Summary
La composizione proteica della valvola mitrale umana è ancora parzialmente sconosciuta, perché la sua analisi è complicata da basse cellularità e quindi da bassa biosintesi proteica. Questo lavoro fornisce un protocollo per estrarre efficacemente proteine per l'analisi della proteoma della valvola mitrale.
Abstract
L'analisi del proteome cellulare può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari che sottostanno le malattie dovute allo sviluppo di tecnologie che permettono l'identificazione e la quantificazione su larga scala delle proteine presenti nei complessi sistemi biologici. Le conoscenze acquisite da un approccio proteomico possono portare a un Una migliore comprensione dei meccanismi patogeni che affrontano le malattie, consentendo l'individuazione di nuovi marcatori di malattia diagnostici e prognostici e, speriamo, di obiettivi terapeutici. Tuttavia, la valvola cardiaca mitrale rappresenta un campione molto impegnativo per l'analisi proteomica a causa della bassa mobilità in proteoglicano e matrice extracellulare ricca di collagene. Questo rende impegnativo estrarre le proteine per un'analisi proteomica globale. Questo lavoro descrive un protocollo compatibile con l'analisi proteica successiva, come proteomica quantitativa e immunoblotting. Ciò può consentire la correlazione dei dati riguardantiG con dati sull'espressione mRNA quantitativa e analisi immunoistochimica non-quantitativa. Infatti, questi approcci, se eseguiti insieme, porteranno ad una comprensione più completa dei meccanismi molecolari che stanno alla base di malattie, da mRNA a modifica della proteina post-traduzionale. Quindi, questo metodo può essere rilevante per i ricercatori interessati allo studio della fisiopatologia della valvola cardiaca.
Introduction
Recenti testimonianze hanno alterato la comprensione dei ruoli dei molti meccanismi regolatori che si verificano dopo la sintesi di mRNA. Infatti, i processi traslazionali, post-trascrizionali e proteolitici possono regolare l'abbondanza e la funzione proteica. Il dogma, che afferma che le concentrazioni di mRNA sono proxy a quelle delle proteine corrispondenti, assumendo che i livelli di trascritture sono il determinante principale dell'abbondanza di proteine, è stata parzialmente riveduta. In effetti, i livelli di trascrizione solo parzialmente prevedono l'abbondanza di proteine, suggerendo che gli eventi post-trascrizionali Si verificano per regolare le proteine all'interno delle cellule 1 , 2 .
Inoltre, le proteine infine dettano la funzione della cellula e quindi dettano il suo fenotipo, che può subire variazioni dinamiche in risposta ai fattori autocrini, paracrini e endocrini; Mediatori di sangue; temperatura; Trattamento farmacologico; E la malattia si sviluppament. Pertanto, un'analisi di espressione incentrata sul livello della proteina è utile per caratterizzare il proteome e per svelare i cambiamenti critici che si verificano come parte della patogenesi della malattia 3 .
Pertanto, le opportunità che la proteomica presenta per chiarire le condizioni della salute e delle malattie sono formidabili, nonostante le sfide tecnologiche esistenti. Le aree particolarmente promettenti di ricerca a cui la proteomica può contribuire comprendono: l'individuazione dell'espressione alterata di proteine a qualsiasi livello ( cioè cellule intere o tessuti, compartimenti subcellulari e fluidi biologici); L'identificazione, la verifica e la convalida di nuovi biomarcatori utili per la diagnosi e la prognosi della malattia; E, auspicabilmente, l'individuazione di nuovi bersagli proteici che possono essere utilizzati per scopi terapeutici, nonché per la valutazione dell'efficacia e della tossicità farmacologica 4 .
Catturare la complessità diIl proteome rappresenta una sfida tecnologica. Gli attuali strumenti proteomici offrono l'opportunità di eseguire analisi su larga scala e ad alto rendimento per l'identificazione, la quantificazione e la convalida dei livelli alterati di proteine. Inoltre, l'introduzione di tecniche di frazionamento e arricchimento, mirante ad evitare le interferenze causate dalle proteine più abbondanti, ha anche migliorato l'identificazione delle proteine includendo le proteine meno abbondanti. Infine, la proteomica è stata completata dall'analisi delle modificazioni post-traduzionali, che emergono progressivamente come importanti modulatori della funzione proteica.
Tuttavia, la preparazione del campione e il recupero delle proteine nei campioni biologici in analisi rimangono ancora i passi limitanti nel flusso di lavoro proteomico e aumentano il potenziale di eventuali insidie 5 . Infatti, nella maggior parte delle tecniche di biologia molecolare che devono essere ottimizzate, i primi passi sono l'omogeneizzazione dei tessutiIoni e cellule, soprattutto durante l'analisi di proteine a bassa abbondanza per le quali non esistono metodi di amplificazione. Inoltre, la natura chimica delle proteine può influenzare il proprio recupero. Ad esempio, l'analisi delle proteine altamente idrofobiche è molto impegnativa, perché facilmente precipitano durante la messa a fuoco isoelettrica, mentre le proteine di trans-membrana sono quasi insolubili (esaminate nel Reference 5). Inoltre, la variabilità della composizione tissutale crea una barriera significativa allo sviluppo di un metodo di estrazione universale. Infine, poiché quasi tutti gli esemplari clinici sono di quantità limitata, è essenziale consentire la preparazione di proteine con il massimo recupero e riproducibilità da quantità minime di campioni 6 .
Questo lavoro descrive un protocollo ottimizzato per l'estrazione proteica dalla valvola mitrale normale cardiaca umana, che rappresenta un campione molto impegnativo per l'analisi proteomica. La normale valvola mitrale è un compLex che si trova tra l'atrio sinistro e il ventricolo sinistro del cuore ( Figura 1 ). Esso svolge un ruolo importante nel controllo del flusso di sangue dall'atrio al ventricolo, impedendo il flusso di riflusso e assicurando il corretto livello di alimentazione dell'ossigeno per tutto il corpo, mantenendo così un'adeguata uscita cardiaca. Tuttavia, è spesso considerato un tessuto "inattivo", con una bassa cellularità e pochi componenti, principalmente nella matrice extracellulare. Ciò è dovuto al fatto che, in condizioni normali, le cellule interstiziali valvolari residenti (VIC) presentano un fenotipo di riposo con una bassa percentuale di biosintesi proteica 7 .
Tuttavia, è stato dimostrato che, in uno stato patologico, il numero di VICs nella spongiosa aumenta e la loro sintesi proteica è attivata, insieme ad altri cambiamenti funzionali e fenotipici 8 . Pertanto, non sorprende che i dati minimi disponibili inLa letteratura si concentra sull'analisi delle valvole mitraliche patologiche 9 , 10 , in cui l'aumento del numero di VIC attivato potrebbe spiegare il numero relativamente elevato di proteine identificate.
