सीमा को परिभाषित करते हैं।
  6. बाँझ autoclavable कैंची और गैर-दर्दनाक संदंश का उपयोग, बाएं आलिंद काटना और पूरे mitral वाल्व के परिधि के आसपास वेंट्रिकल दीवार मोटाई
  7. मिट्रो-महाधमनी वाल्व निरंतरता को पहचानें
    नोट: बाएं वेंट्रिकल में पूरे मित्राल वाल्व और chords शामिल हैं।
  8. पीछे के विक्रय वाल्व पत्रक से पूर्वकाल मिश्रित वाल्व पत्रक अलग करें, वेंट्रिकल (संचयन) के साथ सम्मिलन के साथ पीछे के पत्रक काटने।
  9. खारा समाधान में पीछे की पुस्तिका को धो लें पुस्तिका को छोटे टुकड़ों (<1 सेमी 2 ) में काटें और व्यक्तिगत रूप से उन्हें एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें। तरल नाइट्रोजन के साथ स्नैप-फ्रीज करें
    सावधानी: तरल नाइट्रोजन का उपयोग करते समय संगठनात्मक सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करें।
    1. कैबिनेट की तालिका में 70% आइसोप्रोपील अल्कोहल समाधान और 6% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान प्रक्रिया के अंत में समाहित करें।

2. प्रोटीन निष्कर्षण

  1. तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत नमूना लेने के लिए संदंश का उपयोग करें और इसे अभी भी सूखा बर्फ पर रखें, जबकि एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा हुआ है। किसी भी स्थानान्तरण के दौरान नमूने को पिघलना छोड़ दें।
  2. पीसने से पहले, द्रव नाइट्रोजन (~ 500 एमएल) वाले देवर के फ्लास्क में डालकर, चीनी मिट्टी के बरतन / जिरकोनाइम मोर्टार और एक पेल्स्टर सिस्टम की मस्तूल ( उदाहरण के लिए, क्रायो ग्रिंडर) को नमूना के साथ ठंडा कर दें।
    सावधानी: तरल नाइट्रोजन का उपयोग करते समय संगठनात्मक सुरक्षा प्रक्रियाओं का पालन करें।
  3. सूखे बर्फ युक्त एक पॉलीस्टाइन बॉक्स में मोर्टार और मसाले रखो। एल्यूमीनियम पन्नी से नमूना निकालें और इसे मोर्टार में डाल दें।
  4. पीस लेंपेस्टल को घुमाने के लिए पेचकश का उपयोग करके, वह मोर्टार के 15-20 गुना के खिलाफ बड़े मूसल के साथ नमूना पीसने की प्रक्रिया के दौरान एक पूर्व ठंडा रंग की नोक के साथ नमूना मिलाएं।
    1. छोटे मूसल के साथ दोहराएं।
  5. पहले नमूना ट्यूब के लिए पहले से तौला ट्यूब ( उदाहरण के लिए, 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब) को ट्यूब में घुसने, मोर्टार पर रखकर, और ट्यूब में नमूना को स्थानांतरित करने के लिए उन्हें एक साथ घुमाकर स्थानांतरित करें। मोर्टार से सभी सामग्री को ठीक करने के लिए पूर्व-ठंडा रंग का प्रयोग करें।
    1. स्थानांतरण के दौरान नमूना पिघलना से बचने के लिए सूखी बर्फ पर नमूना के साथ ट्यूब रखें।
  6. नमूना के शुद्ध वजन की गणना करें।
  7. हर नमूना के बाद मोर्टार और पेस्टल्स को साफ करें और उन्हें 2 घंटे के लिए 200 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेविंग या हीटिंग के द्वारा डिज़ाइन करें।
  8. उलटा द्वारा एक homogenizer के ग्लास ट्यूब के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब से पाउडर नमूना स्थानांतरित करें।
  9. फ़िल्टर्ड यूरिया बफ़ी जोड़ेंगिलास ट्यूब के लिए आर (8 एम यूरिया, 2 एम थियोरिया, 4% वाइ-वी सीएपीएस, 20 एमएम ट्राइस और 55 मिमी डीथॉयट्रेटीइटॉल), प्रत्येक 10 मिलीग्राम पाउडर टिशू के लिए 200 μएल यूरिया बफर।
    नोट: यूरिया बफर की गणना की मात्रा के हिस्से का उपयोग करके अपकेंद्रित्र ट्यूब में शेष अवशिष्ट पाउडर नमूना पुनर्प्राप्त किया जा सकता है।
  10. एक borosilicate ग्लास मोर्टार और एक polytetrafluoroethylene (पीटीएफई) मूसल से सुसज्जित एक हलचल का उपयोग कर नमूना homogenize धीरे-धीरे मूसल को एक घुमाव गति (1,500 आरपीएम) के साथ नमूना पर 10 बार दबाएं
  11. सतह पर तैरनेवाला को पुनर्प्राप्त करें और उसे साफ 1.7 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। फिर से ताजा यूरिया बफर के साथ शेष नमूना निकालें, पहले निष्कर्षण के दौरान इस्तेमाल किए गए मात्रा का आधा हिस्सा जोड़कर।
  12. दोहराएं चरण 2.10
  13. सतह पर तैरनेवाला को ठीक करें और चरण 2.11 से सतह पर तैरने वाले के साथ इसे गठबंधन करें। 30 मिनट के लिए एक ट्यूब रोटेटर पर संयुक्त सतह पर तैरनेवाला रखें
  14. ट्यूब 30 मिनट 13,000 xg और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र
  15. सतह पर तैरनेवाला एक को पुनर्प्राप्त करेंडी निर्माता के निर्देशों के अनुसार, ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख का उपयोग करते हुए प्रोटीन एकाग्रता को मापने। उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना स्टोर करें।

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Representative Results

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यूरिया बफर में प्रोटीन का निष्कर्षण और विघटन सीधे आइसोएक्ट्रोफोकसिंग (दो-आयामी वैद्युतकणसंचलन (2-डीई) 11 और तरल चरण आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग (आईईएफ) 12 ) पर आधारित प्रोटिमीक विधियों के साथ संगत है और लामेल्ली बफर 13 में कमजोर पड़ने के बाद इम्यूनोब्लॉटिंग के साथ एक प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल युक्त 14

जेल से मुक्त जन स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित विधियों ( अर्थात्, डेटा-स्वतंत्र जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण (एलसी / एमएस ) और दो-आयामी एलसी / एमएस (2 डी-एलसी / एमएस ) के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी 15 , नमूने निकाले गए वर्णित यूरिया बफर में यूरिया और थियोरिया को खत्म करने के लिए और इलाज किया जाना चाहिए, जो बाद में प्रोटीन पाचन और तरल क्रोमैटोग्राफी अलग होने में हस्तक्षेप कर सकता है। थीप्रोटीन को कम करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए वाणिज्यिक प्रोटीन वर्षा किट का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है। नमूना तो 25 एमएम एनएच 4 एचसीओ 3 में भंग किया जा सकता है जिसमें प्रोटीन पाचन 16 के लिए 0.1% क्लेविएबल डिटर्जेंट होते हैं। प्रोटीन का वर्षा बफर घटकों को समाप्त कर सकता है, कम से कम प्रोटीन सामग्री (प्रोटीन वसूली:> 85%) को प्रभावित कर सकता है, इस प्रकार प्रत्येक प्रकार के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नमूना प्रदान करता है।

मानव मिश्रित वाल्व से प्रोटीन निष्कर्षण के लिए कुल 422 प्रोटीन की पहचान के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग, चार अलग-अलग प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोणों के संयोजन से पहले 11 , 15 के विवरण में वर्णित है। विशेष रूप से, 16 9 प्रोटीन की पहचान 2-डी, 330 प्रोटीन तरल चरण आईईएफ, एलसी / एमएस द्वारा 96 प्रोटीन और 148 प्रोटीन2 डी-एलसी / एमएस (तालिका 1) द्वारा

