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Biochemistry

Protocollo ottimizzato per l'estrazione delle proteine ​​dalla valvola mitrale umana

doi: 10.3791/55762 Published: June 14, 2017

Summary

La composizione proteica della valvola mitrale umana è ancora parzialmente sconosciuta, perché la sua analisi è complicata da basse cellularità e quindi da bassa biosintesi proteica. Questo lavoro fornisce un protocollo per estrarre efficacemente proteine ​​per l'analisi della proteoma della valvola mitrale.

Abstract

L'analisi del proteome cellulare può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari che sottostanno le malattie dovute allo sviluppo di tecnologie che permettono l'identificazione e la quantificazione su larga scala delle proteine ​​presenti nei complessi sistemi biologici. Le conoscenze acquisite da un approccio proteomico possono portare a un Una migliore comprensione dei meccanismi patogeni che affrontano le malattie, consentendo l'individuazione di nuovi marcatori di malattia diagnostici e prognostici e, speriamo, di obiettivi terapeutici. Tuttavia, la valvola cardiaca mitrale rappresenta un campione molto impegnativo per l'analisi proteomica a causa della bassa mobilità in proteoglicano e matrice extracellulare ricca di collagene. Questo rende impegnativo estrarre le proteine ​​per un'analisi proteomica globale. Questo lavoro descrive un protocollo compatibile con l'analisi proteica successiva, come proteomica quantitativa e immunoblotting. Ciò può consentire la correlazione dei dati riguardantiG con dati sull'espressione mRNA quantitativa e analisi immunoistochimica non-quantitativa. Infatti, questi approcci, se eseguiti insieme, porteranno ad una comprensione più completa dei meccanismi molecolari che stanno alla base di malattie, da mRNA a modifica della proteina post-traduzionale. Quindi, questo metodo può essere rilevante per i ricercatori interessati allo studio della fisiopatologia della valvola cardiaca.

Introduction

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Recenti testimonianze hanno alterato la comprensione dei ruoli dei molti meccanismi regolatori che si verificano dopo la sintesi di mRNA. Infatti, i processi traslazionali, post-trascrizionali e proteolitici possono regolare l'abbondanza e la funzione proteica. Il dogma, che afferma che le concentrazioni di mRNA sono proxy a quelle delle proteine ​​corrispondenti, assumendo che i livelli di trascritture sono il determinante principale dell'abbondanza di proteine, è stata parzialmente riveduta. In effetti, i livelli di trascrizione solo parzialmente prevedono l'abbondanza di proteine, suggerendo che gli eventi post-trascrizionali Si verificano per regolare le proteine ​​all'interno delle cellule 1 , 2 .

Inoltre, le proteine ​​infine dettano la funzione della cellula e quindi dettano il suo fenotipo, che può subire variazioni dinamiche in risposta ai fattori autocrini, paracrini e endocrini; Mediatori di sangue; temperatura; Trattamento farmacologico; E la malattia si sviluppament. Pertanto, un'analisi di espressione incentrata sul livello della proteina è utile per caratterizzare il proteome e per svelare i cambiamenti critici che si verificano come parte della patogenesi della malattia 3 .

Pertanto, le opportunità che la proteomica presenta per chiarire le condizioni della salute e delle malattie sono formidabili, nonostante le sfide tecnologiche esistenti. Le aree particolarmente promettenti di ricerca a cui la proteomica può contribuire comprendono: l'individuazione dell'espressione alterata di proteine ​​a qualsiasi livello ( cioè cellule intere o tessuti, compartimenti subcellulari e fluidi biologici); L'identificazione, la verifica e la convalida di nuovi biomarcatori utili per la diagnosi e la prognosi della malattia; E, auspicabilmente, l'individuazione di nuovi bersagli proteici che possono essere utilizzati per scopi terapeutici, nonché per la valutazione dell'efficacia e della tossicità farmacologica 4 .

Catturare la complessità diIl proteome rappresenta una sfida tecnologica. Gli attuali strumenti proteomici offrono l'opportunità di eseguire analisi su larga scala e ad alto rendimento per l'identificazione, la quantificazione e la convalida dei livelli alterati di proteine. Inoltre, l'introduzione di tecniche di frazionamento e arricchimento, mirante ad evitare le interferenze causate dalle proteine ​​più abbondanti, ha anche migliorato l'identificazione delle proteine ​​includendo le proteine ​​meno abbondanti. Infine, la proteomica è stata completata dall'analisi delle modificazioni post-traduzionali, che emergono progressivamente come importanti modulatori della funzione proteica.

Tuttavia, la preparazione del campione e il recupero delle proteine ​​nei campioni biologici in analisi rimangono ancora i passi limitanti nel flusso di lavoro proteomico e aumentano il potenziale di eventuali insidie 5 . Infatti, nella maggior parte delle tecniche di biologia molecolare che devono essere ottimizzate, i primi passi sono l'omogeneizzazione dei tessutiIoni e cellule, soprattutto durante l'analisi di proteine ​​a bassa abbondanza per le quali non esistono metodi di amplificazione. Inoltre, la natura chimica delle proteine ​​può influenzare il proprio recupero. Ad esempio, l'analisi delle proteine ​​altamente idrofobiche è molto impegnativa, perché facilmente precipitano durante la messa a fuoco isoelettrica, mentre le proteine ​​di trans-membrana sono quasi insolubili (esaminate nel Reference 5). Inoltre, la variabilità della composizione tissutale crea una barriera significativa allo sviluppo di un metodo di estrazione universale. Infine, poiché quasi tutti gli esemplari clinici sono di quantità limitata, è essenziale consentire la preparazione di proteine ​​con il massimo recupero e riproducibilità da quantità minime di campioni 6 .

Questo lavoro descrive un protocollo ottimizzato per l'estrazione proteica dalla valvola mitrale normale cardiaca umana, che rappresenta un campione molto impegnativo per l'analisi proteomica. La normale valvola mitrale è un compLex che si trova tra l'atrio sinistro e il ventricolo sinistro del cuore ( Figura 1 ). Esso svolge un ruolo importante nel controllo del flusso di sangue dall'atrio al ventricolo, impedendo il flusso di riflusso e assicurando il corretto livello di alimentazione dell'ossigeno per tutto il corpo, mantenendo così un'adeguata uscita cardiaca. Tuttavia, è spesso considerato un tessuto "inattivo", con una bassa cellularità e pochi componenti, principalmente nella matrice extracellulare. Ciò è dovuto al fatto che, in condizioni normali, le cellule interstiziali valvolari residenti (VIC) presentano un fenotipo di riposo con una bassa percentuale di biosintesi proteica 7 .