In conclusione, il presente protocollo può servire a sviluppare la comprensione dei meccanismi patogeni responsabili delle malattie delle valvole mitraliche attraverso lo studio di componenti proteici della valvola mitrale. Infatti, una maggiore comprensione dei processi patologici sottostanti potrebbe contribuire a migliorare la gestione clinica delle malattie delle valvole, le cui attuali indicazioni per l'intervento sono in gran parte predicate sulle considerazioni emodinamiche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In questo protocollo, i cuori umani vengono raccolti durante l'esplorazione multiorgano (tempi di ischemia fredda di 4-12 h, media 6 ± 2 h) dai donatori multi-organi esclusi dal trapianto di organi per motivi tecnici o funzionali, nonostante i normali parametri ecocardiografici. Sono inviati alla Banca Tissue Cardiovascolare di Milano, Centro Cardiologico Monzino (Milano, Italia) per l'attività bancaria delle valvole aortiche e polmonari. I volantini posteriori mitraali non vengono utilizzati per scopi clinici, quindi vengono raccolti durante l'isolamento delle valvole aortiche e delle valvole polmonari, dopo che il consenso informato è ottenuto dai parenti dei donatori. Il tessuto per il trapianto e la ricerca viene raccolto solo dopo il consenso dei genitori; Sul foglio di autorizzazione, autorizzano (o non) l'uso del tessuto cardiaco per la ricerca solo se non è idoneo all'uso clinico umano ( ad esempio, problemi microbiologici, funzionali e sierologici), seguendo le linee guida del comitato eticoCentro Cardiologico Monzino.
1. Preparazione della valvola mitrale
- Raccogliere la valvola mitrale umana il più presto possibile dopo l'esplosione dell'organo (tempo di ischemia fredda di 4-12 h).
- In una stanza pulita, togliere il cuore dalla borsa di trasporto contenente una soluzione fredda (4 ° C) ( cioè soluzione salina o medie equilibrate Eurocollins o Wisconsin). Metterlo in un secchio e collocarlo in un armadio di biosicurezza (classificazione della classe A, Good Manufacturing Practices (GMP)) per procedere alla preparazione della valvola.
- Posizionare il cuore su un drappo monouso sterile nell'armadio. Usando un bisturi monouso sterile, tagliare completamente il cuore, perpendicolarmente al suo asse principale, sul livello dei ventricoli sinistro e destro, circa 4 cm di distanza dall'apice.
- Spostare l'aorta ascendente e l'arteria polmonare per visualizzare il tetto atriale sinistro.
- Con pinze e scatti sterilizzabili sterilizzabili, tagliare attorno all'orecchio sinistro sullaTetto atriale sinistro, rendendo visibile la valvola mitrale e consentendo di identificare il grande foglietto mitrale (anteriore) e il piccolo foglio mitrale (posteriore).
NOTA: Gli antero laterali e le commissioni mediali posteriori definiscono il bordo del foglio anteriore e della zona posteriore. - Utilizzando forbici sterilizzabili autoclavabili e pinze non traumatiche, dissectare l'atrio sinistro e lo spessore della parete del ventricolo attorno alla circonferenza di tutta la valvola mitrale .
- Identificare la continuità della valvola mitro-aortica.
NOTA: Il ventricolo sinistro contiene l'intera valvola mitrale e gli accordi. - Separare il foglietto della valvola mitrale anteriore dal foglietto della valvola mitrale posteriore, tagliando il foglio posteriore lungo l'inserimento con il ventricolo (commissure).
- Lavare il foglietto posteriore nella soluzione salina. Tagliare il foglietto in piccoli pezzi (<1 cm 2 ) e avvolgerli individualmente in fogli di alluminio. Snap-congelare con azoto liquido.
Attenzione: Seguire le procedure di sicurezza organizzative quando si utilizza azoto liquido.- Sanitizzare la tabella dell'armadio con una soluzione alcolica al 70% di isopropilato e una soluzione al perossido di idrogeno al 6% alla fine della procedura.
2. Estrazione della proteina
- Utilizzare pinze per prelevare il campione immagazzinato in azoto liquido e posizionarlo immediatamente in ghiaccio secco mentre ancora avvolto nel foglio di alluminio. Non lasciare scongelare il campione durante qualsiasi trasferimento.
- Prima della macinazione, raffreddare il malta di porcellana / zirconio e pestelli di un sistema di macinazione ( ad esempio, CryoGrinder), insieme al campione, inserendoli in un pallone Dewar contenente azoto liquido (~ 500 mL).
Attenzione: Seguire le procedure di sicurezza organizzative quando si utilizza azoto liquido. - Mettere il mortaio e il pestello in una scatola di polistirolo contenente ghiaccio secco. Rimuovere il campione dal foglio di alluminio e inserirlo nella malta.
- Grind tCampione con il grande pestello contro la malta 15-20 volte, utilizzando il cacciavite per ruotare il pestello. Mescolare il campione con la punta di una spatola pre-raffreddata durante il processo di macinazione.
- Ripeti con il piccolo pestello.
- Trasferire il campione di massa a un tubo precedentemente pesato ( es. Tubo da centrifuga da 15 ml) invertendo il tubo, ponendolo sopra la malta e invertendo insieme per spostare il campione sul tubo. Utilizzare una spatola pre-raffreddata per recuperare tutto il materiale dalla malta.
- Tenere il tubo con il campione su ghiaccio secco per evitare il disgelo del campione durante il trasferimento.
- Calcolare il peso netto del campione.
- Pulire la malta e il pestello dopo ogni campione e decontaminarli mediante autoclave o riscaldandoli a 200 ° C per 2 ore.
- Trasferire il campione in polvere dal tubo di centrifuga al tubo di vetro di un omogeneizzatore per inversione.
- Aggiungere bufere filtrato in ureaR (8 M urea, 2 M tiourea, 4% w / v CHAPS, 20 mM Tris e 55 mM dithiotreitolo) al tubo di vetro, 200 μl di buffer urea per ogni 10 mg di tessuto in polvere.
NOTA: Il campione in polvere residuo lasciato nel tubo di centrifuga può essere recuperato usando una parte del volume calcolato di buffer urea. - Homogenizzare il campione utilizzando un agitatore dotato di un mulino di vetro borosilicato e un pestello di politetrafluoroetilene (PTFE). Premere lentamente il pestello sul campione con un movimento di torsione (1.500 giri / min) 10 volte.
- Recuperare il surnatante e trasferirlo in un tubo centrifugo da 1,7 ml. Riprendere il campione rimanente con il buffer di urea fresco, aggiungendo metà del volume utilizzato durante la prima estrazione.
- Ripetere il passaggio 2.10.
- Recuperare il surnatante e combinarlo con il surnatante dal punto 2.11. Posizionare il supernatante combinato su un rotatore di tubo per 30 min.
- Centrifugare il tubo per 30 minuti a 13.000 xg e 4 ° C.
- Recuperare il surnatante anD misurare la concentrazione proteica utilizzando il saggio della proteina Bradford, secondo le istruzioni del produttore. Conservare il campione a -80 ° C fino all'uso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'estrazione e la dissoluzione delle proteine nel buffer urea è direttamente compatibile con i metodi proteomici basati su isoelectrofocusing (elettroforesi bidimensionale (2-DE) 11 e fuoco isoelettrico a fase liquida (IEF) 12 ) e con immunoblotting dopo la diluizione in tampone Laemmli 13 Contenente un cocktail inibitore della proteasi 14 .