Subcellular स्थानीयकरण के मामले में 422 पहचाने गए प्रोटीन को वर्गीकृत करने के लिए, एक सॉफ्टवेयर जीन ओण्टोलॉजी (जीओ) विश्लेषण ( जैसे, साइटोस्केप) के लिए इस्तेमाल किया गया था। सॉफ्टवेयर और इसके संबंधित प्लग-इन के साथ बनाया गया नेटवर्क दिखाता है कि बाहरी क्षेत्र में स्थानीयकृत प्रोटीनों के अलावा ( चित्रा 2 के ऊपरी दाएं भाग को देखें), प्रोटिओमिक दृष्टिकोणों द्वारा पहचाने जानेवाले अधिकांश प्रोटीन इंट्रासेल्यूलर क्षेत्र से होते थे ( यानी, साइटलोप्लाज्म, ऑर्गेनेल, फेशियल और साइटोस्केलेटन)। सेल-सतह प्रोटीन की पहचान की गई ( चित्रा 2 )।

परिणामों को तीन स्वतंत्र मेट्रल वाल्व नमूनों में और पुष्टि की गई थी। इम्यूनोबलॉटिंग का उपयोग चार प्रोटीन के समूह ( यानी, सेप्टिन -11, चार और एक आधा लिम डोमेन प्रोटीन 1 (एफएचएल-1) के विश्लेषण के लिए किया गया था, डेरमैटॉपॉन्टीन, और अल्फा-क्रिस्टलीन बी (क्रैएब)) जिन्हें कभी सामान्य मेट्रल वाल्व ( चित्रा 3 ) में नहीं पहचाना गया है।

आकृति 1
चित्रा 1: मैट्रल वाल्व संरचना। बंद ( ) या खुली ( बी ) मानव मिट्रल वाल्व दिखा मानव दिल के शीर्ष दृश्य मानव हृदय के बाएं वेंट्रिकल के सामने का दृश्य ( सी ) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 चित्रा 2: सेलुलर वितरण की अवधि में पहचान mitral वाल्व प्रोटीन का विश्लेषण। साइटोस्केप और प्लगइन बीएनजीओ का उपयोग करने के लिए किया गया थासेलुलर घटक श्रेणियों से जीन ओण्टोलॉजी (जीओ) के नियमों का वितरण। सर्कल का आकार चयनित गो शर्तों से जुड़े प्रोटीन घटकों की संख्या के अनुपात में है, और ओवर-प्रस्तुतीकरण के पी-मान के लिए रंग पैमाने की सूचना दी जाती है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: सेप्टीन -11, एफएचएल-1, डर्माटोपोंटिन और क्रायैब के तीन मानव सामान्य मिट्रल वाल्व पत्रक से पूरे निकालने में Immunoblotting विश्लेषण। इम्यूनोबलॉटिंग को क्रायएब और खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के खिलाफ सेप्टीन -11, एफएचएल-1, और डर्माटोपोन्टिन एंटीबॉडी के खिलाफ माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। कृप्याइस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें

<td> एक्स <td> <टीडी> प्रोटीसॉम सबयूनेट बीटा टाइप 4 अग्रदूत <td> </ Tr> <टीडी> ट्रांसगेलिन 2 <td> <tr> <td>
परिग्रहण विवरण 2-डे 2 डी-नियंत्रण रेखा एलसी-एमएस तरल चरण आईईएफ
A6NMZ7 कोलेजन अल्फा VI एक्स
O00151 पीडीजी और एलआईएम डोमेन प्रोटीन 1 एक्स
O00299 क्लोराइड इंट्राससेल्यूलर चैनल प्रोटीन 1 एक्स
O00764 पायरेडॉक्सल किनाज एक्स
O14558 हीट शॉक प्रोटीन बीटा 6 एक्स
O43399 ट्यूमर प्रोटीन डी 54 एक्स
O43488 अफलेटोक्सिन बी 1 एल्डिहाइड रिडक्टेस सदस्य 2 एक्स
O43707 अल्फा एक्टिनिन 4 एक्स एक्स
O43866 अग्रिम की तरह सीडी 5 एंटीजन एक्स
O60493 नेक्सिन 3 छंटनी एक्स
O60701 यूडीपी ग्लूकोज 6 डिहाइड्रोजनेज एक्स
O75223 अप्रभावित प्रोटीन एक्स
O75368 एसएच 3 डोमेन बाध्यकारी ग्लूटामिक एसिड प्रोटीन की तरह समृद्ध है एक्स
O75390 साइट्रेट सिंथेज़ मिटोकोंड्रियल अग्रदूत एक्स
O75489 एनएडीएच डिहाइड्रोजनेज ubiquinone लोहा सल्फर प्रोटीन 3 मिटोकोंड्रल अग्रदूत एक्स एक्स
O75608 एसील प्रोटीन thioesterase 1 एक्स
O75828 कार्बोनिल रिडक्टेज एनएडीएफ़एच 3 एक्स
O75874 आइसोकिटेट डिहाइड्रोजनेज एनएडीपी साइटोप्लाजिकिक एक्स
O75955 Flotillin एक्स
O94760 एनजी एनजी डायमिथॉलैगिनिन डाइमेथिलमाइनहाइड्रॉलेस 1 एक्स
O94788 रेटिनल डिहाइड्रोजनेज 2 एक्स
O95865 एनजी एनजी डायमिथाइलैगिनिन डाइमेथिलमाइनहाइड्रॉलेस 2 एक्स एक्स
P00325 शराब डिहाइड्रोजनेज 1 बी एक्स एक्स
P00338 एल लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज ए चेन एक्स
P00352 रेटिनल डिहाइड्रोजनेज 1 एक्स
P00441 सुपरऑक्साइड डिसूटाटेज क्यू जेएन एक्स एक्स
P00450 सेरूलोप्लास्मीन अग्रदूत एक्स एक्स
P00488 जमावट का कारक XIII एक चेन अग्रदूत एक्स
P00491 प्यूरिन न्यूक्लॉसाइड फॉस्फोराइलैस एक्स
P00492 हाइपॉक्सीथाइन गैनिन फॉस्फोर्बिस्सिलट्रांसफेरेज एक्स
P00558 फॉस्फोग्लाइर्टेट किनाज 1 एक्स एक्स
P00568 एडेनीलेट कानेज एकोनजीम 1 एक्स
P00734 prothrombin एक्स एक्स
P00738 haptoglobin एक्स एक्स एक्स एक्स
P00739 हप्टोग्लोबिन संबंधित प्रोटीन अग्रदूत एक्स
P00751 पूरक कारक बी एक्स एक्स एक्स
P00915 कार्बोनिक एनहाइड्राज़ 1 एक्स
P00918 कार्बोनिक एनहाइड्रेस 2 एक्स
P01008 एंटीथ्रॉम्बिन III अग्रदूत साबित एक्स एक्स एक्स
P01009 अल्फा 1 एंटीट्रिप्सिन एक्स एक्स एक्स एक्स
P01011 अल्फा 1 एंटीकाइमोट्रिप्सिन एक्स एक्स एक्स एक्स
P01019 एंजियोटेनसिनोजन अग्रदूत एक्स एक्स
P01023 अल्फा 2 मैक्रोग्लोबुलिन एक्स एक्स
P01024 पूरक C3 एक्स एक्स एक्स एक्स
P01033 मेटलॉप्रोटीनस अवरोधक 1 अग्रदूत एक्स
P01042 Kininogen 1 अग्रदूत साबित एक्स
P01593 आईजी कपा चेन VI क्षेत्र एजी एक्स
P01598 आईजी कप चैन VI क्षेत्र ईयू एक्स
P01600 आईजी कप चैन विजन क्षेत्र हा एक्स एक्स
P01611 आईजी कप चेन VI क्षेत्र वेस एक्स
P01620 आईजी कप चैन वी III क्षेत्र एसआईई एक्स
P01625 आईजी कप चेन वी 4 क्षेत्र लेन एक्स
P01766 आईजी भारी श्रृंखला वी III क्षेत्र बीआरओ एक्स एक्स
P01781 आईजी भारी श्रृंखला वी III क्षेत्र लड़की एक्स
P01834 आईजी कप चेन सी क्षेत्र एक्स एक्स एक्स एक्स
P01842 आईजी लैम्ब्डा श्रृंखला सी क्षेत्र एक्स एक्स एक्स
P01857 आईजी गामा 1 श्रृंखला सी क्षेत्र एक्स एक्स एक्स एक्स
P01859 आईजी गामा 2 श्रृंखला सी क्षेत्र एक्स एक्स एक्स एक्स
P01860 आईजी गामा 3 श्रृंखला सी क्षेत्र एक्स एक्स एक्स
P01861 आईजी गामा 4 श्रृंखला सी क्षेत्र एक्स एक्स एक्स
P01871 आईजीएम चेन सी क्षेत्र एक्स एक्स एक्स
P01876 आईजी अल्फा 1 श्रृंखला सी क्षेत्र एक्स एक्स एक्स एक्स
P01877 आईजी अल्फा 2 श्रृंखला सी क्षेत्र एक्स
P02144 Myoglobin एक्स एक्स
P02452 कोलेजन अल्फा 1 आई श्रृंखला एक्स एक्स एक्स एक्स
P02511 अल्फा क्रिस्टलीन बी श्रृंखला एक्स
P02545 लैमिन एसी 70 केडीए लेमीन एक्स एक्स एक्स एक्स
P02647 अपोलिपोप्रोटीन एआई एक्स एक्स एक्स एक्स
P02649 अपोलिपोप्रोटीन ई एक्स एक्स एक्स एक्स
P02671 फाइब्रिनोज़ अल्फा श्रृंखला एक्स एक्स एक्स एक्स
P02675 फाइब्रिनोज बीटा श्रृंखला एक्स एक्स एक्स एक्स
P02679 फाइब्रिनोज गामा श्रृंखला एक्स एक्स एक्स एक्स
P02689 मायीलिन पी 2 प्रोटीन एक्स
P02735 सीरम अमाइलाइड एक प्रोटीन अग्रदूत एक्स
P02741 सी प्रतिक्रियाशील प्रोटीन अग्रदूत एक्स
P02743 सीरम अमाइलॉइड पी घटक एक्स एक्स एक्स एक्स
P02746 कॉम्प्लिटर C1q सबकम्पनेट सबयूनिट बी एक्स एक्स
P02747 C1q उपघटक उप-भाग सी अग्रदूत के पूरक एक्स
P02748 कम्प्लिमेंट घटक सी 9 एक्स एक्स एक्स
P02749 बीटा 2 ग्लाइकोप्रोटीन 1 एक्स एक्स एक्स एक्स
P02750 लाइकोइन अमीर अल्फा 2 ग्लाइकोप्रोटीन अग्रदूत एक्स
P02751 फ़ाइब्रोनेक्टिन एक्स एक्स
P02760 एएमबीपी प्रोटीन अग्रदूत एक्स एक्स एक्स एक्स
P02763 अल्फा 1 एसिड ग्लाइकोप्रोटीन 1 एक्स एक्स एक्स
P02765 अल्फा 2 एचएस ग्लाइकोप्रोटीन अग्रदूत एक्स
P02766 ट्रांस्टिथ्रिन अग्रदूत एक्स एक्स एक्स
P02768 सीरम एल्ब्युमिन एक्स एक्स एक्स एक्स
P02774 विटामिन डी बाइंडिंग प्रोटीन अग्रदूत एक्स
P02787 Serotransferrin एक्स एक्स एक्स एक्स
P02788 लैक्टोट्रांसफ़्रिन अग्रदूत एक्स
P02790 Hemopexin एक्स एक्स एक्स एक्स
P02792 फेरिटीन लाइट चेन एक्स
P04004 vitronectin एक्स एक्स एक्स एक्स
P04075 फर्कटोज बिस्फोस्फेट एल्डोलेज़ ए एक्स
P04083 एनेक्सिन ए 1 एक्स एक्स एक्स एक्स
P04179 सुपरऑक्साइड डिसूटासेज एमएन मिटोचोनड्रल अग्रदूत एक्स
P04196 हिस्टीडीन समृद्ध ग्लाइकोप्रोटीन अग्रदूत एक्स
P04217 अल्फा 1 बी ग्लाइकोप्रोटीन अग्रदूत एक्स एक्स
P04350 टूबुलीन बीटा 4 श्रृंखला एक्स
P04406 ग्लिसराइडहाइड 3 फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज एक्स एक्स एक्स एक्स
P04792 हीट शॉक प्रोटीन बीटा 1 एक्स एक्स एक्स एक्स
P05091 एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज मिटोकॉन्ड्रियल अग्रदूत एक्स एक्स
प्लाज्मा प्रोटीज सी 1 अवरोधक अग्रदूत एक्स
P05156 पूरक कारक मैं पूर्ववर्ती एक्स
P05413 फैटी एसिड बाइंडिंग प्रोटीन दिल एक्स
P05452 टेट्रानैक्टिन अग्रदूत टीएन एक्स एक्स
P05787 केराटिन प्रकार II साइटोस्केलेटल 8 एक्स
P06396 Gelsolin एक्स एक्स एक्स एक्स
P06576 एटीपी सिंथेस सबयूनेट बीटा मिटोकॉन्ड्रियल अग्रदूत एक्स एक्स
P06732 क्रिएटिन कीनेस एम टाइप एक्स एक्स
P06733 अल्फा एनोलेज़ एक्स एक्स एक्स एक्स
P06753 ट्रोपोमायसिन अल्फा 3 श्रृंखला एक्स एक्स
P07108 एसीएल कोए बाइंडिंग प्रोटीन एक्स
P07195 एल लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज बी चेन एक्स एक्स एक्स
P07196 न्यूरोफ़िलामेंट लाइट पॉलीपेप्टाइड एक्स
P07197 न्यूरोफिल्मेट मध्यम पॉलीप्प्टाइड एक्स एक्स
P07237 प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड isomerase अग्रदूत एक्स एक्स
P07339 कैथेशसिन डी अग्रदूत एक्स एक्स
P07355 एनेक्सिन ए 2 एक्स एक्स एक्स एक्स
P07360 पूरक C8 गामा श्रृंखला अग्रदूत साबित एक्स
P07437 टूबुलीन बीटा श्रृंखला एक्स एक्स एक्स एक्स
P07585 Decorin एक्स एक्स एक्स एक्स
P07737 प्रोफाइल 1 एक्स
P07858 कैथेशसिन बी अग्रदूत एक्स
P07900 हीट सदमे प्रोटीन एचएसपी 90 अल्फा एक्स एक्स
P07951 ट्रोपोमायसिन बीटा श्रृंखला एक्स
P07954 फ्यूमरेट हाइड्रेट्स मिटोकॉन्ड्रियल अग्रदूत एक्स
P07996 थ्रोम्बोस्पोंडिन 1 एक्स एक्स एक्स
P08107 गर्मी झटका 70 केडीए प्रोटीन 1 ए 1 बी एक्स एक्स एक्स एक्स
P08123 कोलेजन अल्फा 2 आई श्रृंखला एक्स एक्स एक्स एक्स
P08133 एनेक्सिन ए 6 एक्स एक्स
P08238 हीट सदमे प्रोटीन एचएसपी 90 बीटा एक्स एक्स
P08253 72 केडीए प्रकार IV collagenase अग्रदूत एक्स
P08294 एक्स्ट्रासेल्युलर सुपरऑक्साइड डिमुटाईज़ क्यू जेएन प्रीursor एक्स एक्स एक्स
P08590 मायोसिन प्रकाश पॉलीपेप्टाइड 3 एक्स एक्स
P08603 पूरक कारक एच एक्स एक्स एक्स एक्स
P08670 vimentin एक्स एक्स एक्स एक्स
P08729 केराटिन प्रकार II साइटोकैक्टल 7 एक्स
P08758 एनेक्सिन ए 5 एक्स एक्स एक्स एक्स
P09211 ग्लुटाथियोन एस ट्रांसफर पी एक्स एक्स एक्स