Tuttavia, è stato dimostrato che, in uno stato patologico, il numero di VICs nella spongiosa aumenta e la loro sintesi proteica è attivata, insieme ad altri cambiamenti funzionali e fenotipici 8 . Pertanto, non sorprende che i dati minimi disponibili inLa letteratura si concentra sull'analisi delle valvole mitraliche patologiche 9 , 10 , in cui l'aumento del numero di VIC attivato potrebbe spiegare il numero relativamente elevato di proteine ​​identificate.

In conclusione, il presente protocollo può servire a sviluppare la comprensione dei meccanismi patogeni responsabili delle malattie delle valvole mitraliche attraverso lo studio di componenti proteici della valvola mitrale. Infatti, una maggiore comprensione dei processi patologici sottostanti potrebbe contribuire a migliorare la gestione clinica delle malattie delle valvole, le cui attuali indicazioni per l'intervento sono in gran parte predicate sulle considerazioni emodinamiche.

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Protocol

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In questo protocollo, i cuori umani vengono raccolti durante l'esplorazione multiorgano (tempi di ischemia fredda di 4-12 h, media 6 ± 2 h) dai donatori multi-organi esclusi dal trapianto di organi per motivi tecnici o funzionali, nonostante i normali parametri ecocardiografici. Sono inviati alla Banca Tissue Cardiovascolare di Milano, Centro Cardiologico Monzino (Milano, Italia) per l'attività bancaria delle valvole aortiche e polmonari. I volantini posteriori mitraali non vengono utilizzati per scopi clinici, quindi vengono raccolti durante l'isolamento delle valvole aortiche e delle valvole polmonari, dopo che il consenso informato è ottenuto dai parenti dei donatori. Il tessuto per il trapianto e la ricerca viene raccolto solo dopo il consenso dei genitori; Sul foglio di autorizzazione, autorizzano (o non) l'uso del tessuto cardiaco per la ricerca solo se non è idoneo all'uso clinico umano ( ad esempio, problemi microbiologici, funzionali e sierologici), seguendo le linee guida del comitato eticoCentro Cardiologico Monzino.

1. Preparazione della valvola mitrale

  1. Raccogliere la valvola mitrale umana il più presto possibile dopo l'esplosione dell'organo (tempo di ischemia fredda di 4-12 h).
  2. In una stanza pulita, togliere il cuore dalla borsa di trasporto contenente una soluzione fredda (4 ° C) ( cioè soluzione salina o medie equilibrate Eurocollins o Wisconsin). Metterlo in un secchio e collocarlo in un armadio di biosicurezza (classificazione della classe A, Good Manufacturing Practices (GMP)) per procedere alla preparazione della valvola.
  3. Posizionare il cuore su un drappo monouso sterile nell'armadio. Usando un bisturi monouso sterile, tagliare completamente il cuore, perpendicolarmente al suo asse principale, sul livello dei ventricoli sinistro e destro, circa 4 cm di distanza dall'apice.
  4. Spostare l'aorta ascendente e l'arteria polmonare per visualizzare il tetto atriale sinistro.
  5. Con pinze e scatti sterilizzabili sterilizzabili, tagliare attorno all'orecchio sinistro sullaTetto atriale sinistro, rendendo visibile la valvola mitrale e consentendo di identificare il grande foglietto mitrale (anteriore) e il piccolo foglio mitrale (posteriore).
    NOTA: Gli antero laterali e le commissioni mediali posteriori definiscono il bordo del foglio anteriore e della zona posteriore.
  6. Utilizzando forbici sterilizzabili autoclavabili e pinze non traumatiche, dissectare l'atrio sinistro e lo spessore della parete del ventricolo attorno alla circonferenza di tutta la valvola mitrale .
  7. Identificare la continuità della valvola mitro-aortica.
    NOTA: Il ventricolo sinistro contiene l'intera valvola mitrale e gli accordi.
  8. Separare il foglietto della valvola mitrale anteriore dal foglietto della valvola mitrale posteriore, tagliando il foglio posteriore lungo l'inserimento con il ventricolo (commissure).
  9. Lavare il foglietto posteriore nella soluzione salina. Tagliare il foglietto in piccoli pezzi (<1 cm 2 ) e avvolgerli individualmente in fogli di alluminio. Snap-congelare con azoto liquido.
    Attenzione: Seguire le procedure di sicurezza organizzative quando si utilizza azoto liquido.
    1. Sanitizzare la tabella dell'armadio con una soluzione alcolica al 70% di isopropilato e una soluzione al perossido di idrogeno al 6% alla fine della procedura.