Per i metodi basati sulla spettrometria di massa senza gel ( cioè la cromatografia liquida accoppiata ad analisi di spettrometria di massa indipendente dai dati (LC / MS E ) e LC / MS E bidimensionale (2D-LC / MS E )) 15 i campioni estratti Nel tampone urea descritto devono essere ulteriormente trattati per eliminare l'urea e la tiourea, che potrebbero interferire con la successiva separazione della proteina e della cromatografia liquida. ThiS si può compiere utilizzando i kit di precipitazione di proteine commerciali, seguendo le istruzioni del produttore per precipitare le proteine. Il campione può quindi essere sciolto in 25 mM di NH 4 HCO 3 contenente detergenti cleavabili 0,1% per la digestione proteica 16 . La precipitazione delle proteine può eliminare i componenti del tampone, minimizzando il contenuto proteico (recupero di proteine:> 85%), rendendo il campione adatto a ogni tipo di analisi.
L'applicazione di questo protocollo per l'estrazione proteica da valvole umane mitraliche ha consentito l'identificazione di un totale di 422 proteine, combinando quattro differenti approcci proteomici precedentemente descritti in dettaglio 11 , 15 . In particolare, 169 proteine sono state identificate da proteine 2-DE, 330 mediante IEF in fase liquida, 96 proteine da LC / MS E e 148 proteineDa 2D-LC / MS E (Tabella 1).
Per classificare le 422 proteine identificate in termini di localizzazione subcellulare, è stato utilizzato un software per l'analisi di ontologia genica (GO) ( ad esempio Cytoscape). La rete creata con il software e il relativo plug-in ha mostrato che, oltre alle proteine previste localizzate nella regione extracellulare (vedere la parte superiore destra della Figura 2 ), la maggior parte delle proteine identificate dagli approcci proteomici erano dalla regione intracellulare ( Cioè citoplasma, organi, vescicole e citoscheletro). Sono state anche identificate proteine della superficie cellulare ( figura 2 ).
I risultati sono stati ulteriormente confermati in tre campioni di valvola mitralica indipendente. L'immunoblotting è stato usato per analizzare un gruppo di quattro proteine ( vale a dire septin-11, quattro e mezzo domini LIM proteina 1 (FHL-1), derMatopontin e alfa-cristallina B (CryAB)) che non sono mai stati identificati nella normale valvola mitrale ( Figura 3 ).
Figura 1: Struttura della valvola mitrale. Vista dall'alto del cuore umano mostrando la valvola mitrale omologata ( A ) o aperta ( B ). Vista frontale del ventricolo sinistro di un cuore umano ( C ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi delle proteine valvolari mitralmente identificate in termini di distribuzione cellulare. Cytoscape e il plugin BiNGO sono stati utilizzati per obtaiN la distribuzione di termini ontologici gene (GO) dalle categorie di componenti cellulari. La dimensione del cerchio è proporzionale al numero di componenti proteici associati ai termini GO selezionati e viene riportata la scala dei colori per il valore p di sovra-rappresentazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi dell'immunoblotting di septin-11, FHL-1, dermatopontin e CryAB in estratto intero da tre pallienti di valvola mitralica normale umana. L'immunoblotting è stato eseguito utilizzando anticorpi monoclonali del mouse contro CryAB e anticorpi policlonali coniglio contro gli anticorpi di septin-11, FHL-1 e dermatopontin. per favoreClicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| accessione | Descrizione | 2-DE | 2D-LC | LC-MS E | Fase liquida IEF |
| A6NMZ7 | Collagene alfa VI | X | |||
| O00151 | Proteine PDZ e LIM dominio 1 | X | |||
| O00299 | Proteina del canale intracellulare del cloruro 1 | X | |||
| O00764 | Pyridoxal chinasi | X | |||
| O14558 | Proteina anti shock caldo beta 6 | X | |||
| O43399 | Proteina tumorale D54 | X | |||
| O43488 | Membro 2 dell'aldehido reduttasi aflatoxina B1 | X | |||
| O43707 | Alpha actinin 4 | X | X | ||
| O43866 | Antigene CD5 come precursore | X | |||
| O60493 | Ordinamento di nexin 3 | X | |||
| O60701 | UDP glucosio 6 deidrogenasi | X | |||
| O75223 | Proteine non caratterizzate | X | |||
| O75368 | SH3 che lega l'acido glutammico ricco di proteine | X | |||
| O75390 | Precursore mitocondriale di sintasi di citrato | X | |||
| O75489 | NADH deidrogenasi ubiquinone ferro di zolfo proteina 3 precursore mitocondriale | X | X | ||
| O75608 | Tioesterasi 1 di proteine aciliche | X | |||
| O75828 | Carbonyl reduttasi NADPH 3 | X | |||
| O75874 | Isocitrato deidrogenasi NADP citoplasmatico | X | |||
| O75955 | flotillina | X | |||
| O94760 | NG NG dimetilarginina dimetilamminoidrolasi 1 | X | |||
| O94788 | Retinale deidrogenasi 2 | X | |||
| O95865 | NG NG dimetilarginina dimetilamminoidrolasi 2 | X | X | ||
| P00325 | Alcool deidrogenasi 1B | X | X | ||
| P00338 | L di lattato deidrogenasi A | X | |||
| P00352 | Retina deidrogenasi 1 | X | |||
| P00441 | Superossido dismutasi Cu Zn | X | X | ||
| P00450 | Ceruloplasmin precursore | X | X | ||
| P00488 | Fattore di coagulazione XIII A precursore della catena | X | |||
| P00491 | Purin nucleoside fosforilasi | X | |||
| P00492 | Ipossanthine guanine phosphoribosyltransferase | X | |||
| P00558 | Fosfoglicerato chinasi 1 | <td> xX | X | ||
| P00568 | Adenilato chinasi isoenzimo 1 | X | |||
| P00734 | protrombina | X | X | ||
| P00738 | aptoglobina | X | X | X | X |
| P00739 | Precursore proteico correlato all'Haptoglobin | X | |||
| P00751 | Fattore complementare B | X | X | X | |
| P00915 | Anidride carbonica 1 | X | |||
| P00918 | Anidride carbonica 2 | X | |||
| P01008 | Antithrombin III precursore | X | X | X | |
| P01009 | Alfa 1 antitripsina | X | X | X | X |
| P01011 | Anticicotripsina alfa 1 | X | X | X | X |
| P01019 | Precursore angiotensinogenico | X | X | ||