P09382 गैलेक्टिन 1 एक्स एक्स एक्स
P09417 डायहाइड्रोप्राइडिन रिडक्टेस एक्स
P09493 ट्रोपोमायसिन 1 अल्फा श्रृंखला एक्स एक्स
P09525 एनेक्सिन ए 4 एक्स एक्स
P09651 विषम परमाणु रिबन्यूक्लोप्रोटीन ए 1 एक्स
P09871 कॉम्प्लेमर सी 1 एस उपकंपनीेंट अग्रदूत एक्स
P09936 यूबीक्विटीन कार्बोक्ज़िल टर्मिनल हाइड्रोलेस आइसोज़ाइम एल 1 एक्स
P09972 फर्कटोज बिस्फोस्फेट एल्डोलेज़ सी एक्स
P0C0L4 कॉम्प्लिटर सी 4 ए अग्रदूत एक्स
P0CG05 पुलिस महानिरीक्षकलैम्ब्डा 2 श्रृंखला सी क्षेत्र एक्स
P0CG38 पोट आकीरिन डोमेन परिवार के सदस्य I एक्स
P10515 डाइहाइड्रॉलीफ़ोलीस्सिन अवशेषों एइकेलाट्रांसफेरेज घटक पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज कॉम्प्लेक्स एक्स
P10768 एस फार्मिलग्लैटाथिऑन हाइड्रोलाज़ एक्स
P10809 60 केडीए गर्मी आघात प्रोटीन मिटोचोनड्रल अग्रदूत एक्स
P10909 Clusterin एक्स एक्स एक्स एक्स
P10915 Hyaluronan और proteoglycan लिंक प्रोटीन 1 अग्रदूत साबित एक्स एक्स
P11021 78 केडीए जील्यूकोस विनियमित प्रोटीन एक्स एक्स एक्स
P11047 लैमिनिन सबिनिट गामा 1 अग्रदूत एक्स
P11142 हीट शॉक 71 केडीए प्रोटीन का संकलन एक्स एक्स एक्स एक्स
P11177 पिरुवेट डिहाइड्रोजनेज ई 1 के घटक सबयूनेट बीटा मिटोकॉन्ड्रियल अग्रदूत एक्स
P11217 ग्लाइकोजन फॉस्फोरेलेस मांसपेशियों का रूप एक्स
P11310 मध्यम श्रृंखला विशिष्ट एसीएल कोए डिहाइड्रोजनेज मिटोकोंड्रियल अग्रदूत एक्स
P11413 ग्लूकोज़ 6 फॉस्फेट 1 डिहाइड्रोजनेज एक्स
P11766 शराब डिहाइड्रोजनेज वर्ग 3 ची श्रृंखला एक्स
P12036 न्यूरोफिलामेंट भारी पॉलीप्प्टाइड एक्स
P12109 कोलेजन अल्फा 1 छठी श्रृंखला एक्स एक्स एक्स एक्स
P12110 कोलेजन अल्फा 2 छठी श्रृंखला एक्स एक्स एक्स एक्स
P12111 कोलेजन अल्फा 3 छठी श्रृंखला एक्स एक्स एक्स
P12277 क्रिएटिन कीनेस बी प्रकार एक्स
P12429 एनेक्सिन ए 3 एक्स एक्स
P12814 अल्फा एक्टिनिन 1 एक्स एक्स
P12829 मायोसिन प्रकाश पॉलीपेप्टाइड 4 एक्स
P12882 मायोसिन 1 एक्स
P12883 मायोसिन 7 एक्स एक्स
P12955 ज़ा प्रो डायपेप्टीडाबेस एक्स
P13489 रिबन्यूकेस अवरोधक एक्स
P13533 मायोसिन 6 एक्स एक्स
P13611 वर्कीय कोर प्रोटीन अग्रदूत एक्स एक्स
P13639 बढ़ाव कारक 2 एक्स
P13716 डेल्टा एमिनोलेवुलिनिक एसिड डीहाइड्रेटस एक्स
P13796 प्लास्टिन 2 एक्स
P13804 इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण फ्लैवोप्रोटीन सबयूनेट अल्फा मिटोचोन्द्रीयल अग्रदूत एक्स
P13929 बीटा एनोलस एक्स एक्स
P14136 ग्लिअल फेब्र्रेरीयस अम्लीय प्रोटीन एस्ट्रोसाइट एक्स
P14314 ग्लूकोजिडस 2 उपनिट बीटा अग्रदूत एक्स
P14550 शराब डिहाइड्रोजनेज एनएडीपी एक्स
P14618 पिरुवेट कीनाज़ आइसोजिम्स एम 1 एम 2 एक्स एक्स एक्स
P14625 </ Td> एंडोप्लासिन अग्रदूत एक्स एक्स
P15121 एल्डोस रिडक्टेज एक्स
P15259 फॉस्फोग्लाइर्टेट उत्परिवर्तन 2 एक्स
P16152 कार्बीनल रिडक्टेस एनएडीएफ़एच 1 एक्स
P17066 गर्मी झटका 70 केडीए प्रोटीन 6 एक्स एक्स एक्स
P17174 Aspartate aminotransferase cytoplasmic एक्स
P17540 क्रिएटिन कीनेस सरकोमेरिक मिटोकोंड्रियल अग्रदूत एक्स
P17661 Desmin एक्स एक्स एक्स एक्स
P17980 26 एस प्रोटीज नियामक सबयूनेट 6 ए एक्स
P17987 टी जटिल प्रोटीन 1 सबयूनेट अल्फा एक्स
P18206 Vinculin एक्स एक्स
P18428 लाइपोपॉलासेकेराइड बाइंडिंग प्रोटीन अग्रदूत एक्स
P18669 फॉस्फोग्लाइर्टेट उत्परिवर्तित 1 एक्स
P19105 मायोसिन नियामक प्रकाश श्रृंखला 2 एक्स एक्स
P19623 स्पर्मिडाइन सिंथेस एक्स
P19652 अल्फा 1 एसिड ग्लाइकोप्रोटीन 2 अग्रदूत एक्स एक्स
P19823 इंटर अल्फा ट्रिप्सिन इनहिबिटर भारी श्रृंखला एच 2 एक्स
P19827 इंटर अल्फा ट्रिप्सिन अवरोधक भारी श्रृंखला एच 1 एक्स एक्स
P20073 एनेक्सिन ए 7 एक्स
P20618 प्रोटेसाम सबयूनेट बीटा टाइप 1 अग्रदूत एक्स
P20774 Mimecan एक्स एक्स एक्स एक्स
P21266 ग्लुटाथियोन एस ट्रांसफर म्यू 3 एक्स
P21333 फिलामिन ए एक्स एक्स
P21796 वोल्ट आश्रित आयनों का चयनात्मक चैनल प्रोटीन1 एक्स
P21810 Biglycan एक्स एक्स एक्स एक्स
P21980 प्रोटीन ग्लूटामाइन गामा ग्लूटामिल ट्रान्सफरेज़ 2 एक्स एक्स
P22105 टेनास्किन एक्स एक्स एक्स
P22314 Ubiquitin सक्रिय एंजाइम E1 एक्स
P22352 ग्लुटाथियोन पेरोक्सीडेस 3 अग्रदूत एक्स एक्स
P22626 विषम परमाणु रिबोन्यूक्लॉप्टरेटिन ए 2 बी 1 एक्स
P22695 Ubiquinol cytochrome c reductase जटिल कोर प्रोटीन 2 mitochondrial अग्रदूत एक्स
P23141 लीवर कार्बोक्ज़ेलेस्टेस 1 अग्रदूत एक्स
P23142 फिबुलिन 1 एक्स एक्स एक्स एक्स
P23284 पेप्टिडाइल प्रोलिल सीआईएस ट्रांस isomerase बी अग्रदूत एक्स
P23381 ट्रिप्टोफैनल टीआरएनए सिंथेसेटिस साइटोप्लाजिकिक एक्स
P23526 Adenosylhomocysteinase एक्स एक्स
P23528 कॉफ़ीलीन 1 एक्स
P24752 एसिटाइल कोए एसिटाइलट्रांसफेरेज मिटोकॉन्ड्रियल अग्रदूत एक्स
P25311 जस्ता अल्फा 2 ग्लाइकोप्रोटीएन अग्रदूत एक्स
P25705 एटीपी सिंथेस सबयुनिट अल्फा मिटोचोनड्रल एक्स
P25788 प्रोटेसाम सबिनिट अल्फा टाइप 3 एक्स एक्स
P25789 प्रोटेसाओम सबिनिट अल्फा टाइप 4 एक्स
P26447 प्रोटीन एस 100 ए 4 एक्स
P27348 14 3 3 प्रोटीन थीटा एक्स एक्स
P27797 Calreticulin अग्रदूत एक्स
P28066 प्रोटेसाम सबिनिट अल्फा टाइप 5 एक्स
P28070 एक्स एक्स
P28072 प्रोटेसाम सबयूनेट बीटा टाइप 6 अग्रदूत एक्स
P28074 प्रोटेसाम सबयूनेट बीटा टाइप 5 अग्रदूत एक्स
P28331 एनएडीएच ubiquinone oxidoreductase 75 केडीए सबुनाइट मिटोकोंड्रियल अग्रदूत एक्स
P28838 साइटोसोल एमिनोपैप्टिडेस एक्स
P29218 इनॉसिटॉल मोनोफोस्फेटस एक्स
P29401 Transketolase एक्स
P29692 बढ़ाव कारक 1 डेल्टा एक्स
P29966 माइक्रोसॉइलेटेड अलानाइन अमीर सी किनेज सब्सट्रेट एक्स
P30040 एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम प्रोटीन ईआरपी 2 9 अग्रदूत एक्स
P30041 पेरोक्साइडऑक्सीन 6 एक्स एक्स
P30043 फ़्लाविन रिडक्टेस एक्स
P30044 पेरोक्साइडऑक्सीन 5 मिटोकोंड्रियल अग्रदूत एक्स
P30085 यूएमपी सीएमपी किनेज एक्स
P30086 फॉस्फेटिडेलेथिनोलामाइन बाइंडिंग प्रोटीन 1 एक्स
P30101 proteiएन डिल्फाइड isomerase ए 3 अग्रदूत साबित एक्स एक्स एक्स
P30613 पाइरूवेट कीनाज आइसोजिम्स आरएल एक्स
P30740 ल्यूकोसैट इलास्टेज अवरोधक एक्स
P31025 लिपोकलिन 1 अग्रदूत एक्स
P31937 3 हाइड्रॉक्सियिसोब्युटेट डिहाइड्रोजनेज मिटोचोन्डाय्रियल अग्रदूत एक्स
P31942 विषम परमाणु रिबन्यूक्लोप्रोटीन एच 3 एक्स
P31943 विषम परमाणु रिबन्यूक्लोप्रोटीन एच एक्स
P31946 14 3 3 प्रोटीन बीटा अल्फा एक्स एक्स
P31948 तनाव प्रेरित फॉस्फोप्रोटीन 1 एक्स
P31949 प्रोटीन एस 100 ए 11 एक्स
P32119 पेरोक्साइडऑक्सीन 2 एक्स एक्स
P34931 हीट सदमे 70 केडीए प्रोटीन 1 की तरह एक्स एक्स
P34932 गर्मी झटका 70 केडीए प्रोटीन 4 एक्स
P35232 Prohibitin एक्स
P35237 सर्पिन बी 6 एक्स
P35443 थ्रोम्बोस्पोंडिन 4 एक्स
P35555 फाइब्रिलिन 1 एक्स एक्स
P35579 मायोसिन 9 एक्स एक्स एक्स
P35580 मायोसिन 10 एक्स एक्स
P35609 अल्फा एक्टिनिन 2 एक्स
P35625 मेटालोपोटिनेज अवरोधक 3 एक्स एक्स
P35998 26 एस प्रोटीज नियामक सब्यूनिट 7 एक्स
P36871 फास्फोग्लुमुटस 1 एक्स एक्स
P36955 वर्णक एपिथेलियम व्युत्पन्न कारक एक्स एक्स
P37802 एक्स एक्स
P37837 Transaldolase एक्स
P38117 इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर फ्लैवोप्रोटीन सबयूनेट बीटा एक्स
P38646 तनाव 70 प्रोटीन मिटोकोंड्रियल अग्रदूत एक्स एक्स
P39687 एसिडिक ल्यूसिन समृद्ध परमाणु फॉस्फोप्रोटीन 32 परिवार के सदस्य ए एक्स
P40121 मैक्रोफेज कैपिंग प्रोटीन एक्स
P40925 मालेट डिहाइड्रोजनेस साइोपलास्मिइक एक्स
P40926 मालटे डिहाइड्रोजनेज मिटोचोन्डाय्रियल अग्रदूत एक्स
P41219 Peripherin एक्स
P42330 एल्डो केटो रिडक्टेज परिवार 1 सदस्य सी 3 एक्स
P45880 वोल्टेज निर्भर एंजीन चयनात्मक चैनल प्रोटीन 2 एक्स
P47755 एफ एक्टिन कैपिंग प्रोटीन सबयूनेट अल्फा 2 एक्स एक्स
P47756 एफ एक्टिन कैपिंग प्रोटीन सबयूनेट बीटा एक्स एक्स