2. Estrazione della proteina

  1. Utilizzare pinze per prelevare il campione immagazzinato in azoto liquido e posizionarlo immediatamente in ghiaccio secco mentre ancora avvolto nel foglio di alluminio. Non lasciare scongelare il campione durante qualsiasi trasferimento.
  2. Prima della macinazione, raffreddare il malta di porcellana / zirconio e pestelli di un sistema di macinazione ( ad esempio, CryoGrinder), insieme al campione, inserendoli in un pallone Dewar contenente azoto liquido (~ 500 mL).
    Attenzione: Seguire le procedure di sicurezza organizzative quando si utilizza azoto liquido.
  3. Mettere il mortaio e il pestello in una scatola di polistirolo contenente ghiaccio secco. Rimuovere il campione dal foglio di alluminio e inserirlo nella malta.
  4. Grind tCampione con il grande pestello contro la malta 15-20 volte, utilizzando il cacciavite per ruotare il pestello. Mescolare il campione con la punta di una spatola pre-raffreddata durante il processo di macinazione.
    1. Ripeti con il piccolo pestello.
  5. Trasferire il campione di massa a un tubo precedentemente pesato ( es. Tubo da centrifuga da 15 ml) invertendo il tubo, ponendolo sopra la malta e invertendo insieme per spostare il campione sul tubo. Utilizzare una spatola pre-raffreddata per recuperare tutto il materiale dalla malta.
    1. Tenere il tubo con il campione su ghiaccio secco per evitare il disgelo del campione durante il trasferimento.
  6. Calcolare il peso netto del campione.
  7. Pulire la malta e il pestello dopo ogni campione e decontaminarli mediante autoclave o riscaldandoli a 200 ° C per 2 ore.
  8. Trasferire il campione in polvere dal tubo di centrifuga al tubo di vetro di un omogeneizzatore per inversione.
  9. Aggiungere bufere filtrato in ureaR (8 M urea, 2 M tiourea, 4% w / v CHAPS, 20 mM Tris e 55 mM dithiotreitolo) al tubo di vetro, 200 μl di buffer urea per ogni 10 mg di tessuto in polvere.
    NOTA: Il campione in polvere residuo lasciato nel tubo di centrifuga può essere recuperato usando una parte del volume calcolato di buffer urea.
  10. Homogenizzare il campione utilizzando un agitatore dotato di un mulino di vetro borosilicato e un pestello di politetrafluoroetilene (PTFE). Premere lentamente il pestello sul campione con un movimento di torsione (1.500 giri / min) 10 volte.
  11. Recuperare il surnatante e trasferirlo in un tubo centrifugo da 1,7 ml. Riprendere il campione rimanente con il buffer di urea fresco, aggiungendo metà del volume utilizzato durante la prima estrazione.
  12. Ripetere il passaggio 2.10.
  13. Recuperare il surnatante e combinarlo con il surnatante dal punto 2.11. Posizionare il supernatante combinato su un rotatore di tubo per 30 min.
  14. Centrifugare il tubo per 30 minuti a 13.000 xg e 4 ° C.
  15. Recuperare il surnatante anD misurare la concentrazione proteica utilizzando il saggio della proteina Bradford, secondo le istruzioni del produttore. Conservare il campione a -80 ° C fino all'uso.

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Representative Results

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L'estrazione e la dissoluzione delle proteine ​​nel buffer urea è direttamente compatibile con i metodi proteomici basati su isoelectrofocusing (elettroforesi bidimensionale (2-DE) 11 e fuoco isoelettrico a fase liquida (IEF) 12 ) e con immunoblotting dopo la diluizione in tampone Laemmli 13 Contenente un cocktail inibitore della proteasi 14 .

Per i metodi basati sulla spettrometria di massa senza gel ( cioè la cromatografia liquida accoppiata ad analisi di spettrometria di massa indipendente dai dati (LC / MS E ) e LC / MS E bidimensionale (2D-LC / MS E )) 15 i campioni estratti Nel tampone urea descritto devono essere ulteriormente trattati per eliminare l'urea e la tiourea, che potrebbero interferire con la successiva separazione della proteina e della cromatografia liquida. ThiS si può compiere utilizzando i kit di precipitazione di proteine ​​commerciali, seguendo le istruzioni del produttore per precipitare le proteine. Il campione può quindi essere sciolto in 25 mM di NH 4 HCO 3 contenente detergenti cleavabili 0,1% per la digestione proteica 16 . La precipitazione delle proteine ​​può eliminare i componenti del tampone, minimizzando il contenuto proteico (recupero di proteine:> 85%), rendendo il campione adatto a ogni tipo di analisi.

L'applicazione di questo protocollo per l'estrazione proteica da valvole umane mitraliche ha consentito l'identificazione di un totale di 422 proteine, combinando quattro differenti approcci proteomici precedentemente descritti in dettaglio 11 , 15 . In particolare, 169 proteine ​​sono state identificate da proteine ​​2-DE, 330 mediante IEF in fase liquida, 96 proteine ​​da LC / MS E e 148 proteineDa 2D-LC / MS E (Tabella 1).

Per classificare le 422 proteine ​​identificate in termini di localizzazione subcellulare, è stato utilizzato un software per l'analisi di ontologia genica (GO) ( ad esempio Cytoscape). La rete creata con il software e il relativo plug-in ha mostrato che, oltre alle proteine ​​previste localizzate nella regione extracellulare (vedere la parte superiore destra della Figura 2 ), la maggior parte delle proteine ​​identificate dagli approcci proteomici erano dalla regione intracellulare ( Cioè citoplasma, organi, vescicole e citoscheletro). Sono state anche identificate proteine ​​della superficie cellulare ( figura 2 ).

I risultati sono stati ulteriormente confermati in tre campioni di valvola mitralica indipendente. L'immunoblotting è stato usato per analizzare un gruppo di quattro proteine ​​( vale a dire septin-11, quattro e mezzo domini LIM proteina 1 (FHL-1), derMatopontin e alfa-cristallina B (CryAB)) che non sono mai stati identificati nella normale valvola mitrale ( Figura 3 ).

Figura 1
Figura 1: Struttura della valvola mitrale. Vista dall'alto del cuore umano mostrando la valvola mitrale omologata ( A ) o aperta ( B ). Vista frontale del ventricolo sinistro di un cuore umano ( C ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Analisi delle proteine ​​valvolari mitralmente identificate in termini di distribuzione cellulare. Cytoscape e il plugin BiNGO sono stati utilizzati per obtaiN la distribuzione di termini ontologici gene (GO) dalle categorie di componenti cellulari. La dimensione del cerchio è proporzionale al numero di componenti proteici associati ai termini GO selezionati e viene riportata la scala dei colori per il valore p di sovra-rappresentazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Analisi dell'immunoblotting di septin-11, FHL-1, dermatopontin e CryAB in estratto intero da tre pallienti di valvola mitralica normale umana. L'immunoblotting è stato eseguito utilizzando anticorpi monoclonali del mouse contro CryAB e anticorpi policlonali coniglio contro gli anticorpi di septin-11, FHL-1 e dermatopontin. per favoreClicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