| P01023 | Alpha 2 macroglobulin | X | X | ||
| P01024 | Complemento C3 | X | X | X | X |
| P01033 | Inibitore della metalloproteinasi 1 precursore | X | |||
| P01042 | Kininogen 1 precursore | X | |||
| P01593 | Ig kappa catena VI regione AG | X | |||
| P01598 | Regione di Ig kappa regione VI regione dell'UE | X | |||
| P01600 | Regione di Ig kappa regione VI Hau | X | X | ||
| P01611 | Regione di Ig kappa VI regione Wes | X | |||
| P01620 | Ig kappa catena V III regione SIE | X | |||
| P01625 | Catena Ig kappa V IV regione Len | X | |||
| P01766 | Ig catena pesante V III regione BRO | X | X | ||
| P01781 | Ig catena pesante V III regione GAL | X | |||
| P01834 | Regione Ig della catena Ig kappa | X | X | X | X |
| P01842 | Regioni della catena di Ig lambda | X | X | X | |
| P01857 | Ig gamma 1 catena C regione | X | X | X | X |
| P01859 | Ig gamma 2 catena C | X | X | X | X |
| P01860 | Ig gamma 3 catena C | X | X | X | |
| P01861 | Ig gamma 4 catena C | X | X | X | |
| P01871 | Ig mu catena regione C | X | X | X | |
| P01876 | Ig alfa 1 catena C regione | X | X | X | X |
| P01877 | Ig alfa 2 catena C | X | |||
| P02144 | Mioglobina | X | X | ||
| P02452 | Collagene alfa 1 I catena | X | X | X | X |
| P02511 | Catena a cristallo B di Alpha | X | |||
| P02545 | Laminato Lamin AC 70 kDa | X | X | X | X |
| P02647 | Apolipoproteina AI | X | X | X | X |
| P02649 | Apolipoproteina E | X | X | X | X |
| P02671 | Catena alfa di Fibrinogen | X | X | X | X |
| P02675 | Catena beta di fibrinogeno | X | X | X | X |
| P02679 | Catena gamma fibrinogena | X | X | X | X |
| P02689 | Proteina di Myelin P2 | X | |||
| P02735 | Precursore proteico di amiloide del siero | X | |||
| P02741 | C precursore proteico reattivo | X | |||
| P02743 | Componente amiloidale P siero | X | X | X | X |
| P02746 | Subunità subcomponente B di complemento C1q | X | X | ||
| P02747 | Complemento C1q subunità sub-componente C precursore | X | |||
| P02748 | Componente supplementare C9 | X | X | X | |
| P02749 | Beta 2 glicoproteina 1 | X | X | X | X |
| P02750 | Leucine ricco di alfa 2 glicoproteina precursore | X | |||
| P02751 | fibronectina | X | X | ||
| P02760 | Precursore delle proteine AMBP | X | X | X | X |
| P02763 | Glicoproteina acida alfa 1 | X | X | X | |
| P02765 | Alpha 2 HS precursore glicoproteico | X | |||
| P02766 | Transthyretin precursore | X | X | X | |
| P02768 | Siero albumina | X | X | X | X |
| P02774 | Vitamina D precursore proteico legante | X | |||
| P02787 | Serotransferrin | X | X | X | X |
| P02788 | Precursore di lattotrasferrina | X | |||
| P02790 | hemopexin | X | X | X | X |
| P02792 | Catena leggera ferritina | X | |||
| P04004 | vitronectina | X | X | X | X |
| P04075 | Fruttosio bisfosfato aldolasi A | X | |||
| P04083 | Annexin A1 | X | X | X | X |
| P04179 | Precursore mitocondriale Mn superossido dismutasi | X | |||
| P04196 | Precursore glicoproteico ricco di istidina | X | |||
| P04217 | Precursore di glicoproteina alfa 1B | X | X | ||
| P04350 | Tubulin beta 4 catena | X | |||
| P04406 | Glyceraldehyde 3 fosfato deidrogenasi | X | X | X | X |
| P04792 | Proteina di shock caldo beta 1 | X | X | X | X |
| P05091 | Precursore mitocondriale di deidrogenasi di aldeide | X | X | ||
| Precursore di inibitori del proteasi C1 del plasma | X | ||||
| P05156 | Fattore complementare I precursore | X | |||
| P05413 | Cuore proteico legante acido grasso | X | |||
| P05452 | Tetranectina precursore TN | X | X | ||
| P05787 | Citoscheletrico di tipo II di cheratina 8 | X | |||
| P06396 | gelsolin | X | X | X | X |
| P06576 | Precursore mitocondriale beta della subunità di sintesi ATP | X | X | ||
| P06732 | Tipo di creatina chinasi M | X | X | ||
| P06733 | Alpha enolase | X | X | X | X |
| P06753 | Tropomyosin alfa 3 catena | X | X | ||
| P07108 | Proteina legante Acyl CoA | X | |||
| P07195 | L di lattato deidrogenasi B | X | X | X | |
| P07196 | Neurofilamento leggero polipeptide | X | |||
| P07197 | Neurofilamento medio polipeptide | X | X | ||
| P07237 | Proteina disolfuro isomerasi precursore | X | X | ||
| P07339 | Precursore di cathepsina D. | X | X | ||
| P07355 | Annexin A2 | X | X | X | X |
| P07360 | Componente complementare del precursore della catena gamma C8 | X | |||
| P07437 | Catena beta-tubulina | X | X | X | X |
| P07585 | decorin | X | X | X | X |
| P07737 | Profilo 1 | X | |||
| P07858 | Precursore della cathepsina B. | X | |||
| P07900 | Protezione anti shock caldo HSP 90 alfa | X | X | ||
| P07951 | Catena beta tropomyosin | X | |||
| P07954 | Fumarate precursore mitocondriale di idratasi | X | |||
| P07996 | Thrombospondin 1 | X | X | X | |
| P08107 | Scossa termica 70 kDa proteina 1A 1B | X | X | X | X |
| P08123 | Collagene alfa 2 I catena | X | X | X | X |
| P08133 | Annexin A6 | X | X | ||
| P08238 | Proteina anti shock termico HSP 90 beta | X | X | ||
| P08253 | 72 kDa di tipo IV precursore di collagenasi | X | |||
| P08294 | Superossido extracellulare dismutasi Cu Zn precursor | X | X | X | |
| P08590 | Polipeptide leggero di miosina 3 | X | X | ||
| P08603 | Fattore complementare H | X | X | X | X |
| P08670 | vimentin | X | X | X | X |
| P08729 | Cistoscheletrico II di tipo Keratina 7 | X | |||
| P08758 | Annexin A5 | X | X | X | X |
| P09211 | Glutatione S transferase P | X | X | X | |
| P09382 | Galectina 1 | X | X | X | |
| P09417 | Dihidropteridine reduttasi | <td> | X | ||
| P09493 | Tropomyosin 1 catena alfa | X | X | ||
| P09525 | Annexin A4 | X | X | ||
| P09651 | Ribonucleoproteina nucleare eterogene A1 | X | |||
| P09871 | Competitivo C1s precursore sottocomponente | X | |||
| P09936 | Ubiquitina terminale carbossilato idrolasi isosimo L1 | X | |||
| P09972 | Fruttosio bisfosfato aldolasi C | X | |||
| P0C0L4 | Complemento C4 Un precursore | X | |||