P47985 Ubiquinol cytochrome c reductase लोहा सल्फर सबुनाइट मिटोकोंड्रियल अग्रदूत एक्स
P48047 एटीपी सिंथेस हे सब्युनिट मिटोकोंड्रियल अग्रदूत एक्स
P48637 ग्लुटाथियोन सिंथेटेस एक्स
P48741 गर्मी झटका 70 केडीए प्रोटीन 7 एक्स एक्स
P49189 4 ट्राइमिथिलमिनब्युट्रैलिहाइड डेहाइड्रोजनेज एक्स
P49368 टी जटिल प्रोटीन 1 सबयूनिट गामा एक्स
P49747 कार्टिलेज ऑलिगॉमरिक मैट्रिक्स प्रोटीन एक्स एक्स एक्स एक्स
P49748 बहुत लंबी श्रृंखला विशिष्ट एसीएल कोए डिहाइड्रोजनेज मिटोकोंड्रियल अग्रदूत एक्स
P50395 रब जीडीपी पृथक्करण अवरोधक बीटा एक्स x </ Td>
P50454 सर्पिन एच 1 अग्रदूत एक्स
P50995 एनेक्सिन ए 11 एक्स
P51452 दोहरी विशिष्टता प्रोटीन फॉस्फेट 3 एक्स
P51884 Lumican एक्स एक्स एक्स एक्स
P51888 प्रोलागिन अग्रदूत एक्स एक्स एक्स एक्स
P52565 रो जीडीपी पृथक्करण अवरोध 1 एक्स
P52566 रो जीडीपी पृथक्करण अवरोध 2 एक्स
P54652 गर्मी झटका से संबंधित 70 केडीए प्रोटीन 2 एक्स एक्स एक्स एक्स
P55072 संक्रमणकालीन एंडोप्लास्मिक रेटिकुलम एटपैस एक्स
P55083 माइक्रोप्रििलिल जुड़े ग्लाइकोप्रोटीन 4 अग्रदूत एक्स एक्स
P57053 हिस्टोन एच 2 बी टाइप एफ एक्स
P60174 त्रिओसोफॉस्फेट isomerase एक्स एक्स एक्स
P60660 मायोसिन प्रकाश पॉलीपेप्टाइड 6 एक्स एक्स
P60709 एटिन साइटोप्लाजिकिक 1 एक्स एक्स एक्स एक्स
P60981 Destrin एक्स
P61086 Ubiquitin संयुग्मित एंजाइम E2 25 केडीए एक्स
P61088 Ubiquitin संयुग्मित एंजाइम E2 एक्स
P61224 रास से संबंधित प्रोटीन रैप 1 बी अग्रदूत एक्स
P61978 विषम परमाणु रिबन्यूक्लोप्रोटीन कश्मीर एक्स एक्स
P61981 14 3 3 प्रोटीन गामा एक्स एक्स एक्स
P62258 14 3 3 प्रोटीन एप्सिलॉन 14 3 3 ई एक्स
P62491 रास संबंधित प्रोटीन एक्स
P62714 सेरीन थ्रेऑनिन प्रोटीन फॉस्फेट 2 ए कैलेटिक सबयूनेट बीटा आईसोफॉर्म एक्स
P62736 एक्टिन महाधमनी चिकनी पेशी एक्स एक्स एक्स
P62805 हिस्टोन एच 4 एक्स
P62826 जीटीपी बंधनकारी परमाणु प्रोटीन भाग गया एक्स
P62873 ग्वानिन न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग प्रोटीन जीआईजीएसजीटी सबयूनेट बीटा 1 एक्स
P62879 गुनाइन न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग प्रोटीन जीआईजीएसजीटी सबयूनेट बीटा 2 एक्स
P62937 पेप्टाइडल प्रोलिल सीआईएस ट्रांस isomerase ए एक्स एक्स
P62987 Ubiquitin 60S रिबोसोमल प्रोटीन L40 एक्स
P63104 14 3 3 समर्थकटीन जिटा डेल्टा एक्स एक्स एक्स एक्स
P63241 यूकेरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक 5 ए 1 एक्स
P63244 गुनाइन न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग प्रोटीन सबयूनेट बीटा 2 की तरह 1 एक्स
P63267 एक्टिन गामा एंटरिक चिकनी पेशी एक्स एक्स
P67936 ट्रोपोमायसिन अल्फा 4 श्रृंखला एक्स
P68032 एक्टिन अल्फा कार्डियक स्नायु 1 एक्स
P68104 बढ़ाव कारक 1 अल्फा 1 एक्स एक्स एक्स
P68133 एक्टिन अल्फा कंकाल की मांसपेशी
P68363 टूबुलिन अल्फा 1 बी चेन एक्स एक्स एक्स
P68371 टूबुलिन बीटा 2 सी चेन एक्स एक्स एक्स
P68402 प्लेटलेट सक्रियण कारक एसीटिहाइड्रॉलीज आईबी सबयूनेट बीटा एक्स
P68871 हीमोग्लोबिन उपनिट बीटा एक्स एक्स एक्स
P69905 हीमोग्लोबिन सबिनिट अल्फा एक्स एक्स
P78371 टी जटिल प्रोटीन 1 सबयूनिट बीटा एक्स
P78417 ग्लूटाथिने ट्रांसनेशेस ओमेगा 1 एक्स एक्स
P80748 आईजी लैम्ब्डा चेन VIद्वितीय क्षेत्र LOI एक्स
P98095 फिबुलिन 2 एक्स एक्स
Q01082 स्पेक्ट्रिन बीटा चेन मस्तिष्क 1 एक्स
Q01449 मायोसिन नियामक लाइट चेन 2 एडीअल आईसोफॉर्म एक्स
Q01518 एडेंनेली cyclase संबद्ध प्रोटीन 1 एक्स
Q01995 ट्रांसगेलिन चिकना पेशी प्रोटीन 22 अल्फा एक्स
Q03252 लैमिन बी 2 एक्स एक्स
Q03591 पूरक कारक एच संबंधित प्रोटीन 1 अग्रदूत साबित एक्स
Q04917 14 3 3 प्रोटीन एटा एक्स एक्स
Q06323 प्रोटेसाओम उत्प्रेरक जटिल उप-भाग 1 एक्स
Q06828 Fibromodulin एक्स एक्स एक्स एक्स
Q06830 पेरोक्साइडऑक्सीन 1 एक्स एक्स
Q07507 Dermatopontin एक्स एक्स एक्स एक्स
Q07960 आरओ जीटीपीएज़ सक्रिय प्रोटीन 1 एक्स
Q08257 क्विनोन ऑक्सीडॉर्डेटस एक्स
Q08431 Lactadherin एक्स एक्स
Q12765 एसईकार्निन 1 एक्स
Q13011 डेल्टा 3 5 डेल्टा 2 4 डिनोयएल कोए आइसोमेरेस मिटोकोंड्रियल अग्रदूत एक्स एक्स
Q13228 सेलेनियम बाइंडिंग प्रोटीन 1 एक्स एक्स
Q13404 Ubiquitin conjugating एंजाइम E2 संस्करण 1 एक्स
Q13409 साइोप्लास्मेनिक डाइनिन 1 इंटरमीडिएट श्रृंखला 2 एक्स
Q13509 टूबुलीन बीटा 3 श्रृंखला एक्स एक्स एक्स
Q13642 चार और एक आधा लिम डोमेन प्रोटीन 1 एक्स
Q13765 नवजात पॉलीपेप्टाइड जुड़े जटिल उप-भाग अल्फा एक्स
Q13885 एन टूबुलिन बीटा 2 ए चेन एक्स एक्स
Q14194 डायहाइड्रॉपीरिडीनस संबंधित प्रोटीन 1 एक्स
Q14195 डायहाइड्रॉपीरिडीनस संबंधित प्रोटीन 3 एक्स एक्स एक्स एक्स
Q14624 इंटर अल्फा ट्रिप्सिन अवरोधक भारी चेन एच 4 अग्रदूत एक्स
Q14697 तटस्थ अल्फा ग्लूकोसिडेस एबी पूर्ववर्ती एक्स
Q14764 मेजर वॉल्ट प्रोटीन एक्स
Q14767 अव्यवस्थित परिवर्तन कारक बीटा बाइंडिंग प्रोटीन 2 एक्स एक्स
Q14894 म्यू क्रिस्टलीन होमोल एनएडीपी थायराइड हार्मोन बंधनकारी प्रोटीन को नियंत्रित करता है एक्स
Q15063 पेरियोस्टिन अग्रदूत एक्स एक्स एक्स एक्स
Q15084 प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड isomerase ए 6 अग्रदूत एक्स
Q15113 प्रोकोलाजेन सी एंडोपेप्टाइडेस बढ़ाने वाले 1 अग्रदूत एक्स
Q15181 अकार्बनिक पाइरोफॉस्फेटस एक्स
Q15365 पाली आरसी बाध्यकारी प्रोटीन 1 एक्स
Q15366 पाली आरसी बाध्यकारी प्रोटीन 2 एक्स
Q15582 ट्रांसफ़ॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर बीटा प्रेरित प्रोटीन एक्स एक्स एक्स
Q15819 Ubiquitin conjugating एंजाइम E2 संस्करण 2 एक्स
Q16352 अल्फा इंटरएक्सिन एक्स
Q16473 पुटेटिक टेनास्किन एक्सए एक्स
Q16555 डायहाइड्रॉपीरिडीनस संबंधित प्रोटीन 2 एक्स एक्स एक्स
Q16698 2 4 डिनोयएल कोए रीक्टाज़ मिटोकोंड्रियल अग्रदूत एक्स
Q16891 मिटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली एक्स
Q562R1 बीटा एक्टिन प्रोटीन 2 की तरह एक्स
Q6S8J3 पोट आकीरिन डोमेन परिवार के सदस्य ई एक्स
Q6UWY5 Olfactomedin प्रोटीन 1 अग्रदूत की तरह एक्स एक्स
Q71U36 टूबुलिन अल्फा 1 ए चेन एक्स एक्स एक्स
Q7Z7G0 एसएच 3 अग्रदूत के लक्ष्य एक्स एक्स एक्स
Q8WUM4 प्रोग्रामेड कोशिका मृत्यु 6 इंटरैक्टिंग प्रोटीन एक्स
Q8WWX9 थियरेडॉक्सिन जैसे सेलेनोप्रोटीन एम अग्रदूत एक्स
Q92597 प्रोटीन एनडीआरजी 1 एक्स
Q92945 सुदूर अपस्ट्रीम तत्व बाइंडिंग प्रोटीन 2 एक्स
Q96CN7 Isochorismatase डोमेन युक्त प्रोटीन 1 एक्स
Q96CX2 प्रोटीन वाली बीटीबी पॉज़ डोमेन एक्स
Q96KK5 हिस्टोन एच 2 ए टाइप 1 एच एक्स एक्स
Q96KP4 साइटोसॉलिक नॉनपेसिफिक डायपेप्टीडिज़ एक्स
Q99426 टुबुलीन विशिष्ट संरक्षक बी एक्स
Q99497 प्रोटीन डीजे 1 एक्स एक्स
Q99536 सिनैप्टिक फेंके झिल्ली प्रोटीन एक्स एक्स एक्स
Q99714 3 हाइड्रोक्साइसीएल सीओए डिहाइड्रोजनेज टाइप 2 एक्स
Q99715 कोलेजन अल्फा 1 XII श्रृंखला एक्स एक्स
Q99798 हाइड्रेट मिटोकॉन्ड्रियल अग्रदूत बनना एक्स
Q9BQE3 टूबुलिन अल्फा 6 श्रृंखला एक्स
Q9BUF5 टूबुलीन बीटा 6 श्रृंखला एक्स एक्स
Q9BUT1 3 हाइड्रोक्सीबायट्रेट डिहाइड्रोजनेज टाइप 2 एक्स
Q9BVA1 टूबुलिन बीटा 2 बी चेन एक्स एक्स एक्स
Q9BXN1 Asporin एक्स x </ Td> एक्स एक्स
Q9H0W9 एस्टर हाइड्रोलाज़ C11orf54 एक्स
Q9H4B7 टूबुलीन बीटा 1 श्रृंखला एक्स
Q9NRN5 प्रोटीन 3 अग्रदूत की तरह ओल्फ़ैक्टोमेडिन एक्स एक्स
Q9NRV9 हेम बाइंडिंग प्रोटीन 1 एक्स
Q9NSB2 केराटिन प्रकार II कटिक्यूलर एचबी 4 एक्स एक्स
Q9NVA2 सेप्टीन 11 एक्स
Q9UBR2 कैथेशसिन जेड अग्रदूत एक्स
Q9UBX5 फाइबुलिन 5 एक्स एक्स
Q9UK22 एफ बॉक्स केवल प्रोटीन 2 एक्स
Q9Y277 वोल्टेज निर्भर एंजीन चयनात्मक चैनल प्रोटीन 3 एक्स
Q9Y281 कोफिलिन 2 एक्स
Q9Y490 तालिन 1 एक्स
Q9Y696 क्लोराइड इंट्रासेल्यूलर चैनल प्रोटीन 4 एक्स
Q9Y6C2 इमिलिन 1 एक्स एक्स