<td> x <td> <Td> Proteasome subunit beta tipo 4 precursore <td> </ Tr> <Td> Transgelin 2 <td> <tr> <td>
accessione Descrizione 2-DE 2D-LC LC-MS E Fase liquida IEF
A6NMZ7 Collagene alfa VI X
O00151 Proteine ​​PDZ e LIM dominio 1 X
O00299 Proteina del canale intracellulare del cloruro 1 X
O00764 Pyridoxal chinasi X
O14558 Proteina anti shock caldo beta 6 X
O43399 Proteina tumorale D54 X
O43488 Membro 2 dell'aldehido reduttasi aflatoxina B1 X
O43707 Alpha actinin 4 X X
O43866 Antigene CD5 come precursore X
O60493 Ordinamento di nexin 3 X
O60701 UDP glucosio 6 deidrogenasi X
O75223 Proteine ​​non caratterizzate X
O75368 SH3 che lega l'acido glutammico ricco di proteine X
O75390 Precursore mitocondriale di sintasi di citrato X
O75489 NADH deidrogenasi ubiquinone ferro di zolfo proteina 3 precursore mitocondriale X X
O75608 Tioesterasi 1 di proteine ​​aciliche X
O75828 Carbonyl reduttasi NADPH 3 X
O75874 Isocitrato deidrogenasi NADP citoplasmatico X
O75955 flotillina X
O94760 NG NG dimetilarginina dimetilamminoidrolasi 1 X
O94788 Retinale deidrogenasi 2 X
O95865 NG NG dimetilarginina dimetilamminoidrolasi 2 X X
P00325 Alcool deidrogenasi 1B X X
P00338 L di lattato deidrogenasi A X
P00352 Retina deidrogenasi 1 X
P00441 Superossido dismutasi Cu Zn X X
P00450 Ceruloplasmin precursore X X
P00488 Fattore di coagulazione XIII A precursore della catena X
P00491 Purin nucleoside fosforilasi X
P00492 Ipossanthine guanine phosphoribosyltransferase X
P00558 Fosfoglicerato chinasi 1 X X
P00568 Adenilato chinasi isoenzimo 1 X
P00734 protrombina X X
P00738 aptoglobina X X X X
P00739 Precursore proteico correlato all'Haptoglobin X
P00751 Fattore complementare B X X X
P00915 Anidride carbonica 1 X
P00918 Anidride carbonica 2 X
P01008 Antithrombin III precursore X X X
P01009 Alfa 1 antitripsina X X X X
P01011 Anticicotripsina alfa 1 X X X X
P01019 Precursore angiotensinogenico X X
P01023 Alpha 2 macroglobulin X X
P01024 Complemento C3 X X X X
P01033 Inibitore della metalloproteinasi 1 precursore X
P01042 Kininogen 1 precursore X
P01593 Ig kappa catena VI regione AG X
P01598 Regione di Ig kappa regione VI regione dell'UE X
P01600 Regione di Ig kappa regione VI Hau X X
P01611 Regione di Ig kappa VI regione Wes X
P01620 Ig kappa catena V III regione SIE X
P01625 Catena Ig kappa V IV regione Len X
P01766 Ig catena pesante V III regione BRO X X
P01781 Ig catena pesante V III regione GAL X
P01834 Regione Ig della catena Ig kappa X X X X
P01842 Regioni della catena di Ig lambda X X X
P01857 Ig gamma 1 catena C regione X X X X
P01859 Ig gamma 2 catena C X X X X
P01860 Ig gamma 3 catena C X X X
P01861 Ig gamma 4 catena C X X X
P01871 Ig mu catena regione C X X X
P01876 Ig alfa 1 catena C regione X X X X
P01877 Ig alfa 2 catena C X
P02144 Mioglobina X X
P02452 Collagene alfa 1 I catena X X X X
P02511 Catena a cristallo B di Alpha X
P02545 Laminato Lamin AC 70 kDa X X X X
P02647 Apolipoproteina AI X X X X
P02649 Apolipoproteina E X X X X
P02671 Catena alfa di Fibrinogen X X X X
P02675 Catena beta di fibrinogeno X X X X
P02679 Catena gamma fibrinogena X X X X
P02689 Proteina di Myelin P2 X
P02735 Precursore proteico di amiloide del siero X
P02741 C precursore proteico reattivo X
P02743 Componente amiloidale P siero X X X X
P02746 Subunità subcomponente B di complemento C1q X X
P02747 Complemento C1q subunità sub-componente C precursore X
P02748 Componente supplementare C9 X X X
P02749 Beta 2 glicoproteina 1 X X X X
P02750 Leucine ricco di alfa 2 glicoproteina precursore X
P02751 fibronectina X X
P02760 Precursore delle proteine ​​AMBP X X X X
P02763 Glicoproteina acida alfa 1 X X X
P02765 Alpha 2 HS precursore glicoproteico X
P02766 Transthyretin precursore X X X
P02768 Siero albumina X X X X
P02774 Vitamina D precursore proteico legante X
P02787 Serotransferrin X X X X
P02788 Precursore di lattotrasferrina X
P02790 hemopexin X X X X
P02792 Catena leggera ferritina X
P04004 vitronectina X X X X
P04075 Fruttosio bisfosfato aldolasi A X
P04083 Annexin A1 X X X X
P04179 Precursore mitocondriale Mn superossido dismutasi X
P04196 Precursore glicoproteico ricco di istidina X
P04217 Precursore di glicoproteina alfa 1B X X
P04350 Tubulin beta 4 catena X
P04406 Glyceraldehyde 3 fosfato deidrogenasi X X X X
P04792 Proteina di shock caldo beta 1 X X X X
P05091 Precursore mitocondriale di deidrogenasi di aldeide X X
Precursore di inibitori del proteasi C1 del plasma X
P05156 Fattore complementare I precursore X
P05413 Cuore proteico legante acido grasso X
P05452 Tetranectina precursore TN X X
P05787 Citoscheletrico di tipo II di cheratina 8 X
P06396 gelsolin X X X X
P06576 Precursore mitocondriale beta della subunità di sintesi ATP X X
P06732 Tipo di creatina chinasi M X X
P06733 Alpha enolase X X X X
P06753 Tropomyosin alfa 3 catena X X
P07108 Proteina legante Acyl CoA X
P07195 L di lattato deidrogenasi B X X X
P07196 Neurofilamento leggero polipeptide X
P07197 Neurofilamento medio polipeptide X X
P07237 Proteina disolfuro isomerasi precursore X X
P07339 Precursore di cathepsina D. X X
P07355 Annexin A2 X X X X
P07360 Componente complementare del precursore della catena gamma C8 X
P07437 Catena beta-tubulina X X X X
P07585 decorin X X X X
P07737 Profilo 1 X
P07858 Precursore della cathepsina B. X
P07900 Protezione anti shock caldo HSP 90 alfa X X
P07951 Catena beta tropomyosin X
P07954 Fumarate precursore mitocondriale di idratasi X
P07996 Thrombospondin 1 X X X
P08107 Scossa termica 70 kDa proteina 1A 1B X X X X
P08123 Collagene alfa 2 I catena X X X X
P08133 Annexin A6 X X
P08238 Proteina anti shock termico HSP 90 beta X X
P08253 72 kDa di tipo IV precursore di collagenasi X
P08294 Superossido extracellulare dismutasi Cu Zn precursor X X X
P08590 Polipeptide leggero di miosina 3 X X
P08603 Fattore complementare H X X X X
P08670 vimentin X X X X
P08729 Cistoscheletrico II di tipo Keratina 7 X
P08758 Annexin A5 X X X X
P09211 Glutatione S transferase P X X X
P09382 Galectina 1 X X X
P09417 Dihidropteridine reduttasi X
P09493 Tropomyosin 1 catena alfa X X
P09525 Annexin A4 X X
P09651 Ribonucleoproteina nucleare eterogene A1 X
P09871 Competitivo C1s precursore sottocomponente X
P09936 Ubiquitina terminale carbossilato idrolasi isosimo L1 X