| P0CG05 | IgRegioni della catena lambda 2 | X | |||
| P0CG38 | POTE membro della famiglia di domini ankyrin I | X | |||
| P10515 | Componente acetiltransferasi residuo di dihidrolipililsina del complesso piruvato deidrogenasi | X | |||
| P10768 | S formilglutathione idrolase | X | |||
| P10809 | Proteina 60 kDa precursore mitocondriale | X | |||
| P10909 | clusterina | X | X | X | X |
| P10915 | Ialuronano e proteoglicano legano la proteina 1 precursore | X | X | ||
| P11021 | 78 kDa gProteina regolata da lucose | X | X | X | |
| P11047 | Laminin gamma subunit gamma 1 | X | |||
| P11142 | La proteina 71 kDa connesso a calore | X | X | X | X |
| P11177 | Preurorito mitocondriale di beta-subunità di beta-componente di deidrogenasi E1 | X | |||
| P11217 | Forma muscolare di fosforilasi glicogena | X | |||
| P11310 | Precursore mitocondriale a catena specifica a catena specifica di acil CoA deidrogenasi | X | |||
| P11413 | Glucosio 6 fosfato 1 deidrogenasi | X | |||
| P11766 | Catena di classe 3 di alcool deidrogenasi | X | |||
| P12036 | Neurofilamento pesante polipeptide | X | |||
| P12109 | Catena collagene alfa 1 VI | X | X | X | X |
| P12110 | Catena collagene alpha 2 VI | X | X | X | X |
| P12111 | Catena collagene alfa 3 VI | X | X | X | |
| P12277 | Tipo di creatina chinasi B | X | |||
| P12429 | Annexin A3 | X | X | ||
| P12814 | Alpha actinin 1 | X | X | ||
| P12829 | Polipeptide leggero di miosina 4 | X | |||
| P12882 | Myosin 1 | X | |||
| P12883 | Myosin 7 | X | X | ||
| P12955 | Xaa Pro dipeptidasi | X | |||
| P13489 | Inibitore della ribonucleasi | X | |||
| P13533 | Myosin 6 | X | X | ||
| P13611 | Precursore delle proteine coreane del Versican | X | X | ||
| P13639 | Fattore di allungamento 2 | X | |||
| P13716 | Delta aminolevulinic acid dehydratase | X | |||
| P13796 | Plastin 2 | X | |||
| P13804 | Trasferimento elettronico precursore mitocondriale della subunità di flavoproteina alfa alfa | X | |||
| P13929 | Beta enolase | X | X | ||
| P14136 | Gli astrociti delle proteine acide fibrillari gliali | X | |||
| P14314 | Glucosidasi 2 precursore subunità beta | X | |||
| P14550 | Alcohol dehydrogenase NADP | X | |||
| P14618 | Isozimici di piruvato chinasi M1 M2 | X | X | X | |
| P14625 </ Td> | Precursore endoplasmico | X | X | ||
| P15121 | Aldose reduttasi | X | |||
| P15259 | Fosfoglicerato mutasi 2 | X | |||
| P16152 | Carbonyl reduttasi NADPH 1 | X | |||
| P17066 | Protezione da calore 70 kDa di calore 6 | X | X | X | |
| P17174 | Aspartato aminotransferasi citoplasmatico | X | |||
| P17540 | Precursore mitocondriale sarcomerico della creatina chinasi | X | |||
| P17661 | desmina | X | X | X | X |
| P17980 | 26A subunità di regolazione della proteasi 6A | X | |||
| P17987 | T complesso proteina 1 subunità alfa | X | |||
| P18206 | vinculin | X | X | ||
| P18428 | Precursore proteico legante lipopolisaccaride | X | |||
| P18669 | Phosphoglycerate mutase 1 | X | |||
| P19105 | Catena leggera regolatrice di myosina 2 | X | X | ||
| P19623 | Spermidina sintasi | X | |||
| P19652 | 1 precursore di acido glicoproteico 2 alfa | X | X | ||
| P19823 | Inibitore della catena pesante H2 di inibitore dell'inter alpha tripasina | X | |||
| P19827 | Inibitore della catena pesante H1 di inter-alfa tripasina | X | X | ||
| P20073 | Annexin A7 | X | |||
| P20618 | Precursore della proteina subunitaria beta tipo 1 | X | |||
| P20774 | Mimecan | X | X | X | X |
| P21266 | Glutatione S transferase Mu 3 | X | |||
| P21333 | Filamin A | X | X | ||
| P21796 | Proteina canale selettiva di anioni dipendenti da tensione1 | X | |||
| P21810 | biglicano | X | X | X | X |
| P21980 | Proteina glutammina gamma glutamiltransferasi 2 | X | X | ||
| P22105 | Tenascin X | X | X | ||
| P22314 | Ubiquitina attiva l'enzima E1 | X | |||
| P22352 | Glutathione perossidasi 3 precursore | X | X | ||
| P22626 | Ribonucleoproteine nucleari eterogenee A2 B1 | X | |||
| P22695 | Ubiquinolo citochrome c reduttasi complesso proteina nucleare 2 precursore mitocondriale | X | |||
| P23141 | Precursore di fegato carbossilesterasi 1 | X | |||
| P23142 | Fibulina 1 | X | X | X | X |
| P23284 | Precursore del peptidil prolyl cis trans isomerasi B | X | |||
| P23381 | Sintetasi triptofania tRNA citoplasmatica | X | |||
| P23526 | Adenosylhomocysteinase | X | X | ||
| P23528 | Cofilin 1 | X | |||
| P24752 | Precursore mitocondriale di Acetil CoA acetiltransferasi | X | |||
| P25311 | Zinco alfa 2 glicoproteiN precursore | X | |||
| P25705 | ATP synthase subunità alfa mitocondriale | X | |||
| P25788 | Proteasome subunità alfa tipo 3 | X | X | ||
| P25789 | Proteusoma subunità alfa tipo 4 | X | |||
| P26447 | Proteina S100 A4 | X | |||
| P27348 | 14 3 3 proteina theta | X | X | ||
| P27797 | Precursore di calreticulina | X | |||
| P28066 | Alfa tipo 5 proteasome | X | |||
| P28070 | <Td> Proteasome subunit beta tipo 4 precursoreX | X | |||
| P28072 | Preturatore di proteasome subunità beta tipo 6 | X | |||
| P28074 | Preturatore di proteasoma subunità beta tipo 5 | X | |||
| P28331 | NADH ubiquinone oxidoreductase pre-precursore mitocondriale subunità 75 kDa | X | |||
| P28838 | Cytosol aminopeptidase | X | |||
| P29218 | Inositol monofosfatasi | X | |||
| P29401 | transketolase | X | |||
| P29692 | Fattore di allungamento 1 delta | <td> | X | ||
| P29966 | Substrato ricco di C kinasi myristoilato di alanina | X | |||
| P30040 | Proteina endoplasmatica del reticolo ERp29 | X | |||
| P30041 | Peroxiredoxin 6 | X | X | ||
| P30043 | Flavin reduttasi | X | |||
| P30044 | Precursore mitocondriale perossiredossina 5 | X | |||
| P30085 | UMP CMP chinasi | X | |||
| P30086 | Proteina di legame di fosfatidiletilammina1 | X | |||
| P30101 | ProteiN disolfuro isomerasi A3 precursore | X | X | X | |