तालिका 1: चार अलग-अलग प्रोटिओमिक दृष्टिकोण लागू किए गए थे जब mitral वाल्व ऊतक निकालने में पहचान की प्रोटीन की सूची: दो आयामी वैद्युतकणसंचलन (2-डीई), दो-आयामी एलसी-एमएस (2 डी-एलसी / एमएस ), एलसी / एमएस और तरल-चरण आईईएफ। जिस पद्धति द्वारा प्रत्येक प्रोटीन की पहचान की गई है, उसकी रिपोर्ट की जाती है।

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम नमूना फ्रीज करने के लिए तरल नाइट्रोजन का उपयोग और चक्की प्रणाली को ठंडा करने के लिए है। तरल नाइट्रोजन का उपयोग जैविक गिरावट को रोकता है और कुशल पाउडरिंग के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह सुरक्षित हैंडलिंग के लिए विशिष्ट प्रशिक्षण की आवश्यकता है।

इस प्रोटोकॉल में नमूना पीसने के लिए एक चक्की प्रणाली है क्योंकि छोटे नमूनों को मानक मोर्टार और पेस्टल से ठीक करना मुश्किल है। इस मामले में, छोटे नमूनों मोर्टार की सतह पर एक अच्छा पाउडर के रूप में फैला हुआ है, संग्रह कठिन प्रदान एक अन्य लाभ यह है कि चक्की मोटर चालित होती है, जो प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से संसाधित करने के लिए अधिक से अधिक नमूनों की अनुमति देती है और बिना थकावट के। एक चक्की के उपयोग पर एक सीमा यह है कि नमूने के आकार को छोटा करने के लिए (100 मिलीग्राम या उससे कम) मस्तूल के खिलाफ प्रभावी रूप से दबाया जा सकता है इसके अलावा, चक्की के घटकों को क्लीनिन के उपयोग के बीच कमरे के तापमान पर गर्म होना चाहिए जी। नतीजतन, प्रक्रिया समय लगता है और, अगर कई नमूने दैनिक संसाधित होते हैं, तो कई सेटों की ज़रूरत होती है

एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम निष्कर्षण बफर की तैयारी है। विशेष रूप से यूरिया (8 एम) और थियोरिया (2 एम) के लिए नमक सांद्रता काफी अधिक है; इस प्रकार, नमक की मात्रा समाधान का कुल मात्रा लगभग आधा है। इसके अलावा, विघटन आसान नहीं है क्योंकि गर्मी को बचा जाना चाहिए क्योंकि 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक यूरिया प्रोटीन / पेप्टाइड्स के एन टर्मिनिनी पर प्रोटीन कारबैमिलेशन और लीसेन और आर्जिनेन अवशेषों के साइड-चेन एमिनो समूह पर ले जा सकते हैं। । भंग होने के बाद, यूरिया बफर को 0.22-माइक्रोन फिल्टर से फ़िल्टर्ड किया जाना चाहिए और इसकी निकासी प्रभावकारिता को प्रभावित किए बिना 4 हफ्तों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन इसे पूर्ण विघटन के लिए अनुमति देने से पहले 15 डिग्री सेल्सियस से अधिक गर्म होना चाहिए ।

संशोधन और समस्या निवारण

Ent "> इस प्रोटोकॉल में, वर्णित यूरिया बफर का उपयोग करके प्रोटीन निष्कर्षण किया जाता है क्योंकि यह प्रोटिओमिक अध्ययनों के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला प्रोटीन निकासी समाधानों में से एक है जिसे आइसोएक्लेक्ट्रोफोकसिंग और संयत रूप से घुलनशील प्रोटीन को सुलझाने में इसकी दक्षता 18 । यह बफर प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए ब्रैडफ़ोर्ड परख के साथ पूरी तरह से संगत है, और यह बुलर 18 के रूप में एकत्रीकरण के लिए अत्यधिक प्रवण है जैसे अभिन्न झिल्ली प्रोटीन, 19 , या अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के रूप में बहुत ही कुशलता से घुलनशील प्रोटीन, solubilize कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया। इसे 2-डीई और तरल-चरण आईईएफ विश्लेषण में सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है।