P09972 Fruttosio bisfosfato aldolasi C X
P0C0L4 Complemento C4 Un precursore X
P0CG05 IgRegioni della catena lambda 2 X
P0CG38 POTE membro della famiglia di domini ankyrin I X
P10515 Componente acetiltransferasi residuo di dihidrolipililsina del complesso piruvato deidrogenasi X
P10768 S formilglutathione idrolase X
P10809 Proteina 60 kDa precursore mitocondriale X
P10909 clusterina X X X X
P10915 Ialuronano e proteoglicano legano la proteina 1 precursore X X
P11021 78 kDa gProteina regolata da lucose X X X
P11047 Laminin gamma subunit gamma 1 X
P11142 La proteina 71 kDa connesso a calore X X X X
P11177 Preurorito mitocondriale di beta-subunità di beta-componente di deidrogenasi E1 X
P11217 Forma muscolare di fosforilasi glicogena X
P11310 Precursore mitocondriale a catena specifica a catena specifica di acil CoA deidrogenasi X
P11413 Glucosio 6 fosfato 1 deidrogenasi X
P11766 Catena di classe 3 di alcool deidrogenasi X
P12036 Neurofilamento pesante polipeptide X
P12109 Catena collagene alfa 1 VI X X X X
P12110 Catena collagene alpha 2 VI X X X X
P12111 Catena collagene alfa 3 VI X X X
P12277 Tipo di creatina chinasi B X
P12429 Annexin A3 X X
P12814 Alpha actinin 1 X X
P12829 Polipeptide leggero di miosina 4 X
P12882 Myosin 1 X
P12883 Myosin 7 X X
P12955 Xaa Pro dipeptidasi X
P13489 Inibitore della ribonucleasi X
P13533 Myosin 6 X X
P13611 Precursore delle proteine ​​coreane del Versican X X
P13639 Fattore di allungamento 2 X
P13716 Delta aminolevulinic acid dehydratase X
P13796 Plastin 2 X
P13804 Trasferimento elettronico precursore mitocondriale della subunità di flavoproteina alfa alfa X
P13929 Beta enolase X X
P14136 Gli astrociti delle proteine ​​acide fibrillari gliali X
P14314 Glucosidasi 2 precursore subunità beta X
P14550 Alcohol dehydrogenase NADP X
P14618 Isozimici di piruvato chinasi M1 M2 X X X
P14625 </ Td> Precursore endoplasmico X X
P15121 Aldose reduttasi X
P15259 Fosfoglicerato mutasi 2 X
P16152 Carbonyl reduttasi NADPH 1 X
P17066 Protezione da calore 70 kDa di calore 6 X X X
P17174 Aspartato aminotransferasi citoplasmatico X
P17540 Precursore mitocondriale sarcomerico della creatina chinasi X
P17661 desmina X X X X
P17980 26A subunità di regolazione della proteasi 6A X
P17987 T complesso proteina 1 subunità alfa X
P18206 vinculin X X
P18428 Precursore proteico legante lipopolisaccaride X
P18669 Phosphoglycerate mutase 1 X
P19105 Catena leggera regolatrice di myosina 2 X X
P19623 Spermidina sintasi X
P19652 1 precursore di acido glicoproteico 2 alfa X X
P19823 Inibitore della catena pesante H2 di inibitore dell'inter alpha tripasina X
P19827 Inibitore della catena pesante H1 di inter-alfa tripasina X X
P20073 Annexin A7 X
P20618 Precursore della proteina subunitaria beta tipo 1 X
P20774 Mimecan X X X X
P21266 Glutatione S transferase Mu 3 X
P21333 Filamin A X X
P21796 Proteina canale selettiva di anioni dipendenti da tensione1 X
P21810 biglicano X X X X
P21980 Proteina glutammina gamma glutamiltransferasi 2 X X
P22105 Tenascin X X X
P22314 Ubiquitina attiva l'enzima E1 X
P22352 Glutathione perossidasi 3 precursore X X
P22626 Ribonucleoproteine ​​nucleari eterogenee A2 B1 X
P22695 Ubiquinolo citochrome c reduttasi complesso proteina nucleare 2 precursore mitocondriale X
P23141 Precursore di fegato carbossilesterasi 1 X
P23142 Fibulina 1 X X X X
P23284 Precursore del peptidil prolyl cis trans isomerasi B X
P23381 Sintetasi triptofania tRNA citoplasmatica X
P23526 Adenosylhomocysteinase X X
P23528 Cofilin 1 X
P24752 Precursore mitocondriale di Acetil CoA acetiltransferasi X
P25311 Zinco alfa 2 glicoproteiN precursore X
P25705 ATP synthase subunità alfa mitocondriale X
P25788 Proteasome subunità alfa tipo 3 X X
P25789 Proteusoma subunità alfa tipo 4 X
P26447 Proteina S100 A4 X
P27348 14 3 3 proteina theta X X
P27797 Precursore di calreticulina X
P28066 Alfa tipo 5 proteasome X
P28070 X X
P28072 Preturatore di proteasome subunità beta tipo 6 X
P28074 Preturatore di proteasoma subunità beta tipo 5 X
P28331 NADH ubiquinone oxidoreductase pre-precursore mitocondriale subunità 75 kDa X
P28838 Cytosol aminopeptidase X
P29218 Inositol monofosfatasi X
P29401 transketolase X
P29692 Fattore di allungamento 1 delta X
P29966 Substrato ricco di C kinasi myristoilato di alanina X
P30040 Proteina endoplasmatica del reticolo ERp29 X
P30041 Peroxiredoxin 6 X X
P30043 Flavin reduttasi X
P30044 Precursore mitocondriale perossiredossina 5 X
P30085 UMP CMP chinasi X
P30086 Proteina di legame di fosfatidiletilammina1 X
P30101 ProteiN disolfuro isomerasi A3 precursore X X X
P30613 Isozimici di piruvato chinasi RL X
P30740 Inibitore della elastasi di leucociti X
P31025 Precursore Lipocalin 1 X
P31937 3 precursore mitocondriale di idrossibutirato deidrogenasi X
P31942 Ribonucleoproteina nucleare eterogene H3 X
P31943 Ribonucleoproteina nucleare eterogene H X
P31946 14 3 3 proteina beta alfa X X
P31948 Fosfoproteina indotta da stress 1 X
P31949 Proteina S100 A11 X
P32119 Peroxiredoxin 2 X X
P34931 Scossa termica 70 kDa proteina 1 piace X X
P34932 Protezione da calore 70 kDa di calore 4 X
P35232 proibitina X
P35237 Serpin B6 X
P35443 Thrombospondin 4 X
P35555 Fibrillina 1 X X
P35579 Myosin 9 X X X
P35580 Myosin 10 X X
P35609 Alpha actinin 2 X
P35625 Inibitore della metalloproteinasi 3 X X
P35998 26S subunità di regolazione della proteasi 7 X
P36871 Phosphoglucomutase 1 X X
P36955 Fattore derivato dall'epitelio pigmentato X X
P37802 X X
P37837 transaldolasi X
P38117 La beta subunità di flavoprotein di trasferimento di elettroni X
P38646 Precursore mitocondriale proteico 70 X X
P39687 Fosfoproteina nucleare ricca di leucina acida 32 membro della famiglia A X
P40121 Proteina di copertura del macrofago X
P40925 Malato deidrogenasi citoplasmatico X
P40926 Precursore mitocondriale di malato deidrogenasi X
P41219 periferina X
P42330 Aldo keto reduttasi famiglia 1 membro C3 X
P45880 Proteina canale selettiva di anioni dipendenti da tensione 2 X
P47755 F subunita proteina di copertura del actin alfa 2 X X
P47756 F actin capping proteina subunità beta X X
P47985 Preurorito mitocondriale subunitale di zolfo del ferro del citocromo c reduttasi dell'uccinio ubiquinolo X