| P30613 | Isozimici di piruvato chinasi RL | X | |||
| P30740 | Inibitore della elastasi di leucociti | X | |||
| P31025 | Precursore Lipocalin 1 | X | |||
| P31937 | 3 precursore mitocondriale di idrossibutirato deidrogenasi | X | |||
| P31942 | Ribonucleoproteina nucleare eterogene H3 | X | |||
| P31943 | Ribonucleoproteina nucleare eterogene H | X | |||
| P31946 | 14 3 3 proteina beta alfa | X | X | ||
| P31948 | Fosfoproteina indotta da stress 1 | X | |||
| P31949 | Proteina S100 A11 | X | |||
| P32119 | Peroxiredoxin 2 | X | X | ||
| P34931 | Scossa termica 70 kDa proteina 1 piace | X | X | ||
| P34932 | Protezione da calore 70 kDa di calore 4 | X | |||
| P35232 | proibitina | X | |||
| P35237 | Serpin B6 | X | |||
| P35443 | Thrombospondin 4 | X | </ Tr> | ||
| P35555 | Fibrillina 1 | X | X | ||
| P35579 | Myosin 9 | X | X | X | |
| P35580 | Myosin 10 | X | X | ||
| P35609 | Alpha actinin 2 | X | |||
| P35625 | Inibitore della metalloproteinasi 3 | X | X | ||
| P35998 | 26S subunità di regolazione della proteasi 7 | X | |||
| P36871 | Phosphoglucomutase 1 | X | X | ||
| P36955 | Fattore derivato dall'epitelio pigmentato | X | X | ||
| P37802 | <Td> Transgelin 2X | X | |||
| P37837 | transaldolasi | X | |||
| P38117 | La beta subunità di flavoprotein di trasferimento di elettroni | X | |||
| P38646 | Precursore mitocondriale proteico 70 | X | X | ||
| P39687 | Fosfoproteina nucleare ricca di leucina acida 32 membro della famiglia A | X | |||
| P40121 | Proteina di copertura del macrofago | X | |||
| P40925 | Malato deidrogenasi citoplasmatico | X | |||
| P40926 | Precursore mitocondriale di malato deidrogenasi | <td> | X | ||
| P41219 | periferina | X | |||
| P42330 | Aldo keto reduttasi famiglia 1 membro C3 | X | |||
| P45880 | Proteina canale selettiva di anioni dipendenti da tensione 2 | X | |||
| P47755 | F subunita proteina di copertura del actin alfa 2 | X | X | ||
| P47756 | F actin capping proteina subunità beta | X | X | ||
| P47985 | Preurorito mitocondriale subunitale di zolfo del ferro del citocromo c reduttasi dell'uccinio ubiquinolo | X | |||
| P48047 | ATP synthase O precursore mitocondriale subunità | X | |||
| P48637 | Sintetasi di glutatione | X | |||
| P48741 | Scossa termica 70 kDa proteica 7 | X | X | ||
| P49189 | 4 trimetilaminobutiraldehide deidrogenasi | X | |||
| P49368 | T proteina complessiva 1 gamma subunità | X | |||
| P49747 | Cartilagine proteica della matrice oligomerica | X | X | X | X |
| P49748 | Precursore mitocondriale molto lungo a catena specifica di acil CoA deidrogenasi | X | |||
| P50395 | Inibitore della dissociazione del PIL di Rab | X | x </ Td> | ||
| P50454 | Precursore di Serpin H1 | X | |||
| P50995 | Allegato A11 | X | |||
| P51452 | Doppia specificità proteina fosfatasi 3 | X | |||
| P51884 | lumican | X | X | X | X |
| P51888 | Precursore di Prolargin | X | X | X | X |
| P52565 | Inibitore della dissociazione del PCO di Rho 1 | X | |||
| P52566 | Inibitore della dissociazione del PCO di Rho 2 | X | |||
| P54652 | La proteina 70 kDa correlata agli shock termici 2 | X | X | X | X |
| P55072 | Reticolo endoplasmatico transazionale ATPasi | X | |||
| P55083 | Precursore della glicoproteina 4 associata a microfibrille | X | X | ||
| P57053 | Histone H2B tipo F | X | |||
| P60174 | Isomero triosfosfato | X | X | X | |
| P60660 | Polipeptide leggero di miosina 6 | X | X | ||
| P60709 | Actin citoplasmatico 1 | X | X | X | X |
| P60981 | Destrin | X | |||
| P61086 | Ubiquitina coniuga l'enzima E2 25 kDa | X | |||
| P61088 | Ubiquitina coniuga l'enzima E2 | X | |||
| P61224 | Ras correlata alla proteina Rap 1b precursore | X | |||
| P61978 | Ribonucleoproteina nucleare eterogenea K | X | X | ||
| P61981 | 14 3 3 proteine gamma | X | X | X | |
| P62258 | 14 3 3 proteina epsilon 14 3 3E | X | |||
| P62491 | Ras correlata proteina | X | |||
| P62714 | Isoforma della beta-subunita catalitica della fosfatasi 2A della serina della treinina | X | |||
| P62736 | Actin muscolo liscio aortico | X | X | X | |
| P62805 | Istone H4 | X | |||
| P62826 | Proteina nucleare legante GTP Ran | X | |||
| P62873 | La proteina legante della guanina nucleotida GIGSGT beta 1 | X | |||
| P62879 | La proteina legante della guanina di legame GIGSGT beta 2 | X | |||
| P62937 | Peptidil prolyl cis trans isomerasi A | X | X | ||
| P62987 | Ubiquitina 60S proteina ribosomale L40 | X | |||
| P63104 | 14 3 3 proTein zeta delta | X | X | X | X |
| P63241 | Fattore di iniziazione della traduzione eucariota 5A 1 | X | |||
| P63244 | La proteina di legame di guanina nucleotide beta 2 come 1 | X | |||
| P63267 | Actin gamma enterico muscolo liscio | X | X | ||
| P67936 | Tropomyosin alfa 4 catena | X | |||
| P68032 | Actin alfa cardiaco muscolare 1 | X | |||
| P68104 | Fattore di allungamento 1 alfa 1 | X | X | X | |
| P68133 | Muscolo scheletrico di Actin alfa | ||||
| P68363 | Catena di Tubulin alpha 1B | X | X | X | |
| P68371 | Tubulin beta 2C catena | X | X | X | |
| P68402 | Fattore di attivazione della trombocitola beta-acetilhydroazasi IB | X | |||
| P68871 | Beta di emoglobina | X | X | X | |
| P69905 | Alunno di emoglobina | X | X | ||
| P78371 | T complesso proteina 1 subunità beta | X | |||
| P78417 | Glutatione transferasi omega 1 | X | X | ||
| P80748 | Ig lambda catena VIII regione LOI | X | |||
| P98095 | Fibulin 2 | X | X | ||
| Q01082 | Cervello della catena beta della spettrina 1 | X | |||
| Q01449 | Myosina leggera catena leggera 2 isoforma atriale | X | |||
| Q01518 | Proteina associata alla adenil ciclasi 1 | X | |||
| Q01995 | Transgelin Proteina muscolare liscia 22 alfa | X | |||
| Q03252 | Lamin B2 | X | X | ||
| Q03591 | Fattore complementare H correlato proteina 1 precursore | X | Q04917 | 14 3 3 proteine eta | X | X |