हालांकि, यह बफर एक नमूना में उपस्थित सभी प्रोटीन के solubilization के लिए आदर्श नहीं है। यह संभव है कि विभिन्न निष्कर्षण बफ़र्स इस प्रोटोकॉल द्वारा पता लगाए जाने वाले प्रोटीनों को प्रकट कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, यह अच्छी तरह से kno हैडब्ल्यूएन कि राइबोसोमल और परमाणु प्रोटीन एसिड निष्कर्षण या ट्राइक्लोरोएटेसिटिक एसिड / एसीटोन वर्षा 20 के साथ बेहतर निकाले जा सकते हैं, जबकि क्षारीय पीएच स्तर झिल्ली प्रोटीन 21 , 22 के लिए अधिक उपयुक्त हैं। इसलिए, वैकल्पिक बफ़र्स के उपयोग में 2-डीई या तरल-चरण आईईएफ के साथ हस्तक्षेप वाले नमक को समाप्त करने के लिए प्रोटीन के लिए अतिरिक्त कदम हो सकते हैं।

तकनीक की सीमाएं

इस प्रोटोकॉल द्वारा पहचाने जानेवाले प्रोटीन की संख्या अपेक्षाकृत कम है, लेकिन प्रोटिओमिक विश्लेषण की पहचान और कवरेज की संख्या को और अधिक आधुनिक उपकरणों के उपयोग से बढ़ाया जा सकता है, जिनके द्रव्यमान सटीकता और अनुक्रमण गति पिछले कुछ वर्षों में नाटकीय रूप से बढ़ी है 23। तरल चक्र के लिए लंबे समय तक ढाल को नियोजित करके, प्रोटीम का एक बड़ा हिस्सा, किसी भी प्रीफेक्शनेशन स्टेप्स के बिना कवर करना संभव हैरैमेटोग्राफी अलग-अलग उच्च-रिज़ॉल्यूशन वाले एमएस इंस्ट्रूमेंट के साथ युग्मित है जिसमें तेजी से क्रमिक गति 24 है

मौजूदा / वैकल्पिक तरीकों के संबंध में तकनीक का महत्व

मानव हृदय वाल्वों जैसे कि विकार वाल्व में प्रोटीन की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने की क्षमता एक महत्वपूर्ण और चुनौतीपूर्ण कार्य है जो वाल्व रोगों में शारीरिक / रोग प्रक्रियाओं के तंत्र को स्पष्ट करने में मदद करेगा। मिट्रल वाल्व प्रोटीम के परिवर्तन को परिभाषित करने से ऊतक की बीमारी राज्य से जुड़े जैविक प्रक्रियाओं की प्रकृति की समझ में बहुत वृद्धि होगी।

मैट्रल वाल्व के फिजियोपाथोलॉजी पर वर्तमान ज्ञान सीमित है और आम तौर पर विशिष्ट प्रक्रियाओं में शामिल व्यक्तिगत प्रोटीनों के विश्लेषण के माध्यम से प्राप्त होता है, जैसे बाह्य मैट्रिक्स रीमोडलिंग, हेमोस्टेसिस, सूजन, या ऑक्सीडेटिव तनाव 25 9 , 10 के विश्लेषण पर केंद्रित है।

व्यापक प्रोटिओमिक अध्ययनों की कमी इस कम सेल्युलैटी ऊतक की जटिलता के रूप में हो सकती है जो कि बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन ( यानी, प्रोटीओग्लिचेंस, कोलेजन, और एलिस्टिन) में बहुत अधिक समृद्ध है। ये प्रोटीन कुल राशि का लगभग 80% है, कम-बहुतायत वाले प्रोटीन 26 के विश्लेषण में बाधा डालती है।

इस प्रकार, इस ऊतक के प्रोटीम का वर्णन करने के लिए प्रोटीन solubilization को अधिकतम करने के लिए एक कुशल निष्कर्षण प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए आवश्यक था। इस प्रोटोकॉल को 1 मिलीग्राम ऊतक से ~ 50 ग्राम प्रोटीन निकालने के लिए अनुमति दी गई। यह "नरम" ऊतक से तुलना में अपेक्षाकृत कम उपज है, जैसेजिगर के रूप में (~ 1 मिलीग्राम ऊतक से 135 μg), लेकिन यह व्यक्तिगत नमूनों पर प्रोटीन विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त है। यह विशेष रूप से प्रासंगिक है जब एक घटना के अंतर-व्यक्ति परिवर्तनशीलता को परिभाषित करते हैं।

इसके अलावा, इस विधि के कई विश्लेषणात्मक अनुप्रयोगों के साथ संगत होने का लाभ है। प्रस्तावित निकासी बफर में मिश्रित वाल्व प्रोटीन का उपयोग सीधे दो-आयामी वैद्युतकणसंचलन और तरल चरण आइसोइलेक्ट्रोफोरोसिस 11 , 12 या पर आधारित इम्यूनोबलॉटिंग और प्रोटियोमिक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, जैसे अन्य एशेज के लिए बफर घटक के हस्तक्षेप को समाप्त करने के लिए प्रोटीन वर्षा से, जैसे जेल मुक्त जन स्पेक्ट्रोमेट्री 15

इस निष्कर्षण प्रोटोकॉल के आवेदन के साथ, सामान्य मेट्रल वाल्व ऊतक के प्रोटीन घटकों का अधिक विस्तृत लक्षण वर्णन कई इंट्रेलिक्स की पहचान के माध्यम से प्राप्त किया गया हैलुलर प्रोटीन ये प्रोटीन कोशिका कोशिका या ऑर्गेनेल में स्थानीयकृत होते हैं, न केवल बाह्य मैट्रिक्स में, और विभिन्न आणविक और जैविक कार्य हैं। अन्य रोचक प्रोटीन ( यानी, क्रैयाब , सेप्टिन -11 , एफएचएल-1, और डर्माटोपोंतिन) की पहचान भी की गई थी। इन प्रोटीनों के पास मैट्रल वाल्व में अज्ञात कार्य हैं, लेकिन उनके जैविक गुण वाल्व रोगों में एक संभावित भूमिका का सुझाव देते हैं।

इस तकनीक को माहिर होने के बाद भविष्य के अनुप्रयोग या निर्देश

इस प्रोटोकॉल के साथ, मात्रात्मक एमआरएनए अभिव्यक्ति और गैर-मात्रात्मक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण पर डेटा के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति के संबंध में डेटा को सहसंबंधित करना संभव है। दरअसल, जब एक साथ उपयोग किया जाता है, इन तरीकों से बीमारियों के आणविक तंत्र की अधिक व्यापक समझ मिलेगी, एमआरएनए से पोस्ट-ट्रांसजेशन प्रोटीन संशोधन। इस प्रकार, इस विधि को हृदय वाल्व फिजियोपैथोलॉजी पर केंद्रित शोधकर्ताओं के लिए ब्याज की हो सकती है। पंखसहयोगी, इस प्रोटोकॉल को पोर्किअन मेट्रल वाल्व पर भी लागू किया जा सकता है, जो वाल्व फंक्शन मूल्यांकन के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय ने इस अध्ययन का समर्थन किया (आर सी 2013-जैव 15)। हम उत्कृष्ट उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए बारबरा मिशेली का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

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References

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मानव मैट्रल वाल्व से प्रोटीन के निष्कर्षण के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल
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Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).More

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

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