P48047 ATP synthase O precursore mitocondriale subunità X
P48637 Sintetasi di glutatione X
P48741 Scossa termica 70 kDa proteica 7 X X
P49189 4 trimetilaminobutiraldehide deidrogenasi X
P49368 T proteina complessiva 1 gamma subunità X
P49747 Cartilagine proteica della matrice oligomerica X X X X
P49748 Precursore mitocondriale molto lungo a catena specifica di acil CoA deidrogenasi X
P50395 Inibitore della dissociazione del PIL di Rab X x </ Td>
P50454 Precursore di Serpin H1 X
P50995 Allegato A11 X
P51452 Doppia specificità proteina fosfatasi 3 X
P51884 lumican X X X X
P51888 Precursore di Prolargin X X X X
P52565 Inibitore della dissociazione del PCO di Rho 1 X
P52566 Inibitore della dissociazione del PCO di Rho 2 X
P54652 La proteina 70 kDa correlata agli shock termici 2 X X X X
P55072 Reticolo endoplasmatico transazionale ATPasi X
P55083 Precursore della glicoproteina 4 associata a microfibrille X X
P57053 Histone H2B tipo F X
P60174 Isomero triosfosfato X X X
P60660 Polipeptide leggero di miosina 6 X X
P60709 Actin citoplasmatico 1 X X X X
P60981 Destrin X
P61086 Ubiquitina coniuga l'enzima E2 25 kDa X
P61088 Ubiquitina coniuga l'enzima E2 X
P61224 Ras correlata alla proteina Rap 1b precursore X
P61978 Ribonucleoproteina nucleare eterogenea K X X
P61981 14 3 3 proteine ​​gamma X X X
P62258 14 3 3 proteina epsilon 14 3 3E X
P62491 Ras correlata proteina X
P62714 Isoforma della beta-subunita catalitica della fosfatasi 2A della serina della treinina X
P62736 Actin muscolo liscio aortico X X X
P62805 Istone H4 X
P62826 Proteina nucleare legante GTP Ran X
P62873 La proteina legante della guanina nucleotida GIGSGT beta 1 X
P62879 La proteina legante della guanina di legame GIGSGT beta 2 X
P62937 Peptidil prolyl cis trans isomerasi A X X
P62987 Ubiquitina 60S proteina ribosomale L40 X
P63104 14 3 3 proTein zeta delta X X X X
P63241 Fattore di iniziazione della traduzione eucariota 5A 1 X
P63244 La proteina di legame di guanina nucleotide beta 2 come 1 X
P63267 Actin gamma enterico muscolo liscio X X
P67936 Tropomyosin alfa 4 catena X
P68032 Actin alfa cardiaco muscolare 1 X
P68104 Fattore di allungamento 1 alfa 1 X X X
P68133 Muscolo scheletrico di Actin alfa
P68363 Catena di Tubulin alpha 1B X X X
P68371 Tubulin beta 2C catena X X X
P68402 Fattore di attivazione della trombocitola beta-acetilhydroazasi IB X
P68871 Beta di emoglobina X X X
P69905 Alunno di emoglobina X X
P78371 T complesso proteina 1 subunità beta X
P78417 Glutatione transferasi omega 1 X X
P80748 Ig lambda catena VIII regione LOI X
P98095 Fibulin 2 X X
Q01082 Cervello della catena beta della spettrina 1 X
Q01449 Myosina leggera catena leggera 2 isoforma atriale X
Q01518 Proteina associata alla adenil ciclasi 1 X
Q01995 Transgelin Proteina muscolare liscia 22 alfa X
Q03252 Lamin B2 X X
Q03591 Fattore complementare H correlato proteina 1 precursore X
Q04917 14 3 3 proteine ​​eta X X
Q06323 Sottunita complessa dell'attivatore Proteasome 1 X
Q06828 fibromodulina X X X X
Q06830 Peroxiredoxin 1 X X
Q07507 Dermatopontin X X X X
Q07960 Proteina attivante Rho GTPase 1 X
Q08257 Quinone ossidoreductasi X
Q08431 lactadherin X X
Q12765 SEcernin 1 X
Q13011 Delta 3 5 Delta 2 4 precursore mitocondriale di CoE isomerasi dienoile X X
Q13228 Proteina legante di selenio 1 X X
Q13404 Ubiquitina coniuga l'enzima E2 variante 1 X
Q13409 Catena intermedia 2 di Dynein citoplasmatica X
Q13509 Tubulina beta 3 catena X X X
Q13642 Quattro e mezza LIM dominano la proteina 1 X
Q13765 Nascent polipeptide associato complesso subunità alfa X
Q13885 N Tubulin beta 2A catena X X
Q14194 Proteina legata alla dihidropirimidinasi 1 X
Q14195 Proteina legata alla droidropirimidinasi 3 X X X X
Q14624 Inter-alfa tripasina inibitore catena pesante H4 precursore X
Q14697 Precursore neutro alfa glucosidasi AB X
Q14764 Proteina maggiore del vault X
Q14767 Fattore di trasformazione latente trasformante beta che lega la proteina 2 X X
Q14894 La proteina legante della proteina legante dell'ormone tiroideo regolava NADP omologo cristallino X
Q15063 Precursore di Periostin X X X X
Q15084 Proteina disolfuro isomerasi A6 precursore X
Q15113 Procollagen C endopeptidase enhancer 1 precursore X
Q15181 Pirofosfatasi inorganica X
Q15365 Proteina legante di Poly rC 1 X
Q15366 Proteina legante di Poly rC 2 X
Q15582 Trasformazione della proteina indotta da fattore di crescita beta X X X
Q15819 Ubiquitina coniuga l'enzima E2 variante 2 X
Q16352 Alpha internexin X
Q16473 Tenascinative XA X
Q16555 Proteina legata alla droidropirimidinasi 2 X X X
Q16698 2 4 precursore mitocondriale dienoilico CoA reduttasi X
Q16891 Membrana interna mitocondriale X
Q562R1 Beta actina come la proteina 2 X
Q6S8J3 Membro del nucleo familiare POTE di ankyrin E X
Q6UWY5 Olfactomedina come proteina 1 precursore X X
Q71U36 Catena di tubulina alfa 1A X X X
Q7Z7G0 Target di Nesh SH3 precursore X X X
Q8WUM4 Morte programmata della morte 6 proteine ​​interagenti X
Q8WWX9 Tioredossina come il precursore di selenoproteina M. X
Q92597 Proteina NDRG1 X
Q92945 Lungo elemento a monte dell'elemento a monte 2 X
Q96CN7 Dominio di Isochorismatase contenente la proteina 1 X
Q96CX2 Dominio di BTB POZ contenente proteine X
Q96KK5 Histone H2A tipo 1 H X X
Q96KP4 Dipeptidasi non specifico citosolica X
Q99426 Chaperone specifico di Tubulin B X
Q99497 Protein DJ 1 X X
Q99536 Proteina sinaptica della membrana vescicale X X X
Q99714 3 idrossi-acil CoA deidrogenasi tipo 2 X
Q99715 Catena collagene alpha 1 XII X X
Q99798 Aconitate il precursore mitocondriale idratasi X
Q9BQE3 Tubulina alfa 6 catena X
Q9BUF5 Tubulina beta 6 catena X X
Q9BUT1 3 idrossibutirrato deidrogenasi tipo 2 X
Q9BVA1 Tubulin beta 2B catena X X X
Q9BXN1 Asporin X x </ Td> X X
Q9H0W9 Ester idrolasi C11orf54 X
Q9H4B7 Tubulina beta 1 catena X
Q9NRN5 Olfactomedina come proteina 3 precursore X X
Q9NRV9 Proteina di legame di Heme 1 X
Q9NSB2 Keratina tipo II cuticolale Hb4 X X
Q9NVA2 Settembre 11 X
Q9UBR2 Precursore di Cathepsin Z X
Q9UBX5 Fibulin 5 X X
Q9UK22 F box solo proteina 2 X
Q9Y277 Proteina canale selettiva di anioni dipendenti da tensione 3 X
Q9Y281 Cofilin 2 X
Q9Y490 Talin 1 X
Q9Y696 Proteina del canale intracellulare del cloruro 4 X
Q9Y6C2 EMILIN 1 X X