| Q06323 | Sottunita complessa dell'attivatore Proteasome 1 | X | |||
| Q06828 | fibromodulina | X | X | X | X |
| Q06830 | Peroxiredoxin 1 | X | X | ||
| Q07507 | Dermatopontin | X | X | X | X |
| Q07960 | Proteina attivante Rho GTPase 1 | X | |||
| Q08257 | Quinone ossidoreductasi | X | |||
| Q08431 | lactadherin | X | X | ||
| Q12765 | SEcernin 1 | X | |||
| Q13011 | Delta 3 5 Delta 2 4 precursore mitocondriale di CoE isomerasi dienoile | X | X | ||
| Q13228 | Proteina legante di selenio 1 | X | X | ||
| Q13404 | Ubiquitina coniuga l'enzima E2 variante 1 | X | |||
| Q13409 | Catena intermedia 2 di Dynein citoplasmatica | X | |||
| Q13509 | Tubulina beta 3 catena | X | X | X | |
| Q13642 | Quattro e mezza LIM dominano la proteina 1 | X | |||
| Q13765 | Nascent polipeptide associato complesso subunità alfa | X | |||
| Q13885 | N Tubulin beta 2A catena | X | X | ||
| Q14194 | Proteina legata alla dihidropirimidinasi 1 | X | |||
| Q14195 | Proteina legata alla droidropirimidinasi 3 | X | X | X | X |
| Q14624 | Inter-alfa tripasina inibitore catena pesante H4 precursore | X | |||
| Q14697 | Precursore neutro alfa glucosidasi AB | X | |||
| Q14764 | Proteina maggiore del vault | X | |||
| Q14767 | Fattore di trasformazione latente trasformante beta che lega la proteina 2 | X | <td>X | ||
| Q14894 | La proteina legante della proteina legante dell'ormone tiroideo regolava NADP omologo cristallino | X | |||
| Q15063 | Precursore di Periostin | X | X | X | X |
| Q15084 | Proteina disolfuro isomerasi A6 precursore | X | |||
| Q15113 | Procollagen C endopeptidase enhancer 1 precursore | X | |||
| Q15181 | Pirofosfatasi inorganica | X | |||
| Q15365 | Proteina legante di Poly rC 1 | X | |||
| Q15366 | Proteina legante di Poly rC 2 | X | |||
| Q15582 | Trasformazione della proteina indotta da fattore di crescita beta | X | X | X | |
| Q15819 | Ubiquitina coniuga l'enzima E2 variante 2 | X | |||
| Q16352 | Alpha internexin | X | |||
| Q16473 | Tenascinative XA | X | |||
| Q16555 | Proteina legata alla droidropirimidinasi 2 | X | X | X | |
| Q16698 | 2 4 precursore mitocondriale dienoilico CoA reduttasi | X | |||
| Q16891 | Membrana interna mitocondriale | X | |||
| Q562R1 | Beta actina come la proteina 2 | X | |||
| Q6S8J3 | Membro del nucleo familiare POTE di ankyrin E | X | |||
| Q6UWY5 | Olfactomedina come proteina 1 precursore | X | X | ||
| Q71U36 | Catena di tubulina alfa 1A | X | X | X | |
| Q7Z7G0 | Target di Nesh SH3 precursore | X | X | X | |
| Q8WUM4 | Morte programmata della morte 6 proteine interagenti | X | |||
| Q8WWX9 | Tioredossina come il precursore di selenoproteina M. | X | |||
| Q92597 | Proteina NDRG1 | X | |||
| Q92945 Lungo elemento a monte dell'elemento a monte 2 | X | ||||
| Q96CN7 | Dominio di Isochorismatase contenente la proteina 1 | X | |||
| Q96CX2 | Dominio di BTB POZ contenente proteine | X | |||
| Q96KK5 | Histone H2A tipo 1 H | X | X | ||
| Q96KP4 | Dipeptidasi non specifico citosolica | X | |||
| Q99426 | Chaperone specifico di Tubulin B | X | |||
| Q99497 | Protein DJ 1 | X | X | ||
| Q99536 | Proteina sinaptica della membrana vescicale | X | X | X | |
| Q99714 | 3 idrossi-acil CoA deidrogenasi tipo 2 | X | |||
| Q99715 | Catena collagene alpha 1 XII | X | X | ||
| Q99798 | Aconitate il precursore mitocondriale idratasi | X | |||
| Q9BQE3 | Tubulina alfa 6 catena | X | |||
| Q9BUF5 | Tubulina beta 6 catena | X | X | ||
| Q9BUT1 | 3 idrossibutirrato deidrogenasi tipo 2 | X | |||
| Q9BVA1 | Tubulin beta 2B catena | X | X | X | |
| Q9BXN1 | Asporin | X | x </ Td> | X | X |
| Q9H0W9 | Ester idrolasi C11orf54 | X | |||
| Q9H4B7 | Tubulina beta 1 catena | X | |||
| Q9NRN5 | Olfactomedina come proteina 3 precursore | X | X | ||
| Q9NRV9 | Proteina di legame di Heme 1 | X | |||
| Q9NSB2 | Keratina tipo II cuticolale Hb4 | X | X | ||
| Q9NVA2 | Settembre 11 | X | |||
| Q9UBR2 | Precursore di Cathepsin Z | X | |||
| Q9UBX5 | Fibulin 5 | X | X | ||
| Q9UK22 | F box solo proteina 2 | X | |||
| Q9Y277 | Proteina canale selettiva di anioni dipendenti da tensione 3 | X | |||
| Q9Y281 | Cofilin 2 | X | |||
| Q9Y490 | Talin 1 | X | |||
| Q9Y696 | Proteina del canale intracellulare del cloruro 4 | X | |||
| Q9Y6C2 | EMILIN 1 | X | X |
Tabella 1: Elenco delle proteine identificate nell'estratto tessuto della valvola mitrale quando sono stati applicati quattro approcci proteomi diversi: elettroforesi bidimensionale (2-DE), LC-MS E bidimensionale (2D-LC / MS E ), LC / MS E e IEF a fase liquida. Viene riportato il metodo di identificazione di ciascuna proteina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Un passo critico di questo protocollo è l'uso di azoto liquido per congelare il campione e per raffreddare il sistema di macinazione. L'utilizzo di azoto liquido evita il degrado biologico e consente una polverizzazione efficace, ma richiede una formazione specifica per una manipolazione sicura.
In questo protocollo è previsto un sistema di macinazione per la macinazione del campione in quanto i piccoli campioni sono difficili da recuperare da mortai e pestelli standard. In questo caso, piccoli campioni si diffondono come una polvere fine sulla superficie della malta, rendendo difficile la raccolta. Un altro vantaggio è che la smerigliatrice è motorizzata, che consente un maggior numero di campioni da lavorare in modo riproducibile e senza aggiunta di stanchezza. Una limitazione all'utilizzo di una macinatrice è che la dimensione del campione che deve essere piccola (100 mg o meno) per il pestello essere pressata efficacemente contro la malta. Inoltre, i componenti della smerigliatrice devono essere riscaldati a temperatura ambiente tra gli usi per la pulizia g. Di conseguenza, la procedura richiede tempo e, se molti campioni vengono elaborati quotidianamente, sono necessari molti set.
Un ulteriore passo critico è la preparazione del tampone di estrazione. Le concentrazioni di sale, in particolare per l'urea (8 M) e la tiourea (2 M), sono abbastanza elevate; Quindi, il volume di sale è quasi la metà del volume totale della soluzione. Inoltre, la dissoluzione non è facile considerando che il calore deve essere evitato in quanto, a più di 37 ° C, l'urea può portare alla carbamilazione delle proteine alle proteine / peptidi N e ai gruppi amminoidali a catena laterale di residui di lisina e arginina 17 . Una volta sciolto, il tampone di urea deve essere filtrato con filtri da 0,22 μm e può essere conservato a -80 ° C per 4 settimane senza compromettere l'efficacia di estrazione, ma deve essere riscaldato a più di 15 ° C prima dell'uso per consentire una completa dissoluzione .
Modifiche e risoluzione dei problemi
In questo protocollo, l'estrazione di proteine viene eseguita utilizzando il buffer di urea descritto, perché è una delle soluzioni di estrazione di proteine più comunemente usate per studi proteomici a causa della sua compatibilità con isoelettrofocus e la sua efficacia nel solubilizzazione di proteine poco solubili 18 . Ha dimostrato che questo tampone può solubilizzare in modo molto efficiente proteine poco solubili, come proteine membrane integrali 19 o proteine altamente inclini all'aggregazione, come il tubulino 18. Inoltre, questo tampone è completamente compatibile con il saggio di Bradford per determinare la concentrazione proteica e Può essere utilizzato direttamente in analisi IEF a 2-DE e in fase liquida.Tuttavia, questo buffer non è ideale per la solubilizzazione di tutte le proteine presenti in un campione. È possibile che diversi buffer di estrazione possano rivelare le proteine non rilevabili da questo protocollo. Ad esempio, è bene knoConsiderando che le proteine ribosomali e nucleari potrebbero essere meglio estratte con l'estrazione dell'acido o l'acido tricloroacetico / acetone 20 , mentre i livelli di pH alcalini sono più adatti alle proteine 21 e 22 delle membrane. Pertanto, l'utilizzo di buffer alternativi potrebbe richiedere passi aggiuntivi per la precipitazione delle proteine per eliminare sali che interferiscono con IEF a 2-DE o in fase liquida.
Limitazioni della tecnica
Il numero di proteine identificate da questo protocollo è relativamente basso, ma il numero di identificazioni e la copertura dell'analisi proteomica possono essere ulteriormente aumentate grazie all'utilizzo di strumenti più moderni, la cui precisione di massa e velocità di sequenza sono aumentati notevolmente negli ultimi anni 23. È possibile coprire una gran parte del proteome, senza alcuna fase di prefrazione, impiegando una lunga pendenza per i liquidiSeparazioni di romatografia accoppiate con uno strumento MS ad alta risoluzione che ha una veloce velocità di sequenza 24 .
Significato della tecnica rispetto ai metodi esistenti / alternativi
La capacità di identificare e quantificare le proteine nelle valvole cardiache umane, come la valvola mitrale, è un compito importante e stimolante che aiuterà a chiarire i meccanismi dei processi fisiologici / patologici nelle malattie delle valvole. Definire i cambiamenti della proteoma della valvola mitrale aumenta notevolmente la comprensione della natura dei processi biologici associati allo stato di malattia del tessuto.
Le conoscenze attuali sulla fisiopatologia della valvola mitrale sono limitate e generalmente ottenute attraverso l'analisi di singole proteine coinvolte in processi specifici, come il rimodellamento delle matrici extracellulari, l'emostasi, l'infiammazione o lo stress ossidativo 25 9 , 10 .
La mancanza di studi proteomici completi può essere attribuita alla complessità di questo tessuto a basse cellule che è altamente ricco di proteine della matrice extracellulare ( cioè proteoglicani, collagene e elastina). Queste proteine costituiscono circa l'80% della quantità totale, ostacolando l'analisi delle proteine a bassa abbondanza 26 .
Pertanto, è stato necessario stabilire un efficace protocollo di estrazione per massimizzare la solubilizzazione delle proteine per descrivere il proteome di questo tessuto. Questo protocollo ha permesso l'estrazione di ~ 50 μg di proteine da 1 mg di tessuto. Questo è un rendimento relativamente basso rispetto al tessuto "morbido", ad esempioCome fegato (~ 135 μg da 1 mg di tessuto), ma è sufficiente eseguire un'analisi proteica su singoli campioni. Ciò è particolarmente importante quando si definisce la variabilità intra-individuale di un fenomeno.
Inoltre, questo metodo ha il vantaggio di essere compatibile con molte applicazioni analitiche. Le proteine della valvola mitrale disciolte nel tampone di estrazione proposto possono essere utilizzate direttamente per l'immunoblotting e l'analisi proteomica basata su elettroforesi bidimensionale e isoelettroforesi in fase liquida 11 , 12 o, dopo la precipitazione delle proteine per eliminare l'interferenza del componente tampone, per altri dosaggi quali Spettrometria di massa senza gel 15 .
Con l'applicazione di questo protocollo di estrazione, è stata ottenuta una caratterizzazione più esauriente dei componenti proteici del tessuto valvolare normale mitrale attraverso l'identificazione di molti intracelProteine luliche. Queste proteine sono localizzate nel citosolo o negli organelli, non solo nella matrice extracellulare e hanno diverse funzioni molecolari e biologiche. Sono state inoltre identificate altre proteine interessanti ( cioè CryAB , septin-11, FHL-1 e dermatopontin). Queste proteine hanno funzioni sconosciute nella valvola mitralica, ma le loro proprietà biologiche suggeriscono un possibile ruolo nelle malattie delle valvole.
Applicazioni future o indicazioni dopo masterizzazione di questa tecnica
Con questo protocollo è possibile correlare i dati relativi all'espressione di proteine con i dati sull'espressione quantitativa di mRNA e sulle analisi immunohistochemiche non-quantitative. Infatti, quando utilizzati insieme, questi approcci porteranno ad una comprensione più completa dei meccanismi molecolari che sottostanno la malattia, dall'MRNA alla modifica della proteina post-traslatoria. Quindi, questo metodo può essere di interesse per i ricercatori concentrati sulla valvola cardiaca fisiopatologica. pinnaAllo stesso modo, questo protocollo può essere applicato anche alla valvola mitrale della porcellana, che ha una somiglianza molto vicina alla valvola umana 27 ed è usata come modello sperimentale per la valutazione delle funzioni della valvola.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Il Ministero della Salute italiano ha sostenuto questo studio (RC 2013-BIO 15). Ringraziamo Barbara Micheli per la sua eccellente assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