Tabella 1: Elenco delle proteine ​​identificate nell'estratto tessuto della valvola mitrale quando sono stati applicati quattro approcci proteomi diversi: elettroforesi bidimensionale (2-DE), LC-MS E bidimensionale (2D-LC / MS E ), LC / MS E e IEF a fase liquida. Viene riportato il metodo di identificazione di ciascuna proteina.

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Discussion

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Un passo critico di questo protocollo è l'uso di azoto liquido per congelare il campione e per raffreddare il sistema di macinazione. L'utilizzo di azoto liquido evita il degrado biologico e consente una polverizzazione efficace, ma richiede una formazione specifica per una manipolazione sicura.

In questo protocollo è previsto un sistema di macinazione per la macinazione del campione in quanto i piccoli campioni sono difficili da recuperare da mortai e pestelli standard. In questo caso, piccoli campioni si diffondono come una polvere fine sulla superficie della malta, rendendo difficile la raccolta. Un altro vantaggio è che la smerigliatrice è motorizzata, che consente un maggior numero di campioni da lavorare in modo riproducibile e senza aggiunta di stanchezza. Una limitazione all'utilizzo di una macinatrice è che la dimensione del campione che deve essere piccola (100 mg o meno) per il pestello essere pressata efficacemente contro la malta. Inoltre, i componenti della smerigliatrice devono essere riscaldati a temperatura ambiente tra gli usi per la pulizia g. Di conseguenza, la procedura richiede tempo e, se molti campioni vengono elaborati quotidianamente, sono necessari molti set.

Un ulteriore passo critico è la preparazione del tampone di estrazione. Le concentrazioni di sale, in particolare per l'urea (8 M) e la tiourea (2 M), sono abbastanza elevate; Quindi, il volume di sale è quasi la metà del volume totale della soluzione. Inoltre, la dissoluzione non è facile considerando che il calore deve essere evitato in quanto, a più di 37 ° C, l'urea può portare alla carbamilazione delle proteine ​​alle proteine ​​/ peptidi N e ai gruppi amminoidali a catena laterale di residui di lisina e arginina 17 . Una volta sciolto, il tampone di urea deve essere filtrato con filtri da 0,22 μm e può essere conservato a -80 ° C per 4 settimane senza compromettere l'efficacia di estrazione, ma deve essere riscaldato a più di 15 ° C prima dell'uso per consentire una completa dissoluzione .

Modifiche e risoluzione dei problemi

In questo protocollo, l'estrazione di proteine ​​viene eseguita utilizzando il buffer di urea descritto, perché è una delle soluzioni di estrazione di proteine ​​più comunemente usate per studi proteomici a causa della sua compatibilità con isoelettrofocus e la sua efficacia nel solubilizzazione di proteine ​​poco solubili 18 . Ha dimostrato che questo tampone può solubilizzare in modo molto efficiente proteine ​​poco solubili, come proteine ​​membrane integrali 19 o proteine ​​altamente inclini all'aggregazione, come il tubulino 18. Inoltre, questo tampone è completamente compatibile con il saggio di Bradford per determinare la concentrazione proteica e Può essere utilizzato direttamente in analisi IEF a 2-DE e in fase liquida.

Tuttavia, questo buffer non è ideale per la solubilizzazione di tutte le proteine ​​presenti in un campione. È possibile che diversi buffer di estrazione possano rivelare le proteine ​​non rilevabili da questo protocollo. Ad esempio, è bene knoConsiderando che le proteine ​​ribosomali e nucleari potrebbero essere meglio estratte con l'estrazione dell'acido o l'acido tricloroacetico / acetone 20 , mentre i livelli di pH alcalini sono più adatti alle proteine 21 e 22 delle membrane. Pertanto, l'utilizzo di buffer alternativi potrebbe richiedere passi aggiuntivi per la precipitazione delle proteine ​​per eliminare sali che interferiscono con IEF a 2-DE o in fase liquida.

Limitazioni della tecnica

Il numero di proteine ​​identificate da questo protocollo è relativamente basso, ma il numero di identificazioni e la copertura dell'analisi proteomica possono essere ulteriormente aumentate grazie all'utilizzo di strumenti più moderni, la cui precisione di massa e velocità di sequenza sono aumentati notevolmente negli ultimi anni 23. È possibile coprire una gran parte del proteome, senza alcuna fase di prefrazione, impiegando una lunga pendenza per i liquidiSeparazioni di romatografia accoppiate con uno strumento MS ad alta risoluzione che ha una veloce velocità di sequenza 24 .

Significato della tecnica rispetto ai metodi esistenti / alternativi

La capacità di identificare e quantificare le proteine ​​nelle valvole cardiache umane, come la valvola mitrale, è un compito importante e stimolante che aiuterà a chiarire i meccanismi dei processi fisiologici / patologici nelle malattie delle valvole. Definire i cambiamenti della proteoma della valvola mitrale aumenta notevolmente la comprensione della natura dei processi biologici associati allo stato di malattia del tessuto.

Le conoscenze attuali sulla fisiopatologia della valvola mitrale sono limitate e generalmente ottenute attraverso l'analisi di singole proteine ​​coinvolte in processi specifici, come il rimodellamento delle matrici extracellulari, l'emostasi, l'infiammazione o lo stress ossidativo 25 9 , 10 .

La mancanza di studi proteomici completi può essere attribuita alla complessità di questo tessuto a basse cellule che è altamente ricco di proteine ​​della matrice extracellulare ( cioè proteoglicani, collagene e elastina). Queste proteine ​​costituiscono circa l'80% della quantità totale, ostacolando l'analisi delle proteine ​​a bassa abbondanza 26 .

Pertanto, è stato necessario stabilire un efficace protocollo di estrazione per massimizzare la solubilizzazione delle proteine ​​per descrivere il proteome di questo tessuto. Questo protocollo ha permesso l'estrazione di ~ 50 μg di proteine ​​da 1 mg di tessuto. Questo è un rendimento relativamente basso rispetto al tessuto "morbido", ad esempioCome fegato (~ 135 μg da 1 mg di tessuto), ma è sufficiente eseguire un'analisi proteica su singoli campioni. Ciò è particolarmente importante quando si definisce la variabilità intra-individuale di un fenomeno.

Inoltre, questo metodo ha il vantaggio di essere compatibile con molte applicazioni analitiche. Le proteine ​​della valvola mitrale disciolte nel tampone di estrazione proposto possono essere utilizzate direttamente per l'immunoblotting e l'analisi proteomica basata su elettroforesi bidimensionale e isoelettroforesi in fase liquida 11 , 12 o, dopo la precipitazione delle proteine ​​per eliminare l'interferenza del componente tampone, per altri dosaggi quali Spettrometria di massa senza gel 15 .

Con l'applicazione di questo protocollo di estrazione, è stata ottenuta una caratterizzazione più esauriente dei componenti proteici del tessuto valvolare normale mitrale attraverso l'identificazione di molti intracelProteine ​​luliche. Queste proteine ​​sono localizzate nel citosolo o negli organelli, non solo nella matrice extracellulare e hanno diverse funzioni molecolari e biologiche. Sono state inoltre identificate altre proteine ​​interessanti ( cioè CryAB , septin-11, FHL-1 e dermatopontin). Queste proteine ​​hanno funzioni sconosciute nella valvola mitralica, ma le loro proprietà biologiche suggeriscono un possibile ruolo nelle malattie delle valvole.

Applicazioni future o indicazioni dopo masterizzazione di questa tecnica

Con questo protocollo è possibile correlare i dati relativi all'espressione di proteine ​​con i dati sull'espressione quantitativa di mRNA e sulle analisi immunohistochemiche non-quantitative. Infatti, quando utilizzati insieme, questi approcci porteranno ad una comprensione più completa dei meccanismi molecolari che sottostanno la malattia, dall'MRNA alla modifica della proteina post-traslatoria. Quindi, questo metodo può essere di interesse per i ricercatori concentrati sulla valvola cardiaca fisiopatologica. pinnaAllo stesso modo, questo protocollo può essere applicato anche alla valvola mitrale della porcellana, che ha una somiglianza molto vicina alla valvola umana 27 ed è usata come modello sperimentale per la valutazione delle funzioni della valvola.

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Disclosures

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Acknowledgments

Il Ministero della Salute italiano ha sostenuto questo studio (RC 2013-BIO 15). Ringraziamo Barbara Micheli per la sua eccellente assistenza tecnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

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References

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Protocollo ottimizzato per l&#39;estrazione delle proteine ​​dalla valvola mitrale umana
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Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).More

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

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